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FOSFATASE ALCALINA EM LEITE E DERIVADOS: ASPECTOS TERICOS E PRTICOS

Alkaline phosphatase in milk and dairy products: theoretical and practical aspects
Gisela de Magalhes Machado 1 Adbeel de Lima Santos 1 Luiz Carlos Gonalves Costa Jnior 2 Renata Golin Bueno Costa 2 Paulo Henrique Costa Paiva 3

SUMRIO A indstria de laticnios vem passando por grandes transformaes. O aumento na capacidade produtiva para atender ao crescente nmero de consumidores traz novos desafios tecnolgicos. Segurana alimentar, qualidade e eficincia econmica so essenciais. Nesse sentido, conhecer e aplicar corretamente as tcnicas analticas de controle de qualidade do leite e de seus derivados, dentre elas a de atividade de fosfatase alcalina, fundamental. Este trabalho tem como objetivo apresentar alguns aspectos que so relevantes na aplicao e interpretao das tcnicas de determinao de atividade de fosfatase alcalina bem como servir de fonte de informaes para futuros trabalhos. Termos para indexao: leite, fosfatase alcalina, qualidade. 1 INTRODUO Todo leite que no foi tratado termicamente contm a enzima fosfatase, sendo que seu teor varia principalmente em funo do estgio de lactao, da presena de infeces no bere e de fatores individuais. No incio da lactao, o teor de fosfatase no leite baixo, regularizando-se com o passar do tempo. O leite proveniente de animais com mastite tambm contm baixos teores de fosfatase, isso muito provavelmente devido presena de leuccitos (Fox & McSweeney, 1998). A existncia de uma fosfatase em leite foi pela primeira vez reconhecida em 1925. Desde ento diversos estudos foram realizados no sentido de aprofundar o conhecimento existente a respeito dessa enzima e caractersticas teis e importantes foram descobertas nestas pesquisas (Fox & McSweeney,1998). Este trabalho tem como objetivo apresentar alguns aspectos que so relevantes na aplicao e interpretao da tcnica de determinao de atividade de fosfatase alcalina bem como servir de fonte de informaes para futuros trabalhos.
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2 A FOSFATASE NO LEITE Atualmente sabe-se que no leite existem vrios tipos de fosfatases: pirofosfatase inorgnica, pirofosfatase nucleotdeo, fosfatase de cido fosfatdico, adenosina trifosfatase e glucose-6-fosfatase, todas encontradas em preparaes da membrana do glbulo de gordura. Mas dois tipos de fosfatase que se diferenciam em diversos aspectos, sendo um fator relevante o pH de atuao, so as mais estudadas: a fosfatase alcalina e a cida (Fox e McSweeney,1998). Essas se diferenciam em diversos aspectos, sendo um dos mais relevantes o pH de atuao (Fox & McSweeney,1998). A fosfatase alcalina (E.C.3.1.3.1) uma fosfomonoesterase que possui pH timo de atividade em torno de 9,0, sendo este valor dependente do substrato em que vai atuar, da quantidade desse substrato, e tambm de fatores composicionais, como presena de molculas com caractersticas tamponantes (Haab e Smith, 1956). A fosfatase cida, cujo pH timo para atividade de aproximadamente 4,0, uma fosfomonoesterase cida (E.C.3.1.3.2) que encontrada principalmente no

Professores e Pesquisadores EPAMIG Instituto de Laticnios Cndido Tostes, discentes Mestrado profissionalizante Cincia e Tecnologia do leite e Derivados: giselammachado@epamig.br; lima@epamig.br; Professores e Pesquisadores EPAMIG Instituto de Laticnios Cndido Tostes, docentes Mestrado profissionalizante Cincia e Tecnologia do leite e Derivados: luizcarlos@epamig.br; renata.osta@epamig.br; Professor e Pesquisador EPAMIG Instituto de Laticnios Cndido Tostes: paulohcp@epamig.br

