Universidade de vora Departamento de Qumica U.C.

Tecnologia de Enzimas

Trabalho Prtico n 1:
Anlise da produo de amidase de uma estirpe recombinante de E. coli (pKK223-3 AI3) em cultura descontnua.
Docentes: Prof Rosrio Martins Prof Ana Paula Pinto Discentes: Ctia Fernandes, n25892 Diana Balbino, n25920 Filipa Santos, n26895 Rita Bicho, n29744 Curso: Biotecnologia Turma B 24 de Outubro de 2012

Trabalho n 1

ndice:

Resumo ............................................................................................................................................................ 3 Introduo Terica .................................................................................................................................... 3 Objectivos ....................................................................................................................................................... 8 Procedimento Experimental ................................................................................................................. 9 Material Laboratorial:.......................................................................................................................... 9 Equipamentos: ........................................................................................................................................ 9 Solues:..................................................................................................................................................... 9 Procedimento: ......................................................................................................................................... 9 Resultados e Tratamento de Resultados ...................................................................................... 13 Discusso e Concluso .......................................................................................................................... 26 Bibliografia ................................................................................................................................................. 27

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

Trabalho n 1

Resumo
Uma cultura de Escherichia coli recombinante (pKK223-3 AI3) foi incubada com um meio apropriado, Luria Bertani, contendo ampicilina e IPTG para a seleco de colnias do microrganismo produtoras da amidase, em descontnuo. Foram retiradas vrias amostras em vrios tempos de incubao para posterior medio da absorvncia a 540 nm, para o acompanhamento do crescimento celular e para a determinao da taxa especfica de crescimento () e o tempo de duplicao (g). Em simultneo, a actividade enzimtica foi determinada nos mesmos tempos de incubao utilizados no acompanhamento do crescimento microbiano. Uma amostra de 1,5 mL foi centrifugada e o sedimento foi ressuspenso em soro fisiolgico, foi centrifugado novamente e o sedimento foi ressuspenso em tampo TME. Desta ltima ressuspenso foram retirados 20 L para uma microplaca de ELISA, adicionado o substrato p-nitroacetanilida e lida a uma absorvncia de 405 nm durante 14 minutos. Este ensaio foi efectuado em triplicado para cada amostra. Depois com os resultados obtidos foram determinadas graficamente as velocidades de reaco, e com estas e a adaptao da Lei Lambert-Beer foi determinada a actividade enzimtica final da cultura.

Figura 1: Actividade enzimtica

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

Trabalho n 1

Introduo Terica
A Escherichia coli uma bactria bacilar Gram-negativa, uma bactria simbionte descoberta em 1885 pelo alemo-austraco Theodor Escherich. A E. coli assume a forma de um bacilo e pertence famlia das Enterobacteriaceae. So bactrias aerbias e anaerobias facultativas, tendo como habitat natural o lmen intestinal dos seres humanos e de outros animais. Possui ainda vrios flagelos dispostos em volta da clula.

Figura 2: Escherichia coli 0157:H7 A E. coli uma bactria nica capaz de produzir todos os componentes de que constituida, a partir de compostos bsicos e fontes de energia suficientes, algo que poucos seres vivos conseguem fazer, ainda lactase positiva, uma enzima fermentadora de acares. O genoma da E. coli, possui cerca de 5 milhes de pares de bases e vrios milhares de genes que codificam mais de 4000 protenas em contraste com o genoma humano que possui 3 bilhes de pares de bases e cerca de 27 mil protenas. Esta bactria foi e continua a ser muito estudada enquanto modelo geral para mecanismos biolgicos das bactrias, na rea da biologia molecular, tendo tambm um papel muito importante em bioengenharia e microbiologia industrial. Na vida quotidiana a E. coli tem importncia na: Avaliao da contaminao fecal em guas superficiais, de esturios e marinas. Monitorizao de guas recreacionais como piscinas, praias e lagos. um indicador fundamental para avaliar as condies de balneabilidade, de acordo com os padres nacionais. Avaliao da qualidade bacteriolgica de guas destinadas irrigao, descendentao de animais, criao de ostras e mariscos.
Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012 4

Trabalho n 1

Avaliao da eficincia dos sistemas de tratamento das estaes de tratamento de guas residuais. Monitorizao da qualidade de gua para consumo humano, da rede de distribuio, de guas minerais, poos, etc.

