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Universidad de La Sabana Asignatura Biologa General Programa de Ingeniera Qumica Semestre I 2013 Docente Jorge Cortzar

LABORATORIO No 1 Observacin de clulas al microscopio

OBJETIVO Identificar las diferencias morfolgicas de clulas de diversos organismos. FUNDAMENTO DE LA PRCTICA El Microscopio El microscopio es un instrumento ptico que permite observar seres o estructuras que no se pueden percibir a simple vista. Hay diversas clases de microscopio, como el

microscopio simple o lupa, el microscopio compuesto, el microscopio de luz ultravioleta, el microscopio electrnico, el microscopio de contraste de fases, el microscopio de polarizacin y otros

El microscopio compuesto es el principal instrumento de todos los utilizados en el estudio de los organismos vivientes. Tiene dos sistemas de lentes: objetivo y ocular. Para la biotecnologa es indispensable identificar tanto en investigacin, como control de calidad del proceso y el producto las clulas presentes en cada etapa, su morfologa y su pureza; y el simple hecho de identificar en el microscopio las diversas estructuras celulares puede ahorrar tiempo en la toma de decisiones con respecto a otras metodologas como los cultivos en medios de cultivo especficos.

PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO: esencialmente las mismas

Al estudiar el diagrama tenga en

cuenta que su microscopio puede ser distinto al que se muestra. Las partes son

Partes mecnicas. La base tiene forma de U, sirve para darle estabilidad al instrumento. El brazo sirve para transportarlo y soportar algunas piezas como el tornillo macromtrico (para enfoque aproximado) y el tornillo micromtrico (para enfoque de precisin). A veces estos tornillos estn acoplados en uno solo. La platina es una placa metlica con una perforacin central sobre ella se coloca la preparacin que se va a observar. Generalmente posee un par de pinzas para sostener la lmina y un sistema mecnico denominado carro, para mover la preparacin de derecha a izquierda y de adelante hacia atrs. A veces posee dos escalas que permiten fijar una determinada estructura en la preparacin observada. El tubo ptico tiene como funcin soportar los oculares.

El revolver o porta objetivo se encuentra en la parte inferior del tubo ptico y en el se encuentran los objetivos. El condensador: se encuentra debajo de la platina y su funcin es la de soportar las lentes que recogen los rayos luminosos. Espejo: tiene dos caras una plana y otra cncava. La segunda se usa solo cuando el microscopio no tiene condensador. Partes pticas. El objetivo es el lente mas importante del microscopio la que controla el aumento posible y la claridad de la imagen. Todos los objetivos se acoplan a los microscopios mediante roscas estndar y pueden ser cambiadas de un microscopio a otro independientemente de su marca. Los aumentos mas utilizados son: 5X,10X,20X,40X y 100X. Si examinamos un objetivo observamos que hay cifras grabadas por ejemplo: 40X / 0,70:160/ 0,17 en donde: 40X es el aumento del objetivo y 0,70 es la abertura numrica, es decir la medida del tamao del cono de luz que el objetivo puede admitir, 160 es la longitud en mm del tubo ocular que debe ser utilizado con ese objetivo, 0,17 es el espesor del cubre objeto(en mm) que debe utilizarse con ese objetivo. El ocular se compone de dos lentes. La lente inferior recoge la imagen del

objetivo, la reduce y la reforma dentro del ocular a nivel del limitador del campo visual. La lente superior forma una imagen virtual aumentada para ser vista. El aumento de los oculares oscila normalmente entre X5 y X15. El condensador es la lente que ilumina la lente del objetivo, su abertura numrica debe ser suficientemente alta para suministrar el cono de luz requerido. En la parte inferior del condensador hay una abertura regulable, o diafragma-iris controlado por una palanca lateral. Hay tambin un anillo para alojar filtros coloreados o de luz natural.

Tincin de Gram La tincin de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaos, morfologas celulares y reaccin Gram (color). A nivel del laboratorio es til como test para un rpido diagnstico presuntivo de agentes infecciosos, control de calidad de procesos tanto en muestras como en cultivos en crecimiento. Las bacterias se tien

gram positivas (+), gram negativas () o no se tien debido a sus diferencias en la composicin de su pared y arquitectura celular.

Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de pptidoglucano y gran cantidad de cidos teicicos que no son afectados por la decoloracin con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con yodo y visualizndose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular est intacta o daada (por tratamientos antibiticos, edad celular).

Las bacterias gram () tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por molculas de lipopolisacridos. Esta membrana externa es daada por el alcohol y/o acetona de la decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante.

Clsicamente los reactivos utilizados para la realizacin de la tincin de Gram han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solucin de lugol para acomplejar a ste, el alcohol y/o acetona para la decoloracin y la safranina o fucsina bsica como contracolorante.

Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realizacin, a saber: Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solucin de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso.

La estabilidad de la solucin de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina bsica es de 1 ao y la de la solucin de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en frascos cerrados (la evaporacin puede alterar su efectividad) a temperatura ambiente.

Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretacin microscpica de la tincin, como son la preparacin de extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados, sobrecalentamiento en la fijacin y excesivos lavados durante la tincin. Todos los anteriores son causas comunes de pobres resultados en la tincin de Gram.

Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tincin pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero presentes consiguen ser recuperados en el cultivo. Tincin simple En el caso de levaduras y mohos un solo colorante como el azul de metileno o azul de lactofenol permite dar el suficiente contraste en el microscopio para definir su morfologa e identificar ciertas estructuras presentes. En el caso de clulas vegetales o animales el caso es similar y se emplean sustancias como el lugol y azul de metileno.

