Exacta

Centro Universitario Nove de Julho

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ISSN (Versin impresa): 1678-5428 BRASIL

2007 Daniel Jos Toffoli / Lilia Coronato Courrol / Larcio Gomes / Nilson Dias Vieira INVESTIGAO DO COMPORTAMENTO PTICO DE COMPLEXOS DE LANTANDEOS: POSSVEIS APLICAES BIOMDICAS Exacta, janeiro-junho, ao/vol. 5, nmero 001 Centro Universitario Nove de Julho So Paulo, Brasil pp. 119-126

Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina y el Caribe, Espaa y Portugal Universidad Autnoma del Estado de Mxico
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Artigos

Investigao do comportamento ptico de complexos de lantandeos: possveis aplicaes biomdicas

Daniel Jos Toffoli
Mestrando em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear Ipen/USP. So Paulo SP [Brasil] daniel.j.t@uol.com.br

Lilia Coronato Courrol

Doutora em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear; Professora Adjunta Unifesp; Pesquisadora Colaboradora do Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares CNEN/Ipen. Diadema SP [Brasil] lcourrol@gmail.com

Larcio Gomes
Doutor em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear; Pesquisador Titular do Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares CNEN/Ipen. So Paulo SP [Brasil] lgomes@ipen.br

Nilson Dias Vieira Jnior

Doutor em Fsica pela Universidade de So Paulo; Pesquisador Titular do Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares. So Paulo SP [Brasil] nilsondv@ipen.br

A hipericina (Hp), um cromforo natural originrio de plantas do gnero Hypericum, e a hipocrelina A (HA), cromforo proveniente do fungo Hypocrella bambusae, vm ganhando destaque por causa de suas atividades fotossensibilizantes. Sabe-se que a HA pode formar com o on lantnio um complexo que exibe grande rendimento quntico de gerao de oxignio singleto e janela de absoro deslocada para a regio do vermelho, quando comparado HA. Por esse motivo, a influncia da adio dos ons lantnio e eurpio e de perxido de hidrognio nas propriedades da HA e da Hp foi investigada por meio de mtodos de espectroscopia ptica. Assim, pde-se determinar a potencialidade de tais complexos para uso em aplicaes biomdicas. Palavras-chave: Hipericina. Hipocrelina A. Lantandeos. Perxido de hidrognio.
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Introduo
A hipocrelina A (HA) ou Hypocrella bambu-

tes luz da regio espectral de, aproximadamente, 600 a 900 nm a janela teraputica (LEE et al., 2006). Entre as opes que permitem atingir tais resultados, a formao de complexos com ons lantnio mostrou-se a mais eficaz (zHOU et al., 2005; zHOU et al., 2003). A hipericina (Hp), outro pigmento, proveniente de plantas do gnero Hypericum (Figura 1b), em razo de suas excelentes propriedades farmacolgicas (em especial no que diz respeito ao antitumoral induzida por radiao), apresentou evoluo semelhante descrita para a HA (SHEN et al., 2006; DUMAS et al., 2003).

sae, pigmento originrio de um fungo muito comum em todo o continente asitico, principalmente, em pases como China e Sri Lanka, vem sendo alvo de vrios estudos nas ltimas duas dcadas (Figura 1a). Tal interesse se justifica pelos timos resultados encontrados nessa substncia no tocante capacidade de produo de oxignio singleto e a suas propriedades de absoro de luz na regio espectral correspondente cor vermelha. Esses resultados, j discutidos na literatura (MILLER et al., 1997), evidenciam sua potencialidade para utilizao em uma tcnica teraputica que se baseia no processo fotoqumico de transferncia de energia de um fotossensibilizador, que responsvel por absorver a radiao eletromagntica incidente, para o oxignio em seu estado fundamental, dando origem a espcies excitadas de oxignio, entre as quais o singleto. Tal tcnica teraputica, conhecida pela sigla PDT, do termo ingls Photodynamic Therapy, ou Terapia Fotodinmica, e que se destaca por sua alta seletividade e eficincia, pode ser empregada, inclusive, para tratamento de cncer, uma vez que os produtos da reao de transferncia de energia, as espcies excitadas de oxignio, so extremamente reativos, a ponto de induzir morte celular. Devido a essa nobre aplicao da HA, pesquisadores (zHOU et al., 2005; LEE et al., 2003; WANG et al., 2005) buscaram um aprimoramento das propriedades desse composto, de forma que a PDT voltada para tratamento de cncer pudesse tornar-se uma realidade em hospitais e clnicas pelo mundo. Para tanto, era necessrio melhorar sua solubilidade (uma vez que a soluo deveria entrar em contato com o fluido corpreo), bem como deslocar seu espectro de absoro para regies de maiores comprimentos de onda (o que maximizaria sua ao seletiva, visto que os tecidos do corpo humano so transparen-