Rev. Inst. Latic. Cndido Tostes, Set/Out, n 370, 64: 22-28, 2009 plasma do leite. Sua concentrao no leite muito baixa quando comparada da fosfatase alcalina, mas alta no colostro (Walstra & Jenness, 1984). Da fosfatase alcalina foram identificadas duas isoenzimas principais, a e a -fosfatase, localizadas fundamentalmente no plasma do leite e na membrana do glbulo de gordura respectivamente. A -fosfatase, isoenzima mais abundante, tem sido purificada a partir do leite de vaca e um dmero de duas subunidades idnticas ou muito similares, cada uma das quais possui uma massa molar de aproximadamente 85.000 Da. Contm 5 tomos de zinco por molcula de dmero. Seu pH timo para a hidrlise varia de um ster fosfato a outro e com a composio do meio. A membrana do glbulo de gordura contm pelo menos 10 enzimas distintas e a fosfatase alcalina representa aproximadamente 10% das protenas da membrana (Walstra & Jenness, 1984). Esses dmeros so formados pelo aquecimento (100C/2minutos) ou acidificao (pH 2,1) (Fox & McSweeney,1998). Embora no exista relao entre o teor de fosfatase e o teor de gordura no leite cru, a fosfatase alcalina est associada ao glbulo de gordura. Ela no solvel em gordura, mas est presente na fina camada protica que cobre os glbulos ou adsorvida ao glbulo de gordura. Este fato requer que os glbulos de gordura estejam bem distribudos no leite antes da determinao de sua atividade (Burgwald, 1939). Outra caracterstica que diferencia as fosfatases alcalina e cida a sensibilidade ao calor. A fosfatase alcalina apresenta maior sensibilidade ao calor que a fosfatase cida, no apresentando atividade aps tratamento trmico de pasteurizao, enquanto a cida resistente a tal procedimento. A pasteurizao lenta (65C/30min) causa uma inativao de 10 a 20% da fosfatase cida. J o tratamento trmico de 88C/30min requerido para a sua completa inativao (Fox & McSweeney, 1998). Por ser mais resistente ao calor que os microrganismos patognicos no esporulados comumente encontrados no leite e por ser sensvel aos binmios tempo/temperatura praticados na pasteurizao, a atividade de fosfatase alcalina tem sido utilizada principalmente como parmetro para avaliao do tratamento trmico e para verificao de fraude por adio de leite cru. Diversas tcnicas tm sido elaboradas e modificadas com base em sua atividade fosfoesterase (Murthy et al, 1992). Estudos indicaram que em alguns casos havia ocorrncia de teste positivo para fosfatase em creme pasteurizado e refrigerado, e que aparentemente esse resultado no foi causado por fosfatase ligada ou protegida/adsorvida ao glbulo de gordura. Amostras de creme pasteurizado que desenvolveram reao de fosfatase positiva aps estocagem a 10C ou 4C continham bacilos

