Prctica 1.-Determinacin y observacin de principios inmediatos en alimentos: 1.1 Azcares reductores (tincin con reactivo de Fehling), 1.

1 Almidn (tincin con Lugol) 1.2 Lpidos (tincin con Sudn III) 1.3 Protenas (reaccin de Biuret).

Prctica 2.-Estudio de la mitosis en clulas de raz de cebolla: Tincin con fucsina cida y/o orcena

Prctica 3.- Observacin de bacterias: Tincin de Gram (serrapio dental, yogur)

Prctica 4.-.- Extraccin de ADN.

Prctica 5.- Observacin de vdeos animados sobre el proceso de la sntesis proteica

Practica 6.- Bsqueda de informacin en libros o revistas cientficas o de divulgacin de los siguientes temas Proyecto genoma humano Clonacin en animales Plantas transgnicas. Anlisis de sus repercusiones biolgicas, econmicas y sociales.

Introduccin Microscopios
M. simple
Lupas monoculares Lupas binoculares

M. Compuesto:

Estereomicroscopios De fluorescencia De campo oscuro Microscopia por luz reflejada De luz ultravioleta De contraste de fases De polarizacin

Microscopia electrnica

*De Barrido (MEB) *Microscopio confocal de barrido lser *De Transmisin (TLM)

MICROSCOPIO PTICO (o de campo luminoso).

En estos tipos de microscopios el rea observada est ampliamente iluminada y los objetos que se estudian aparecen ms oscuros que el fondo. Normalmente alcanzan hasta unos 1000 aumentos, aunque con oculares poderosos esta cifra puede llegar a incrementarse en dos veces. El limite til de este aumento es un mximo 2000 y la razn de este lmite de amplificacin, se debe al poder de resolucin, entendido como la capacidad de distinguir dos puntos adyacentes como distintos y separados. Este poder de resolucin se da en funcin de la longitud de onda de la luz utilizada y de la apertura numrica que posea el sistema de lentes empleado. As, puede afirmarse que no siempre las amplificaciones mayores son las de ms utilidad, ya que pueden no ser tan claras como otras menores. Dentro de la microscopia ptica podemos distinguir, segn el nmero y posicin de las lentes el microscopio simple y el compuesto.

MICROSCOPIO SIMPLE (Lupa)

Est provisto de una lente o sistema de lentes convergentes dispuestas de manera que proporcionan una imagen virtual, derecha y mayor que el objeto, que a su vez est situado entre la lente y el foco. La ampliacin del microscopio simple es bastante limitada y suele utilizarse para la diseccin de pequeos animales o para la disociacin de piezas histolgicas. Este tipo de microscopio se denomina tambin lupa. Las lupas pueden ser monoculares o binoculares. La lupa binocular permite aumentar la imagen de objetos y consta de los siguientes elementos: -Oculares: son dos lentes (una para cada ojo) a travs de las cuales se realiza la observacin. Existen lupas con un solo ocular. -Objetivo: lente ms cercana al objeto, normalmente en el interior de una estructura de plstico, redondeada y de color negro. A veces existen dos posiciones, con diferentes aumentos. -Platina: estructura de vidrio circular, donde se coloca la preparacin y objeto que se va a visualizar. Encima de ella existen unas pinzas para sujetar a la muestra. -Mando de enfoque: rueda o tornillo de enfoque, que se regulara para obtener una mayor nitidez de la muestra. Al moverle se desliza todo el bloque de la lupa hacia abajo o hacia arriba. -Interruptor: para conectarse a la red. -Fuente de luz (bombilla). Suelen existir dos bombillas que se sitan una cerca del objetivo y la otra debajo de la platina. En funcin de la muestra a observar se seleccionar una u otra a travs de una llave de tres posiciones. A veces existe una rueda para controlar la intensidad de la luz. -Base y brazo: donde se acoplan el resto de las partes de la lupa binocular. En el brazo existe un tornillo que controla la posicin de todo el conjunto de objetivos, oculares y fuente de luz. Todo el

conjunto se tendr que subir o bajar en funcin del tamao de la muestra u objeto a observar

MICROSCOPIO COMPUESTO

A diferencia del simple, en este tipo de microscopios se combinan dos lentes o sistemas de lentes convergentes de amplificacin de imagen, colocados en los extremos del tubo el denominado objetivo, situado ms cerca del objeto a observar; y el ocular ms cercano al ojo del observador. Antes de pasar a hablar de los diferentes tipos de microscopios compuestos consideramos importante hacer referencia a los cabezales monoculares, binoculares y triloculares, en orden de menor a mayor especializacin en este tipo de tcnica. El cabezal monocular consta de un solo ocular, llevando consigo el inconveniente de producir la fatiga visual en observaciones prolongadas. Este problema se solvent con la aparicin del cabezal binocular, el cual permite la visin con los dos ojos, siendo importante alcanzar una adecuada fusin de la imagen. El cabezal trilocular adems de poseer las ventajas del anterior posibilita fotografiar el objeto de estudio.

