Universidade de vora Departamento de Qumica U.C.

Tecnologia de Enzimas

Trabalho Prtico n 2:
Ruptura das clulas e purificao da amidase da estirpe E.coli (pKK223-3 AI3) por cromatografia de afinidade.
Docentes: Prof Rosrio Martins Prof Ana Paula Pinto Discentes: Ctia Fernandes, n25892 Diana Balbino, n25920 Filipa Santos, n26895 Rita Bicho, n29744 Curso: Biotecnologia Turma B 7 de Novembro de 2012

Trabalho n2

ndice

Resumo ............................................................................................................................................................ 3 Introduo terica...................................................................................................................................... 4 Objectivos ....................................................................................................................................................... 9 Procedimento Experimental .............................................................................................................. 10 Material Laboratorial:....................................................................................................................... 10 Equipamentos: ..................................................................................................................................... 10 Solues:.................................................................................................................................................. 10 Procedimento: ...................................................................................................................................... 10 Resultados e Tratamento de Resultados ...................................................................................... 18 Discusso e Concluso .......................................................................................................................... 18 Bibliografia ................................................................................................................................................. 42

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

Trabalho n2

Resumo
Para preparao do extracto foram utilizadas as clulas de E.coli recombinantes, ao qual se adicionou tampo TMEG com benzamidina. Esta preparao foi ao equipamento de ultra-sons, para rebentamento da parede celular das clulas, e depois centrifugado e recolhido o sobrenadante. A separao e purificao da amidase, produzida pela bactria utilizada, foram efectuadas pelo mtodo de cromatografia por afinidade. Foi utilizada uma coluna de cromatografia com Sepharose 6B epoxiactivada com acetamida equilibrada com tampo TME. O extracto foi adicionado coluna e foram recolhidas as fraces de lavagem e lida a absorvncia a 250nm at diminuio desta aproximadamente at 0.05, indicando que todos compostos que no foram adsorvidos pela coluna foram eludos. Aps esta diminuio foram adicionados coluna solues de KCl de concentraes 20, 50, 75 e 100 mM em tampo TME, efectuando a eluio da amidase da coluna por gradiente. Estas fraces tambm foram recolhidas e a absorvncia tambm foi lida a 280nm. Seguidamente procedeu-se ao doseamento da actividade enzimtica do extracto celular enzimtico (no purificado), das fraces de lavagem e durante a eluio da amidase nas fraces j purificadas. Foram retirados 20 L de cada fraco para uma microplaca de ELISA, adicionado o substrato p-nitroacetanilida e lida a absorvncia a 405 nm durante cerca de 10 minutos. Este ensaio foi efectuado em triplicado para cada amostra. Depois com os resultados obtidos foram determinadas graficamente as velocidades de reaco, e com estas e a adaptao da Lei Lambert-Beer foi determinada a actividade enzimtica do extracto e das fraces purificadas com amidase. Para o doseamento da protena foi utilizado o mtodo de ligao do corante Azul de Coomassie G, para o extracto celular e para as fraces de eluio com actividade enzimtica. Foi elaborada a recta de calibrao para as solues padres de BSA, de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 40 g/mL preparadas a partir de uma soluo me de 2mg/mL de BSA. Para cada amostra foram efectuadas diluies, dependo se era ou no purificada, e foram retirados 100L de cada amostra e respectivas diluies para uma microplaca de ELISA, adicionando tambm o mesmo volume de azul de Comassie G., esperou-se 5 minutos para se dar a reaco e foi lida a absorvncia a 630nm; este ensaio foi efectuado em triplicado para cada amostra. Seguidamente, com os resultados obtidos, foi escolhida a melhor diluio que caa na gama dos valores padro da curva de calibrao e foi determinada a quantidade de protena no extracto celular e nas fraces purificadas com amidase, a partir da equao da recta de calibrao. Tambm foram calculados a actividade enzimtica especfica do extracto e das fraces purificadas com amidase, o rendimento e o factor de purificao deste processo experimental, a partir da quantidade de protena e das actividades enzimtica do extracto e das fraces purificadas com amidase obtidas.
Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012 3

Trabalho n2

Introduo terica
A Escherichia coli uma bactria bacilar Gram-negativa, uma bactria simbionte descoberta em 1885 pelo alemo-austraco Theodor Escherich. A E. coli assume a forma de um bacilo e pertence famlia das Enterobacteriaceae. So bactrias aerbias e anaerobias facultativas, tendo como habitat natural o lmen intestinal dos seres humanos e de outros animais. Possui ainda vrios flagelos dispostos em volta da clula.

Figura 1: Escherichia coli 0157:H7

A E. coli uma bactria nica capaz de produzir todos os componentes de que constituida, a partir de compostos bsicos e fontes de energia suficientes, algo que poucos seres vivos conseguem fazer, ainda lactase positiva, uma enzima fermentadora de acares. O genoma da E. coli, possui cerca de 5 milhes de pares de bases e vrios milhares de genes que codificam mais de 4000 protenas em contraste com o genoma humano que possui 3 bilhes de pares de bases e cerca de 27 mil protenas. Esta bactria foi e continua a ser muito estudada enquanto modelo geral para mecanismos biolgicos das bactrias, na rea da biologia molecular, tendo tambm um papel muito importante em bioengenharia e microbiologia industrial. Na vida quotidiana a E. coli tem importncia na: Avaliao da contaminao fecal em guas superficiais, de esturios e marinas. Monitorizao de guas recreacionais como piscinas, praias e lagos. um indicador fundamental para avaliar as condies de balneabilidade, de acordo com os padres nacionais.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

Trabalho n2

Avaliao da qualidade bacteriolgica de guas destinadas irrigao, descendentao de animais, criao de ostras e mariscos. Avaliao da eficincia dos sistemas de tratamento das estaes de tratamento de guas residuais. Monitorizao da qualidade de gua para consumo humano, da rede de distribuio, de guas minerais, poos, etc.

Os reactores descontnuos so os biorreactores mais utilizados na produo de enzimas em forma solvel. Quando uma cultura microbiana se desenvolve num sistema fechado, pode-se traar uma curva de crescimento microbiano. Esta pode ser dividida nas seguintes etapas ou fases: Fase Lag onde ainda no h um aumento significativo da populao, sendo o perodo necessrio para o microorganismo se adaptarem ao meio; Fase Log ou exponencial, nesta etapa h diviso celular mxima, as clulas esto plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando os seus constituintes e multiplicando-se; Fase estacionria que so sintetizados vrios metabolitos secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas; Fase de declnio na qual maioria das clulas est em processo de morte onde poder ser uma morte lenta ou de uma forma exponencial, nalguns casos ocorre a lise celular. Na curva iremos obter as diversas fases de crescimento na qual uma fase importante a fase exponencial onde as clulas crescem a uma taxa constante e mxima, nesta ser possvel determinar a taxa de crescimento exponencial, um factor muito importante para determinao do tempo mdio de gerao, comparao do desenvolvimento de estirpes e comparao do desenvolvimento de estirpes em diferentes condies.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

