UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA LABORATORIO DE BIOQUIMICA II

DOCUMENTO DE APOYO PRCTICA 3

IDENTIFICACIN DE GLUCGENO EN EL HGADO ANIMAL lvarez, L; Barrillas, H; Barrios, L; Beato, J; Chajn, D; Chicas, E; Diguez, J; Hernndez, W; Ordoez, K; Pacheco, E; Paniagua, J; Snchez, J; GENERALIDADES DEL GLUCGENO El glucgeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra principalmente en el hgado y en el msculo representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso hmedo, respectivamente. El glucgeno se almacena hasta una cantidad mxima cercana a 100g en el hgado y unos 200g en los msculos. Pueden encontrarse pequeas cantidades de glucgeno en ciertas clulas gliales del cerebro. Una sola molcula de glucgeno puede contener ms de 120.000 molculas de glucosa. La importancia de que el glucgeno sea una molcula tan ramificada es debido a que: 1. La ramificacin aumenta su solubilidad. 2. La ramificacin permite la abundancia de residuos de glucosa, que al estar unidos entre si no poseen extremos reductores libres, que van a ser los lugares de unin de las enzimas glucgeno fosforilasa y glucgeno sintetasa, es decir, las ramificaciones facilitan tanto la velocidad de sntesis como la de degradacin del glucgeno. Esta ms ramificado que el almidn, las ramificaciones ocurren cada 8 a 10 residuos de glucosa con enlaces (1-6). Las enzimas - y -amilasas hidrolizan estos enlaces y tambin se produce dextrinas limite, que van a ser posteriormente hidrolizadas por una enzima desramificadora, la (1-6) glucosidasa. HIDRLISIS DE GLUCGENO Y PRUEBA DE FEHLING El glucgeno se libera de los tejidos que lo contienen por calentamiento con una base fuerte (KOH) hasta la destruccin total del tejido. La separacin del glucgeno del tejido se consigue mediante la adicin de etanol (precipita polisacridos y elimina los monosacridos solubles) El glucgeno posee una estructura ramificada con cadenas lineales de restos consecutivos de glucosa, unidos por enlaces (1-4), y por enlaces (1-6) en los puntos de ramificacin La hidrlisis de estos enlaces glucosdicos puede ser catalizada por algn cido mineral, el cual acta rompiendo enlaces al azar, con formacin intermediaria de todos los posibles oligosacridos y la conversin final de stos en glucosa (1). La reaccin cuantitativa de determinacin de los azucares reductores, denominada en general determinacin del ndice de cobre, se basa en la oxidacin del hidrato de cobre correspondiente con el licor de fehling, y la determinacin final de cobre formado por la reduccin del complejo que forma el ion cobre (2). El reactivo de Fehling, tambin conocido como Licor de Fehling, es una disolucin descubierta por el qumico alemn Hermann von Fehling, se utiliza como reactivo para la determinacin de azcares reductores. Se basa en el carcter reductor de los monosacridos y de la mayora de los disacridos (excepto la sacarosa).

El ensayo con el licor de Fehling se fundamenta en el poder reductor del grupo carbonilo de un aldehdo. ste se oxida a cido y reduce la sal de cobre (II) en medio alcalino a xido de cobre (I), que forma un precipitado de color rojo. Un aspecto importante de esta reaccin es que la forma aldehdo puede detectarse fcilmente aunque exista en muy pequea cantidad. Si un azcar reduce el licor de Fehling a xido de cobre (I) rojo, se dice que es un azcar reductor (3). Al aplicar esta prueba en el caso de hidrlisis de glucgeno, la reaccin ser positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo. La reaccin positiva indica que se ha conseguido romper el enlace O-glucosdico del glucgeno y por ende se encuentran en la solucin pptidos de diferentes longitudes capaces de participar en las reacciones de oxidorreduccin. La reaccin ser negativa si la muestra queda azul, o cambia a un tono azul-verdoso. ESQUEMA No. 1