Os reactores descontnuos so os biorreactores mais utilizados na produo de enzimas em forma solvel. Quando uma cultura microbiana se desenvolve num sistema fechado, pode-se traar uma curva de crescimento microbiano. Esta pode ser dividida nas seguintes etapas ou fases: Fase Lag onde ainda no h um aumento significativo da populao, sendo o perodo necessrio para o microorganismo se adaptarem ao meio; Fase Log ou exponencial, nesta etapa h diviso celular mxima, as clulas esto plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando os seus constituintes e multiplicando-se; Fase estacionria que so sintetizados vrios metabolitos secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas; Fase de declnio na qual maioria das clulas est em processo de morte onde poder ser uma morte lenta ou de uma forma exponencial, nalguns casos ocorre a lise celular. Na curva iremos obter as diversas fases de crescimento na qual uma fase importante a fase exponencial onde as clulas crescem a uma taxa constante e mxima, nesta ser possvel determinar a taxa de crescimento exponencial, um factor muito importante para determinao do tempo mdio de gerao, comparao do desenvolvimento de estirpes e comparao do desenvolvimento de estirpes em diferentes condies.

Figura 3: Curva de crescimento em sistemas fechados

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

Trabalho n 1

Uma fase Lag longa poder significar que o inculo insuficiente para se multiplicar, poderemos ter uma cultura envelhecida, ou o meio e a temperatura so desfavorveis o que poder levar a no existncia da curva de crescimento. Na fase estacionria, os nutrientes comeam a escassear e os produtos txicos tornam-se mais abundantes, nesta etapa no h um crescimento lquido da populao, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem. Na curva iremos obter as diversas fases de crescimento na qual uma fase importante a fase exponencial onde as clulas crescem a uma taxa constante e mxima, nesta ser possvel determinar a taxa de crescimento exponencial, um fator muito importante para determinao do tempo medio de gerao, comparao do desenvolvimento de estirpes e comparao do desenvolvimento de estirpes em diferentes condies. A utilizao de enzimas como catalisadores de reaces de sntese de vrios compostos de interesse industrial tem recebido considervel ateno devido s conhecidas vantagens que os enzimas apresentam relativamente a catalisadores qumicos como a estereoespecificidade, a especificidade de substrato, o baixo consumo energtico, entre outras. A amidase um homohexmero em que cada subunidade da amidase apresenta um arranjo de quatro camadas, tipo sandwich (33% hlices- e 22% folhas-) com duas folhas- internas 21. No entanto, relativamente s outras nitrilases, a amidase apresenta uma folha- adicional na cadeia N-terminal e uma cadeia C-terminal mais longa. O sucesso deste enzima deve-se variedade de reaces que pode realizar e diversidade de especificidade, catalizando reaces onde amidas, cidos e esteres podem servir de substrato, o que levar obviamente obteno de uma enorme variedade de produtos de sntese alguns dos quais com aplicao industrial. De entre os vrios produtos de interesse industrial podem-se referir os cidos hidroxmicos amplamente utilizados na indstria farmacutica como constituintes de antibiticos, factores de crescimento e inibidores de tumores. Entre os diferentes enzimas capazes de realizar reaces de sntese destes cidos hidroxmicos encontra-se a amidase de Pseudomonas aeruginosa. A amidase produzida por tecnologia de DNA recombinante em E.coli. As ferramentas de DNA recombinante h muito que so utilizadas por permitirem o controle e potenciao da sntese de enzimas e produtos que no so normalmente produzidos pelo microorganismo. As enzimas convertem o substrato (uma substncia) no produto (noutra substncia), em que o substrato liga-se a uma zona especfica da enzima (centro activo) e forma o complexo enzima-substrato. Enzima + Substrato Enzima + Produto
Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012 6

Trabalho n 1

Os enzimas so biocatalizadores porque aumentam a velocidade da reaco diminuindo a energia de activao necessria para a converso do substrato em produto; no so consumidos e no alteram o equilbrio qumico da mesma reaco e so muito especficos para a reaco que catalisam ou em relao aos substratos que transformam. A actividade enzimtica (UI) definida pela quantidade de enzima necessria para converter um micromole de substrato por minuto em determinadas condies favorveis. Esta actividade pode depender da presena de cofactores, em que o enzima necessita de ligao a molculas no proteicas para que possam exercer a sua funo. Tambm existem factores que influenciam a actividade enzimtica, afectando a velocidade da reaco: concentrao da enzima concentrao do substrato pH temperatura presena de activadores e inibidores