Trabalho n2

Figura 2: Curva de crescimento em sistemas fechados

Uma fase Lag longa poder significar que o inculo insuficiente para se multiplicar, poderemos ter uma cultura envelhecida, ou o meio e a temperatura so desfavorveis o que poder levar a no existncia da curva de crescimento. Na fase estacionria, os nutrientes comeam a escassear e os produtos txicos tornam-se mais abundantes, nesta etapa no h um crescimento lquido da populao, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem. Na curva iremos obter as diversas fases de crescimento na qual uma fase importante a fase exponencial onde as clulas crescem a uma taxa constante e mxima, nesta ser possvel determinar a taxa de crescimento exponencial, um fator muito importante para determinao do tempo medio de gerao, comparao do desenvolvimento de estirpes e comparao do desenvolvimento de estirpes em diferentes condies. A utilizao de enzimas como catalisadores de reaces de sntese de vrios compostos de interesse industrial tem recebido considervel ateno devido s conhecidas vantagens que as enzimas apresentam relativamente a catalisadores qumicos como a estereoespecificidade, a especificidade de substrato, o baixo consumo energtico, entre outras. A amidase um homohexmero em que cada subunidade da amidase apresenta um arranjo de quatro camadas, tipo sandwich (33% hlices- e 22% folhas-) com duas folhas- internas 21. No entanto, relativamente s outras nitrilases, a amidase apresenta uma folha- adicional na cadeia N-terminal e uma cadeia C-terminal mais longa. O sucesso deste enzima deve-se variedade de reaces que pode realizar e diversidade de especificidade, catalizando reaces onde amidas, cidos e esteres podem servir de substrato, o que levar obviamente obteno de uma enorme variedade de produtos de sntese alguns dos quais com aplicao industrial. De entre os vrios produtos de interesse industrial podem-se referir os cidos hidroxmicos amplamente utilizados na indstria farmacutica como
Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012 6

Trabalho n2

constituintes de antibiticos, factores de crescimento e inibidores de tumores. Entre os diferentes enzimas capazes de realizar reaces de sntese destes cidos hidroxmicos encontra-se a amidase de Pseudomonas aeruginosa. A amidase produzida por tecnologia de DNA recombinante em E.coli. As ferramentas de DNA recombinante h muito que so utilizadas por permitirem o controle e potenciao da sntese de enzimas e produtos que no so normalmente produzidos pelo microorganismo. As enzimas convertem o substrato (uma substncia) no produto (noutra substncia), em que o substrato liga-se a uma zona especfica da enzima (centro activo) e forma o complexo enzima-substrato. Enzima + Substrato Enzima + Produto Os enzimas so biocatalizadores porque aumentam a velocidade da reaco diminuindo a energia de activao necessria para a converso do substrato em produto; no so consumidos e no alteram o equilbrio qumico da mesma reaco e so muito especficos para a reaco que catalisam ou em relao aos substratos que transformam. A actividade enzimtica (UI) definida pela quantidade de enzima necessria para converter um micromole de substrato por minuto em determinadas condies favorveis. Esta actividade pode depender da presena de cofactores, em que o enzima necessita de ligao a molculas no proteicas para que possam exercer a sua funo. Tambm existem factores que influenciam a actividade enzimtica, afectando a velocidade da reaco: concentrao da enzima concentrao do substrato pH temperatura presena de activadores e inibidores

A velocidade cataltica de uma reaco enzimtica condicionada pela concentrao do enzima e do substrato. Com o aumento gradual da concentrao do enzima existe formao de produto at um certo limite, podendo afirmar-se que a velocidade de uma reaco enzimtica directamente proporcional concentrao do enzima, desde que haja excesso de substrato durante a reaco. Se
Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012 7

Trabalho n2

a concentrao de substrato for aumentada, mantendo a do enzima, aumenta a actividade enzimtica, at um certo ponto em que se verifica a saturao enzimtica, pois todo o enzima encontra-se na forma do complexo enzimasubstrato. O pH do meio onde se encontra o enzima um factor condicionante da actividade enzimtica, pois geralmente os enzimas tm um pH ptimo de actuao em que a sua actividade mxima; valores acima ou abaixo provocam diminuio de actividade enzimtica ou at inactivao da mesma. Geralmente a velocidade das reaces enzimticas proporcional temperatura a que estas decorrem e tambm apresentam uma temperatura ptima para uma velocidade mxima. Os enzimas quando sujeitos a baixas temperaturas ficam inactivos devido falta de energia de activao para provocar o choque entre as molculas enzimticas e as molculas do substrato; e quando sujeitas a altas temperaturas o enzima pode deixar de actuar devido desnaturao da protena que a constitui, perdendo-se a configurao espacial e consequentemente o centro activo da mesma. Vrias substncias, algumas de ocorrncia natural nas clulas e outras artificiais, tm a capacidade de fazer variar ou regular a actividade dos enzimas durante as reaces. As que ocorrem naturalmente regulam o metabolismo celular e as artificiais so sintetizadas para tratar doenas ou para estudar a forma de aco dos enzimas. Os efeitos destas substncias podem ser positivos ou activadores, quando aumentam a afinidade do enzima para o substrato e aceleram a reaco, ou podem ter efeitos negativos ou inibidores, quando reduzem a velocidade das reaces competindo com o substrato para a ligao enzima ou ligando-se ao complexo enzima-substrato. A cromatografia uma tcnica de separao baseada na distribuio dos componentes de uma mistura entre um fluido (fase mvel ou eluente) e um adsorvente (fase estacionria). A fase estacionria pode ser um slido ou um lquido depositado num slido inerte, empacotado numa coluna ou espalhado por uma superfcie formando uma camada fina. A cromatografia por afinidade baseia-se numa reaco muito especfica (ex.: enzima-substrato, enzima inibidor, anticorpo-antignio) sendo muito utilizada para compostos biolgicos. A fase estacionria um material inerte (normalmente agarose) que modificado quimicamente, atravs da ligao de compostos com afinidade especfica para as molculas que se querem separar, a fase mvel soluo tamponada aquosa que transporta os analtos.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

Trabalho n2

Figura 3: Imagem representativa do mtodo da cromatografia de afinidade

Objectivos
Este trabalho experimental teve como objectivo a utilizao a tcnica de cromatografia de afinidade para a purificao da amidase da estirpe recombinante de Escherichia coli (pKK223-3 AI3).

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

Trabalho n2

Procedimento Experimental
Material Laboratorial: Tubos de ensaio de plstico Tubo de ultrassons Provetas 10 mL e 50mL Microplacas Pontas para micropipetas Banho de gelo Eppendorfs Gaze Copos de precipitao Microplacas Suporte para eppendorfs Copos de precipitao Equipamentos: Micropipetas 1000L, 200L e 20L Aparelho de Ultrasons Leitor de microplacas Centrfuga refrigerada Coluna de cromatografia (seringa de 10 ou 20 mL) Bomba peristltica Cronmetro Solues: gua destilada Sepharose 6B epoxiactivada contendo acetamida Tampo de eluio: TME contendo KCl 100 mM Tampo TME TMEG com benzamidina Soluo de p-nitroacetanilida 1mM em tampo TME Extracto celular da estirpe recombinante de E. coli (pKK223-3 AI3) Soluo de BSA 2 mg/mL Soluo do corante Azul de Coomassie G-250 a 0,06% (p/v) em HCl 0,6N Procedimento: Nota: todo o extracto celular e todas as fraces que continham amidase foram mantidos em banho de gelo.
Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012 10

Trabalho n2

I - Preparao do extracto celular: 1. 2 mL de tampo TMEG com benzamidina em cada tubo

Clulas de E. coli (pKK223-3 AI3) 2. As clulas foram rebentadas por desintegrao ultrassnica a 105 W durante 30 segundos no Labsonic num banho de gelo, repetindo-se 5 vezes. 3. O extracto celular foi centrifugado a 12000 g durante 10 minutos e o sobrenadante foi recolhido. II - Preparao da coluna de cromatografia: Foi preparada uma coluna de cromatografia com Sepharose 6B epoxiactivada contendo acetamida e equilibrada com tampo TME.