OH

O OCH3

H3CO H3CO

OH CH3 COCH3 OCH3 OH O (a) OH O OH

HO HO

CH3 CH3

OH

OH (b)

Figura 1: Estruturas moleculares de: a) hipocrelina A (C 0 H 2O10) e b) hipericina (C 0 H1O).

Fonte: Shen e colaboradores (2006, p. 1414-1417).

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Artigos

Deve-se mencionar tambm que, em geral, complexos de lantandeos apresentam-se como excelentes compostos luminescentes, possuindo grande deslocamento de Stokes, longo tempo de vida e bandas de emisso bem definidas e de intensidade elevada (LIN, 2004). Foi verificado (WU et al., 2005) que ons eurpio em determinadas solues so sensveis presena de perxido de hidrognio (H 2O2), subproduto de diversas reaes enzimticas, o que evidencia sua potencialidade como agente de diagnstico in vitro. Por estes motivos, h uma grande motivao para investigar as propriedades pticas de HA e Hp, dopadas com diferentes ons lantandeos (La3+ e Eu3+) e sob a presena de perxido de hidrognio, com o intuito de determinar sua potencialidade de uso em cincias biomdicas como sondas luminescentes e agentes fotossensibilizadores.

forneceu ampla variedade de complexos para um estudo mais abrangente. Solues de hipocrelina A: Inicialmente, adicionou-se a 1 mg de HA 1 mL de etanol absoluto, fazendo-se a diluio. A seguir, reservaram-se 500 L dessa soluo, aos quais foram acrescidos 1000 L de etanol. Essa soluo foi dividida em trs pores iguais de 500 L cada: a primeira no sofreu adio de nenhum dopante; a segunda recebeu o acrscimo de 1 mg de cloreto de eurpio hexahidratado (EuCl3.6H 2O); e, aos outros 500 L, adicionou-se 1 mg de cloreto de lantnio heptahidratado (LaCl3.7H 2O).

2.2 Mtodos
Tendo-se as solues preparadas em mos, foram medidos os respectivos espectros de absoro ptica, com o auxlio de um espectrofotmetro Olis Cary, modelo 17-D, da Varian, e de emisso ptica, por meio de montagem, utilizando a tcnica de lock-in. Nesse caso, as amostras foram excitadas por um conjunto de iluminao composto de lmpada de xennio de 300 W e um monocromador de excitao Jarrell-Ash de 0,25 m. O sinal de emisso foi analisado por um monocromador Spex 0,5 m e uma fotomultiplicadora PMT Hamamatsu acoplada a um amplificador lock-in EG&G-PAR, que opera na freqncia de um obturador ptico (chopper Stanford) posicionado na excitao. Tanto nas medidas de absoro ptica quanto nas de emisso, as amostras foram acondicionadas em cubetas com caminhos pticos de iluminao de 1,0 mm.

Parte experimental
2.1 Materiais
A HA, a Hp, o etanol absoluto e os clore-

tos de lantandeos empregados (EuCl3.6H 2O e LaCl3.7H 2O) foram adquiridos da Sigma Aldrich e da Molecular Probes, todos com pureza analtica. A seguir, ser apresentado o modo de preparao das solues estudadas: Solues de hipericina: Inicialmente, diluiu-se 1 mg de hipericina em 1 mL de etanol absoluto. Separou-se metade dessa soluo (o correspondente a 500 L ), adicionando-se, em seguida, 1 mg de cloreto de eurpio hexahidratado (EuCl3.6H 2O). Por fim, foram separados frascos contendo 100 L de soluo hipericina:eurpio, e foram acrescidos 10L, 20 L, 30 L , 40 L , 50 L e 100 L de H 2O2 , o que
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Resultados e discusso
Na Figura 2, so mostrados os espectros de

absoro das solues de hipericina pura (Hp) e de hipericina:eurpio (Hp:Eu).