A velocidade cataltica de uma reaco enzimtica condicionada pela concentrao do enzima e do substrato. Com o aumento gradual da concentrao do enzima existe formao de produto at um certo limite, podendo afirmar-se que a velocidade de uma reaco enzimtica directamente proporcional concentrao do enzima, desde que haja excesso de substrato durante a reaco. Se a concentrao de substrato for aumentada, mantendo a do enzima, aumenta a actividade enzimtica, at um certo ponto em que se verifica a saturao enzimtica, pois todo o enzima encontra-se na forma do complexo enzimasubstrato. O pH do meio onde se encontra o enzima um factor condicionante da actividade enzimtica, pois geralmente os enzimas tm um pH ptimo de actuao em que a sua actividade mxima; valores acima ou abaixo provocam diminuio de actividade enzimtica ou at inactivao da mesma. Geralmente a velocidade das reaces enzimticas proporcional temperatura a que estas decorrem e tambm apresentam uma temperatura ptima para uma velocidade mxima. Os enzimas quando sujeitos a baixas temperaturas ficam inactivos devido falta de energia de activao para provocar o choque entre as molculas enzimticas e as molculas do substrato; e quando sujeitas a altas temperaturas o enzima pode deixar de actuar devido desnaturao da protena
Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012 7

Trabalho n 1

que a constitui, perdendo-se a configurao espacial e consequentemente o centro activo da mesma. Vrias substncias, algumas de ocorrncia natural nas clulas e outras artificiais, tm a capacidade de fazer variar ou regular a actividade dos enzimas durante as reaces. As que ocorrem naturalmente regulam o metabolismo celular e as artificiais so sintetizadas para tratar doenas ou para estudar a forma de aco dos enzimas. Os efeitos destas substncias podem ser positivos ou activadores, quando aumentam a afinidade do enzima para o substrato e aceleram a reaco, ou podem ter efeitos negativos ou inibidores, quando reduzem a velocidade das reaces competindo com o substrato para a ligao enzima ou ligando-se ao complexo enzima-substrato.

Objectivos
Este trabalho experimental teve como objectivos a anlise do crescimento da cultura de uma estirpe recombinante de E. coli (pKK223-3 AI3) e a sntese da amidase atravs da determinao das curvas de crescimento e da produo de amidase na cultura.

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

Trabalho n 1

Procedimento Experimental
Material Laboratorial: Bales erlenmeyers Proveta 100 mL estril Clulas de espectrofotmetro Microplaca Pontas para micropipetas estreis Banho de gelo Eppendorfs Pipeta graduada de 10mL Pompete Suporte para eppendorf Equipamentos: Micropipetas 1000L, 200L e 20L Incubadora de agitao orbital Espectrofotmetro UV-Vis Leitor de microplacas com filtro de 420nm Centrfuga refrigerada Bico de Bunsen Solues: gua destilada Meio de Luria Bertani (LB) Ampicilina IPTG 0,5mM Soro fisiolgico Tampo TME Soluo de p-nitroacetanilida 1mM em tampo TME Estirpe recombinante de E. coli (pKK223-3 AI3) Procedimento: 1. 500L de ampicilina + 60 L de IPTG

10mL de E. coli recombinante (pKK223-3 AI3)

100 mL de meio Luria Bertani (LB)

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012 9

Trabalho n 1

2.

37C e a 250 rpm

Nos tempos de incubao 0min, 20 min, 40 min, 55 min, 70 min, 85 min, 100 min, 115 min, 130 min, 145 min, 160 min e 175 min procedeu-se como indicado nos pontos 3 e 4 do procedimento. 3. Para seguir o crescimento microbiano: 1mL de amostra 1mL de gua destilada (branco)

Leu-se e registou-se a absorvncia a 540nm das amostras, contra o branco. 4. Tratamento antes de seguir a produo da amidase: 1,5mL de cultura

Centrifugou-se o eppendorf a 15000 durante 5 min e o sobrenadante foi removido.

1,5mL de soro fisiolgico

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012 10

Trabalho n 1

O eppendorf foi centrifugado a segunda vez a 15000 durante 5 minutos e o sobrenadante foi removido.

Ressuspenso com 60L de tampo TME

(Volume total) 5. Doseamento da actividade enzimtica da amidase das culturas:

20L de cada suspenso de cada tempo de incubao

(Ensaio em triplicado de cada suspenso)

Adicionou-se 180L de p-nitroacetanilida 1mM a 25C e registou-se a variao de absorvncia a 405nm durante 30 min, em intervalos de 1 min.

Notas: Todas as amostras e o material estril devem ser manuseados perto do bico de busen, para permanecerem sem contaminaes. Todas as amostras de suspenses utilizadas devem permanecer em banho de gelo, incluindo a microplaca, quando no esto a ser utilizadas.