Figura 1: Coluna de cromatografia com Sepharose 6B epoxiactivada contendo acetamida e equilibrada com tampo TME III Desenvolvimento do processo cromatogrfico: 1. O caudal de tampo TME foi regulado para cerca de 0,3 mL/min durante 10 a 15 minutos. 2. Aplicou-se coluna 3 mL de extracto celular enzimtico (preparado no ponto II.3 do procedimento) e quando estava quase no fim foi adicionadoa este 3 mL de TME. 3. Foram recolhidas as sucessivas fraces de lavagem com um volume aproximado de 1,5 mL, em eppendorfs.
Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012 11

Trabalho n2

4. Para cada fraco recolhida, a absorvncia foi lida a 280nm em funo do branco. 5. Quando o valor de absorvncia das fraces em relao ao branco se aproximou de 0,05, procedeu-se eluio por gradiente utilizando:

10 mL

20 mL

1:20 mM de KCl em TME

2:50 mM de KCl em TME

3:75 mM de KCl em TME

4:100 mM de KCl em TME

6. Continuou-se com os passos III-3 e III-4.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

12

Trabalho n2

IV Doseamento de actividade enzimtica: Procedeu-se ao doseamento da actividade no extracto celular enzimtico, nas fraces de lavagem de *5 a *10 e durante a eluio da amidase a partir do momento em que se comeou a registar um aumento de absorvncia a 280nm, ou seja, da fraco *32 a *64:

20L de cada fraco de suspenso celular

(Ensaio em triplicado de cada fraco) Adicionou-se 200L de p-nitroacetanilida 1mM com hidroxilamina a 25C e registou-se a variao de absorvncia a 405nm durante aproximadamente 10 min. 1 A B C D E F G H *48 *52 *56 *60 *64 2 *48 *52 *56 *60 *64 3 *48 *52 *56 *60 *64 4 *45 *49 *53 *57 *61 5 *45 *49 *53 *57 *61 6 *45 *49 *53 *57 *61 7 *46 *50 *54 *58 *62 8 *46 *50 *54 *58 *62 9 *46 *50 *54 *58 *62 10 *47 *51 *55 *59 *63 11 *47 *51 *55 *59 *63 12 *47 *51 *55 *59 *63

Figura 4:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com o extracto celular e fraces *45 a *64.

A B C D E F G H

1 *5 *6 *7 *8 *9 *10

2 *5 *6 *7 *8 *9 *10

3 *5 *6 *7 *8 *9 *10

10

11

12

Figura 5:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as fraces *5 a *10. Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012 13

Trabalho n2

A B C D E F G H

1 *32 *33 *34 *35 *36 *37 *38 *39

2 *32 *33 *34 *35 *36 *37 *38 *39

3 *32 *33 *34 *35 *36 *37 *38 *39

5 *40 *41 *42 *43 *44

6 *40 *41 *42 *43 *44

7 *40 *41 *42 *43 *44

10

11

12

Figura 6: Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as fraces *32 a *44. Legenda: Extracto celular ; Fraces

V Doseamento da protena: Procedeu-se ao doseamento de protenas, pelo mtodo de ligao do corante Azul de Coomassie G, do extracto celular e das fraces de eluio que apresentaram actividade enzimtica: 1.

Soluo me 2 mg/mL de BSA

1 g/mL de BSA

2 g/mL de BSA

5 g/mL de BSA

10 g/mL de BSA

15 g/mL de BSA

20 g/mL de BSA

40 g/mL de BSA

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

14

Trabalho n2

2. Para elaborao da recta de calibrao das solues padro de BSA, preparadas no ponto 1.:
100 L de soluo padro de BSA, preparada em 1.

100 L de azul de Comassie G.

(em triplicado)

Aguardou-se 5 minutos e registou-se a absorvncia a 630 nm 3. Para o doseamento da protena de cada amostra:

100 L de cada amostra: extracto celular nas diluies de 1:500, 1:1000,1:2000 fraces *39 a *51 nas diluies 1:100, 1:500, 1:1000

100 L de azul de Comassie G.

(em triplicado)

Aguardou-se 5 minutos e registou-se a absorvncia a 630 nm

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

15

Trabalho n2

A B C D E F G H

1 1 2 5 10 15 20 40

2 1 2 5 10 15 20 40

3 1 2 5 10 15 20 40

10

11

12

Figura 7:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as solues padro de BSA.

A B C D E F G H

1 2 3 1:500 1:500 1:500 1:1000 1:1000 1:1000 1:2000 1:2000 1:2000

10

11

12

Figura 8:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com os extractos celulares.

A B C D E F G H

1 *39 *43 *47 *51 *42 *46 *50 *41

2 *39 *43 *47 *51 *42 *46 *50 *41

3 *39 *43 *47 *51 *42 *46 *50 *41

4 *40 *44 *48 *39 *43 *47 *51 *42

5 *40 *44 *48 *39 *43 *47 *51 *42

6 *40 *44 *48 *39 *43 *47 *51 *42

7 *41 *45 *49 *40 *44 *48 *39 *43

8 *41 *45 *49 *40 *44 *48 *39 *43

9 *41 *45 *49 *40 *44 *48 *39 *43

10 *42 *46 *50 *41 *45 *49 *40 *44

11 *42 *46 *50 *41 *45 *49 *40 *44

12 *42 *46 *50 *41 *45 *49 *40 *44

Figura 9:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as fraces *39 a *44.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

16

Trabalho n2

A B C D E F G H

1 *45 *49

2 *45 *49

3 *45 *49

4 *46 *50

5 *46 *50

6 *46 *50

7 *47 *51

8 *47 *51

9 *47 *51

10 *48

11 *48

12 *48

Figura 10:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as fraces *45 a *51.