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formadores de esporos gram positivos que produziam fosfatase e foram identificados como Bacillus cereus e Bacillus mesentericus. Esses microrganismos no foram detectados em amostras com resultado negativo para fosfatase alcalina. (Barber & Frazier, 1942). A possibilidade de haver presena de fosfatase no oriunda do leite na amostra levou necessidade de criar um teste que as diferenciasse. A fosfatase alcalina de origem microbiana apresenta maior estabilidade trmica que a enzima do leite, sendo esta propriedade utilizada para diferenciar as duas num teste controle (Pratt-Lowe et al, 1987). Posteriormente foram descobertas algumas fosfatases microbianas to termolbeis quanto as endgenas do leite e um teste para diferenci-las ainda no est disponvel (Karmas & Kleyn, 1990). Se leite cru contm microrganismos produtores de esporos, as clulas vegetativas sero destrudas pela pasteurizao, mas os esporos sobrevivem, germinam e produzem fosfatases termo resistentes (Murthy et al, 1992). Tanto as fosfatases alcalina como a cida liberam fosfato inorgnico das casenas e dos steres solveis, o que pode acontecer no leite e em seus derivados sob condies adequadas. No pH do leite a fosfatase cida mais ativa (Walstra & Jenness, 1984). A atividade da fosfatase cida no leite apenas 2% da atividade da fosfatase alcalina. Apesar de poder desfosforilar casena sob condies adequadas, at onde se sabe a fosfatase alcalina no tem significncia tecnolgica em leite e derivados, talvez pelo pH timo de atuao da enzima estar muito distante do pH normal do leite, como pode ser visto na Tabela 1, e tambm devido ao efeito inibitrio causado por fosfatos inorgnicos. A fosfatase cida apresenta significncia tecnolgica devido sua termoresistncia e pH cido de atuao. Sua importncia reside principalmente na maturao de queijos, onde peptdeos desfosforilados podem ser isolados, comprovando essa atividade. Apesar disso, no se sabe se esses produtos so oriundos de ao da fosfatase cida ou microbiana. A desfosforilao de protenas limita a taxa de hidrlise protica nos queijos, uma vez que muitas proteases e peptidases so inativas frente a substratos desfosforilados (Fox & McSweeney,1998). A fosfatase alcalina apresenta renaturao aps certo perodo de estocagem do leite e produtos lcteos. Harvey Fram (1957) foi um dos primeiros pesquisadores a detectar isso, quando constatou que o creme imediatamente aps o tratamento trmico apresenta reao negativa para fosfatase alcalina, mas quando permanece temperatura ambiente por pelo menos 2 horas, o teste para fosfatase se torna positivo. O mesmo no encontrou mudana no teste de fosfatase quando o creme foi devidamente refrigerado. A anlise microbiolgica do creme pasteurizado pelo mtodo HTST (75/15s) que deu resultado positivo no teste para fosfatase, indicou

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Tabela 1 Caractersticas da fosfatase alcalina do leite (adaptado de Fox & McSweeney,1998).

Caracterstica pH timo Temperatura tima Ativadores Massa molecular Associao/dissociao

Condies (Substrato p-nitrofenil-fosfato) 9,65 10,5 37C Ca+, Mn-, Co2+, Mg2+ 170 190 kDa 2 subunidades de massa molar 85 kDa, formadas pelo aquecimento (100C por 2 min) ou acidificao at pH = 2,1
Existem evidncias de que o sal presente em produtos como a manteiga aumenta a possibilidade de reativao da fosfatase alcalina ou corrobora na liberao de fosfatase alcalina residual de uma estrutura protetora natural (Karmas & Kleyn, 1990). Alm disso, o sal adicionado em vrios queijos aumenta a susceptibilidade da fosfatase alcalina ao calor, tornando-a mais termolbil (Murthy et al, 1992). O teste para determnao de atividade de fosfatase alcalina tem limitada utilidade em produtos muito cidos, a exemplo do iogurte, devido inativao da enzima pelo cido (Murthy et al, 1992). 3 METODOLOGIAS ATUALMENTE UTILIZADAS A fosfatase alcalina hidrolisa steres de mono fosfatos temperatura e pH apropriados liberando compostos que podem ser detectados por desenvolvimento de cor. A quantidade de cor desenvolvida proporcional concentrao da enzima (Murthy et al, 1992). Os mtodos mais utilizados na atualidade para deteco ou medio da atividade de fosfatase alcalina so o Scharer rpido (visual e espectrofotomtrico), Rutgers e Fluorimtrico. Os mtodos descritos sucintamente a seguir foram adaptados de Standard Methods for Examination of Dairy Products (Murthy et al, 1992), e servem para anlise no apenas de leite, mas tambm de derivados, desde que o preparo de amostras seja feito previamente e de maneira adequada. Para todos os mtodos indicado que algumas amostras controles sejam conduzidas paralelamente aos experimentos. Os controles so os que seguem: Controle negativo: usado para determinar os efeitos dos contaminantes dos reagentes, materiais coloridos ou gordura. Para tal deve ser usada amostra aquecida em banho-maria fervente por 1 minuto sendo resfriada rapidamente em seguida. Controle positivo: usado para assegurar que os reagentes, como o CQC (2,6dicloroquinonacloroimida) e o fenil fosfato dissdico esto funcionando