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

11

Trabalho n 1

O esquema da microplaca de ELISA foi o seguinte: 1 to t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 2 to t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 3 to t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 4 t8 t9 t10 t11 5 t8 t9 t10 t11 6 t8 t9 t10 t11 7 8 9 10 11 12

A B C D E F G H

Figura 4: Esquema da localizao dos tempos na microplaca de ELISA das suspenses obtidas

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

12

Trabalho n 1

Resultados e Tratamento de Resultados

Parte I: Crescimento microbiano (Taxa Especifica de Crescimento e Tempo de duplicao) Como referido anteriormente no procedimento experimental, incubou se uma cultura de E. coli, sendo retiradas a partir do tempo 0 (momento da inoculao) amostras de 20 em 20 min at ao tempo 3 sendo que depois deste foram retiradas amostras de 15 em 15 minutos, como mostra a tabela seguinte:
Tabela 1: Crescimento microbiano, registo da Absorvncia a 540nm

Tempo t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10 t11 0 20 40 55 70 85 100 115 130 145 160 175

Abs 0,412 0,47 0,5 0,567 0,632 0,775 1,223 1,551 1,742 2,285 2,337 2,51

Com os resultados obtidos construiu-se o seguinte grfico:

3 2,5 Absorvncia (540nm) 2 1,5 1 0,5 0 0 50 100 Tempo (min) 150 200

Grfico 1: Crescimento microbiano, registo da Absorvncia em funo do Tempo

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

13

Trabalho n 1

Para calcular a taxa especifica de crescimento, escolheu-se os pontos correspondentes a fase exponencial de crescimento, estando estes situados entre o t4 ao t9. Os pontos t6 e t7 foram excludos do seguinte grfico:
1 0,8 ln[Absorvncia (540nm)]

0,6
0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 Tempo (min) 0 20 40 60 80 100 120 140 160

y = 0,0174x - 1,6998 R = 0,9985

Grfico 2: Taxa especfica do crescimento microbiano, Ln da Absorvncia em relao ao tempo

Pela equao da recta do grfico anterior possvel retirar o declive da mesma, sendo este igual ao valor da taxa especfica de crescimento (): = 0,0174 min-1 = 1,044 h-1 Podendo assim calcular-se o tempo de duplicao (g), sendo:

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

14

Trabalho n 1

Parte II: Determinao da Actividade enzimtica A actividade enzimtica foi determinada com a realizao de um ensaio enzimtico, em que se utilizou p-nitroacetanilida como substrato da amidase. Durante 14 minutos a reaco foi seguida, numa microplaca de ELISA, como descrito no procedimento experimental. Os resultados experimentais de absorvncia a 405 nm nos respectivos tempos so apresentados na seguinte tabela:
Tabela 2: Ensaio enzimtico, registo da absorvncia a 405 nm nos respectivos tempos em minutos
Tempo (min)
t0,1 00:00:00 00:01:00 00:02:00 00:03:00 00:04:00 00:05:00 00:06:00 00:07:00 00:08:00 00:09:00 00:10:00 00:11:00 00:12:00 00:13:00 00:14:00 Tempo (min) 00:00:00 00:01:00 00:02:00 00:03:00 00:04:00 00:05:00 00:06:00 00:07:00 00:08:00 00:09:00 00:10:00 00:11:00 00:12:00 00:13:00 00:14:00 0,537 0,572 0,611 0,648 0,678 0,701 0,718 0,734 0,749 0,767 0,789 0,814 0,838 0,86 0,884 t6,1 1,111 1,128 1,154 1,182 1,212 1,243 1,268 1,291 1,321 1,354 1,378 1,405 1,435 1,466 1,484 t0,2 0,523 0,547 0,573 0,599 0,627 0,655 0,684 0,711 0,738 0,765 0,792 0,816 0,843 0,871 0,898 t6,2 0,623 0,624 0,634 0,648 0,661 0,673 0,687 0,701 0,715 0,728 0,743 0,756 0,772 0,787 0,802 t0,3 0,507 0,527 0,54 0,557 0,578 0,602 0,632 0,661 0,687 0,714 0,733 0,741 0,749 0,756 0,768 t6,3 1,069 1,085 1,102 1,123 1,145 1,172 1,198 1,22 1,243 1,264 1,285 1,309 1,334 1,359 1,384 t1,1 0,461 0,48 0,492 0,509 0,527 0,55 0,574 0,598 0,618 0,638 0,666 0,693 0,713 0,726 0,737 t7,1 0,995 1,022 1,056 1,084 1,101 1,125 1,149 1,171 1,19 1,212 1,234 1,257 1,279 1,302 1,324 t1,2 0,466 0,468 0,48 0,496 0,515 0,537 0,557 0,581 0,607 0,627 0,641 0,656 0,671 0,683 0,692 t7,2 1,077 1,1 1,124 1,149 1,176 1,2 1,223 1,255 1,28 1,302 1,326 1,349 1,375 1,4 1,422 t1,3 0,429 0,449 0,469 0,492 0,512 0,527 0,541 0,558 0,577 0,594 0,612 0,631 0,648 0,665 0,679 t7,3 1,083 1,1 1,118 1,137 1,156 1,18 1,203 1,226 1,253 1,279 1,303 1,33 1,353 1,377 1,4 t2,1 0,615 0,63 0,657 0,69 0,716 0,741 0,763 0,785 0,806 0,825 0,844 0,867 0,892 0,904 0,93 t8,1 0,81 0,812 0,82 0,832 0,842 0,856 0,874 0,889 0,908 0,925 0,944 0,962 0,979 1 1,018