Legenda: Extracto celular ; Solues padro de BSA ; Fraco 1:100 ; Fraco 1:500 ; Fraco 1:1000

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

17

Trabalho n2

Resultados e Tratamento de Resultados

I Purificao por Cromatografia de Afinidade: Os valores registados na absorvncia a 280 nm (tabela 1) foram utilizados para traar o cromatograma (grfico 1) correspondente ao processo de purificao da amidase recombinante, de fraces contendo o eluente da cromatografia.
Tabela 1: Valores de absorvncia para cada volume de eluio
Volume Eluio (mL) 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5 15 16,5 18 19,5 21 22,5 24 25,5 27 28,5 30 31,5 33 Volume Eluio (mL) 34,5 36 37,5 39 40,5 42 43,5 45 46,5 48 49,5 51 52,5 54 55,5 57 58,5 60 61,5 63 64,5 66 Volume Eluio (mL) 67,5 69 70,5 72 73,5 75 76,5 78 79,5 81 82,5 84 85,5 87 88,5 90 91,5 93 94,5 96

Eppendorf *

Absorvncia (280 nm)

Eppendorf *

Absorvncia (280 nm)

Eppendorf *

Absorvncia (280 nm)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

0,177 0,094 0,083 0,081 1,979 3,719 3,719 1,801 1,98 2,279 1,833 1,5 1,267 1,089 0,895 0,796 0,729 0,652 0,568 0,516 0,478 0,46

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

0,442 0,417 0,392 0,362 0,335 0,316 0,416 0,602 0,533 0,458 0,637 0,741 0,82 0,774 0,778 1,024 1,679 1,88 1,863 1,43 1,116 0,95

45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64

1,079 1,759 1,804 1,573 1,419 1,242 1,46 3,726 3,726 3,726 3,727 2,766 1,979 1,724 1,423 1,209 1,019 0,868 0,743 0,622

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

18

Trabalho n2

Grfico 1: Cromatografia de afinidade, realizada para purificao da amidase recombinante

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

19

Trabalho n2

II Determinao da Actividade Enzimtica: Seguidamente, foi elaborado o estudo da actividade enzimtica, fazendo ensaios enzimticos para as vrias fraces (tabela 2). Foram utilizadas as fraces purificadas no incio da cromatografia (eppendorf *5 a *10), durante a diluio com KCl de 50mM a 100mM, quando se observou o aumento de absorvncia a 280nm (eppendorf *32 a *64) e o extracto enzimtico, que no foi purificado.
Tabela 2: Estudo enzimtico- registo da absorvncia do extracto celular e das fraces purificadas
Tempo (minutos) Antes da Purificao (Extrato Celular) 1 Ensaio 2 3 Eppendorf 6 Eppendorf 5 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 0 0,295 0,795 1,137 0,229 0,264 0,269 0,221 0,267 0,269 0,121 0,122 0,128 0,108 0,105 0,098 0,118 0,101 0,100 0,153 0,103 0,104 1 0,362 1,004 1,266 0,178 0,224 0,259 0,173 0,226 0,252 0,122 0,122 0,120 0,108 0,105 0,098 0,102 0,102 0,100 0,125 0,102 0,104 2 0,437 1,215 1,471 0,124 0,165 0,23 0,164 0,168 0,226 0,122 0,121 0,120 0,108 0,105 0,098 0,103 0,102 0,100 0,109 0,102 0,103 3 0,506 1,42 1,658 0,124 0,112 0,187 0,163 0,159 0,201 0,122 0,121 0,120 0,108 0,106 0,098 0,103 0,102 0,100 0,109 0,102 0,103 4 0,574 1,614 1,827 0,123 0,112 0,149 0,162 0,159 0,176 0,122 0,121 0,120 0,108 0,106 0,099 0,103 0,102 0,101 0,109 0,102 0,103 5 0,659 1,793 1,974 0,123 0,112 0,115 0,161 0,158 0,156 0,123 0,121 0,120 0,108 0,106 0,099 0,103 0,102 0,101 0,109 0,102 0,103 6 0,741 1,957 2,104 0,121 0,112 0,115 0,161 0,157 0,156 0,123 0,122 0,121 0,108 0,106 0,099 0,103 0,103 0,101 0,108 0,102 0,104 7 0,83 2,11 2,210 0,121 0,112 0,116 0,16 0,156 0,156 0,123 0,122 0,121 0,108 0,106 0,099 0,103 0,103 0,102 0,108 0,102 0,104 8 0,919 2,247 2,300 0,121 0,112 0,116 0,161 0,155 0,157 0,123 0,122 0,121 0,108 0,106 0,099 0,103 0,103 0,101 0,108 0,103 0,105

Absorvncia (405nm)

Aps a Purificao

Eppendorf 10 Eppendorf 9

Eppendorf 8

Eppendorf 7

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

20

Trabalho n2
Tempo (min) Eppendorf 32 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 0 0,08 0,087 0,083 0,091 0,087 0,085 0 0,085 0,087 0,09 0,092 0,083 0,095 0,092 0,092 0,09 0,092 0,09 0,117 0,109 0,105 0,225 0,214 0,144 0,149 0,127 0,124 1 0,08 0,087 0,083 0,09 0,088 0,085 0,084 0,085 0,087 0,09 0,092 0,084 0,095 0,093 0,092 0,09 0,093 0,09 0,125 0,116 0,114 0,278 0,263 0,176 0,192 0,165 0,163 2 0,08 0,087 0,084 0,09 0,088 0,085 0,084 0,086 0,087 0,09 0,093 0,084 0,095 0,093 0,092 0,09 0,093 0,09 0,134 0,125 0,122 0,329 0,313 0,205 0,237 0,202 0,204 3 0,08 0,087 0,084 0,09 0,088 0,085 0,084 0,086 0,087 0,09 0,093 0,084 0,095 0,092 0,092 0,09 0,093 0,09 0,144 0,133 0,132 0,381 0,364 0,239 0,283 0,239 0,245 4 0,08 0,087 0,084 0,09 0,087 0,085 0,085 0,086 0,087 0,09 0,093 0,084 0,095 0,092 0,092 0,091 0,093 0,091 0,154 0,143 0,142 0,436 0,418 0,269 0,329 0,274 0,288 5 0,08 0,087 0,084 0,09 0,087 0,086 0,085 0,086 0,088 0,09 0,093 0,084 0,095 0,092 0,092 0,091 0,094 0,091 0,164 0,152 0,152 0,493 0,473 0,306 0,378 0,314 0,330 6 0,08 0,087 0,084 0,09 0,087 0,086 0,085 0,086 0,088 0,09 0,093 0,084 0,095 0,092 0,092 0,091 0,094 0,091 0,174 0,161 0,163 0,551 0,528 0,347 0,428 0,356 0,374 7 0,08 0,088 0,084 0,09 0,087 0,086 0,085 0,086 0,088 0,091 0,093 0,084 0,096 0,092 0,092 0,091 0,094 0,092 0,184 0,171 0,173 0,61 0,586 0,392 0,48 0,400 0,419 8 0,08 0,088 0,085 0,09 0,087 0,086 0,085 0,087 0,088 0,091 0,093 0,084 0,096 0,092 0,092 0,091 0,094 0,092 0,195 0,18 0,184 0,671 0,641 0,437 0,533 0,446 0,465

Absorvncia (405 nm)

Aps purificao

Eppendorf 40

Eppendorf 39

Eppendorf 38

Eppendorf 37

Eppendorf 36

Eppendorf 35

Eppendorf 34

Eppendorf 33

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

21

Trabalho n2

Eppendorf 41

0,141

0,178

0,220

0,266

0,311

0,353

0,397

0,443

0,491

2 3

0,176 0,084 0,139 0,124 0,123 0,125 0,121 0,123 0,121 0,118 0,121 0,117 0,115 0,105 0,102 0,10 0,095 0,095 0,096 0,100 0,101 0,100 0,091 0

0,239 0,085 0,172 0,155 0,157 0,153 0,148 0,155 0,142 0,14 0,140 0,133 0,129 0,119 0,111 0,109 0,105 0,100 0,100 0,104 0,106 0,105 0,096 1

