Professional Documents
Culture Documents
nite FERMANTASYON YNTEMLER ve LEK BYTME Mikrobiyal Byme Kinetikleri: Biyoteknolojide fermantasyonlar kesikli (batch), kesikli beslemeli (fed-batch) veya srekli (continous) yntemlerle yrtlmektedir. Kesikli Fermantasyon: Kesikli fermantrler kapal sistemler olarak dnlebilir. Ticari olarak penisilin ve bira retiminde kullanlr. Kesikli sistemlerde fermantasyon ortam hazrlanr ve mikroorganizma alanr. Sistemin pH, scaklk ve dier deerleri ayarlandktan sonra ortama yeni substrat veya mikroorganizma ilavesi olmaz. Fermantasyon, ortamdaki besin elementleri tkeninceye kadar veya evresel koullarda gzlemlenen deiikliklere gre sonlandrlr. Fermantasyon boyunca fermantre oksijen, kpk nleyici ve pH ayar iin ilave edilen asit ve bazlar hari herhangi bir madde ilave edilmez. Kltr ortam, biyomas ve metabolit konsantrasyonu hcre metabolizmasnn bir sonucu olarak srekli olarak deiiklik gsterir. Kesikli fermantasyonda steril besiyerine inokule edildikten sonra, uygun koullar altnda inkbasyona braklan mikroorganizmada drt temel byme faz grlr. ekil 4.1.
ekil 4.1. Kesikli kltrde hcre bymesinin kinetii. Lag Faz: Sterilize edilmi byme ortamna a kltrnn ilavesinden hemen sonra lag faz boyunca mikroorganizma saysnda art olmaz. Lag fazn uzunluu veya ksal hcrelerin inokulum ncesi hangi fazda olduklarna baldr. Hcrelerin inokulum ortam ile fermantasyon ortam arasnda farklla gre de bu sre uzun veya ksa olabilir. Log Faz: Lag fazn sonunda hcre yeni kltr ortamna adapte olmu olarak hzla remeye balar. Hcre ktlesi bu aamada hzla artar. Hcre says logaritmik olarak
artarken, kltrn spesifik byme hz sabit kalmaktadr. Spesifik byme hz matematiksel olarak ifade edilebilmekte ve baz tahminler yaplabilmektedir. yle ki: Biyomasn konsantrasyonu, X (mg/L) substratn biyomas tarafndan kullanlmasyla zamana bal olarak artar.
= spesifik byme hz sabiti olup substrat konsantrasyonu (S) nun fonksiyonudur. Byme orann tanmlayan iki sabit kullanlmaktadr. m (mg/L) Maksimum byme hz olup substrat konsantrasyonunda herhangi bir snrlama olmad durumlarda elde edilen deerdir. Ks sabiti ise = m/2 olduu zaman Substrat konsantrasyonudur (ktle /hacim) ekil 4.2.
Monod Eitlii
Bu eitlikte Ks maksimum byme orannn yarsna ulald anda (=0,5 max) elde edilen substrat konsantrasyonudur. Monod eitliinde, ortamda bol miktarda substrat varsa =
m
faznda maksimum byme oranna sahip olacaktr. Eer substrat bileenlerinden her hangi biri tkenirse ve dier bileenler hala mevcutsa bu durumda mikroorganizma kalan substratlara gre ikinci bir log faz yaayacak ve buna bal ikinci bir deerine sahip olacaktr. Bu durumda monod eitliini geniletmek gerekir. Ks deeri genellikle ok dktr. rnein E. colide glikoz iin 1,0mg/l, triptofan iin1,1 mg/l olarak llmtr. Maksimum spesifik byme hz sabitinin endstriyel nemi ok byktr.
m
Monod denkleminin geerli olmad durumlar da vardr. rnein mikroorganizma kompleks besin ortamlarnda oaltlrsa genellikle birden fazla log faz grlebilir. Bu fazlarn ayrm mikroorganizmann katabolik represyonu na dayanr. Mikroorganizma kolay kullanabilecei (genellikle glikoz) ekeri paralamak iin enzimlerini sentezlerken dier kayna kullanacak enzimlerin retimini basklar.