pouca ou insignificante mudana aps 2 horas de estocagem em relao populao microbiana inicial, demonstrando que a atividade encontrada no seria devido presena das enzimas microbianas (Fram, 1957). A reativao pode ocorrer aps aquecimento em temperaturas como 84C para leite e 74C para creme. A temperatura de estocagem tima para reativao 30C, na qual a reativao detectada aps 6 horas e pode continuar por at 7 dias. Sais de magnsio e de zinco promovem fortemente a reativao. Outros sais como de estanho e de cobre e EDTA so inibitrios, enquanto ferro no causa efeito na renaturao da fosfatase alcalina. Grupos sulfidril (-SH) parecem ser essenciais para a reativao, e talvez seja por isso que a fosfatase seja reativada mais facilmente em leite UHT que em leite pasteurizado HTST. O papel dos grupos sulfidril, fornecido pelas soroprotenas desnaturadas, o de apresentar efeito quelante de metais pesados, sendo que esses ltimos poderiam se ligar aos grupos sulfidril da enzima que tambm foram ativados na desnaturao se no se ligassem s soroprotenas, prevenindo assim a renaturao. Mg 2+ e Zn 2+ aparentemente causam uma mudana conformacional na enzima desnaturada, necessria para a renaturao (Fox e McSweeney,1998). Dessa forma, a presena de soroprotenas desnaturadas diminui o magnsio e zinco disponveis, evitando a renaturao de fosfatase alcalina. No leite UHT, tanto pelo processo direto quanto indireto, a desnaturao de soroprotenas maior que na pasteurizao, mas essas protenas desnaturadas, sobretudo a -lactoglobulina, esto em grande parte formando pontes dissulfeto com a -casena (Silva, 2004), possivelmente no estando disponveis para atuar com seu importante efeito quelante na preveno de renaturao de fosfatase alcalina. O teste de diferenciao entre a enzima ativa e a enzima renaturada baseado no aumento da atividade fosfatsica como resultado da adio de Mg2+: a atividade de fosfatase alcalina renaturada aumentada at 14 vezes enquanto a enzima nativa tem sua atividade aumentada de apenas 2 vezes. Fosfatase cida no sofre ativao na presena de sais de magnsio (Fox & McSweeney,1998).

Rev. Inst. Latic. Cndido Tostes, Set/Out, n 370, 64: 22-28, 2009 apropriadamente. O procedimento para tal determinao implica em misturar leite fresco cru amostra tratada por 95C/1 min ou preparar pequenos discos (0,64 cm de dimetro) contendo leite cru seco vcuo. Controle de substncias interferentes: aplicado para anlise de produtos como queijos, leites achocolatados, sorvetes e outros produtos aromatizados. A presena de vanilina provoca um resultado falso positivo no teste de Scharer, pois reage com CQC produzindo indofenol (azul). J produtos derivados do cacau podem conter substncias que inibem a atividade enzimtica, neste caso resultando em um teste falso-negativo, difcil de detectar. Para essa determinao indicado realizar o teste usando tampo simples, sem substrato. Resultados positivos se devem presena de interferentes. Controle de fosfatase microbiana: realizado quando o produto apresenta alta contagem microbiana ou foi estocado por tempo prolongado antes da anlise. A fosfatase microbiana , na maioria das vezes, mais termoresistente que a enzima prpria do leite. Caso o teste tenha sido positivo para fosfatase alcalina, pasteurizar a amostra e refazer o teste. Caso o resultado ainda seja positivo h indicao de que a fosfatase presente seja de origem microbiana. Controle de fosfatase renaturada: baseado no fato de que fosfatase alcalina renaturada em produtos HTST ou UHT so reativadas quando estocadas com sais de magnsio a 34C (1 h) e apresentaro um aumento de 4 a 10 vezes maior na sua atividade que o mesmo produto estocado sem os sais de magnsio. 3.1 Mtodo Scharer visual Este um teste rpido que utiliza como substrato para a fosfatase o fenil fosfato dissdico. O fenol liberado reage com 2,6-dicloroquinona cloroimida na presena de sulfato de cobre gerando um indofenol de cor azul, que posteriormente isolado pela ao de butanol neutralizado. Os mtodos envolvendo fenilfosfato dissdico como substrato so muito sensveis e todas as vidrarias, tampas e reagentes devem ser livres de fenol. A metodologia oficial brasileira descrita na Instruo Normativa no 68 de dezembro de 2006 do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento MAPA - qualitativa e adaptada deste mtodo Scharer visual. Na metodologia oficial no h a extrao do indofenol por butanol e nem comparao com padres em diferentes nveis de fenol, no sendo tambm