0,310 0,086 0,207 0,188 0,191 0,183 0,176 0,190 0,163 0,163 0,160 0,148 0,145 0,134 0,12 0,119 0,116 0,106 0,106 0,110 0,111 0,111 0,101 2

0,385 0,086 0,244 0,221 0,228 0,212 0,205 0,225 0,187 0,187 0,180 0,165 0,161 0,151 0,132 0,129 0,127 0,111 0,111 0,115 0,116 0,116 0,107 3

0,461 0,086 0,282 0,257 0,267 0,242 0,234 0,258 0,211 0,211 0,202 0,182 0,177 0,167 0,143 0,138 0,138 0,117 0,116 0,121 0,121 0,122 0,112 5

0,537 0,086 0,322 0,293 0,306 0,272 0,264 0,293 0,235 0,234 0,224 0,199 0,195 0,184 0,154 0,149 0,150 0,123 0,122 0,127 0,127 0,128 0,117 6

0,615 0,086 0,361 0,329 0,346 0,304 0,295 0,330 0,260 0,259 0,247 0,218 0,213 0,202 0,166 0,160 0,163 0,130 0,127 0,133 0,133 0,134 0,123 7

0,695 0,085 0,400 0,368 0,388 0,338 0,326 0,371 0,286 0,284 0,271 0,237 0,232 0,221 0,178 0,172 0,176 0,137 0,133 0,140 0,138 0,140 0,128 8 0,09

0,778 0,086 0,437 0,406 0,431 0,373 0,358 0,410 0,312 0,309 0,296 0,258 0,251 0,239 0,190 0,184 0,189 0,144 0,140 0,147 0,145 0,147 0,134 9 0,091 0,091 0,093

Eppendorf 42 Eppendorf 43 Eppendorf 44 Eppendorf 45 Eppendorf 46 Eppendorf 47 Eppendorf 48

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Tempo (min) Eppendorf 49 Absorvncia (405mn) Aps Purificao 1 2 3

0,087 0,088 0,09

0,088 0,088 0,09

0,088 0,088 0,09

0,088 0,088 0,091

0,089 0,089 0,091

0,089 0,089 0,092

0,09 0,09 0,092

0,091 0,093

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

22

Trabalho n2
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 0,09 0,082 0,085 0,095 0,092 0,094 0,101 0,094 0,087 0,084 0,089 0,089 0,083 0,083 0,085 0,083 0,096 0,09 0,09 0,103 0,082 0,085 0,085 0,089 0,086 0,085 0,087 0,091 0,081 0,085 0,096 0,092 0,094 0,100 0,094 0,087 0,085 0,089 0,089 0,083 0,083 0,085 0,083 0,096 0,09 0,091 0,101 0,082 0,085 0,085 0,089 0,086 0,085 0,086 0,091 0,082 0,085 0,095 0,092 0,094 0,100 0,095 0,088 0,085 0,089 0,090 0,083 0,083 0,085 0,083 0,096 0,09 0,091 0,100 0,082 0,085 0,085 0,09 0,086 0,085 0,086 0,091 0,083 0,085 0,095 0,092 0,093 0,100 0,095 0,088 0,085 0,089 0,089 0,084 0,084 0,086 0,084 0,095 0,09 0,091 0,099 0,082 0,085 0,084 0,09 0,086 0,086 0,086 0,092 0,083 0,086 0,094 0,092 0,093 0,101 0,095 0,088 0,085 0,090 0,090 0,084 0,084 0,085 0,084 0,096 0,09 0,091 0,099 0,082 0,085 0,084 0,09 0,086 0,086 0,087 0,092 0,084 0,087 0,094 0,092 0,093 0,101 0,095 0,089 0,085 0,090 0,090 0,084 0,084 0,086 0,084 0,095 0,090 0,092 0,098 0,082 0,085 0,085 0,091 0,086 0,087 0,086 0,093 0,084 0,087 0,094 0,091 0,092 0,101 0,095 0,089 0,086 0,089 0,090 0,084 0,084 0,086 0,084 0,095 0,090 0,092 0,098 0,082 0,085 0,085 0,091 0,086 0,087 0,087 0,093 0,084 0,088 0,094 0,092 0,092 0,101 0,096 0,09 0,086 0,090 0,090 0,084 0,085 0,086 0,084 0,096 0,09 0,092 0,098 0,082 0,085 0,085 0,091 0,086 0,087 0,087 0,094 0,085 0,088 0,094 0,093 0,092 0,101 0,096 0,091 0,086 0,090 0,090 0,084 0,085 0,086 0,084 0,095 0,089 0,092 0,097 0,083 0,086 0,085 0,091 0,086 0,087 0,087

Eppendorf 58

Eppendorf 57

Eppendorf 56

Eppendorf 55

Eppendorf 54

Eppendorf 53

Eppendorf 52

Eppendorf 51

Eppendorf 50

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

23

Trabalho n2

Eppendorf 59

0,092

0,092

0,092

0,092

0,091

0,092

0,092

0,092

0,091

2 3

0,097 0,084 0,091 0,091 0,081 0,09 0,088 0,087 0,083 0,086 0,086 0,088 0,082 0,079 0,093 0,091 0,094

0,097 0,083 0,091 0,091 0,081 0,089 0,089 0,087 0,084 0,086 0,086 0,088 0,082 0,079 0,093 0,091 0,093

0,097 0,084 0,092 0,091 0,081 0,088 0,088 0,087 0,084 0,087 0,086 0,088 0,082 0,079 0,094 0,091 0,093

0,097 0,083 0,092 0,091 0,081 0,087 0,088 0,087 0,084 0,087 0,086 0,088 0,082 0,079 0,093 0,091 0,093

0,097 0,084 0,092 0,091 0,082 0,088 0,088 0,087 0,097 0,087 0,086 0,089 0,082 0,079 0,094 0,091 0,093

0,097 0,084 0,092 0,092 0,082 0,087 0,088 0,087 0,097 0,087 0,086 0,088 0,082 0,079 0,094 0,091 0,093

0,097 0,084 0,091 0,091 0,082 0,087 0,088 0,087 0,097 0,087 0,086 0,088 0,082 0,079 0,094 0,091 0,093

0,096 0,084 0,092 0,092 0,082 0,087 0,088 0,087 0,098 0,087 0,086 0,088 0,082 0,080 0,094 0,091 0,093

0,097 0,084 0,091 0,092 0,082 0,087 0,088 0,087 0,098 0,087 0,086 0,087 0,083 0,080 0,094 0,092 0,093

Eppendorf 60

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Os grficos correspondes absorvncia em funo do tempo foram construdos, para cada fraco purificada e no purificada (grficos 2 a 13). Todas as fraces so representadas, excepto as fraces correspondentes ao eppendorf *5 a *10; isto pelo facto de estas fraces iniciais no apresentarem actividade enzimtica, por isso, a representao grfica de todas denecessria, mostrando apenas o grfico do eppendorf *8, servindo como grfico exemplo (grfico 3).