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3,0 2,5 Densidade ptica 2,0 1,5 1,0 0,5 0 300 400 500 600 700 800 900

Adicionando-se eurpio Hp, percebe-se mudana na colorao da soluo, que adquire um tom esverdeado, bem como acentuada diminuio na quantidade de luz absorvida, supresso dos picos em 545 nm e 589 nm e um ligeiro deslocamento do mximo de absoro de 589 nm para cerca de 620 nm. Esse deslocamento interessante, uma vez que, quanto maior o comprimento de onda incidente, menor a absoro por parte dos tecidos biolgicos e, conseqentemente, mais eficaz ser o tratamento por meio da terapia fotodinmica (PDT). A contribuio de H 2O2 absoro do complexo Hp:Eu apresentada na Figura 3.
1,00 0,75 Densidade ptica 0,50 0,25 0,0 -0,25 Comprimento de onda (nm) Hp HP:Eu

Figura 2: Espectros de absoro ptica das amostras de hipericina (Hp) e hipericina eurpio (Hp:Eu) em etanol, mostrando a supresso dos picos de absoro da Hp em 4 nm e 9 nm e a formao de um novo mximo em 20 nm, quando h o acrscimo de ons Eu+
Fonte: Os autores.

interessante verificar que a Hp, de colorao em tom vermelho intenso, apresenta larga banda de absoro, que pode ser dividida em duas regies mais significativas: a primeira delas para comprimentos de onda inferiores a 360 nm, com picos em 225 nm, 285 nm e 331 nm; e a outra se estendia de 450 nm a 600 nm, com mximo de absoro mais significativo em torno de 460 nm, 545 nm e 589 nm. Em primeira anlise, poder-se-ia pensar que o fato de a Hp possuir variados picos de absoro pudesse ser til sua aplicao como agente fotossensibilizador. Essa idia, contudo, precipitada, uma vez que so interessantes apenas os picos de absoro na regio de 600 nm a, aproximadamente, 800 nm, para que haja profunda penetrao da luz nos tecidos, permitindo, assim, adequada excitao do fotossensibilizador. Logo, pode-se dizer que a Hp no se enquadra nas necessidades das aplicaes clnicas como fotossensibilizador pela limitao citada, referente banda de absoro.

300

400

500

600

700

800

900

Comprimento de onda (nm) HP:Eu:H2O2

Figura : Espectro de absoro ptica da soluo hipericina:eurpio contendo 100 L de H 2O2 (Hp:Eu:H 2O2)
Fonte: Os autores.

Comparando-se a Figura 2 com a 3, percebe-se que, na regio do visvel (aproximadamente 400 nm a 700 nm), as curvas para as solues de Hp:Eu:H 2O2 e de Hp possuem forma semelhante. Verifica-se, portanto, uma tendncia reconstruo da banda original da Hp, que havia sido suprimida pela adio de eurpio, quando do acrscimo de H 2O2 ao complexo Hp:Eu. Isso implica que um meio com maior ou menor concentrao de H 2O2 poderia ser facilmente identificado mediante
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o complexo Hp:Eu. Caso o meio em que este se encontre seja livre de H 2O2 , o complexo manter sua colorao habitual, verde; se o meio for rico, haver alteraes em sua colorao, que passar a assumir tons mais intensos quanto maior for a concentrao de H 2O2 . Essas observaes so complementadas na Figura 4, que expe os espectros de emisso ptica do complexo Hp:Eu:H 2O2 sob excitao em 460 nm.
0,024 0,022 0,020 0,018 0,016

posto Hp:Eu. A curva de calibrao, apresentada interiormente na Figura 4, relaciona intensidade de luminescncia com a porcentagem em volume de H 2O2 em soluo Hp:Eu. importante notar que o aumento na intensidade de emisso, para a soluo com 50 L de H 2O2 , chega a, aproximadamente, 700%. Isso evidencia a alta sensibilidade do mtodo proposto, que capaz de detectar (pela curva de calibrao apresentada) concentraes de 9% at 33% em volume de perxido de

lexc = 460nm Sinal (U. A.)