Durgun Faz: Bu fazda ortamdaki karbon kayna gibi kritik bir maddenin tkenmesi veya metabolik son rnlerin birikmesi ile hcre ktlesindeki hzl art durmakta ve hcre durgun faza girmektedir. Bu fazda net byme gzlenmez, biyomas miktar sabit kalr. Bu faz biyoteknolojide baz rnlerin eldesinde nemlidir. nk sekonder metabolitlerin sentezi bu dnemde yaplmaktadr. r. Antibiyotikler
lm Faz: Hcrenin enerji rezervlerinin tamamen tkendii ve metabolik aktivitenin durduu dnemdir. Ticari ilemlerde lm faznn hibir deeri yoktur. Bu aamaya gelir gelmez fermantasyon kesilir. Kesikli Beslemeli (Fed-Batch) Fermantasyon: Kesikli beslemeli fermantrler kesikli ve srekli sistemlerin avantajlarn beraberce tad iin endstride yaygn olarak kullanlrlar. (Penisilin retiminde) Katabolik represyona ak olan substratlarn sisteme kontroll verilmesine olanak tanyan bir yntemdir. ekil 4.3 de tipik bir kesikli beslemeli proseste biyomasn zamana bal olarak deiimi gsterilmitir.
ekil 4.3. Kesikli beslemeli proseste biyomasn zamana bal olarak deiimi. Proses balangta kesikli olarak balar. Besin elementleri tkenmeye balaynca substrat, fermantasyon srasnda eitli zamanlarda azar azar ortama ilave edilir. lave besin eklenmesi hem logaritmik hem de durgun faz srasnda yaplr. Bu hem biyomas hem de sekonder metabolit miktarnn protein artmasna retiminde neden kesikli olur. zellikle rekombinant tipi mikrorganizmalardan beslemeli fermantasyon
benimsenmektedir. Ancak kritik neme sahip besin elementinin konsantrasyonu ok iyi takip edilmelidir. Balangta fermantre konan substratn mmkn olduu kadar konsantre olmas istenir. Bylece reaktr hacminin neden oluu problemler de alm olur. Kesikli beslemeli fermantasyonun en nemli avantaj hem reaksiyon orannn hem de metabolik reaksiyon hznn substratn ilave oranna gre kontrol edilebilmesidir. Oksijen transferi ve
Srekli (Continuous) Fermantasyon: Ak sistemlerdir. Bu sistemde steril besin biyoreaktre ilave edilirken, eit miktarda rn ve onunla birlikte mikroorganizma sistemden alnr (ekil 4.4).