Eppendorf 64

Eppendorf 63

Eppendorf 62

Eppendorf 61

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

24

Trabalho n2
2,5 y = 0,1831x + 0,8406 R = 0,9949

Absorvncia (nm)

y = 0,1511x + 1,1675 R = 0,9873

1,5
Ensaio 1 1 y = 0,0777x + 0,2807 R = 0,9972 Ensaio 2 Ensaio 3

0,5

0 0 2 4 6 8 10

Tempo (min)
Grfico 2: Registo da Absorvancia em funo do tempo para o extrato celular (antes da purificao)

0,11 0,108

y = 0,108 R = 0

Absorvncia (nm)

0,106 0,104 0,102 0,1 0,098 0,096 0 2 4 6 y = 0,0002x + 0,1051 R = 0,675 Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3

y = 0,0002x + 0,0979 R = 0,75

8 10

Tempo (min)
Grfico 3: Registo da Absorvncia em funo do tempo, para a fraco purificada do eppendorf 8.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

25

Trabalho n2 0,8 Absorvncia (nm) 0,7

0,6
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

y = 0,0536x + 0,2078 R = 0,9993

y = 0,0556x + 0,2192 R = 0,9991 y = 0,0362x + 0,1347 R = 0,9932

Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3

0
0 2 4 6 Tempo (min) 8 10

Grfico 4: Registo da Absorvncia em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 39.

0,6
0,5 y = 0,048x + 0,1425 R = 0,9988 y = 0,0426x + 0,1198 R = 0,9994 y = 0,0394x + 0,1227 R = 0,9981 Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3

Absorvncia (nm)

0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 6 Tempo (min) 8 10

Grfico 5: Registo da Absorvncio em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 40.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

26

Trabalho n2
0,9 0,8

Absorvncia (nm)

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 6 8

y = 0,0756x + 0,1637 R = 0,999 y = 0,0439x + 0,1354 R = 0,9994 y = 0,0001x + 0,085 R = 0,2526

Ensaio 1

Ensaio 2
Ensaio 3

10

Tempo (min)
Grfico 6: Registo da Absorvncio em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 41.

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 2

Absorvncia (nm)

y = 0,0377x + 0,1341 R = 0,9993

y = 0,0354x + 0,1187 R = 0,9988

Ensaio 1

y = 0,0386x + 0,1166 R = 0,9985

Ensaio 2
Ensaio 3

Tempo (min)

10

Grfico 7: Registo da Absorvncio em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 42.

0,45 0,4

Absorvncia (nm)

0,35 0,3 0,25 0,2

y = 0,0357x + 0,1187 R = 0,9988 Ensaio 1 y = 0,0308x + 0,1214 R = 0,9988 y = 0,0297x + 0,1177 R = 0,9993 Ensaio 2 Ensaio 3

0,15
0,1 0,05 0 0 2

Tempo (min)

10

Grfico 8: Registo da Absorvncio em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 43.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

27

Trabalho n2

0,35

Absorvncia (nm)

0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 2

y = 0,0239x + 0,116 R = 0,9997 y = 0,0219x + 0,1172 R = 0,9981 y = 0,0239x + 0,116 R = 0,9997

Ensaio 1

Ensaio 2
Ensaio 3

10

Tempo (min)
Grfico 9: Registo da Absorvncio em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 44.

0,3 Absorvancia (nm)

0,25
0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 2

y = 0,0175x + 0,1141 R = 0,9977 y = 0,0169x + 0,1017 R = 0,9982 y = 0,0171x + 0,1116 R = 0,9979

Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3

10

Tempo (min)
Grfico 10: Registo da Absorvncia em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 45.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

28

Trabalho n2
0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 y = 0,0105x + 0,0982 R = 0,9976 y = 0,0111x + 0,0995 R = 0,998

Absorvancia (nm)

y = 0,0118x + 0,0928 R = 0,9979 Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3

0,02
0 0 2 4 6 8 10

Tempo (nm)
Grfico 11: Registo da Absorvncio em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 46.

0,16

Absorvncia (nm)

0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 2

y = 0,0059x + 0,0983 R = 0,996 y = 0,0055x + 0,0949 R = 0,9975

y = 0,0061x + 0,0936 R = 0,9964

Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3

10

Tempo (min)
Grfico 12: Registo da Absorvncio em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 47.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

29

Trabalho n2
0,16 0,14

Absorvncia (nm)

y = 0,0059x + 0,0992 R = 0,9986

y = 0,0054x + 0,0906 R = 0,9995 Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3

0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 2 4 6 8 10 y = 0,0055x + 0,1002 R = 0,9978

Tempo (min)
Grfico 13: Registo da Absorvncia em funo do tempo, para a freaco purificada do eppendorf 47.

Para determinao da actividade enzimtica, a Lei de Lambert-Beer foi adaptada, sendo possvel utilizar os dados obtidos. Com a existncia dos dados obtidos da velocidade das reaces enzimticas (variao da absorvncia com o tempo), ento divide-se ambos os lados da equao por t:
( ) ( ) ( )

Em que com esta adaptao tem-se todos os dados necessrio para o clculo da actividade enzimtica (( )), sendo (11500 M-1cm-1) e l (1cm) constantes. Seguidamente, foram feitos os clculos para determinao da actividade enzimtica final que existia na cultura, correspondente ao ensaio enzimtico. Como clculo exemplo, para o extracto celular no purificado do ensaio 1: ( ) ( )

Este valor est expresso em molaridade e como o ensaio enzimtico condiz a um valor total de 0,2mL, tem-se: ( )

No ensaio enzimtico apenas 20L foram utilizados, tendo sido retirados de um volume final de 3000 L. Ento, tem-se:
Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012 30

Trabalho n2

O resultado anterior tem que ser convertido mol em mol, para obteno da actividade enzimtica da cultura em UI: ( )

Os resultados dos restantes ensaios foram tratados da mesma forma que o exemplo dado para o ensaio 1. Como clculo exemplo, para cada fraco purificada que contem amidase, para o ensaio 1 do eppendorf 39: ( ) ( )

Este valor est expresso em molaridade e como o ensaio enzimtico condiz a um valor total de 0,2mL, tem-se: ( )

No ensaio enzimtico apenas 20L foram utilizados, tendo sido retirados de um tubo eppendorf com volume final de 1500L. Ento, tem-se: ( )

O resultado anterior tem que ser convertido mol em mol, para obteno da actividade enzimtica da cultura em UI: ( ) ( )

Os resultados dos restantes ensaios foram tratados da mesma forma que o exemplo dado para o ensaio 1 do eppendorf 39. Para melhor e facilitada visualizao dos resultados da actividade enzimtica dos restantes eppendorfs foi elaborada uma tabela:

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

31

Trabalho n2
Tabela 3: Actividade Enzimtica mdia para cada amostra recolhida e para cada tempo

Eppendorf * Extracto

Poo A1 A2 A3 H1 H2 H3 A5 A6 A7 B5 B6 B7 C5 C6 C7 D5 D6 D7 E5 E6 E7 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3

Velocidade da reaco (min1) (declive) 0,0777 0,1511 0,1831 0,0536 0,0556 0,0362 0,048 0,0394 0,0426 0,0439 0,0756 0,0001 0,0377 0,0354 0,0386 0,0308 0,0297 0,0357 0,0239 0,0239 0,0219 0,0175 0,0171 0,0169 0,0111 0,0105 0,0118 0,0061 0,0055 0,0059 0,0055 0,0059 0,0054