Absorvncia (405nm)
t2,2 0,628 0,652 0,678 0,703 0,73 0,757 0,786 0,812 0,84 0,864 0,885 0,906 0,925 0,945 0,964 t8,2 0,757 0,759 0,759 0,773 0,791 0,796 0,814 0,829 0,844 0,861 0,874 0,892 0,904 0,928 0,948 t2,3 0,592 0,614 0,638 0,659 0,682 0,706 0,729 0,751 0,774 0,792 0,811 0,831 0,853 0,871 0,888 t8,3 0,745 0,75 0,757 0,77 0,783 0,798 0,816 0,831 0,847 0,859 0,877 0,886 0,9 0,914 0,925 t3,1 0,591 0,617 0,646 0,676 0,709 0,736 0,763 0,784 0,805 0,827 0,849 0,868 0,884 0,905 0,924 t9,1 1,21 1,215 1,242 1,265 1,284 1,307 1,331 1,353 1,381 1,399 1,43 1,454 1,485 1,512 1,54 t3,2 0,648 0,663 0,679 0,693 0,712 0,723 0,74 0,757 0,772 0,789 0,804 0,824 0,838 0,853 0,868 t9,2 1,183 1,194 1,222 1,25 1,275 1,302 1,328 1,355 1,383 1,417 1,45 1,482 1,51 1,54 1,57 t3,3 0,62 0,634 0,647 0,662 0,678 0,695 0,711 0,723 0,736 0,744 0,754 0,762 0,773 0,78 0,792 t9,3 1,068 1,081 1,105 1,126 1,151 1,175 1,2 1,224 1,249 1,276 1,301 1,326 1,351 1,377 1,403 t4,1 0,778 0,801 0,829 0,857 0,885 0,913 0,94 0,963 0,988 1,011 1,035 1,053 1,073 1,094 1,108 t10,1 0,597 0,606 0,617 0,621 0,63 0,638 0,644 0,656 0,666 0,683 0,7 0,715 0,732 0,753 0,763 t4,2 0,731 0,772 0,8 0,827 0,854 0,879 0,905 0,929 0,952 0,971 0,991 1,006 1,023 1,039 1,051 t10,2 0,766 0,78 0,797 0,813 0,828 0,845 0,864 0,88 0,896 0,915 0,939 0,957 0,973 0,99 1,008 t4,3 0,621 0,638 0,657 0,679 0,699 0,717 0,738 0,754 0,772 0,789 0,802 0,811 0,818 0,83 0,842 t10,3 0,115 0,117 0,117 0,118 0,118 0,119 0,119 0,12 0,121 0,121 0,122 0,123 0,124 0,124 0,125 t5,1 0,941 0,965 0,995 1,022 1,049 1,073 1,095 1,119 1,14 1,162 1,184 1,206 1,228 1,25 1,271 t11,1 0,824 0,83 0,843 0,857 0,879 0,9 0,917 0,934 0,953 0,97 0,988 1,009 1,027 1,044 1,06 t5,2 1,003 1,026 1,051 1,074 1,099 1,122 1,148 1,171 1,196 1,22 1,24 1,262 1,283 1,307 1,331 t11,2 0,993 0,996 1,01 1,028 1,044 1,071 1,092 1,11 1,131 1,156 1,183 1,203 1,216 1,251 1,278 t5,3 0,938 0,954 0,98 1,005 1,028 1,052 1,077 1,097 1,119 1,14 1,159 1,181 1,202 1,225 1,246 t11,3 0,592 0,592 0,606 0,603 0,602 0,618 0,619 0,629 0,633 0,645 0,642 0,646 0,646 0,663 0,668

Os volumes de extracto enzimtico obtidos para o ensaio so apresentados na tabela seguinte:

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012 15

Trabalho n 1

Tabela 3: Volume total de suspenso celular dos tubos eppendorf usados em cada tempo

Volume (L) Eppendorf Retirado Sobrante Total t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10 t11 60 77 55 47 55 33 32 36 53 50 63 52 48 137 115 107 115 93 92 96 113 110 123 112 108

Seguidamente, apresenta-se os grficos da absorvncia a 405nm em funo do tempo em minutos, correspondentes aos ensaios enzimticos realizados desde o tempo t0 at o tempo t11. A partir da regresso linear dos grficos, o declive das rectas obtidas correspondem velocidade das reaces enzimticas (v).