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FUENTES DE ERROR O INTERFERENCIAS EN LOS RESULTADOS Si se trabaja con hgado de res debe ser fresco, no puede ser de un da antes, si es as el resultado da negativo. Al momento de la muerte el glucgeno contenido en el hgado se empieza a degradar rpidamente. Durante el calentamiento de la solucin sino se deja el tiempo suficiente o se pasa el tiempo de ebullicin, ms un exceso en el volumen del reactivo de Fehling no se forma el precipitado (CuO) (4). El licor de Fehling consiste de dos soluciones acuosas: Sulfato de cobre cristalizado y una sal de seignette Tartrato mixto de potasio y sodio. Ambas soluciones deben guardarse por separado. Si el reactivo es preparado 1 da antes se da una precipitacin del hidrxido de cobre (II). Y esto puede dar como negativa la prueba. (5)

PROCESO FISIOLGICO DEL GLUCGENO El glucgeno es una forma de almacenamiento de la glucosa fcilmente movilizable. ste es un polmero ramificado de residuos de glucosa. La mayora de los residuos de glucosa en el glucgeno estn ligados por enlaces glucsidos -1,4 (cadenas) y las ramificaciones se forman por enlaces glucosdicos -1,6 que se presentan con una frecuencia aproximada de uno por cada diez residuos (6).

Los dos lugares de almacenamiento de glucgeno son el hgado y el msculo esqueltico. La concentracin de glucgeno es superior en el hgado que en el msculo, pero se acumula ms glucgeno en el msculo esqueltico debido a tener una mayor masa. El glucgeno est presente en el citosol en forma de grnulos (6). El glucgeno del hgado se descompone en glucosa, que pasa a la corriente sangunea para ser utilizada por los tejidos. El glucgeno del msculo es una fuente de energa para la contraccin muscular (7). DEGRADACIN DEL GLUCGENO El glucgeno es degradado hasta un cierto lmite por la enzima glucgeno-fosforilasa, ya que sta enzima cesa de romper los enlaces -1,4 cuando alcanza el cuarto residuo terminal de un punto de ramificacin, y por otra parte, porque los enlaces glucosdicos -1,6 en los puntos de ramificacin no son susceptibles a la accin de la glucgeno-fosforilasa. Las etapas en la degradacin del glucgeno se pueden describir de la siguiente manera: La glucgeno-fosforilasa cataliza la eliminacin secuencial de residuos glucosdicos desde el extremo no reductor de la molcula de glucgeno para producir un tipo de azcar fosforilado llamado glucosa-1-fosfato. El enlace glucosdico entre el C-1 del residuo terminal y el C-4 del residuo adyacente entonces es roto por un grupo ortofosfato de la coenzima piridoxal fosfato, utilizado por la glucgeno fosforilasa para favorecer su accin. La glucgeno-fosforilasa deja de romper enlaces -1,4 cuando alcanza el cuarto residuo terminal de un punto de ramificacin. Despus se requiere de una nueva actividad enzimtica para trasladar el bloque de los tres residuos glucosilos que estn antes del punto de ramificacin, desde una rama a otra, y para ello se utiliza la enzima transferasa. Por accin de la transferasa queda expuesto el punto de ramificacin -1,6 que luego ser degradado por otra enzima. El residuo que queda en el punto de ramificacin con enlace -1,6 es hidrolizado por la enzima desramificante o -1,6-glucosidasa. Ese residuo del punto de ramificacin es liberado como glucosa libre para ser utilizada. As la transferasa y la enzima desramificante convierte la estructura ramificada en otra lineal, que facilita el camino para que la glucgeno-fosforilasa posteriormente rompa los enlaces -1,4 de la cadena lineal hasta llegar a las 4 unidades de distancia del prximo punto de ramificacin (6).
( F U E N T E :