Pi: Pieza maciza y pesada para asegurar la estabilidad del aparato y para soportar las dems piezas que componen al microscopio; en ocasiones est provisto por una charnela, que permite la inclinacin de la parte superior del microscopio. Platina: Pieza metlica redonda o cuadrada, donde se colocan las preparaciones; tiene en el centro una abertura circular por la que pasarn los rayos luminosos procedentes del sistema de iluminacin. Puede estar adosada a un carro con dos tornillos de cremallera que permitan movimientos de

traslacin y si los tornillos estn graduados, para medir desplazamientos La preparacin se sujeta en las platinas fijas, con dos palanquitas mviles. En las patinas con carro, se fija por un reborde Tubo ptico: En l est instalado el sistema ptico. Est constituido por dos cuerpos. Uno el externo en el que se encuentra la cremallera y otro interno adosado al anterior donde se encuentra el objetivo. El tubo se mueve verticalmente para poder enfocar el objetivo, con movimiento rpido mediante el macromtrico y movimiento lento mediante el micromtrico. Objetivos: Estn formados por varias lentes para corregir aberraciones, deben tratarse con mucho cuidado, un golpe puede variar la posicin de las lentes y averiarlas, se atornillan al revlver del portaobjetos Objetivos en seco: Entre la lente y el objetivo slo hay aire. Poseen gran profundidad de foco, lo que permite observar diferentes planos paralelos del objeto Objetivos de inmersin: Debe interponerse entre la lente frontal y la preparacin un lquido cuyo ndice de refraccin sea superior al aire (aceite de cedro) lo que permite una mayor luminosidad, son objetivos de gran aumento y gran poder de definicin (Bacteriologa) Oculares: Los forman dos lentes separadas por un diafragma y van montados en la extremidad superior del tubo El sistema de iluminacin se compone de una lmpara o espejo, un condensador y un diafragma; tiene la misin de iluminar los objetos por medio de luz transmitida. El espejo es redondo, con una cara plana y otra cncava, los expertos sugieren usar la parte plana para objetivos de poco aumento y fuentes de luz directa, y la parte cncava para objetivos con gran aumento y fuentes de luz indirecta; el espejo se puede mover y adaptar a diferentes posiciones segn la fuente luminosa. El condensador consta de un sistema de lentes de gran abertura sujetos a una montura, colocados entre la platina y el espejo, puede subirse y bajarse a voluntad y tiene la finalidad de concentrar los rayos de luz para dirigirlos hacia la preparacin. El diafragma se encuentra unido al condensador y regula la cantidad de rayos luminosos que inciden sobre la preparacin --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Poder de definicin: El objetivo debe presentar con correccin los contornos de la imagen Poder penetrante: El objetivo debe permitir sin variar el enfoque ver varios planos del espesor de una preparacin. El poder de resolucin: El poder de resolucin es la distancia mnima a que deben estar situados dos puntos para verlos con claridad La resolucin mxima del microscopio ptico es de 0,2 = 200nm, la de 1 ojo humano 0,1 mm _______________________________________________________________________________________ Cmo se calcula o nmero de aumentos? Como el microscopio compuesto tiene dos sistemas de aumentos el ocular y el objetivo. Para calcular el aumento total tendremos que multiplicar el aumento propio del objetivo por el aumento del ocular ______________________________________________________________________________________

pticas: _Condensador (8): Concentra los rayos de luz sobre la preparacin. _Objetivos (3): Aumentan el tamao de la muestra y proyectan la imagen al ocular. Se encuentran montados en el revlver. _Ocular (1): Aumenta la imagen y la proyecta sobre la retina del observador. _Diafragma (6): Regula la cantidad de luz que llega al condensador. _Fuente de luz (7): Puede ser un foco o un espejo que refleje la luz hacia el condensador. Mecnicas: _Base: Pieza rgida encargada de otorgar estabilidad a todo el conjunto. _Brazo: Pieza que une al sistema ptico con la base. _Platina (9): Plataforma horizontal con un agujero central que permite el paso de la luz. Los portaobjetos con las preparaciones se colocan sobre ella y se fijan con un par de pinzas. Un sistema de tornillos permite desplazar la platina y la muestra hacia adelante, atrs, izquierda y derecha. _Revlver (2): Sistema sobre el que se encuentran los objetivos, al girar permite seleccionar cualquiera de los objetivos disponibles. _Tornillos macromtrico y micromtrico (4 y 5): Tornillos que permiten enfocar la muestra, desplazando la platina hacia arriba o abajo. _Tubo: Cmara oscura unida al brazo

MICROSCOPIO CONTRASTE DE FASES El microscopio de contraste de fases proporciona una imagen clara y detallada de clulas vivas sin teir. En un microscopio ptico ordinario, el contraste se debe a que los materiales distintos absorben diferentes cantidades de luz. Sin embargo, en el microscopio de contraste de fases se debe a los distintos ndices de refraccin entre las partes de los microorganismos y el fondo. Las nicas diferencias estructurales entre un microscopio ptico ordinario y uno de contraste de fases son los sistemas de las lentes del objetivo y del condensador, que en el segundo estn dotados de unos anillos opacos especiales. El microscopio de contraste de fases se fundamenta en el hecho conocido de que las ondas de luz viajan a distintas velocidades en los materiales que poseen ndices de refraccin diferentes. Por tanto, los rayos de luz que pasan a travs del espcimen no se encuentran en la misma fase que los que pasan a su alrededor. Imaginemos las olas del ocano viniendo haca la playa desde diferentes direcciones. Las olas se suman o anulan unas a otras, dependiendo de que sus crestas lleguen al mismo tiempo o no. De forma similar, el microscopio de contraste de fases combina los rayos de luz procedentes del espcimen y los que llegan de sus alrededores. Los rayos se suman o se anulan unos a otros produciendo diferentes intensidades de luz y aumentando, en consecuencia, el contraste. Se denomina interferencia al resultado de la combinacin de rayos de luz de distinta fase.
MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

Utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. Por ello las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje ptico que conecta el espcimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla

MICROSCOPIO DE LUZ REFLEJADA

Estos microscopios se usan principalmente para observar preparados transparentes y lquidos. El mbito de uso es por ejemplo el anlisis de sangre, clulas, pruebas en plantas. Los microscopios clsicos de luz reflejada tienen una distancia de trabajo muy nfima, por debajo de 4 mm. Por ello, esta clase de microscopios son aptos para preparados muy finos

MICROSCOPIO ELECTRNICO.