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

Actividade Enzimtica (UI) Por Poo Mdia 0,203 0,394 0,358 0,478 0,0699 0,0725 0,063 0,0472 0,0626 0,0514 0,057 0,0556 0,0573 0,0986 0,052 0,00013 0,0492 0,0462 0,049 0,0503 0,0402 0,0388 0,042 0,0466 0,0312 0,0312 0,030 0,0286 0,0228 0,0223 0,022 0,0220 0,0145 0,0137 0,015 0,0154 0,0004 0,0072 0,005 0,0077 0,0072 0,0077 0,007 0,0070

Desvio Padro 0,1409

0,0139

0,0057

0,0494

0,0021

0,0042

0,0015

0,0004

0,0009

0,0041

0,0004

O valor mdio de actividade enzimtica no extracto celular de 0,358 UI. A soma das actividades das vria fraces de 0,202 UI. de salientar que este ultimo valor referido no incluu os eppendorfs *42, *43, *45, *46, *47, *48, tendo sido desprezados.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

32

Trabalho n2

III Quantificao da Protena: Continuamente determinou-se a concentrao de protena, tanto no extracto no purificado como nas fraces purificadas com amidase. Foi construda uma curva de calibrao, apartir das absorvncias lidas das solues padro de BSA de diferentes concentraes . Os valores de absorvncia para cada concentrao e a curva de calibrao encontram-se na tabela 4 e no grfico 14, respectivamente.
Tabela 4: Registo da Absorvncia em funo da concentrao de padres de BSA

Absorvncia (630 nm) Ensaio 1 1 2 3 Mdia Desvio Padro 0,348 0,343 0,328 0,339 0,0104 2 0,353 0,357 0,344 0,351 0,0067
[Padres] (g/mL)

5 0,426 0,434 0,449 0,436 0,0117

10 0,426 0,434 0,449 0,436 0,0117

15 0,539 0,571 0,585 0,565 0,0236

20 0,518 0,600 0,586 0,568 0,0439

40 0,613 0,664 0,712 0,663 0,0439

0,700 0,600 0,500 Absorvncia 0,400 0,300 0,200 0,100 y = 0,0126x + 0,3385 R = 0,915

0,000
0 5 10 [BSA] (g/mL) 15 20 25

Grfico 13: Curva de Calibrao de padres de BSA

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

33

Trabalho n2

Logo a seguir, a absorvncia do extracto no puricado e das fraces purificadas que contm amidase foi lida (tabela 5).
Tabela 5: Registo da Absorvncia das amostras do extracto celular e das fracoes purificadas com amidase, nas diferentes diluies

Ensaio 1:500 Diluio 1:1000 1:2000 39 40 41 42 Eppendorf * 1:100 43 44 45 46 47 Diluio 48 39 40 41 42 Eppendorf * 1:500 43 44 45 46 47 48

1 0,428

2 0,41

3 0,418

Mdia 0,419 0,322 0,294 0,419 0,393 0,359 0,331 0,314 0,347 0,300 0,309 0,272 0,312 0,341 0,295 0,287 0,262 0,261 0,283 0,315 0,265 0,245 0,264

Desvio Padro 0,00902 0,00874 0,00361 0,00987 0,01305 0,00361 0,00900 0,00153 0,0000 0,00751 0,00755 0,00950 0,00666 0,00404 0,00361 0,00513 0,00850 0,01249 0,01069 0,00929 0,00436 0,02919 0,03099 34

Extracto no purificado

0,329 0,324 0,312 0,29 0,297 0,295

0,426 0,424 0,408 0,394 0,405 0,379 0,362 0,355 0,322 0,331 0,36 0,34

0,314 0,316 0,313 0,347 0,347 0,347 0,293 0,301 0,3 0,31 0,308 0,316

Fraces purificadas contendo amidase

Absorvncia (630 nm)

0,272 0,282 0,263 0,315 0,316 0,304 0,339 0,339 0,346 0,296 0,298 0,291 0,281 0,291 0,288 0,268 0,265 0,252 0,257 0,275 0,251 0,271 0,29 0,289

0,309 0,311 0,326 0,262 0,263 0,27 0,26 0,263 0,211

0,228 0,279 0,284

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

Trabalho n2 39 40 41 42 Eppendorf * 1:1000 43 44 45 46 47 48 0,297 0,314 0,334 0,285 0,281 0,286 0,268 0,274 0,274 0,264 0,27 0,277 0,315 0,284 0,272 0,270 0,276 0,271 0,223 0,224 0,229 0,238 0,01852 0,00265 0,00346 0,00651 0,00153 0,01137 0,00702 0,00451 0,01305 0,00551

0,276 0,275 0,278 0,284 0,262 0,268 0,23 0,222 0,216

0,224 0,228 0,219 0,225 0,219 0,244 0,244 0,235 0,234

Com os valores obtidos e a curva de calibrao da protena calculou-se a concentrao de protena. No caso do extracto no purificado, foi utilizado o valor da diluio 1:500, sendo a menor diluio em que absorvncia cai dentro da gama dos valores dos padres. Ento:

[ [ [ ] ]

Multiplicando pelo facto de diluio: [ ]

Voltando a multiplicar o valor anterior por 3mL, correspondente ao volume de extracto purificado na coluna cromatogrfica, tem-se:

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

35

Trabalho n2

Em relao s fraces purificadas que contm amidase, a diluio utilizada foi de 1:100, sendo a menor diluio cuja absorvncia cai dentro da gama dos valores padro. Como clculo exemplo foi utilizado o eppendorf *39. Ento:

[ [ [ ] ]

Multiplicando pelo facto de diluio: [ ]

Voltando a multiplicar o valor anterior por 1,5mL, correspondente ao volume de cada eppendorf, tem-se:

Procedendo de igual modo para as restantes fraces, obtiveram-se os seguintes resultados:

Tabela 6: Quantidade de protena nas fraces purificadas que contm amidase

Eppendorf * Protena (mg) 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 0,959 0,649 0,244 -0,089 -0,292 0,101 -0,458 -0,351 -0,792 -0.315

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

36

Trabalho n2

de salientar os valores negativos para as fraces *42, *43, *45, *46, *47 e *48. Estes valores foram desprezados para o clculo total de protena. O valor de protena no extracto de 9mg e o total de protena para as vrias fraces com amidase de 1,95mg.

IV Corrida cromatogrfica, rendimento e factor de purificao: Para resumo de todos os resultados obtidos anteriormente o prximo grfico mostra o cromatograma e a actividade enzimtica.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

37

Trabalho n2

Grfico 15: Cromatograma e actividade enzimtica ao longo do tempo de eluio

As fraces *5 a *10 foram includas no grfico, em que o valor foi determinado como zero.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

38

Trabalho n2

Foram determinados os parmetros associados ao processo de purificao, o rendimento () e o factor de purificao, respectivamente:

As actividades enzimticas especficas foram determinadas:

Tabela7: Purificao ilustrativa do processo

Protena (mg) Extracto no purificado Fraces purificantes com amidase 9

Actividade Actividade Enzimtica Enzimtic Especfica (UI/mg a (UI) protena) 0,358 0,0398

(%)

