Ao de la integracin nacional y del reconocimiento de nuestra diversidad

Universidad Nacional de Piura

FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE CIENCIAS BIOLOGICAS

PREPARACIONES EN FRESCO Y EN SECO, COLORANTES Y

COLORACIONES

Estudiante: Docente: Curso:

Yamunaqu Cruz Jos Luis Blga. Sandra Cruz Guerrero. Microbiologa

PIURA 31-10-2012

I.

INTRODUCCIN

Para visualizar las bacterias de manera adecuada y demostrar los detalles finos de sus estructuras internas, en general se requieren tinciones biolgicas. La introduccin de las tinciones a mediados del siglo XIX fue, en gran parte, responsable de los principales avances que tuvieron lugar en la microbiologa y en otros campos de la microscopa de diagnstico durante los ltimos 100 aos. Hoy dependemos tanto de las tinciones biolgicas que es demasiado difcil darse cuenta cmo hubiera progresado el estudio de las bacterias sin su implementacin. (Koneman, et al; 2006) Las tinciones consisten en preparaciones acuosas u orgnicas de colorantes o grupos de colorantes que proporcionan una variedad de colores a los microorganismos y a los tejidos vegetales y animales, u otras sustancias de importancia biolgica. Los colorantes pueden utilizarse como tinciones directos de materiales biolgicos, como indicadores de cambios de pH en los medios de cultivo, como indicadores de oxidacin-reduccin para demostrar la presencia o la ausencia de condiciones anaerobias o para demostrar la presencia las funciones fisiolgicas de los microorganismos utilizando las tcnicas denominadas supravitales. (De la rosa, et al; 2003) El tamao tan pequeo de las bacterias no permite observarlas a simple vista, ya que su tamao promedio oscila entre 0.5 a 2.0 micrmetros de dimetro. En cuanto a su forma, las bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos, curvos, en forma de tirabuzn y helicoidales. Los extremos de los bacilos pueden ser redondos, angulares o agudos y pueden ser mviles o inmviles. Las esfricas (cocos) pueden presentarse solas, en pares, en ttradas, en cadenas o en racimos. (Olivas, et al; 2004) Los colorantes son sales compuestas por un in positivo y un in negativo, uno de los cuales estn coloreados y se conoce como cromforo. El color de los denominados colorantes bsicos est en el in positivo; en los colorantes cidos, est en el in negativo. En un pH de 7 las bacterias presentan una carga levemente negativa. Por lo tanto, el in positivo coloreado en un colorante bsico es atrado hacia la clula bacteriana con carga negativa. Los colorantes bsicos, entre los que se encuentran la violeta de genciana, el azul de metileno, el verde de malaquita y la safranina, se utilizan con ms frecuencia que los colorantes cidos. Estos ltimos son atrados por la mayor parte de los tipos de bacterias porque la superficie bacteriana repele los iones negativos del colorante, de modo que este tie el fondo del lugar de la estructura bacteriana. (Tortora, et al; 2007). El objetivo de la prctica fue de familiarizarse con las tcnicas de observacin de microorganismos mediante preparaciones en fresco y en seco, as como de hacer una introduccin al conocimiento de los colorantes y las tcnicas bsicas de coloracin.

FUNDAMENTO TERICO
Preparado en fresco Permite observar en los microorganismos su movilidad, color, tamao, forma y agrupacin en condiciones naturales, cuando estn vivos, sin alteraciones. Sin embargo, la observacin es difcil debido al escaso contraste, por la poca diferencia entre el ndice de refraccin del medio y de los microorganismos. Este problema se resuelve utilizando el microscopio de campo oscuro y el de contraste de fases. La preparacin en fresco es utilizando un portaobjetos normal, con un cubreobjetos encima. Otra forma es la preparacin en gota suspendida, utilizando un portaobjetos excavado y un cubreobjetos.(Koneman, et al; 2006) TCNICAS DE TINCIN Tcnicas de tincin simple o directa Tien homogneamente la clula y slo utilizan un colorante, que puede ser azul de metileno, safranina, cristal violeta, etc. Tinciones Negativas En realidad no colorean los microorganismos, ya que el colorante se limita a depositarse en el campo del rededor, delimitando las clulas. Esto se explica debido a que las bacterias presentan muchas cargas negativas asociadas con la pared, membrana y citoplasma, siendo repelidos los colorantes con carga cida. Tcnicas de tincin compuesta o diferencial Requieren combinaciones de dos o ms colorantes como en la tcnica de Gram, la de ZiehlNeelsen, tincin de esporas, etc. Algunas de estas tcnicas permiten la demostracin de estructuras especficas como cpsula, flagelos, esporas, etc. Otras tien selectivamente bacterias de un grupo especfico (Olivas, et al; 2004). COLORACIN GRAM Permite la diferenciacin de los microorganismos en dos grupos: Gram positivos y Gram negativos. La diferencia de color que presentan los microorganismos tratados con estos colorantes, se debe a la formacin de un complejo Violeta-Yodo que es "atrapado" dentro de la bacteria segn las caractersticas de su pared. Los Gram positivos tienen una pared predominantemente proteica que se deshidrata con la

aplicacin del alcohol-acetona y no permite que el colorante violeta salga de la bacteria.