El microscopio electrnico ha revolucionado el conocimiento de la biologa o la medicina. Tiene la ventaja de alcanzar una extraordinaria amplificacin. Puede dar un poder de resolucin hasta mil veces mayor que el ptico debido a que emplea un haz de electrones en lugar de un haz de fotones.
Existen dos tipos principales de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de barrido y el de transmisin

DE BARRIDO En el microscopio electrnico de barrido (MLB) o microscopia de exploracin electrnica (SEM), los electrones inciden desde arriba sobre la preparacin por ello la muestra puede ser de cualquier grosor o tamao. Emplea dos tcnicas preparatorias: Secado por congelacin. Secado por punto crtico. Despus se cubre la muestra con una capa de metal (oro o platino). DE TRANSMISIN En este tipo de microscopia electrnica, el haz de electrones atraviesa al material que se desea observar. El modo de operar de este tipo de microscopio es similar al del microscopio ptico, ya que est basado en el hecho de que la manera de actuar de un campo electromagntico sobre un haz de electrones es anloga a la accin de la lente de cristal sobre el haz de fotones. La imagen, sin embargo, se forma sobre una pantalla fluorescente como lo hara en una pantalla de televisor. El haz de electrones pasa a travs de la muestra estudiada y posteriormente, a travs de unas lentes electromagnticas que dan lugar a una imagen amplificada. Esta imagen pasa a su vez por una lente proyectora hasta una pantalla de material fluorescente, que brilla al recibir el impacto de los electrones. Debajo de la pantalla se sita la cmara para fotografiar la imagen No obstante, al igual que en el microscopio ptico, el microscopio electrnico de transmisin tiene la limitacin de ser til slo para un grosor determinado del objeto. Las pelculas de muestra, adems de ser delgadas, no deben poseer materiales que puedan dispersar o absorber electrones, deben ser lo suficientemente fuertes como para poderlas manipular, y lo bastante estables, como para no volatilizarse, a causa del bombardeo en el vaco. El interior del microscopio debe hallarse en vaco, ya que el aire impide la movilidad de tos electrones. Esto se efecta mediante las bombas de vaco. Estas condiciones imposibilitan la observacin de microorganismos vivos, y de sus procesos fisiolgicos. Las tcnicas que ms se utilizan para este tipo de microscopio electrnico son: tincin negativa, microtoma y congelacin.

PREPARACIN DEL OBJETO DE ESTUDIO PARA MICROSCOPIA PTICA La preparacin del objeto de estudio puede resultar un proceso simple o. por el contrario, ser bastante complejo, dependiendo de la naturaleza y caractersticas de aquello que queremos observar.

La preparacin de una muestra para estudiarla al microscopio ptico es diferente segn la naturaleza del material que ha de ser observado: orgnico o inorgnico. Si es orgnico, segn queramos observar propiedades que slo se manifiestan en estado vivo, o si queremos observar morfologa y estructuras, que no se modifican cuando sobreviene la muerte celular.

- Preparaciones hmedas
Para observar organismos acuticos microscpicos (algas, larvas, etc.). Se pone una gota del lquido que los contiene sobre el portaobjetos y se pone el cubreobjetos con cuidado para que no aparezcan burbujas de aire

- Gota pendiente:
Se utilizan portaobjetos excavados sobre los que se pone el cubreobjetos, que lleva adherido la gota del lquido que ha de ser observado. As podemos observar el movimiento de los microorganismos en el medio lquido, sin que estn sometidos a la presin entre portaobjetos y cubreobjetos. Esta tcnica presenta varios problemas que hay que tener en cuenta: 1. La gota constituye una lente trmula que desva los rayos de luz e interfiere con la iluminacin, esto resulta muy molesto cuando se emplea microscopio de contraste de fases. 2. Los portaobjetos excavados actan como una lente divergente que puede modificar la realidad de lo que se est observando.

- Examen en fresco con nigrosina:

Esta tcnica consiste en aadir nigrosina, se prefiere a la tinta china, al objeto de estudio. Con este mtodo podemos distinguir bacterias incoloras sobre fondo negro. Se utiliza sobre todo para el estudio de detalles estructurales como cpsulas y flagelos. Se utiliza el objetivo de inmersin. En el examen en fresco se pueden utilizar dos tipos de medios: los lquidos fisiolgicos o los lquidos de adicin. Los lquidos fisiolgicos son los que conservan las condiciones ms parecidas a aquellas en las que se desenvuelve el microorganismo vivo. Los lquidos de adicin se utilizan para aclarar los objetos de estudio poco transparentes (insectos, pelos, fragmentos vegetales) y as hacerlos visibles. Como lquidos de adicin se utilizan el lactofenol o el clorofenol.

b) Coloracin vital.
Permite poner de relieve detalles estructurales sin matar al organismo. En general no tien, sino que se acumulan en determinadas zonas de la clula. Como todo colorante es una sustancia txica; por lo que hay que emplear bajas concentraciones. Como colorantes vitales se utilizan el azul de metileno, el rojo congo, el verde Janus. La coloracin en vivo se puede hacer de dos maneras: 1. Por difusin: en el espacio entre portaobjetos y cubreobjetos de una preparacin en fresco, se pone una gota de colorante que penetra en la muestra por capilaridad. 2. Mezclando una gota de colorante con el material que ha de ser examinado en el portaobjetos y colocando luego el cubreobjetos.