0,014 0,012 0,010 0,008

Emisso = 588nm

hidrognio (o correspondente a variaes de 10 L a 50 L de H 2O2). Verifica-se, assim, a potencialidade de uso

Curva de Calibrao

Sinal (U. A.)

0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000 -0,002

Hp:Eu:50L H2O2

desse complexo como sonda luminescente in vitro. Amostras de sangue poderiam ser colocadas na presena do complexo Hp:Eu que, por ser sensvel presena de H 2O2 , atuaria como um biossensor, indicando quantitativamente a presena

10

20 30 40 Concentrao de H2O2(%)

Hp:Eu

560 570

580

590

600

610

620

630

640

650

desse composto. So mostrados na Figura 5 os espectros de absoro ptica das solues de HA, HA:Eu e HA: La. Inicialmente, pode-se perceber por esses espectros que a hipocrelina A apresenta larga banda de absoro, desde cerca de 350 nm at aproximadamente 600 nm, com picos de maior intensidade em torno de 460 nm, 540 nm e 580 nm, o que justifica sua colorao em tom vermelho. Confirma-se, desse modo, que a HA no apresentaria eficincia ideal na PDT, visto que a incidncia de luz, em seus picos de absoro, acarretaria absoro tambm por parte dos tecidos biolgicos. Nesse contexto, a adio de ons lantandeos em HA provocou modificaes em suas propriedades de absoro. Percebe-se que a adio de eurpio no se revela proveitosa do ponto de vista da absoro na janela teraputica, uma vez que os picos de absoro dessa soluo encontram-se abaixo desta regio. A dopagem com lantnio, por sua vez, deu origem a picos em torno de 475 nm, 560 nm e 600 nm, ou seja, provocou um ligeiro deslocamento do espectro de absoro da HA para a

Comprimento de onda (nm)

Figura 4: Espectro de emisso comparativo da soluo de hipericina:eurpio (Hp:Eu) e hipericina:eurpio:perxido de hidrognio (Hp:Eu:H 2O2), obtido sob excitao em 40 nm. A figura interna mostra a curva de calibrao para perxido de hidrognio em solues de Hp:Eu, exibindo uma regio linear correspondente a concentraes de 9% (10 L) a % (0 L) em volume de perxido de hidrognio.
Fonte: Os autores.

Por motivos de clareza, na Figura 4, apresentado apenas o espectro de emisso da soluo com 50 L de H 2O2 em comparao com o complexo Hp:Eu. Pode-se dizer que todas as solues com acrscimo progressivo de H 2O2 possuem espectros de emisso muito semelhantes, com picos em torno de 588 nm e 635 nm, diferindo apenas pela intensidade de sinal emitido, que se torna to maior quanto mais alta a concentrao de H 2O2 em Hp:Eu. Desse modo, sugere-se outra forma de deteco e quantificao de perxido de hidrognio, com base na intensidade de emisso do com-

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12

1,6

1,0 HA lexc = 460nm 0,8 0,7

Densidade ptica

1,2 Sinal (U.A.)

0,8

0,5 0,3 0,2 HA:Eu

HA:La

0,4

0,0 300 400 500 600 700 0,0 600 625 650 675 Comprimento de onda (nm) HA HA:Eu HA:La 700

Comprimento de onda (nm) HA:Eu HA:La HA

Figura : Espectros de absoro ptica das amostras de hipocrelina A (HA), hipocrelina A: eurpio (HA:Eu) e hipocrelina A:lantnio (HA:La)
Fonte: Os autores.

Figura : Espectros de emisso ptica das amostras de hipocrelina A (HA), hipocrelina A: eurpio (HA:Eu) e hipocrelina A:lantnio (HA: La) excitadas em 40 nm
Fonte: Os autores.