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

16

Trabalho n 1
1 0,95 0,9 Absorvncia (405 nm) y = 0,027x + 0,5206 R = 0,9998

0,85
0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 y = 0,023x + 0,5654 R = 0,9834 y = 0,0205x + 0,507 R = 0,977 t0,1 t0,2 t0,3

0,55
0,5 0,45 0,4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tempo (minutos)

Grfico 3: Velocidade da reaco em t0,1; t0,2;t0,3 correspondente ao t0

0,8

0,75
Absorvncia (405 nm) 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tempo (minutos) y = 0,021x + 0,4517 R = 0,9951 y = 0,0177x + 0,4347 R = 0,9985 y = 0,0181x + 0,4516 R = 0,9887

t1,1 t1,2 t1,3

Grfico 4: Velocidade da reaco em t1,1; t1,2;t1,3 correspondente ao t1

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

17

Trabalho n 1
1 0,95 0,9 Absorvncia (405 nm) y = 0,0226x + 0,6195 R = 0,9957 y = 0,0246x + 0,6328 R = 0,9962 t2,1 y = 0,0214x + 0,5965 R = 0,9983 t2,2 t2,3

0,85
0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5

10

12

14

16

Tempo (minutos)

Grfico 5: Velocidade da reaco em t2,1; t2,2;t2,3 correspondente ao t2 1 0,95 0,9 Absorvncia (405 nm) 0,85 0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tempo (minutos) y = 0,0124x + 0,6275 R = 0,9861 t3,1 t3,2 t3,3 y = 0,0238x + 0,6057 R = 0,9906 y = 0,0159x + 0,6466 R = 0,9995

Grfico 6: Velocidade da reaco em t3,1; t3,2;t3,3 correspondente ao t3

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

18

Trabalho n 1
1,2 1,15 1,1 1,05 Absorvncia (405 nm) 1 0,95 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 y = 0,0161x + 0,6315 R = 0,9831 y = 0,0242x + 0,7861 R = 0,9947

y = 0,0226x + 0,7575 R = 0,9844

t4,1 t4,2 t4,3

Tempo (minutos)

Grfico 7: Velocidade da reaco em t4,1; t4,2;t4,3 correspondente ao t4

1,4 1,35 1,3 Absorvncia (405 nm) 1,25 1,2 y = 0,0234x + 1,0048 R = 0,9995 t5,1 y = 0,0222x + 0,9384 R = 0,999 t5,2 t5,3 y = 0,0234x + 0,9496 R = 0,9977

1,15 1,1 1,05 1

0,95 0,9 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tempo (minutos)

Grfico 8: Velocidade da reaco em t5,1; t5,2;t5,3 correspondente ao t5

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

19

Trabalho n 1

1,6 1,4 Absorvncia 405nm 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 5 Tempo (minutos) 10 15 y = 0,0133x + 0,6102 R = 0,9947 y = 0,0275x + 1,1027 R = 0,9991 y = 0,0229x + 1,0594 R = 0,9985

t6,1 t6.2 t6.3

Grfico 9: Velocidade da reaco em t6,1; t6,2;t6,3 correspondente ao t6

1,45 1,4 y = 0,0249x + 1,076 R = 0,9996 y = 0,0231x + 1,0708 R = 0,9962

1,35
Absorvncia 405nm 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1 0,95 0 2 4 6 8 10 12

y = 0,0229x + 1,0066 R = 0,9975

t7,1 t7.2 t7.3

14

16

Tempo (minutos)

Grfico 10: Velocidade da reaco em t7,1; t7,2;t7,3 correspondente ao t7

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

20

Trabalho n 1
1,05 1 0,95 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tempo (minutos) y = 0,0138x + 0,7341 R = 0,9948 t8.1 t8.2 t8.3

y = 0,0156x + 0,7886 R = 0,9839

y = 0,0141x + 0,7362 R = 0,981

Absorvncia 405nm

Grfico 11: Velocidade da reaco em t8,1; t8,2;t8,3 correspondente ao t8

1,65 1,6 1,55 1,5 1,45 1,4 1,35 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1 0,95 0,9 0 2 4 6

y = 0,0284x + 1,165 R = 0,9968 y = 0,0241x + 1,1922 R = 0,9953

Absorvncia 405nm

y = 0,0245x + 1,0562 R = 0,9986

t9.1 t9.2 t9.3

10

12

14

16

Tempo (minutos)