ESTUDIO "IN VITRO".

Consiste en la observacin de clulas y tejidos muertos. Para ello se realizan una serie de pasos, corno son la fijacin, la inclusin, el corte (microtoma), la tincin y el montaje.

I.

Fijacin:
Mecanismo que consiste en matar a la clula lo ms rpidamente posible, para permitir que se mantengan las propiedades fisiolgicas y morfolgicas del organismo vivo. Los fijadores solidifican el coloide protoplasmtico mediante coagulacin o precipitacin, convirtindolo en un gel insoluble. La fijacin evita que el tejido se pudra y se desintegre, produciendo puentes entre protenas y diferentes materiales de los tejidos. 24 horas despus se proceder a la inclusin. Hay diferentes tipos de fijadores: - Fsicos: calor (hmedo o seco), fro (congelacin rpida). - Qumicos: segn la base fijadora: alcohol metlico, dicromato de potasio, formol 10% tamponado, etc. La muestra que va a ser fijada no debe tener ms de tres milmetros de espesor, porque, de lo contrario, el fijador, que penetra por difusin no actuara por igual en todas las clulas de la muestra. Adems, el lquido fijador debe exceder en 50:1 al de la muestra. Hay que tener en cuenta que los lquidos fijadores son voltiles y que el recipiente donde se vaya a dar la fijacin debe ser cerrado. Existe un tiempo adecuado de fijacin, que no debe excederse; una vez concluido, se lava la muestra para quitar el exceso de fijador. Adems de mantener las propiedades del objeto de estudio, los fijadores, dependiendo de los casos, pueden servir para endurecerlo o ablandarlo, o aumentar su afinidad tintorial.

II.

Inclusin

Para poder cortar la pieza sta debe tener una cierta consistencia. Para endurecerla, la incluimos en un material que llegue a todas las estructuras celulares. Esta debe ser una sustancia con plasticidad como la parafina., el colodin o la gelatina. La inclusin nos permite conservar la muestra durante largo tiempo. Lo ms corriente es utilizar la parafina: a) Deshidratacin: proceso necesario para que, a pesar de la insolubilidad de la parafina, sta pueda impregnar la pieza. Consiste en hacer pasar la muestra por una gradacin creciente de alcoholes. b) Aclaracin: se baa la pieza tres veces durante unos 30-40 minutos en un disolvente de la parafina, como el xilol, el benzol o el toluol. c) Impregnacin en parafina: Para evaporar el disolvente de la parafina y que sta pueda penetrar en la pieza, se la incluye en parafina fundida dos veces durante 5 horas cada vez. Para que la parafina est fundida debemos tenerla 24 horas a 56-60C d) Inclusin definitiva: La pieza se mete en parafina fundida depositada en moldes, normalmente en 'casquetes" de parafina, para que al enfriarse podamos obtener bloques de parafina que incluyen la pieza.

II Corte
La obtencin de cortes para estudios microscpicos se realiza mediante unos aparatos llamados. Hay de diferentes tipos que se eligen dependiendo de la textura del material que se ha de estudiar. Para cortes de clulas vegetales de un rgano duro se utiliza el micrtomo de mano o de Ranvier. Para el resto de rganos vegetales y para rganos animales se utiliza el micrtomo de rotacin o de Monot, o el de deslizamiento Se pueden obtener diferentes grosores de corte. Finos de 5-10 m de grosor. Los cortes de 0.5-5 m de grosor se realizan a partir de material incluido en plstico y no en parafina Los cortes obtenidos se planchan en la superficie de un bao Mara a 45C con un 55 de gelatina, y se presentan con el portaobjetos Tambin se pueden realizar cortes a partir de material no incluido en parafina mediante congelacin. Es muy rpida, slo permite cortes de 60-80 m de grosor Los cortes una vez obtenidos se tien para evitar que se sequen

IV Tincin
Para teir los cortes no deben tener parafina porque no penetrara el colorante. La parafina se elimina sumergiendo los cortes 15 minutos en xilol. Se elimina el xilol hacindolos pasar por alcohol absoluto, alcohol de 90, alcohol de 70 y agua destilada. Una vez eliminada la parafina, se procede a la tincin. Hay muchos tipos de tinciones: a) segn su origen -Naturales: proceden de animales o vegetales: eosina, carmn de cochinilla, etc. -Artificiales: proceden del carbn mineral. Son los que ms se utilizan. b) Segn su naturaleza: -cidos: tien lo bsico. Ejemplo: eosina -Bsicos: tien lo cido. Ejemplo: azul de metileno. -Neutros: tanto la parte aninica como la catinica son colorantes. Existen dos tipos de tcnicas de coloracin: -Vitales o en vivo: el colorante no provoca la muerte celular. Ejemplos: azul de metileno, rojo neutro. -Supravitales: los colorantes se aplican cuando el material ya ha muerto a causa de la fijacin. Hay tinciones que son bastante rutinarias y frecuentes, como la hematoxilina eosina en animal. El green-safranina en vegetal o el Gram para bacterias. Una vez teidos los cortes, se deshidratan para quitarles el agua y que sta no produzca cambios en la refringencia. Para ello se pasan los cortes por alcohol de gradacin creciente, hasta acabar en alcohol puro. Despus se aclaran con dos baos de xilol.