Los Gram negativos tienen una pared con una capa lipdica que se disuelve con el alcoholPara poder observar entonces estos

acetona, permitiendo la salida de complejo violeta-yodo.

microorganismos, se colorean luego con la Safranina que se agrega al final del procedimiento. Bacterias gram positivas En microbiologa, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram: de aqu el nombre de "Gram-positivas" o tambin "grampositivas". Esta caracterstica est ntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organizacin bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxn se utiliza tambin el nombre de Posibacteria. Las restantes son las bacterias Gram negativas. La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicanos, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtica mediante molculas de cido lipoteicoico. La capa de peptidoglicanos confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tincin de gram. Bacterias gram negativas Se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram: de ah el nombre de "Gram negativas" o tambin "gramnegativas". 1 Esta caracterstica est ntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de organizacin bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias y cuando se tratan como taxn se utiliza tambin el nombre de Negibacteria. Las restantes son las bacterias Gram positivas (Daz, 2005).

II.
MONTAJE HUMEDO

MATERIAL Y MTODOS

GOTA PENDIENTE (MOTILIDAD) PREPARACIONES EN SECO

Se explic el procedimiento para los preparados en fresco. Se explicaron dos procedimientos, los cuales fueron, montaje hmedo en cual la muestra o cultivo se coloca en una lmina porta objetos y se cubre con una laminilla. Y la gota pendiente en el cual el cultivo se coloca en un instrumento y como su nombre lo dice el cultivo se encuentra a punto de caer a una lmina. Preparaciones en seco: 1. 2. Se recibi una preparacin coloreada de una bacteria Se examin los frotis con los objetos de pequeo, mediano y gran aumento. haciendo los ajustes necesarios de iluminacin con cada tipo de lente.

COLORACIONES COLORACION SIMPLE: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Sobre un porta objetos limpio se coloco una gota de agua, luego se le aadi una porcin pequea de sustancia portadora del inoculo. Se extendi la preparacin y fij pasando la lmina a travs de la llama hasta que la extensin se seque. Se cubri la extensin con colorante cristal violeta por 2 minutos. Se lav el exceso de colorante, evitando el desprendimiento del preparado. Se seco al medio ambiente Se examin la lmina al microscopio usando objeto de inmersin, colocando previamente sobre la extensin una gota de aceite de cedro. COLORACIONES COMPUESTAS:

Materiales
Lugol. Cultivo en medio lquido o slido. Cristal violeta. Alcohol acetona. Safranina. Asas de siembra. mechero Aceite de inmersin. Portaobjetos desengrasados. Pizetas con agua destilada. Microscopio.

COLORACION GRAM: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Se hizo un extendido del preparado sobre el portaobjetos . Se fij a la llama con 3 pasajes sobre ella. Se coloc el cristal violeta por un minuto . Se lav con agua destilada. Se cubri el mismo con lugol durante 1 minuto y se lav con agua destilada. Se decolore con alcohol durante 20 segundos y se lav con agua destilada. Se agreg fucsina por treinta segundos, se lav con agua destilada y se dej secar. Se agreg una gota de aceite de cedro y se observ.

COLORACION ZIEHL NEELSEN COLORACION DE ESPORAS (WIRTZ):

III. Coloracin gram

RESULTADOS

Fig. 1. Se agreg una gota de agua destilada antes de colocar la muestra.

Fig. 2y 3. Se coloc una porcin de la sustancia portadora del inculo, luego se fij la muestra y luego se le agreg cristal violeta por un minuto

Luego se siguieron los procedimientos descritos anteriormente en la coloracin gran.

Fig. 4. Despus de lavar la muestra se le agrega lugol por un minuto

Bacterias gram negativas

Tipo de bacteria: bacillus Coloracin: Compuesta- Coloracin Diferencial de Gram Aumento: 1000X

Bacterias gram positivas

Tipo de bacteria: cocos Coloracin: Compuesta- Coloracin Diferencial de Gram Aumento: 1000X

ESPORAS

Estructura: ESPORAS (VERDE) y bastones unidos (rojo) Coloracin: Compuesta- Coloracin Diferencial de esporas

Aumento: 1000X

IV.