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estabelecido um limite quantitativo comparativo. De acordo com trabalho realizado por Castro et al (2005 b) o mtodo brasileiro s detectou como positivas amostras contendo de 1 a 2% de leite cru adicionado ao leite tratado termicamente, limite mnimo muito elevado e considerado insatisfatrio por esses pesquisadores. A Portaria no1 de outubro de 1981 do MAPA, ainda vigente, utiliza metodologia similar Instruo Normativa no 68, porm utiliza comprimidos Phos-phax e Indo-phax que contm os mesmo reagentes e promovem as mesmas reaes descritas a seguir. O mtodo Scharer visual apresenta restries quanto ao uso em leite UHT, devido presena de aminocidos aromticos na -lactoglobulina, que desnaturada, expem esses grupos e os torna aptos a reagir com CQC formando um composto de cor azul, que pode ser confundido como atividade de fosfatase no substrato. A -lactoglobulina apresenta em sua estrutura primria quatro resduos de fenilalanina, quatro de tirosina e dois de triptofano (Fox & McSweeney, 1998). Reaes: Fenil fosfato dissdico + fosfatase alcalina + gua fenol + fosfato de sdio Fenol + 2,6-dicloroquinonacloroimida (CQC) + sulfato de cobre indofenol (azul)

3.2 Mtodo Scharer espectrofotomtrico As reaes que acontecem nesta tcnica so semelhantes ao mtodo visual, porm aqui h a quantificao de fenol produzido pela fosfatase alcalina por anlise de absorvncia a 650 nm. A curva de calibrao do mtodo feita utilizando fenol p.a. em diferentes concentraes, sendo este reagente adicionado de dicloroquinona cloroimida para desenvolvimento da cor azul (indofenol). Para amostras o mtodo espectrofotomtrico similar ao visual, porm, aps a adio de lcool butlico neutro, a amostra deve ser centrifugada e a camada alcolica retirada e sua absorvncia lida a 650 nm. A absorvncia obtida para a amostra deve ser comparada com os padres para obter a concentrao de fenol da amostra. O mtodo oficial da A.O.A.C.(946.01) para anlise de fosfatase alcalina residual em leite um mtodo de Scharer espectrofotomtrico adaptado, que utiliza 2,6 dibromoquinonacloroimida (BQC) no lugar de 2,6 dicloro quinonacloroimida (CQC) como reagente de desenvolvimento de cor (produo de indofenol aps reao com fenol liberado pela ao da enzima no seu substrato fenil fosfato dissdico). A A.O.A.C.(946.03) apresenta especificidades analticas para cada tipo de queijo, utilizando este mtodo adaptado de Scharer. Estas especificidades esto relacionadas principalmente quantidade e tipo de solues tampes adequadas para cada tipo de queijo,