V. Montaje:
Hay varios tipos de montaje: o -Gota pendiente: ya explicado anteriormente. Se untan los bordes del cubreobjetos con vaselina para conseguir adherencia y que no se seque la muestra, si se va a observar durante ms de una hora. Extensin o frotis: Se extiende la gota sobre el portaobjetos con ayuda de otro portaobjetos, muy rpidamente para que no se d coagulacin. El lquido extendido se fija, colorea y monta de manera normal. Se suele utilizar en el estudio de sangre y de bacterias. Aplastamiento: es la tcnica ms comn. Los cortes se depositan en el portaobjetos, si no se

quiere conservar la preparacin, no aadiremos medio de montaje, slo pondremos el cubreobjetos, pero la preparacin no durara ms de una hora ya que su contenido lquido se evaporar por el calor emitido por el foco luminoso. Si la preparacin se quiere conservar, utilizaremos un buen medio de montaje que debe cumplir una serie de propiedades como tener un buen ndice de refraccin, un pH neutro, y un secado rpido. Tradicionalmente se ha venido utilizando el blsamo de Canad, que actualmente ha sido sustituido por resinas sintticas, como el Eulcitt. Gracias al medio de montaje, la preparacin se conservar durante mucho tiempo. Una vez aadida la gota de medio de montaje. Se cubre con el cubreobjetos y se espera a su secado.

VI Etiquetaje:
Las preparaciones deben etiquetarse, si es que se quieren conservar o se van a utilizar posteriormente. En la etiqueta se pone el nombre del material, la tcnica utilizada y la fecha de realizacin.

1. Vaso de precipitado. 2. Vidrio de reloj. 3. Esptula. 4. Abrazadera. 5. Gradilla para tubos de ensayo. 6. Probeta. 7. Bureta. 8. Pie o soporte de hierro. 9. Mechero Bunsen. 10. Tubo de ensayo. 11. Trpode. 12. Mortero. 13. Matraz de fondo curvo. 14. Embudo de filtro. 15. Matraz cnico o Erlenmeyer. 16. Varilla de agitacin. 17. Rejilla. 18. Matraz de fondo piano. 19. Termmetro. 20. Embudo de separacin. 21. Pipeta. 22. Capsula de porcelana. 23. Escobilla. 24. Cuentagotas.

Determinacin y observacin de principios inmediatos en alimentos Azcares reductores (tincin con reactivo de Fehling), Almidn (tincin con Lugol) Lpidos (tincin con Sudn II Protenas (reaccin de Biuret) Objetivos: Identificacin de principios inmediatos mediante ensayos simples de laboratorio Caracterizacin dos distintos tipos de molculas en funcin de sus propiedades qumicas Valorar a importancia das tcnicas de identificacin para detectar fraudes alimenticios

1.1

a) Identificacin de azcares reductores:

Material:

Tubos de ensayo Vaso de precipitados de 250 cc Pinzas Trpode Rejilla de amianto Dos pipetas Balanza Esptula

Productos qumicos:

Glucosa, sacarosa, almidn. CuS04 Tartrato sdico potsico KOH Lugol (6 g de yoduro de potasio en 100 cm3 de agua ms 2 g de yodo). NaOH al 20%. HCl al 10%. Papel indicador

Reaccin de Fehling

Generalmente las pruebas de un anlisis cualitativo se basan en la obtencin de compuestos coloreados que ponen de manifiesto la presencia de determinadas sustancias cuando reaccionan con ciertos reactivos. El reactivo utilizado con el fin de poner de manifiesto la capacidad reductora de un azcar se denomina licor de Fehling, y consiste en una mezcla de dos reactivos: el Fehling A (sulfato cprico) de color azul y el Fehling B (tartrato sdicopotsico) incoloro. Se procede de la siguiente manera

Preparacin del licor de Fehling LICOR DE FHELING. Solucin A Solucin B

CuS0 4 -------- 3,5 g Agua hasta 50 m1

Tartrato sdico potsico---- 1,8 g KOH-------------------------- 7,7 g Agua hasta 50 ml

Se mezclan volmenes iguales de A y B. _________________________________________________________________ Disponemos de lentejas de NaOH

Preparar una disolucin de NaOH al 10 %. Preparar una disolucin de HCl al 10 %.