regio de maiores comprimentos de onda, o que torna a soluo mais eficiente para uso em PDT. Tambm foi feito um estudo da emisso dessas solues sob excitao em 460 nm (Figura 6) e em 580 nm (Figura 7). Observou-se, com base nos espectros de emisso obtidos, que, entre as trs amostras, a soluo que contm apenas HA foi a que mais emitiu esse material. Essa amostra apresenta larga banda de emisso, com mximos
Sinal (U.A.) 6,7 8,3 HA lexc = 580nm

ndeos. Tambm possvel que a diferena entre os raios atmicos desses elementos e as diferentes distribuies dos nveis de energia em cada solu-

em torno de 600 nm e 630 nm. A soluo HA: Eu sofre um acentuado decrscimo de intensidade de emisso, mas praticamente conserva os picos caractersticos da hipocrelina A. Percebe-se tambm que o acrscimo de lantnio em hipocrelina A gera uma pequena diminuio da intensidade de emisso; todavia, ao contrrio do que ocorre com a amostra com eurpio, produz uma supresso da banda em torno de 600 nm. Acredita-se que as diferenas obtidas das propriedades pticas da HA sob a presena de lantnio e eurpio sejam decorrentes de alteraes estruturais, principalmente, no que diz respeito quantidade de ligaes perturbadas pelos lanta-

5,0

3,3 HA:Eu HA:La 1,7

0,0

600

625 650 675 Comprimento de onda (nm) HA HA:Eu HA:La

700

Figura 7: Espectros de emisso ptica das amostras de hipocrelina A (HA), hipocrelina A: eurpio (HA:Eu) e hipocrelina A:lantnio (HA: La) excitadas em 0 nm.
Fonte: Os autores.

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o tenham contribudo para explicar os diferentes comportamentos observados.

Consideraes finais
Pela anlise dos resultados obtidos, foi pos-

svel verificar que a presena dos ons lantandeos em HA e em Hp modificou os nveis de energia dessas molculas, assim como suas probabilidades de transies radiativas. Foi mostrado o potencial da soluo hipericina:eurpio como marcador luminescente para mtodos de diagnstico in vitro. Tal soluo atuaria de forma rpida, conveniente e altamente especfica, visto que concentraes pequenas de perxido de hidrognio alteram consideravelmente suas propriedades de absoro e de emisso. Tambm foi possvel verificar que a formao de complexos com lantnio responsvel por deslocar o espectro de absoro da hipocrelina A para a regio de maiores comprimentos de onda, com a gerao de picos de absoro em torno de 475 nm, 560 nm e 600 nm. Tal deslocamento, embora pequeno, significativo do ponto de vista das aplicaes clnicas da HA em PDT. Observou-se, com base nos espectros obtidos, a potencialidade de utilizao desses complexos na rea biomdica. Em trabalhos futuros, pretendemos realizar medidas de tempo de vida e ensaios in vitro com cultura de bactrias, a fim de que se possa determinar a eficincia quntica de gerao de oxignio singleto por parte desses complexos, bem como o seu potencial citotxico.

A (HA), a chromophore from the fungus Hypocrella bambusae, have been gaining much notability due to their photosensitizing activities. It is known that HA can form a complex with lanthanum ion, which shows a large quantum yield of singlet oxygen generation and a redshifted absorption window when it is compared with HA. For this reason, the influence of the addition of lanthanum ion, europium ion and hydrogen peroxide to the properties of the HA and Hp has been investigated by means of optic spectroscopy methods. Thus, it was possible to determine the potentiality of such complexes for use in biomedical applications. Key words: Hydrogen peroxide. Hypericin. Hypocrellin A. Lanthanides.

Referncias
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Optical behavior investigation of lanthanide complexes: possible biomedical applications

Hypericin (Hp), a natural chromophore found in plants of genus Hypericum; and hypocrellin

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SHEN, L.; JI, H.; zHANG, H. Anion of hypericin is crucial to understanding the photosensitive features of the pigment. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Oxford, v. 16, n. 5, p. 1414-1417, 2006. WANG, L.; WANG, X.; zHANG, H. A theoretical study on photobleaching mechanisms of hypocrellins. Dyes Pigment, v. 67, n. 3, p. 161-166, 2005. WU, M.; LIN, z.; SCHFERLING, M.; DRKOP, A.; WOLFBEIS, O. Fluorescence imaging of the activity of glucose oxidase using a hydrogen-peroxide-sensitive europium probe. Analytical Biochemistry, New York, v. 340, n. 1, p. 66-73, 2005.

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Recebido em 18 dez. 2006 / aprovado em 6 mar. 2007

Para referenciar este texto

TOFFOLI, D. J. et. al. Investigao do comportamento ptico de complexos de lantandeos: possveis aplicaes biomdicas. Exacta, So Paulo, v. 5, n. 1, p. 119-126, jan./jun. 2007.

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