ekil 4.4. Srekli fermantrn genel yaps rnn alm srasnda kaybedilen mikroorganizmalar, reaktrdeki hcre blnmesiyle dengelenir. Srekli fermantasyon ynteminde iki temel uygulama vardr. Homojen karmn saland biyoreaktrler ve tapa akl reaktrler. Homojen karmn saland reaktrlerde kemostat veya trbidostat olarak alabilir. Kemostat sisteminde fermantasyonunun kararll substratlardan bir tanesinin konsantrasyonu ayarlanarak hcre bymesi kontrol edilerek salanr. Trbidostat yntemine ise fermantasyonda biyomas konsantrasyonu trbidimetrik olarak llr ve elde edilen verilere gre besin ilave edilerek kararllk salanr. Tapa akl reaktrlerde ise kltr solsyonu silindirik yapda bir reaktrde kartrma olmakszn ilerler. Silindirik tpn kesitlerinde hcre says veya rn konsantrasyonu farkllk gsterir. Srekli fermantasyonda kararl hal durumunda
biyoreaktrden alnan mikroorganizmalardan dolay sistemden ayrlan mikroorganizmalar reaktr iinde hcrelerin blnmesi ile dengelenir. D=F/V D= dilsyon oran F= volmetrik akm (l/s) V= reaktr hacmi (l) D deeri mikroorganizmann reaktre giren taze substrat kullanabilmesi iin substratn reaktrde ne kadar alkonaca hakknda bize bilgi verir. Reaktre giren taze besininin dilsyon oran (D) ayarlanrsa reaktr iinde oalan hcrelerle reaktrden ayrlan hcreler dengeye ular ve sistemde birim zamanda net mikroorganizma deiimi sfr olur Yani Dx/dt =x- Dx (monod denklemine gre) Kararl hale ulaldnda reme oran sitemden kan mikroorganizmalarla dengelenecei iin dx/dt=0 olacaktr. sonu olarak x= Dx olacaktr. Veya =D olacaktr dolaysyla sabit ak oran ve sabit dilsyon orannda sistemde fiziksel ve kimyasal koullarda sabit olacaktr. Sistem kararl hale ulat zaman spesifik byme oran dilsyon oranna bal olacaktr. Ancak eer dilsyon oran max deerini aarsa hcreler oalmak iin yeterince zaman bulamayacaklardr besinin sistemi hzla terk etmesinden dolay Bu ndan kanmak iin kritik dilsyon orann amamak gerekir. (ekil 4.5).
ekil 4.5. Kemostatta mikrobiyal byme monod denklemini srekli sisteme uyarlarsak sistemin kararl halinde =D olduu iin monod denklemine uyarlarsak: D=max S/Ks+S
Bu denklemde S kararl halde sabit dilsyon orannda reaktrde kalan substrat miktarn gstermektedir. Denklem S deerini elde edecek ekilde tekrar dzenlenirse: S= D Ks/max-D bulunur. Sonu olarak reaktrde kalan substratn miktar dilsyon oran (D) ile kontrol edilebilir. Dilsyon oranndaki herhangi bir deiiklik yeni dilsyon orannn salad substart elde etme olanana gre mikroorganizmann byme orann deitirecektir.
Dm deeri zerine kld zaman reaktrde kararl halin olumas mmkn deildir. Eer ak oran Dm in hemen altnda olursa sistem d etkilere kar ok hassas bir duruma gelir ve hcre veya sistemden ayrlan kltr zerinde hafif bir deiiklik biyomas zerinde ok byk deiiklikler meydana getirebilir. Maksimum byme hz sabiti endstriyel retimlerde en ok verim ve en kk fermantr hacmini karlayacak ekilde ayarlanmaldr. Srekli fermantasyon sistemlerinde ak hz ok yava veya ok hzl olursa monod denklemi uygulanamaz. Srekli fermantasyon ok eitli ekillerde uygulanabilir. Sadece tek bir fermantrn kullanld sistemler, geri beslemeli srekli fermantrler (sistemden uzaklatrlan ktlenin bir ksm sisteme yeniden verilir), ve iki veya daha fazla fermantrn beraberce kullanld srekli sistemler gibi. Asetik asit, etanol, glukonik asit, laktik asit, btanol, subtilin, ekmek mayas, bira gibi rnler bu sistemle ticari olarak retilmektedir. Endstriyel fermantasyonlarda temel konu maliyetlerin minimuma, rn veriminin maksimuma karlmasdr. Bu ama iin her proses iin en etkili fermantasyon yntemlerinin belirlenmesi gerekmektedir. Srekli kltrlerde elde edilen hcre biyomasnn retim maliyeti, kesikli fermantasyona gre daha dktr. Ticari olarak ayn miktardaki rn retmek iin, srekli kltrlerde, kesikli kltrlere gre daha kk lekli biyoreaktrler gerekmektedir. Byk lekli kesikli fermantasyonlar tamamlandktan sonra hcrelerin hasad,
paralanmas, veya metabolitlerin izolasyon ve saflatrlmas iin byk lekli ekipmana ihtiya vardr. Srekli kltrde ise rn ortama azar azar alnd iin bu ilemler iin daha az ekipman gerekmektedir.