Disponemos de cido clorhdrico al 37% y d = 1,18 g/cc ___________________________________________________________________________________

Jose Seijo Ramil

PRCTICAS

Protocolo

Preparamos, para utilizar todos, una disolucin de glucosa, otra de sacarosa y una tercera de almidn. Para ello disolvemos (35 g de cada sustancia en 100 cc de agua)

Tomamos 2 cc de cada una de las sustancias a investigar (glucosa, sacarosa y almidn) y las depositamos en tres tubos de ensayo, que marcamos y colocamos en la parte inferior de la gradilla. Las utilizaremos para comprobar su carcter reductor frente al licor de Fehling Tomamos 2 cc de cada una de las sustancias a investigar (glucosa, sacarosa y almidn) y las depositamos en tres tubos de ensayo, que marcamos y colocamos en la parte superior de la gradilla A continuacin se agrega 2 cc de lquido Fehling a cada una de las disoluciones de glucosa, sacarosa y almidn, de la parte inferior de la gradilla. Las disoluciones adoptarn entonces un color azul intenso. Se calientan suavemente los tubos de ensayo en la llama del mechero (procura que no entre en ebullicin pues el lquido saldra proyectado y podra quemar al que lo maneja y acompaantes). a. Si el azcar es reductor al cabo de unos instantes aparecer un precipitado de xido de cobre (I) de color rojo ladrillo. b. Los azcares no reductores como la sacarosa y los polisacridos (como el almidn) no dan positiva la reaccin de Fehling. En ausencia de sustancias reductoras, el hidrxido de cobre (I) de color azul se transforma en xido de cobre (II) de color negro En presencia de un agente reductor como es el caso de un monosacrido o disacrido que tiene un grupo carbonilo. El hidrxido de cobre (II) pasa a hidrxido de cobre (I).El hidrxido de cobre (I), pierde una molcula de agua y origina el xido de cobre (I) de color rojo ladrillo

Fundamento

: A los dos tubos de ensayo que contienen sustancias que no han reducido el reactivo de Fehling, aadir 1 cc de HCl al 10% para efectuar la hidrlisis de los enlaces glucosdicos : Calentar durante 15 minutos al bao mara Aadir hidrxido de sodio al 20% hasta que el medio se vuelva bsico (se comprueba mediante el papel indicador) Repetir la prueba Fehling

1.1 b) Almidn (tincin con Lugol)

Con los tres tubos de ensayo que nos quedan en la parte superior de la gradilla con glucosa, sacarosa y almidn, vamos a comprobar si forman un complejo azul oscuro con el yodo Para ello aadimos unas gotas de Lugol a los tres tubos. El que contiene almidn se tie con el yodo porque las molculas de yodo quedan atrapadas en la hlice de glucosas Entregar las respuestas a las siguientes cuestiones: 1) En qu se basa el empleo del licor de Fehling para caracterizar monosacridos? 2) Cmo nos permite o reactivo de Fehling distinguir entre los diferentes hidratos de carbono? 3) Podras mediante la reaccin de Fehling distinguir entre almidn y celulosa? 4) Si dispusieras de dos soluciones en dos tubos de ensayo, uno con glucosa y otro con sacarosa, pero sin etiquetar, cmo determinaras en el laboratorio la identidad de cada tubo? 5) Cmo demostraras no laboratorio el poder reductor dos glcidos? Indica el mtodo y el material. 6) Qu tipo de proceso tiene lugar en la tincin del almidn con Lugol?, es una reaccin qumica? Podras explicarlo? 7) Cmo podras investigar si una sustancia desconocida es una protena? 8) Por qu la reaccin de Biuret es positiva con las protenas y no con los aminocidos?
Jose Seijo Ramil

PRCTICAS

1.2: Reconocimiento de grasas

Tubos de ensayo Agua Aceite Sudn III

El Sudn III es un colorante especfico de grasas. Para prepararlo disolver un poco de Sudn II en polvo en alcohol de 70, hasta que la solucin quede saturada, luego se filtra Coloca 2 ml de aceite en un tubo de ensayo y aade 2 ml de agua. Apreciars que ambos lquidos no se mezclan, se producen dos fases: una superior de aceite y otra inferior de agua Aade unas gotas de Sudan III, agita y espera unos minutos. Observars que la fase superior, el aceite, aparece teida de rojo mientras que la inferior permanece incolora ____________________________________________________________________________________________

1.3: Reconocimiento de Protenas Reaccin de Biuret

Tubos de ensayo NaOH al 10% Cu SO4 Disolucin de clara de huevo (proporcin 1 a 6) Coloca 2 ml de la disolucin proteica en un tubo de ensayo Aade 2 ml de una disolucin de NaOH al 10% y agita. Aade 4 0 5 gotas de una disolucin de Cu SO4

Obtendrs una coloracin ail indicativa de la presencia de protenas El resultado se debe a una reaccin tpica de los enlaces peptdicos, en la cual los tomos de Cu se unen a los grupos amino, lo que provoca la coloracin rosaviolcea ____________________________________________________________________________________________

Jose Seijo Ramil

PRCTICAS

Estudio de la mitosis en la raz de cebolla: Tincin con fucsina cida y/o orcena
Objetivos:
Observacin de cromosomas y estudio de las etapas de la mitosis Adquirir experiencia en la utilizacin de tcnicas de procesamiento de tejidos para su estudio con microscopa ptica Conocer o manejo do microscopio ptico Conocer y manejar as unidades de medida das clulas Valorar a contribucin decisiva da microscopa al estudio y conocimiento de la clula