Grfico 12: Velocidade da reaco em t9,1; t9,2;t9,3 correspondente ao t9

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

21

Trabalho n 1
1,2 1 Absorvncia 405nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tempo (minutos) Grfico 13: Velocidade da reaco em t10,1; t10,2;t10,3 correspondente ao t10 y = 0,0118x + 0,5851 R = 0,9686 t10.1 t10.2 t10.3 y = 0,0176x + 0,7605 R = 0,9985

y = 0,0007x + 0,1156 R = 0,9826

1,3 1,2 1,1 Absorvncia 405nm 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 y = 0,021x + 0,9704 R = 0,991

y = 0,0177x + 0,8115 R = 0,997

t11.1 t11.2

y = 0,0054x + 0,589 R = 0,9654

t11.3

10

12

14

16

Tempo (minutos)

Grfico 14: Velocidade da reaco em t11,1; t11,2;t11,3 correspondente ao t11

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

22

Trabalho n 1

Para determinao da actividade enzimtica, a Lei de Lambert-Beer foi adaptada, sendo possvel utilizar os dados obtidos. Com a existncia dos dados obtidos da velocidade das reaces enzimticas (variao da absorvncia com o tempo), ento divide-se ambos os lados da equao por t:
( ) ( ) ( )

Em que com esta adaptao tem-se todos os dados necessrio para o clculo da actividade enzimtica (( )), sendo (11500 M-1cm-1) e l (1cm) constantes. Seguidamente, foram feitos os clculos para determinao da actividade enzimtica final que existia na cultura, correspondente ao ensaio enzimtico. Como clculo exemplo, para o poo t0,1:

( )

( )

Este valor est expresso em molaridade e como o ensaio enzimtico condiz a um valor total de 0,2mL, tem-se: ( )

No ensaio enzimtico apenas 20L foram utilizados, tendo sido retirados de um tubo eppendorf com volume final de 137L. Tem-se ateno que os volumes finais so variveis, dependendo de cada tubo de eppendorf, como se verifica na tabela 3. Ento, tem-se: ( )

Como as amostras retiradas eram de 1,5mL, tem que se dividir o resultado anterior por este valor e converter mol em mol, para obteno da actividade enzimtica da cultura em UI mL-1: ( )

Os resultados dos restantes poos foram tratados da mesma forma que o exemplo dado para o poo t0,1. Para melhor e facilitada visualizao dos resultados da actividade enzimtica dos restantes tubos foi executada uma tabela:
Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012 23

Trabalho n 1

Tabela 4: Actividade Enzimtica mdia para cada amostra recolhida e para cada tempo

Tempo Poo (minutos) t0 0 t0,1 t0,2 t0,3 t1,1 t1,2 t1,3 t2,1 t2,2 t2,3 t3,1 t3,2 t3,3 t4,1 t4,2 t4,3 t5,1 t5,2 t5,3 t6,1 t6,2 t6,3 t7,1 t7,2 t7,3 t8,1 t8,2 t8,3 t9,1 t9,2 t9,3 t10,1 t10,2 t10,3 t11,1 t11,2 t11,3

t1

20

t2

40

t3

55

t4

70

t5

85

t6

100

t7

115

t8

130

t9

145

t10

160

t11

175

Velocidade da reaco (min-1) (declive) 0,023 0,027 0,0205 0,021 0,0181 0,0177 0,0226 0,0246 0,0214 0,0238 0,0159 0,0124 0,0242 0,0226 0,0161 0,0234 0,0234 0,0222 0,0275 0,0133 0,0229 0,0229 0,0249 0,0231 0,0156 0,0141 0,0138 0,0241 0,0284 0,0245 0,0118 0,0176 0,0007 0,0177 0,021 0,0054

Actividade Enzimtica Volumtrica (10-3 UI/min) Por Poo Mdia 1,83 1,985 2,14 1,63 1,40 1,21 1,263 1,18 1,40 1,53 1,420 1,33 1,59 1,159 1,06 0,827 1,30 1,129 1,22 0,868 1,25 1,227 1,25 1,18 1,53 1,180 0,740 1,27 1,50 1,547 1,63 1,51 0,995 0,899 0,995 0,880 1,72 1,833 2,03 1,75 0,766 0,650 1,14 0,045 1,11 0,919 1,31 0,338

Desviopadro 0,155

0,097

0,083

0,319

1,300

0,033

0,329

0,059

0,050

0,140

0,454

0,419

Seguidamente, foi construdo o grfico correspondente aos valores mdios da actividade enzimtica em funo do tempo de incubao da cultura:

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

24

Trabalho n 1

Absorvncia Enzimtica ( 10-3 UI/min)

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Tempo de incubao (minutos)

Grfico 15: Actividade enzimtica em funo do tempo de incubao da cultura

Para finalizar, para observar de que modo o crescimento afecta a actividade enzimtica, elaborou-se um grfico com o crescimento celular, representado no grfico 1, e com a actividade enzimtica, representada no grfico 15, em funo do tempo de incubao da cultura em minutos.
2,50 2,00 3 2,5 2 Absorvncia (540nm)