DISCUSIN

La tincin simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. La tincin puede ser uniforme o presentar algunos grnulos en su interior. Utiliza un solo colorante (en este caso violeta de genciana,). La tincin simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares bsicas. En estas se usa un nico reactivo, que preferentemente es de tipo bsico y contiene un cromgeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromgeno. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. Las tinciones simples se realizan sobre preparaciones previamente secadas. Sobre un portaobjetos con una suspensin de microorganismos previamente secada y fijada a la llama (Tortora, et al; 2007). Para la coloracin Gram el colorante violeta y el yodo se combinan en el citoplasma de cada bacteria y lo colorean de violeta oscuro o prpura. Las bacterias que conservan este color despus de haberles agregado el alcohol para decolorarlas se clasifican como gran positivas; las bacterias que pierden el color violeta oscuro despus de la decoloracin se clasifican como gran negativas. Como las bacterias gran negativas son incoloras despus del lavado con alcohol, dejan de ser visibles. Por

este motivo se les aplica el colorante bsico safranina, que las convierte en rosadas. Los colorantes como la safranina que tienen un color que contrasta con el colorante primario se denominan colorantes de contraste. Dado que las bacterias gran positivas conservan el colorante violeta original, no son afectadas por el colorante de contraste safranina (Olivas, et al; 2004). En efecto, una caracterstica taxonmica importante de las bacterias es su respuesta a la tincin de Gram, esta caracterstica parece ser fundamental. En el laboratorio se observaron cocos por ejemplo teidos de azul violeta, lo que demostr que eran bacterias gran positivas, y otras bacterias como bastones, teidos de rosa, lo que demostr que eran gran negativas. Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters (Schlegel ,1997). Debido al colorante verde de malaquita las esporas se teirn de color verde mientras que la clula est muerta debido a que no resisti las altas temperaturas. Las bacterias cido alcohol resistentes son bacterias Gram positivas que resisten la decoloracin con decolorantes enrgicos, como las soluciones de etanol en cido clorhdrico (de donde deriva la denominacin). Esta resistencia se debe a cidos grasos especficos de la pared (cidos miclicos). Los cidos se encuentran esterificando hidroxilos de glcidos de diferente tamao. Pulsa aqu para ver el esquema de la pared celular. El resultado es la formacin de una pared lipdica (hidrfoba). En consecuencia la pared dificulta la difusin de molculas hidroflicas (nutrientes y colorantes)a travs de su envuelta celular. El aspecto de los cultivos sobre medios slidos es caracterstico: se forman grumos (en la imagen a la izquierda cultivo de Mycobacterium smegmatis y a la derecha de E. coli). Si las bacterias AAR no se extienden con fruicin, quedan agrupadas dificultando la definicin de su forma (en ambas imgenes cultivos de M. smegmatis). La impermeabilidad a molculas hidroflicas determina un crecimiento (lento) caracterstico (formacin de grumos) y la dificultad de tincin por colorantes convencionales, pero como las endosporas, una vez teidas son difciles de decolorar. Solo se tien bien forzando la tincin (con calor como en la endospora o con una solucin muy concentrada de colorante (fuchina) en fenol). El Alcohol-clorhdrico no las decolora, por lo que se observan de color rojo. Cualquier otra clula (excepto de algunas Nocardia, o endosporas) es decolorada, por lo que admite la tincin por un segundo colorante (azul de metileno). Puede hacerse segn dos tcnicas: tincin de Ziehl-Neelsen o tincin de Kinyoun (Kruiff, 2000). V. CONCLUSIONES

Se logr realizar coloraciones o tinciones, que nos permitieron observar bacterias, como cocos, estafilococos, bastones.

Se logr reconocer la morfologa de las diferentes bacterias que se encontraban en los diferentes cultivos del laboratorio. Se logr realizar las coloraciones diferenciales como la de Gram, la de esporas y la tincin negativa.

VI.

RECOMENDACIONES

El frontis se debe dejar enfriar antes de colorearlo, no colorear antes. Cristal Violeta se debe de filtrar, pues puede contener sedimentos que alteren el resultado de la prctica. VII. BIBLIOGRFICAS REFERENCIAS

Brock, 1999. Biologa de los microorganismos. Prentice May international. Madrid. De la rosa, M; J, Prieto.2003. Microbiologa en ciencias de la salud. Segunda edicin. Edit. Elservier S.A. Madrid,Espaa. Daz, R; Gamazo, C. (2005). Manual prctico de Microbiologa. 2Ed.Edit; Masson, S.A. Barcelona. Koneman E, S. Allen. 2006. Diagnstico microbiolgico. Texto y Atlas en color. Sexta edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Kruiff, P. (2000) .Los cazadores de microbios. 2,Ed.Edit, Aguilar. Madrid. Madigan, M; Martinko, J. M. y Parker, J.(2003). Brock Biologa de los Prentice-Hall. Madrid. Olivas E, L. Alarcn. 2004. Manual de prcticas de Microbiologa bsica y Microbiologa de alimentos: Programa de Nutricin. Segunda reimpresin. Edit. Universidad Autnoma de Ciudad Jurez. Mxico. Pelczar, 1982. Microbiologa 2da edicin. Editorial Mc. Graw Hill. Mxico. Prescott, M; Harley, J. (1997). Microbiologa. 4 Ed.Edit.McGraw-Hill Interamericana. Madrid. Schlegel, H. (1997).Microbiologa General. Nueva Edicin.Edit, Ediciones Omega. Espaa. Tortora G, B. Funke y C. Case. 2007. Introduccin a la microbiologa. Novena edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. LINKOGRFICAS Microorganismos. 10, Ed.

www.wikilearning.com/...tinciones...microbiologia www.biol.unlp.edu.ar/microbiologiagral/laboratorioN1-2009