Procedimiento

Para observar la mitosis en clulas vegetales se utilizan tejidos meristemticos, en los que las clulas se multiplican constantemente, por lo que ser fcil "sorprender" algunas clulas en distintas fases mitticas. Observacin de la mitosis en el pice de la raz cebolla o de otros vegetales con bulbo. Como material biolgico, en la prctica se describe el procedimiento a partir de raicillas de cebolla, pero tambin se podran utilizar las races obtenidas a partir de otros bulbos (ajos, puerros, jacintos, tulipanes, etctera). Para conseguir races en crecimiento, se coloca el bulbo de cebolla (al que previamente se habrn eliminado las races secas) sobre un vaso de precipitados (si es necesario se sujeta mediante unos palillos). Se llena el vaso con agua hasta que toque superficialmente la zona donde van a crecer las raicillas. Al cabo de 2 o 3 das empezarn a crecer las races. Microscopio Vidrio de reloj Mechero Portaobjetos Portaobjetos Cubreobjetos Cubreobjetos Pinzas Vaso de precipitados Cuchilla o escalpelo Aguja enmangada Cebolla

cido clorhdrico 1 N

Elige una raz joven (de unos 2 cm.), lvala con agua y corta la punta a 5 mm del extremo. Coloca la punta de la raz en un vidrio de reloj. Para ablandar los tejidos e iniciar la tincin, se cubre la raz con orcena actica y clorhdrico 1 N en la proporcin de 9:1, es decir, 9 gotas de orcena por cada gota de HCl. (Orcena A) La hidrlisis debe hacerse en caliente, a unos 60 C. Para ello, calienta el vidrio de reloj a la llama del mechero, justo hasta que empiecen a desprenderse tenues vapores, teniendo mucho cuidado de que no hierva (al retirar el vidrio no debe quemar la mano). Retralo para que se enfre durante 8 minutos y repite esta operacin 3 veces, aadiendo ms orcena si hiciera falta, de modo que el lquido cubra en todo momento la punta de la raz.5. Saca la raicilla con la aguja enmangada y colcala sobre el portaobjetos. Con la cuchilla corta el pice a unos 2 mm. El resto se descarta ya que las clulas meristemticas se encuentran en el extremo, bajo la cofia. Aade una gota de cido actico al 45% (orcena B) para terminar de ablandar los tejidos. Limpia con papel de filtro los posibles residuos del colorante. PRCTICAS

Jose Seijo Ramil

 Coloca el cubreobjetos y realiza un squash o aplastamiento. Para ello sita la preparacin en un papel de filtro doblado y presiona con el dedo pulgar para aplastar el tejido y eliminar el exceso de colorante. Si al retirar el papel de filtro se ve que la muestra no queda suficientemente aplastada, se puede presionar el cubre en la zona donde est la raicilla con la parte posterior de la aguja enmangada. En cualquier caso hay que evitar que el cubreobjetos se deslice sobre el portaobjetos en el curso de la presin, y se debe conseguir una monocapa de clulas a travs de la que pase la luz. Observar al microscopio. Al principio con un aumento pequeo, para localizar las clulas meristemticas mejor teidas y en un solo plano. Luego, con mayor aumento, tratar de identificar clulas en cada una de las fases mitticas.

Contestar a las siguientes cuestiones

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Por qu escogemos para el estudio de la mitosis races de cebolla? Podramos escoger fragmentos de hoja? Podemos observar en mitosis de races de cebolla el huso acromtico?, por qu? En qu momento de la mitosis se identifican mejor los cromosomas para su recuento? Sobre un esquema de un microscopio identificar cada una de las partes indicando su funcin Cmo se calcula el nmero de aumentos? Qu es el poder de resolucin de un microscopio? Por qu a preparacin a observar en un microscopio tiene que ser muy fina? Para qu se utilizan los colorantes? Por qu se utilizan diferentes colorantes segn la preparacin a observar? Sobre micrografas identificar algn orgnulo celular, alguna/s fase de la mitosis, o identificar si se trata de una clula animal o vegetal PRCTICAS 7

Jose Seijo Ramil

OBSERVACIN DE BACTERIAS (TINCIN GRAM) Objetivos:

Utilizacin de tcnicas sencillas para la observacin de microorganismos Conocer el manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias (importancia del objetivo de inmersin) Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer comparaciones entre tamaos de procariotas y de eucariotas Reconocer los distintos modelos de la pared bacteriana

MATERIALES Microscopio Aceite de inmersin Cubeta de tinciones Frasco lavador Safranina al 0,5% Cristal violeta al 1% Solucin diluida de yodo (lugol) Alcoholacetona 1:1 o alcohol 95 TCNICA Preparar los frotis bacterianos. Teir con cristal violeta 1 min. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol 1 min. Lavar con agua el exceso de Lugol. Decolorar con alcoholacetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30 seg.) Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. Teir con safranina 1 min. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparacin. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin. FUNDAMENTO Esta tincin fue desarrollada empricamente por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificacin bacteriana.
Jose Seijo Ramil

PRCTICAS

La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas (G+) y Gram negativas (G). La tincin de Gram requiere cuatro soluciones: 1: Primer colorante: E s un colorante bsico que en contacto con las negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta. clulas cargadas

2: Solucin mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como por ejemplo el Lugol. 3: Agente decolorante: es un disolvente orgnico, por ejemplo alcoholacetona (1:1). 4: Colorante de contraste: Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo la safranina o la fucsina. _______________________________________________________________________________________________ Los dos grupos bacterianos que distingue esta tcnica difieren en el color con el que finalmente adquieren. Las bacterias Gram + se teirn de azul por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram perdern la coloracin inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la safranina. ______________________________________________________________________________________________ La diferencia est determinada por la composicin de su envoltura celular. Las Gram + poseen una malla de peptidoglicano en su parte ms externa, mientras que las Gram, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la clula. ______________________________________________________________________________________________ Una de las precauciones al realizar esta tincin es la de trabajar con cultivos en fase exponencial. De lo contrario se pueden obtener resultados falsos. P.ej. las bacterias Gram + en fase estacionaria pueden aparecer como Gram.