Srekli fermantasyonda kesikli kltrlerdeki gibi biyoreaktrn yeniden kullanm iin hazrlanmas gibi bir zaman kayb yoktur. Endstride karlalan en nemli problem biyoreaktrlerin temizlii ve sterilizasyonudur. Bu zaman kaybna yol amakta srekli fermantasyonda ise fermantasyon daha uzun sre gerekletirildii iin temizlik vs. iin daha az zaman gerekmektedir. Srekli fermantasyonda hcrelerin fizyolojik durumu uniform olduundan rn verimi daha tutarldr. Srekli fermantasyon yntemi ile ticari olarak baz antibiyotiklerin, baz solventlerin retildiini gryoruz. Srekli fermantasyon sresi 500-1000 saat arasnda deimektedir. Bu srenin uzun olmas rekombinant teknolojisi ile protein retiminde dezavantaj oluturur. nk rekombinant organizmaya yeni gen ilavesi hcrenin enerji ihtiyacn artrr. Bu yzden organizma belli bir sre sonra plazmitlerini atma eilimi gstermektedir. Buda rn veriminin azalmasna yol aabilir. Endstriyel lekte uzun zaman boyunca sterilitenin korunmas, ayrca kltr ortamnn hep ayn kalitede salanmas gtr ve verimlilii etkiler. lek Bytme (Scale Up) Laboratuar koullarnda yaplan kk lekli bir biyoteknolojik ilemin endstriyel boyuta dntrlmesi ilemine lek bytme denir. Laboratuar leinde yaplan denemelerde saptanan deerler ou kez endstriyel lekte ayn baar ile uygulanamaz. Bunun bir ok nedeni vardr. Havalandrma ve kartrma: Laboratuar leinde yaplan fermantasyonlarda havalandrma ve kartrma kolaydr, ancak endstriyel apta yaplan retimlerde havalandrma ve kartrma zor olmaktadr. Ekipman Hacmi: Ekipman hacmi bydke yzey/hacim oran deiecektir. Kresel bir mikroorganizmann hacmi 4/3r3tr. Alan ise 4r2dir. Alan/Hacim= 3/rdir. Dolaysyla hacim arttka yzey alannn (mikroorganizmann) kldn grrz. Sonu olarak kk bir hcre byk bir hcreye gre daha etkin alabilmektedir. Gaz Transferi: Fermantr hacminden ok maruz kalnan yzeye bal olduu iin kartrma ok byk nem kazanmaktadr. Yzey/hacim oran nedeniyle oksijen transferini byk lekte salanmas ok zordur. Havalandrma iyi yaplamazsa verim der. Havalandrma ok ksa sreli dahi kesilse fermantasyon iinde ksmi anaerobik koullar olutuu iin verimi byk oranda etkiler. Kartrmann daha az
etkili olduu blgelerde cep denilen blgeler olumakta ve mikroorganizma byle ceplere girerse fermantasyon koullarndan farkl evresel koullara maruz kalaca iin verim dmekte ama d eyler geliebilmektedir. lek bytme ekip almasn gerektirir. Kimya mhendisi, biyokimya, mikrobiyolog, gda mhendisi gibi. lek bytmede rol oynayan olay vardr. Termodinamik fenomen, mikrokinetik fenomen ve transport fenomenler. r: Oksijenin svda znrl, reaktrn boyutuna bal deildir. Ama kartrma zaman, kartrma hz ve pervane geometrisi nemlidir. Mikroorganizmalarn mikrokinetik davranlar fermantr boyutuna bal deildir (besin konsantrasyonu, pH, scaklk vb. faktrler nemlidir). Bu iki fenomen lekten bamszdr. Transport prosesleri lee baldr. r: oksijenin svda transportu, svdaki besinin ve oksijenin hcreye transportu gibi. Transport prosesi iin lek arttka zaman sabiti iin iine girmektedir. Transport ilemleri iyi