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Luis Cofre Garcia

Digitally signed by Luis Cofre Garcia DN: cn=Luis Cofre Garcia, o=UNMSM, ou=Seccion Epidemiologia, c=PE Date: 2005.07.16 15:02:55 Z

NUEVOS METODOS PARA LA DETECCION DE TB-MDR

Luis Asencios Sols, Mg. SP

Laboratorio Referencia Nacional de Micobacterias CNSP/INS lasencios@ins.gob.pe

Cmo se produce la resistencia?

u

El mecanismo resistencia es exposicin de medicamentos

de aparici n independiente la bacteria

de la de la a los

En M. tuberculosis , la origina por mutacin.

resistencia se

FRECUENCIA DE MUTANTES DROGO-RESISTENTES

ISONIACIDA RIFAMPICINA ESTREPTOMICINA PYRAZINAMIDA ETHAMBUTOL INH - RFP

6 1 x 10 6 bacilos. 8 1 x 10 8 bacilos. 7 1 x 10 7 bacilos. 6 1 x 10 6 bacilos. 5 1 x 10 5 bacilos. 14 1 x 10 14 bacilos.

TIPOS DE RESISTENCIA CLINICA

Resistencia Primaria (RP) Resistencia Adquirida (RA)

CAUSAS DE RESISTENCIA ADQUIRIDA

Prescripcin de esquemas de tratamiento Prescripcin

inadecuados

No seguir r gimen recomendado rgimen Irregularidad

medicamentos

en

la

ingesti n ingestin

de

Intolerancia a drogas. Resistencia inicial a las drogas

administradas.

Suspensin prematura del tratamiento. Suspensin

Drogas Antituberculosas
u

Drogas primera lnea

(H) (SM) (E) (R) (Z)

Drogas 2da. Lnea

Isoniacida Estreptomicina Ethambutol Rifampicina Pyrazinamida

Ethionamida ( ETH) Kanamicina (KM) PAS Capriomicina (CAP) Ciprofloxacina (CPR) Cicloserina (CS) Ofloxacina (OFLOX)

SITIOS DE ACCION
INH SM: EMB

: Acta sobre s ntesis de cidos mic licos Acta sntesis cidos miclicos RFP: Act a sobre s ntesis de ARN polimerasa Acta sntesis Acta sobre s ntesis de protenas Acta sntesis protenas ribosomales : Acta sobre s ntesis de Acta sntesis polisacridos de la pared celular polisacridos
PZA: A n An

no se conoce el lugar de accin accin

Importancia de la prueba de sensibilidad

u

Estudios Epidemiolgicos: Prevalencia Prevalencia de de resistencia resistencia primaria adquirida

Clnica Individual (fracaso o recada)

Guiar la eleccin de regmenes de quimioterapia (perfil de sensibilidad para elegir la continuacin del tratamiento)
u

IMPORTANCIA CLINICA DE LAS PS

Decisiones de tratamientos adecuados Reducci n de morbilidad y mortalidad Reduce: -Los costos de atencin de la salud

-El costo de que se siga trasmitiendo la enfermedad

Indicaciones de la prueba de sensibilidad

Sospecha de fracaso Recadas tempranas Contactos de TB-MDR VIH Trabajador de salud TB infantil

TCNICAS PARA LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD

Mtodo de las Proporciones (convencional) Mtodo de proporcin en placas Mtodo Radiomtrico (Bactec 460 TB) Mtodo Griess Mtodo MTT

Mtodo de las Proporciones

Esta tcnica consiste en medir la proporci n de bacilos resistentes que existen en una cepa.
uConcentracin

precisa de cada droga que debe contener el medio, para inhibir la poblacin salvaje.

crtica: Es la cantidad

uProporcin

de mutantes resistentes de una poblacin bacilar por encima de la cual la cepa es considerada resistente

Crtica : Es la proporcin

Procedimientos del Mtodo de las Proporciones

Mtodo

partir de la muestra clnica.