Jose Seijo Ramil

PRCTICAS

Extraccin de ADN

Extraccin do DNA de los guisantes

Aprender tcnicas sencillas de extraccin de molculas de ADN de un tejido Identificar a estructura fibrilar do ADN . Existen en: http://www.dnaftb.org/dnaftb/29/concept/index.html MATERIAL Guisantes Detergente lavavajillas Sal (NaCl) Agua destilada Lquido para limpiar lentillas o bien un ablandador de carne Alcohol de 96 Agua destilada Probeta de 250 cc Batidora Microscopio Mezcla en un frasco de batidora 400 g de guisantes con 200 ml de agua destilada y aade 3 cucharadas de detergente de lavavajillas y una de sal. Bate bien y filtra el lquido obtenido (sirve un colador metlico de los que tiene en casa) Pasarlo seguidamente a una probeta. Aade un chorro de lquido para limpiar lentillas y mezcla bien todo. Aade 50 ml de alcohol muy cuidadosamente, hacindolo resbalar por las paredes del vaso para que no se mezcle con el filtrado y forme una capa sobre l separada por densidad

MTODO

Deja reposar durante unos minutos. Se ver que va subiendo y se va mezclando con el alcohol una maraa de hilos blancos que corresponde al ADN de los guisantes. Con un objetivo de mximo aumento observa un fragmento de esos hilos. El DNA debe verse como unos hilos delgados y separados

_______________________________________________________________

La solucin de lavavajillas y la sal ms la accin de la batidora es capaz de romper la pared celular y las membranas plasmtica y nuclear. El lquido limpialentillas contribuye a eliminar las protenas que puedan contaminar al ADN. El alcohol separa el ADN que es soluble en agua. _____________________________________________________________________________________________

Contestar a las siguientes cuestiones:

______________________________________________________________

1. Por qu al aadir sal a un homogeneizado se rompen las membranas celulares? 2. Se no se eliminan las protenas, se puede ver tambin a estructura fibrilar del ADN?, por qu?

Jose Seijo Ramil

PRCTICAS

10

Observacin de vdeos animados sobre el proceso de sntesis proteica

Objetivos: Caracterizar los distintos tipos de ARN y diferenciarlos del ADN Resaltar la importancia de la complementariedad de bases y del cdigo gentico en la sntesis proteica Representar e l flujo de informacin desde una determinada secuencia de bases del ADN a secuencia de aminocidos de una protena Facilitar el estudio y la comprensin terica del proceso de traduccin Ver ejemplos de los distintos tipos de mutaciones que afectan a la secuencia de bases del ADN y demostrar los efectos sobre la protena traducida

En Internet http://www.biostudio.com/case_freeman_protein_synthesis.html http://www.dnaftb.org/dnaftb/22/concept/index.html

Contestar a las siguientes cuestiones:

Con ayuda de una tabla con el cdigo gentico, establecer los pasos que conducirn a la sntesis de un determinado pptido. Qu efecto tendra la insercin, la sustitucin y una delecin de un nucletido en la cadena del ADN que se transcribe? Con ayuda de una tabla con el cdigo gentico, escribir todas las secuencias posibles de ADN que codifiquen para a sntesis de un determinado polipptido. Por qu pueden existir varias secuencias? El nmero de ARN transferentes es igual, mayor o menor que 20? Justificar la respuesta. Enumera los compuestos y estructuras que intervienen en la sntesis proteica, indicando el papel de cada uno en el proceso. Qu se forma al final?

Jose Seijo Ramil

PRCTICAS

11

Observacin de modelos tridimensionales de azcares, lpidos, protenas y cidos nucleicos

Objetivos:

Facilitar la comprensin de la configuracin espacial de stas molculas Agilizar la comprensin terica del desarrollo de las macromolculas Reconocer y diferenciar representaciones sencillas (tridimensionales y planas) de las diferentes biomolculas Explicar la relacin estructurafuncin de las biomolculas. Es de destacar que la funcionalidad de las protenas y de los cidos nucleicos depende de su estructura tridimensional Caracterizar la estructura secundaria del ADN Utilizar el modelo tridimensional do ADN para explicar su replicacin

Direcciones de Internet con imgenes de estas molculas

______________________________________________________________
Conteste a las siguientes cuestiones:
Por qu o almidn, a celulosa y el glucgeno son polisacridos diferentes se todos estn formados por molculas de D-glucopiranosa? Qu diferencias existen a nivel de la estructura molecular entre un lpido saponificable y otro que no lo es? Qu diferencias tridimensionales existen entre los cidos grasos saturados e insaturados con el mismo nmero de tomos de carbono? Qu diferencias hay entre as alfa-hlices y las lminas plegadas de la estructura secundaria de las protenas? A qu se deben las distintas estructuras de las protenas? Hacia dnde quedan dirigidos los puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas en la estructura secundaria del ADN? Qu molculas forman el esqueleto del ADN y cules las cadenas laterales? Qu ventajas supone para la uniformidad y estabilidad de las dos cadenas del ADN que siempre se unan una base prica con otra pirimidnica? Causara algn problema a unin entre dos bases pricas o entre dos pirimidnicas?

http://www.bioxeo.com http://www.ehu.es/biomoleculas/AN/an4.htm

Jose Seijo Ramil

PRCTICAS

12