Absorvncia Enzimtica ( 10-3 UI/min)

1,50
1,5 1,00 1 0,50 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Tempo de incubao (minutos) Actividade Enzimtica Crescimento microbiano 0,5 0

Grfico 16: Actividade enzimtica e crescimento microbiano em funo do tempo de incubao da cultura

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

25

Trabalho n 1

Discusso e Concluso
Neste trabalho foram analisados os parmetros relacionados com a estirpe recombinante em estudo, Escherichia coli pkk223-3 AI: crescimento celular, taxa especfica de crescimento, tempo de gerao e actividade enzimtica. Para o crescimento celular obtivemos um perfil de crescimento microbiano aceitvel, como se observa no grfico 1, em que se pode observar nitidamente as fases de crescimento microbiano: a fase lag de crescimento lento observvel desde o tempo de 0 a 70 minutos, a fase log de crescimento exponencial observvel desde o tempo 70 ao 175 minutos. A fase estacionria e a fase de declnio no se observou nesta experincia devido falta de tempo para a recolha de amostras. A partir do grfico 2 foi possvel determinar a taxa especfica de crescimento () e o tempo de duplicao (g), de valores 1,044 h -1 e 0,664 h respectivamente, em que este ltimo valor exprime o tempo necessrio para que um microrganismo se duplique. Na segunda parte da experincia foi determinada a actividade enzimtica da amidase produzida pela E. coli. Foram realizados os ensaios enzimticos que esto apresentados resumidamente na tabela 4 e no grfico 15. Os grficos 3 a 14 serviram para o clculo das velocidades de reaco de cada poo, no sendo desprezado nenhum valor devido obteno de favorveis R 2 . Por fim, o grfico 16 mostra a influncia do crescimento celular na actividade enzimtica. Observa-se, segundo Gaden, que a produo da amidase aproxima-se do tipo I associada ao crescimento microbiano, em que o catabolismo da fonte de carbono e a formao de amidase esto interligados. Conclui-se que os objectivos em geral foram concretizados. A E. coli recombinate pKK223-3 AI3 tem uma taxa especfica de crescimento () de 1,004 h1 e um tempo de duplicao (g) de 0,664, capaz na produo de amidase. A produo de amidase, segundo Gaden, do tipo I. Para optimizao do processo, conhecendo intensivamente o microrganismo em estudo, poder controlar-se melhor a temperatura ptima de crescimento e agitao do reactor de forma a melhorar o fornecimento de oxignio cultura, durante o seu crescimento, melhorando assim tambm a produo da enzima amidase.

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

26

Trabalho n 1

Bibliografia
Protocolo experimental e registos efectuados da U.C. Tecnologia de Enzimas, Universidade de vora Apontamentos das aulas tericas da U.C. Tecnologia de Enzimas, Universidade de vora http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima (consultado dia 06/10/2012) http://www.notapositiva.com/trab_estudantes/trab_estudantes/biologi a/biologia_trabalhos/enzimas.htm (consultado dia 06/10/2012) http://biologia12.wordpress.com/2009/03/14/actividade-enzimatica2/(consultado dia 06/10/2012) http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/enzima s_aspectos_gerais.pdf (consultado dia 06/10/2012) Borges, P. (2008), Anlise da produo de uma amidase recombinante de Pseudomonas aeruginosa, Instituto Superior de Engenharia de Lisboa Pacheco, R., Karmali, A. e Serralheiro, L. , Sntese enzimtica de cidos hidroxmicos em micelas invertidas, Instituto Superior de Engenharia de Lisboa Fragoso, A. (2008), Efeitos estruturais e cinticos de micelas invertidas sobre uma amidase de pseudomonas aeruginosa, Instituto Superior de Engenharia de Lisboa http://www.dshs.state.tx.us/IDCU/disease/e-coli/e-Coli-Data--Statistics.doc http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd= 3&ved=0CDUQFjAC&url=http%3A%2F%2Fwww.ccta.ufcg.edu.br%2Fad min.files.action.php%3Faction%3Ddownload%26id%3D389&ei=IpF8U Mr7KMLOhAfFyIDwCA&usg=AFQjCNGjy_VysGzF7K3DidgCYeZiBTuo0Q Murray, Patrick R. Microbiologia Mdica. 4 ed. [S.l.]: Elsevier, 2004. Apontamentos das aulas tericas da U.C. Tecnologia de Fermentaes, Universidade de vora. Apontamentos de Bioquimica Microbiana da U.C. Bioquimica Microbiana, Universidade d vora. http://vsites.unb.br/ib/cel/microbiologia/crescimento/crescimento.ht ml

Tecnologia de Enzimas | vora, 24 de Outubro de 2012

27