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Rev. Inst. Latic. Cndido Tostes, Set/Out, n 370, 64: 22-28, 2009 originalmente utilizado para deteco da enzima no sangue, mas utilizado com sucesso para anlise de leite. Este kit utiliza como substrato para a enzima o p-nitrofenilfosfato que sob ao enzimtica libera o p-nitrofenol, de cor amarela, resultado em 3 minutos a 37 oC ou 6 minutos em temperatura ambiente. Este mtodo apresenta a mesma eficincia que o mtodo oficial descrito na Instruo normativa n o68 do MAPA (Paiva et al, 2006). O procedimento simples e consiste na adio de dois reagentes do kit, em quantidades indicadas (gotas), amostra de leite. O mtodo rpido que utliza fitas (Laborclin) para anlise de leite segue o mesmo princpio qumico do kit FS (diasys). A Federao Internacional de Leite (FIL) utiliza uma metodologia semelhante a esta citada anteriormente (substrato p-nitrofenilfosfato que sob ao enzimtica libera o p-nitrofenol) para deteco de fosfatase alcalina em leite e soro fluido e tambm em leite em p e soro em p. Na tcnica da FIL o tempo de incubao de 2 horas e pode detectar at 0,5% de leite cru adicionado ao leite pasteurizado ou 0,2% se o teste for comparado por meio de espectrofotometria (absorvncia a 405 nm). O resultado dado em g de indofenol por mL de amostra e os valores podem variar entre 0 e 14. Os padres na verdade so os controles positivo e negativo que so feitos paralelamente amostra (FIL 82, 2004). Outra metodologia tambm utilizada pela FIL tem por base o sistema enzimtico foto ativado (enzymatic photo-activated system EPAS) para anlise em leite e bebidas lcteas, cujo princpio de deteco bem diferente dos citados at o momento. Na presena de fosfatase alcalina, o substrato estvel aromtico dioxetano-fosfato hidrolisado a 35C para produzir um produto foto ativado (quimioluminescncia). A foto-ativao do produto amplificada por um componente macromolecular. A reao de hidrlise paralisada depois de um tempo especfico de incubao (3 minutos). A quantidade de quimioluminescncia produzida medida e convertida em unidades de enzima por um luminmetro, que deve ser previamente calibrado (FIL, 2007). Salter & Fitchen (2006) obtiveram excelentes resultados deste mtodo comparativamente ao fluorimtrico, obtendo mesma reprodutibilidade e repetibilidade nos resultados das amostras de leite de diferentes espcies analisadas. Diversas tcnicas esto sendo pesquisadas e desenvolvidas para melhorar a preciso da deteco da atividade de fosfatase ou tornar esse processo mais rpido. Como exemplo pode ser citada a tcnica desenvolvida por Hassan et al (2009) que utiliza 4 nitrofenilfosfato como substrato para a fosfatase e seu decrscimo (que proporcional quantidade de enzima presente na

uma vez que este produto apresenta capacidade tamponante diferenciada em funo de seus constituintes, processos e tempos de maturao diversos, que podem interferir na anlise devido ao pH alcalino para atividade enzimtica excelente requerido pela fosfatase. 3.3 Mtodo Rutgers Este mtodo de determinao de atividade de fosfatase alcalina se fundamenta no fato de que a enzima ativa atuar, sob condies de temperatura e pH adequadas, sob o substrato diciclohexilamina fenolftalena mono-fosfato, liberando como produto da reao fenolftalena. Essa substncia apresenta colorao rosa em pH alcalino. A intensidade da cor ser proporcional quantidade de enzima ativa no meio, uma vez mantida constante e em excesso a quantidade de substrato e demais variveis. Reao: Diciclohexilamina fenolftalena mono-fosfato + fosfatase alcalina + gua fenolftalena (rosa)

3.4 MTODO FLUORIMTRICO O mtodo fluorimtrico, devido sua rapidez e preciso analtica, extensamente reconhecido por rgos de fiscalizao em todo o mundo. O Comit Europeu para segurana de produtos lcteos estabelece o limite mximo de 350 mU/L para a atividade de fosfatase alcalina residual em leite pasteurizado. J a entidade americana Food and Drug Administration (FDA) determina que este mesmo limite deva ser aplicado a diversos produtos lcteos (Martins, 2006). O mtodo fluorimtrico para quantificao da fosfatase alcalina utiliza como substrato um monoster ortofosfrico aromtico, denominado Fluorophos, que sob hidrlise, catalisada pela fosfatase alcalina, perde um radical fosfato e torna-se um composto altamente fluorescente, denominado Fluoroyellow. (Castro e Brando, 2005a). O coeficiente de correlao deste mtodo com o Scharer 0,995 (Murthy et al, 1992). A Federao Internacional de Leite (FIL) recomenda um mtodo fluorimtrico similar a este descrito a seguir para deteco de fosfatase em leite, bebidas a base de leite e queijo (FIL 155 partes I e II, 2006). Reao: Fluorophos + fosfatase alcalina + gua fluoroyellow (fluorescente) 3.5 Outras tcnicas Existem no mercado diversos kits comerciais para anlise de fosfatase alcalina em leite. Um dos mais utilizados o kit fosfatase alcalina FS (diasys),