MATERIALES Y REACTIVOS Microscopio. Portaobjetos y cubreobjetos Asa bacteriolgica Agua destilada estril o solucin salina estril. Asa recta Cuchilla Palillos Mechero Frasco lavador Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina o fucsina Azul de metileno Azul de lactofenol Escherichia coli, Staphylococcus sp, Bacillus sp. Aspergillus sp o Penicillium sp. Agua de florero, estancada o similar.

METODOLOGA

1. Preparacin de materiales: los materiales a estudiar, se colocan en una lmina de vidrio llamada portaobjetos o lmina.

Generalmente, se cubre el material que se encuentra sobre el portaobjetos con un vidrio muy delgado de forma circular o cuadrada, llamado laminilla o cubre objetos. Tanto el porta como el cubre objetos deben de estar pticamente limpios.

2. Enfoque del microscopio: coloque la preparacin anterior sobre la platina en tal forma que el cuadrito de papel quede encima de la abertura y luego fije la lamina mediante las pinzas que hay en la platina.

Haga rotar el revlver, ponga el objetivo de 10x en posicin, y al mismo tiempo que observa el microscopio lateralmente haga descender el tubo, usando el tornillo macromtrico hasta que el objetivo de 10x (menor aumento) a un par de milmetros de la laminilla o hasta que lo impida el tope que tienen algunos microscopios.

Nunca haga bajar el tubo del microscopio sin observar su descenso. Si lo hace corre el riesgo de romper el objetivo, la laminilla y la lmina destruyendo una preparacin que quizs sea irremplazable y a su vez causar daos graves al objetivo.

Este en uno de los peores errores que usted puede cometer al manejar el microscopio.

Es importante tener en cuenta que siempre que se haga una observacin al microscopio debe usarse en primer lugar el objetivo de menor aumento. Segn el microscopio puede ser el de 4x o 10x.

Devuelva lentamente el tubo del microscopio con el tornillo macromtrico mientras observa por el ocular hasta visualizar la imagen. Aclrela con el tornillo micromtrico hasta obtener la mejor imagen posible. Haga los ajustes necesarios con el diafragma y el condensador para obtener una iluminacin adecuada.

Tincin de Gram Tomar con la punta del asa bacteriolgica una pequea parte de una colonia del cultivo bacteriano. E. coli, Staphylococcus y Bacillus. Previamente sobre el portaobjetos colocar una gota de agua a solucin salina esteril.

La experiencia permite enfocar de forma rpida con el objetivo de 100 x pero en la prctica se recomienda enfocar de forma progresiva con los diversos objetivos. Observacin de levaduras 1. Se fija suavemente a la llama un porcin de colonia de Saccharomyces cerevisiae 2. Se tie con azul de metileno durante 15 minutos.

3. Se lava con agua corriente. 4. Se seca el porta cuidadosamente con papel a se deja secar al ambiente 5. Observacin al microscopio Observacin de hongos filamentosos (mohos) 1. Se toma un fragmento del cultivo del hongo Aspergillus sp o Penicillium sp con un asa recta o se toma con cinta transparente una impresin del cultivo 2. Se adiciona una gota de azul de lactofenol sobre el fragmento del hongo y se observa al microscopio, en el caso de emplear la cinta esta se coloca sobre la gota de azul de lactofenol, la impresin debe quedar hacia abajo. 3. Se retira el exceso de azul de lactofenol. 4. Se observa al microscopio. Observacin de Protozoos y/o algas 1. De agua estancada, puede ser de florero, acuario o charca se toma una gota. 2. Se ubica sobre el portaobjetos la gota y se cubre con el cubreobjetos. 3. Se observa al microscopio. Observacin de Clulas de epidermis de cebolla

Corte un bulbo de cebolla. Se observa se separa por si sola en capas llamadas catfilos. Tome uno de estos catfilos con la superficie cncava hacia usted y rmpala, entonces vera que se desprende con facilidad una capa muy delgada y transparente que es la epidermis.

1. Tome un fragmento de epidermis y colquelo en un portaobjetos con una gota de agua de modo que la superficie que estaba en contacto con el catfilo quede hacia arriba. Coloque sobre l un cubreobjetos. Dibuje bajo el campo de observacin de 40x

2. Ahora saque la preparacin del microscopio y coloque una gota de lugol en el borde del cubreobjeto para que la solucin penetre por difusin. sobrenadante con papel toalla. Extraiga el lquido

Dibuje bajo el campo de observacin de 40x

identificando las estructuras celulares observadas Observacin de clulas epiteliales de la mucosa bucal humana. 1. Tomar un portaobjetos y un cubreobjetos bien limpios y secos. 2. Tirando del labio inferior hacia fuera, raspar la parte interna del mismo con el borde del portaobjetos o con el palillo. 3. Colocar una gota de agua en el centro de otro portaobjetos 4. Con un palillo , extender la mucosa extrada y dispersarla en la gota de agua. A esto se

le llama realizar un frotis. 5. Teir las preparaciones con una gota de azul de metileno. 6. Colocar el cubreobjetos 7. Observar al microscopio, enfocando progresivamente con los objetivos de mayor aumento. BIBLIOGRAFA DIAGNSTICO MICROBIOLGICO. TEXTO Y ATLAS COLOR. Koneman Allen., Dowell Sommers. Editorial Mdica Panamericana. 2 Reimpresin. 1990. LABORATORIO DE BIOLOGA VEGETAL Y ECOLOGA. Correa Lisbeth. Facultad de Ingeniera . Universidad del Valle.2004. BROCK BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS. Madigan Michael, Martinco Jhon, Parker Jack. Pretince Hall. 10ma edicin.2005.

http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/practi/microbi4.htm
http://www.telefonica.net/web2/carlosmartinezanton/pdf/7.%20Hongos%20y%20levaduras.pdf