Factor de purificao

56 1,95 0,202 0,104

2,61

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

39

Trabalho n2

Discusso e Concluso
Neste trabalho analismos os parmetros relacionados com a estirpe recombinante em estudo, Escherichia coli pKK223-3 AI3, e a tcnica de purificao por cromatografia de afinidade, tais como: a separao e purificao da amidase produzida pela bactria por esta tcnica, a actividade enzimtica no incio e da amidase purificada, a quantidade de protena no incio e aps purificao, o rendimento do processo e o factor de purificao. A purificao da amidase produzida pela Escherichia coli recombinante, por cromatografia, foi a primeira parte do trabalho. Verifica-se pelo grfico 1, a absorvncia foi aumentando rapidamente e foram necessrios cerca de 39mL de tampo TME para diminuir a absorvncia para um nvel mais baixo e estvel, indicando que todo o contedo do extracto enzimtico celular que no foi absorvido pela coluna cromatogrfica foi eludo at esse ponto. Os valores de absorvncia voltaram a aumentar gradualmente com a mudana da fase mvel. O aumento gradual da concentrao de KCl no tampo TME alterou a carga superfcie da fase estacionria, perdendo as suas caractersticas de afinidade com o substracto, a enzima amidase e outras protenas e enzimas; assim, foram sendo gradualmente libertados os compostos com afinidade. Observou-se um pico, no incio da eluio com KCl 75mM, correspondente a um mximo de absorvncia, indicando que a amidase devia estar a ser eluda nessa altura; ento foram guardadas as fraces correspondentes, *38 a *48, para posterior anlise. O grfico do cromatograma indica que mais protena com afinidade para a coluna estava a ser eluda, devido s oscilaes na absorvncia observadas no cromatograma. Seguidamente, executou-se a anlise da actividade enzimtica. Foram analisados o extracto celular enzimtico no purificado, as fraces recolhidas no incio do cromatograma (*5 a *10) e as fraces purificadas *39 a *48, correspondentes ao pico observado no cromatograma. Nas primeiras fraces no foi observada actividade enzimtica, sendo de esperar porque nesta fase da cromatografia a coluna continua com as suas propriedades que lhe possibilita ter afinidade com a enzima e assim absorv-la. Para o extracto celular no purificado e para as fraces purificadas com amidase foram feitos os clculos para a determinao das actividades enzimticas que so 0.358 UI e 0.202 UI, respectivamente. O valor somatrio das fraces com actividade enzimtica deveria ser igual ou menor que o valor da actividade do extracto celular, sendo o resultado obtido. A amidase, quando eluda, recolhida em vrias fraces de 1.5mL, e no numa s. A soma das actividades de todas as fraces deveria obterse um valor bastante prximo do extracto, no tendo acontecido isto possivelmente por ter sido eluda alguma amidase noutras fraces recolhidas mas que no foram analisadas, fazendo com que o valor total tenha sido mais baixo. Analisou-se a actividade em todas as fraces de *5 a *10 e de *32 a *64, mas
Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012 40

Trabalho n2

algumas no foram aqui tratadas graficamente e na elaborao dos clculos pelo facto de anlise destas mostrar a ausncia de actividade, sendo um mtodo de garantia desta ausncia; apesar de serem mostrados os resultados (tabela 2) apenas foram tratados as fraces *39 a *48. Na determinao da quantidade de protena, foram testados o extracto enzimtico celular e as fraces purificadas com amidase, sendo detectados 9mg e 1,95mg de protena, respectivamente. Verifica-se, e era esperado, que o menor valor de protena nas fraces e no no extracto, pois o extracto no possui apenas a enzima que se esteve a purificar mas tambm uma grande diversidade de protenas, enquanto que as fraces analisadas supostamente possuem apenas a amidase. Obteve-se valores negativos de protena para eppendorf *42, *43, *45, *46, *47 e *48, pois os valores de absorvncia na menor diluio relativos a estes estavam fora dos limites da curva de calibrao dos padres de BSA utilizada. Estes valores foram desprezados tanto na soma da quantidade de protena como na soma das actividades enzimticas. Para finalizar, foi construdo o grfico 15, mostrando a cromatografia e actividade ao longo desta. As primeiras fraces no continham actividade enzimtica, sendo esta zero, e esta manteve-se assim at perto do ponto da eluio com KCl 75mM, quando a amidase foi eluda; assim observa-se um rpido aumento da actividade enzimtica, seguida de tambm de uma rpida diminuio da mesma, porque a enzima rpida e facilmente eluda. O rendimento foi determinado e foi de 56%, sendo considerado j um bom valor, e o factor de purificao foi de 2.61, em que as fraces purificadas tm 2.61 vezes mais actividade enzimtica que o extracto celular, para a mesma quantidade de protena. Como concluso, o processo de purificao foi bem realizado porque houve separao da amidase, protena de interesse neste trabalho, dos restantes componentes. Esta ficou ligada coluna e s foi eluda quando o tampo TME com KCl 75mM foi utilizado. Obteve-se um bom rendimento, 56%, mas um factor de purificao um pouco baixo, 2.61. A soma das actividades das fraces purificadas, 0.202 UI, um valor menor mas prximo do valor da actividade para o extracto celular (no purificado), 0.358, como o esperado; acontecendo o mesmo para a quantidade de protena, que foi menor nas fraces, 1.95mg, do que no extracto celular, 9mg.

Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012

41

Trabalho n2

Bibliografia
Protocolo experimental e registos efectuados da U.C. Tecnologia de Enzimas, Universidade de vora Apontamentos das aulas tericas da U.C. Tecnologia de Enzimas, Universidade de vora http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima (consultado dia 06/10/2012) http://www.notapositiva.com/trab_estudantes/trab_estudantes/biologia/ biologia_trabalhos/enzimas.htm (consultado dia 06/10/2012) http://biologia12.wordpress.com/2009/03/14/actividade-enzimatica2/(consultado dia 06/10/2012) http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/enzimas_a spectos_gerais.pdf (consultado dia 06/10/2012) Borges, P. (2008), Anlise da produo de uma amidase recombinante de Pseudomonas aeruginosa, Instituto Superior de Engenharia de Lisboa Pacheco, R., Karmali, A. e Serralheiro, L. , Sntese enzimtica de cidos hidroxmicos em micelas invertidas, Instituto Superior de Engenharia de Lisboa Fragoso, A. (2008), Efeitos estruturais e cinticos de micelas invertidas sobre uma amidase de pseudomonas aeruginosa, Instituto Superior de Engenharia de Lisboa http://www.dshs.state.tx.us/IDCU/disease/e-coli/e-Coli-Data--Statistics.doc http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=3&v ed=0CDUQFjAC&url=http%3A%2F%2Fwww.ccta.ufcg.edu.br%2Fadmin.file s.action.php%3Faction%3Ddownload%26id%3D389&ei=IpF8UMr7KMLOh AfFyIDwCA&usg=AFQjCNGjy_VysGzF7K3DidgCYeZiBTuo0Q Murray, Patrick R. Microbiologia Mdica. 4 ed. [S.l.]: Elsevier, 2004. Apontamentos das aulas tericas da U.C. Tecnologia de Fermentaes, Universidade de vora. Apontamentos de Bioquimica Microbiana da U.C. Bioquimica Microbiana, Universidade d vora. http://vsites.unb.br/ib/cel/microbiologia/crescimento/crescimento.html http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?option=com_content&task =view&id=103&Itemid=451 Teixeira D. (2009), Apontamentos das Aulas de Tecnicas e Mtodos de Laboratrio I, Universidade de vora.EMM
Tecnologia de Enzimas |vora, 7 de Novembro de 2012 42