Rev. Inst. Latic. Cndido Tostes, Set/Out, n 370, 64: 22-28, 2009 amostra) detectado por um sensor plstico tipo membrana. um mtodo rpido ser usado tanto para leite e derivados quanto para fluidos biolgicos. 4 CONSIDERAES FINAIS O estudo da atividade de fosfatase alcalina no leite possui importncia fundamental, pois possibilita a verificao da eficcia do tratamento trmico de maneira rpida e confivel, sem a necessidade de anlises microbiolgicas demoradas e caras. A evoluo da tcnica at a obteno de kits rpidos com bons nveis de deteco fornece para a indstria informao de carter fundamental, j que o tratamento trmico conduzido de maneira inadequada incorre em riscos sade pblica. SUMMARY The dairy industry is p assing throu gh changes. The number of consumers is growing and the industry has to increase its capacity, which brings new technological challenges. Food safety, qu ality an d econo mic efficien cy are essential. In this sense, get to know and correctly apply the analytical techniques of quality control of milk and its derivatives, among which the determination of alkaline fosfatais activity, is essential. This paper aims to present some aspects th at are relev ant to the interpretation and application of the technique of determination of alkaline phosphatase activity as well as serve as a source of information for future work. Index terms: milk, phosphatase, quality. 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS A.O.A.C. Association o f Official Analitical Chemists. Official Methods Of Ana lysis. Method 946-03 Phosphatase (residual) in Cheese. Final Action. Cap.33, p 67-69, 1995. A.O.A.C. Association of Official Analitical Chemists. Official Methods Of Analysis. Method 946-01 Phosphatase (residual) in Milk. Final Action, 1995. BARBER, F. W.; FRAZIER, W. C.; The Development of a Positive Phosphatase Test in Refrigerated, Pasteurized Cream. Journal of Dairy Science, Champaign, p. 343-352, 1942. BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Instruo Normativa N 68, de 12 de dezembro de 2006. Oficializa os Mtodos Analticos Oficiais Fsico-Qumicos, para Controle de Leite e Produtos. Publicado no Dirio Oficial da Unio de 14/12/2006, Seo 1, Pgina 8

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BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Portaria N 1, de 07 de outubro de 1981. Aprova os Mtodos Analticos para Controle de Produtos de Origem Animal e seus Ingredientes, constituindo-se em Mtodos Microbiolgicos e Mtodos Fsicos e Qumicos. Publicado no Dirio Oficial da Unio 13/10/ 1981 , Seo 1 , Pgina 19381 BURGWALD, L. H. The Phosphatase Test: a Review of the Literature on its Application for Detecting Irregularities in the Pasteurization of Milk an d Dairy Prod ucts. Jo urna l of Dairy Science, Champaign, v. 22, p. 853-873, 1939. CASTRO, P.R.S.; BRANDO, S.C.C. Avaliao do mtodo fluorimtrico na determinao da atividade fosfatase alcalina residual em leite. Revista do Instituto de Laticnios Cndido Tostes, Juiz de Fora, v.60, n.345, p. 132-136. 2005a CASTRO, P.R.S., RIGUEIRA, J.C.S., BRANDO, S.C.C. Avaliao do mtodo Scharer modificado visual e espectrofotomtrico e do mtodo oficial brasileiro na determinao da atividade de fosfatase alcalina residual em leite. Revista do Instituto de Laticnios Cndido Tostes, Juiz de Fora, v.60, n.345, p. 136-139. 2005b FOX, P.F.; McSWEENEY, P.L.H.. Dairy Chemistry and Biochemistry. Chapman & Hall. 478 p. 1998. FRAM, H. The Reactivation of Phosphatase in HTST Pasteurized Dairy Products. Journal of Dairy Science, Champaign, v.40, p.19-27, 1957. HAAB, W.; SMITH, L. M. Some Properties of Alkaline Phosphatase of Milk. Journal of Dairy Science, Champaign, p. 546-555, 1956. HASSAN, S.S.M.; SAYOUR, H.E.M.; KAMEL, A.H. A simple-potentiometric method for determination of acid and alkaline phosphatase enzymes in biological fluids and dairy products using a nitrophenylphosphate plastic membrane sensor. Analytica Chimica Acta. n. 640, p. 7581, 2009. IDF International Dairy Federation. Milk and Milk Prodcuts Determination of alkaline phophatase activity. Part 1: Fluorimetric method for milk and milk based drinks. Brussels, 2006. 11 p.(International Standard 155-1). IDF International Dairy Federation. Milk and Milk Prodcuts Determination of alkaline pho phatase activity. Pa rt 2 : Fluorimetric method for cheese. Brussels, 2 003. 8 p.(International Standard 155-2).