BIBLIOGRAFA

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Chechektkin, A.V. et al 1980 Prcticas de bioqumica del ganado y Aves de corral URSS: Editorial Mir Mosc F. Klages. (1968). Tratado de Qumica Orgnica: Campos Especiales. Espaa: Editorial Reverte S.A. Licor de Fehling Disponible en http://sara-d-ita5.blogspot.com/2008_04_01_archive.html Manual de bioquimica Disponible en comunidad.uach.mx/./MANUAL_PRACT_BIOQUIMICA.pdf Practica glucgeno Disponible en www.scribd.com/doc/20709800/practica-glucogeno. Stryer, Lubert. 1976. Bioqumica. Espaa. Editorial Revert, S.A. 378-396 p. Staunton West, E.; Wilbert, T. et al. 1969. Bioqumica Mdica. 4 ed. Mxico. Editorial Interamericana S.A. 857-864. Berg J. M. y John L. Maraculla J. M. (trad). 2008. Bioqumica. 6 ed. Editorial Revert. Barcelona. 595 p. Universidad Autnoma de Chiapas. 2009. Obtencin de Glucgeno Heptico de Hgado de Pollo y Res. Disponible en http://www.scribd.com/doc/20709800/practica-glucogeno

ANEXOS SE CONOCEN DIVERSAS ENFERMEDADES DE ALMACENAMIENTO DE GLUCGENO DETERMINADAS GENTICAMENTE (6)

Tipo Enzima defectuoso rgano afectado Glucgeno afectado en el rgano Caractersticas clnicas Desarrollo voluminoso del hgado. Incapacidad de desarrollo. Severa hipoglucemia cetosis, hiperuricemia, hiperlipemia Un paro cardiorrespiratorio causa la muerte, generalmente antes de los dos aos de edad. Igual que el Tipo I, pero con un curso ms suavizado. Cirrosis progresiva del hgado. Un paro heptico origina la muerte generalmente antes de los 2 aos. Limitacin para realizar ejercicios vigorosos debido a los fuertes dolores musculares. Los pacientes son normales y bien desarrollados. Igual que el Tipo I, pero con un curso ms suavizado. Igual que el Tipo V. Aumento moderado del hgado. Hipoglucemia moderada.

I Enfermedad de Von Gierke

Glucosa - 6 -fosfatasa

Hgado y rin

Cantidad incrementada; estructura normal

II Enfermedad de Pompe III Enfermedad de Cori IV Enfermedad de Andersen

-1.4-glucosidasa (lisosomal) Amilo-1.6-glucosidasa (enzima desramificante) Enzima ramificante (-1.4 -1.6)

Todos los rganos Msculos e hgado

Incremento estructura normal

masivo;

Cantidad incrementada; ramificaciones externas cortas Cantidad normal; muy largas las ramas externas

Hgado y bazo

V Enfermedad de McArdle VI Enfermedad de Hers VII VIII

Fosforilasa

Msculo

Cantidad incrementada moderadamente; estructura normal Cantidad incrementada Cantidad incrementada; estructura normal Cantidad incrementada; estructura normal

Fosforilasa Fosfofrutoquinasa Fosforilasa quinasa

Hgado Msculo Hgado

(Cuadro 1. Desarrolla las enfermedades del almacenamiento de glucgeno. Fuente: Bioquimica, Lubert Stryer)

LA PANCREATECTOMA (7) La extirpacin del pncreas produce efectos diversos en los diferentes animales. Los cambios que se pueden observar son: 1. 2. 3. El azcar sanguneo aumenta a valores hiperglucmicos intensos. El glucgeno heptico y muscular, aunque este en menor proporcin. La glucosa que se ingiere se elimina en su totalidad en la orina.

La capacidad del hgado para desaminar aminocidos y formar azcar se conserva en sus lmites fisiolgicos. Desapareciendo la capacidad del mismo, de depositar y retener azcar en forma de glucgeno EFECTO DE LA PANCREATECTOMA EN DIVERSOS ANIMALES Animal Gato Cabra Cerdo Conejo Pato Mono Lechuza Efecto de la pancreatectoma Esencialmente como en el perro. Hiperglucemia, glucosuria y cetosis ligeras. Aumento del N urinario, pero menos que en el perro. Como en la cabra, pero con cetosis intensa. Glucosuria intensa sin cetosis. Sobrevive durante mucho tiempo sin insulina. No se registran trastornos metablicos o son muy leves. Cuando se le alimenta se observa glucosuria manifiesta y cetosis moderada. En ayunas, cetosis grave. Con buena alimentacin, hiperglucemia intensa. En ayunas puede morir en hipoglucemia. Fuente: Staunton, E, Bioqumica Medica