Directo: Se realiza a

Mtodo

partir de aislamientos primarios

Indirecto: se realiza a

Prueba de Susceptibilidad Indirecta

Mtodo Directo Ventajas

Los resultados se informan dentro de las 3 semanas desde el momento en que se ejecuta la prueba. La proporcin de bacterias resistentes representa mejor la poblaci n bacteriana del paciente. Costos

Mtodo Directo Desventajas

Difcil de calibrar con exactitud el in culo, puede resultar en un crecimiento excesivo o insuficiente. Posible contaminacin de la prueba y no se puede interpretar los resultados Los resultados son vlidos solo si el cultivo es puro

Mtodo INDIRECTO Ventajas

Es ms probable obtener el inculo calibrado en forma apropiado, que en la prueba directa.

Es menos probable la contaminacin

Mtodo Indirecto Desventajas

El subcultivo puede ocasionalmente alterar la proporcin de mutantes resistentes a los medicamentos lo que resulta en una interpretacin inexacta de medicamento sensible. El tiempo de demora de obtencin de los resultados es mayor que de la prueba directa.

Mtodo de proporcin de placa

1. Se compara el nmero de colonias que crecen en un medio que contiene medicamentos con el nmero que crece en un medio sin medicamentos. 2. Determina el porcentaje de organismos resistentes en una poblacin bacteriana.

Factores que afectan los resultados de la prueba

1. Medio 2. Estabilidad del medicamento 3. Inculo 4. Incubacin

Mtodo Radiomtrico (Bactec 460 TB)

Mtodo BACTEC 460 TB

Esta tcnica que mide cuantitativamente

14CO 2

producido durante el metabolismo del

14C

substrato marcado con

presente en el

medio en una escala de 0 a 999.

TEST SENSIBILIDAD S.I.R.E

0.1 mL 9.9 mL Dil = 1/100 0.1 mL 12 B CONTROL 37 C MINIMO 4 DIAS LECTURA DIARIA EN BACTEC 460 TB MAXIMO 12 DIAS GI 30 CULTIVO 12B GI = 300 - 500 0.1 mL

S 12 B

12 B 12 B 12 B

BACTEC 460 TB ventajas

La lectura es automatizada. Obtencin de resultados (7 a 10 das) son m s rpidos que los mtodos convencionales

BACTEC 460 TB desventajas

Costo Uso de elemento radioactivo. No se puede observar las caractersticas de las colonias, pigmentacin en comparacin con los medios slidos. Cultivo contaminado o mezcla puede dar resultados errneos.

Mtodo Griess
Se basa en la determinacin de la actividad de reduccin de nitrato en el cultivo de M. tuberculosis en medio slido L-J conteniendo NaN03 (1 g/l) con y sin droga

Cepa M. tuberculosis H37Rv, sensible a las cuatro drogas estudiadas.

C INH SM EMB RMP

Cepa M. tuberculosis resistente a INH y sensible al resto de las drogas.

C INH RMP

INH

RMP

Cepa M. tuberculosis resistente a INH - RMP .

Interpretacin
El reactivo de Griess (HCl+ sulfanilamida + n-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride).

Lectura Resultado negativo: Sensible (no se observa cambio de color) Resultado positivo: Resistente (se observa cambio de color de rojo o violeta intenso)

Mtodo MTT
3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil -2-tetrazolio

Es una tcnica para la determinacin de la resistencia a drogas. El MTT, es un reactivo de xido-reduccin, que bajo condiciones de reduccin como las generadas durante la actividad metablica bacteriana cambia de color amarillo a violeta al incorporar el reactivo MTT a los pocillos de la placa. Este sistema permite la determinacin de la concentracin inhibitoria mnima para cada droga antituberculosa.

ESQUEMA DE LA PLACA DEL MTODO COLORIMTRICO.

Concentraciones de las drogas de 1ra lnea. INH: SM: EMB: RIF: 1 g/ml 8 g/ml 32 g/ml 2 g/ml

Nuevos mtodos de susceptibilidad a drogas

Revelado de placa con MTT al 6to. Da de proceso

INTERPRETACIN
Las micobacterias metablicamnete activas, producen la reduccin del compuesto dando como resultado el cambio de color a violeta.

Las bacterias no viables o inhibidas por los antibiticos, no inducirn el cambio de color, permaneciendo el colorante en su forma oxidada, es decir, amarilla.

MUCHAS GRACIAS