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Rev. Inst. Latic. Cndido Tostes, Set/Out, n 370, 64: 22-28, 2009 mtodos de deteco de fosfatase alcalina em amostras de leite pasteurizado comercializado em Minas Gerais. Revista do Instituto de Laticnios Cndido Tostes, Juiz de Fora, v.61, n.351, p. 8385. 2006. PRATT-LOWE, E. L.; RICHARDSON, T.; GEIGER, R. M. Inactivation of Microbial Alkaline Phosphatase in Hispanic-Style Cheeses with the Scharer Rapid Phosphatase Test. Journal of Dairy Science, Champaign, v.70, p.1804-1806, 1987. RODRIGUES, R. A fosfatase alcalina no leite. Revista do Instituto de Laticnios Cndido Tostes. Revista do Instituto de Laticnios Cndido Tostes, Juiz de Fora, v.30, n.182, p. 3-6. 1975. SALTER, R. S.; FITCHEN, J. Evaluation of a Chemiluminescence Method for Measuring Alkaline Phosphatase Activity in Whole Milk of Multiple Species and Bovine Dairy Drinks: Interlaboratory Study. Journal of AOAC International Vol. 89, No. 4, p. 1061-1071. 2006 SILVA, P. H. F. Leite UHT: fatores determinantes para sedimentao e gelificao. Juiz de Fora: Templo Editora, 2004. p.127. TETRA-PAK. Da iry pro cessing handboo k. Lund: LP Grafiska AB, 1995. 436p. WASLTRA, P.; JENNESS, R. Qumica y fsica lactolgica. Zaragoza: Editorial Acribia, 1984, 423 p.

IDF International Dairy Federation. Milk and dried Milk, butter milk a nd butter milk powder, whey and whey powder Detection of phophatase activity. Brussels, 2 004. 9 p.(International Standard 82). IDF International Dairy Federation. Milk and milk based drinks - Determination of alkaline phophatase activity Enzymatic photo-activated system (EPAS) method. Brussels, 2007. 16 p.(International Standard 209). KARMAS, R.; KLEYN, D. H. Determination and Interpretation of Alkaline Phosphatase Activity in Exp erimental an d Commercial Bu tters. Journal of Dairy Science, Champaign, v.73, p. 584-589, 1990. MARTINS, F. O. Adaptao do mtodo rpido de Scharer para deteco da atividade de fosfatase alcalina residual em queijo minas padro de acordo com exigncias internacionais. Viosa, UFV, 77 p., 2006. (Dissertao de mestrado). MURTHY, G.K; KLEYN, D.H; RICHARDSON, T; ROCCO, R.M. In:MARSHALL, R.T. (Ed.). Standard Methods for Examination of Dairy Products. American Public Health Association. 16 th edition. Washington, p.413-430. 1992. PAIVA, D.M.; ALMEIDA, V.F; SOUZA, M.R., CERQUEIRA, M.M.O.P; LEITE, M.O.; FONSECA, L.M.; PENNA, C.F.A.M. Comparao de dois