bir ekilde yaplmazsa zaman uzar. Bunun uzamamas iin kartrmann ok iyi yaplmas gerekir. Bu fenomen dnda s transferi nemlidir. lek bydke s artmakta ve sratle soutma gerekmektedir. Birde a kltrnn kararll nemlidir. Mikroorganizmann sahip olduu baz zellikler lek bytmede sorun oluturur. r: Bir hcre ekstraselular proteinaz sentezliyorsa svnn vizkositesini artracaktr. lek bytmede ilk almalar laboratuar erlenlerinde yaplr. Burada baar elde ediliyorsa kk hacimli bir laboratuar fermantrne (5-10lt) gei yaplr. Bu aamalarda kullanlan denemenin maliyeti dk ilem parametrelerini test etmek kolay olduu iin avantajldr. nc basamakta pilot bazda denemeye geilir. Genellikle 300-3000lt hacimli bir fermantrde almalar devam ettirilir. Buradaki koullar ticari hacme olduka yakndr. Ama maliyet yine dktr. Bilgisayar destei ile, laboratuar koullarnda elde edilen deerlere yakn deerler elde edilir. Son safha 10000-400000 lt hacimli fermantrlerin kullanld endstriyel basamaktr. Burada artk hibir sorunun ortaya kmamas gerekmektedir. lek bytme almalarnda en nemli ey fermantrde oksijen orannn fermantr boyutu arttka sabit tutulmasdr. r: Kk bir fermantrde optimum verim elde etmek iin 200mmol/saat oksijen gerekiyorsa lek ne kadar byrse bysn ayn orann temin edilmesi gerekir. Bunun iin kartrmann hzl olmas ve daha gl hava flenmesi gerekmektedir. lek bytme ilemlerinde nerilen yntemler ksaca aadaki gibidir.
enerji giriinin sabit kabul edildii almalar kartrma zamannn sabit kabul edildii almalar oksijen transfer katsaysnn sabit kabul edildii almalar evresel koullarn (znm oksijen gibi) sabit kabul edildii almalar. Endstriyel bir biyoprosesin laboratuar ortamndan aadaki aamalardan sonra gerekleir. alkalamal erlen denemeleri Laboratuvar lekli fermentor (5-10 L) Pilot lekli fermentor (300-3000 L) Ticari fermentor (10,000-500,000 L) ticari fermantre tanmas
alkalamal erlen denemelerinde hedeflenen optimizasyon parametreleri unlardr: 1. pH 2. Scaklk 3. Oksijenin znrl 4. Substrat seimi 5. Substrat konsantrasyonun optimizasyonu 6. Dierleri Laboratuvar lekli fermantrde ise u parametreler optimize edilmeye allr: Kartrma Soutma ve stma Hava giri ve k pH kontrol Besin ilavesi Inokulasyon
Laboratuar lekli denemelerde kesikli proses, kesikli beslemeli proses, srekli proses veya yar srekli proses uygulanabilir. Elde edilen parametreler bir sonraki admda ticari lee yakn bir pilot fermantre uyarlanarak lek biraz daha bytlr. Son adm endstriyel boyutta fermantr uygulamas olup bu aama da sorun kmas istenmez. Kaynaklar: Rengin Eltem Mikrobiyal fizyoloji ders notlar
Basic Biotechnology. John Bulock, Bjorn Kritiansen. Academic Press. Orlano, Florida. 1987. Biotechnology. Wulf Crueger, Anneliese Crueger. A Textbook of Industrial Microbiology. 1989, second edition. Sinauer press. Lesson 1: Fermentation processes- types and stages of fermentation process. Rai University. Modelling of a fed betch fermentation process. University of Oulu. Control Engineering Laboratory Report A No. 21. June 2003