BACTERIOLOGIA COLORACION GRAM: Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844.

Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min. Lavar y secar. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano. Descripcin de la tincin de GRAM: Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas

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BACTERIOLOGIA permanecen azules. Ejemplo: Bacillus anthracis (Gram positivo) Pseudomonas aeruginosa (Gram negativo) Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. 2) EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. 3) Cultivos de ms de 24 horas de teidos pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. REACCION Y COLORACION 1. Solucin de Cristal Violeta al 1%. Se deja actuar 1 minuto Clulas Gram positivas y clulas Gram negativas de color violeta 2. Solucin Yodo- Iodurada. Se deja actuar 1 a 2 minutos Formacin del complejo Yodo Cristal Violeta en el interior de las clulas Las clulas permanecen violetas Formacin del complejo Yodo Cristal Violeta en el interior de las clulas. Las clulas permanecen violetas 3. Solucin de alcohol Acetona. Se deja actuar 30 Segundos El complejo Yodo Cristal Violeta no sale de las Clulas, Gram Positivas,las que conservan el color violeta. El complejo Yodo Cristal Violeta se separa de las Clulas,Gram negativas, las que pierden el Color y no pueden observarse. 4. Solucin de Safranina. Se deja actuar 1 Minuto. Gram Positivas: Las clulas conservan el Color Violeta. Gram Negativas; Las clulas decoloradas se Tien de rojo. 5. Lavar, secar y observar al microscopio.

PREPARACION COLORANTES TINCION DE GRAM. a) Cristal violeta y oxalato de amonio. (Reactivo de Hucker) Solucin A: Cristal violeta (pureza del colorante de por lo menos, el 90%)........ 2 g Etanol (95%)................................................................................... 20 mL Solucin B: Oxalato de amonio.............................................. 0.8 g Agua destilada..................................................... 80 mL - Mezclar cada uno de los solutos en su disolvente respectivo. - Dejar la solucin de oxalato de amonio en reposo durante una noche o calentar

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BACTERIOLOGIA ligeramente hasta que se solubilice. - Mezclar las dos soluciones y filtrar. b) Solucin de yodo yodurado. (Lugol) Yodo (qumicamente puro).............. 1 g Yoduro de potasio........................... 2 g Agua destilada............................ 300 mL Preparacin: - Combinar el yodo y el yoduro de potasio con la ayuda de un mortero. - Lavar el contenido de ste con pequeas alcuotas de agua destilada. - Agregar agua suficiente para obtener un total de 300 mL. - Agitar fuertemente. - Almacenar la solucin en una botella oscura y con tapn de vidrio. c) Alcohol acetona. Alcohol etlico (95%)................................ 500 mL Acetona.................................................... 300 mL Preparacin: - Mezclar los ingredientes respectivos de cada combinacin para su uso. d) Safranina. Safranina (pureza del colorante, 90%)....... 0.25 g Alcohol etlico (95%)...................................... 10 mL Agua destilada............................................ 1000 mL Preparacin: - Disolver el colorante en el alcohol. - Agregar el agua destilada. - Filtrar. - Almacenar en frasco con tapn de vidrio.

Mtodo cido resistente - ZIEHL-NEELSEN Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Preparacin del extendido previa a la coloracin La seleccin de la partcula ms purulenta de la muestra es uno de los pasos ms importantes para aumentar la probabilidad de identificar los casos de tuberculosis mediante la baciloscopia directa de esputo. Colocar la(s) partcula(s) seleccionada(s) sobre el portaobjetos y extenderla (s) con el aplicador con movimientos suaves, circulares, tratando de dispersarla en forma homognea en el centro de la lmina, dibujando un crculo u valo de 2 cm de largo por 1 a 2 cm de ancho, sin llegar a los bordes de la lmina para evitar que el operador se contamine al manipularla .

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BACTERIOLOGIA Verificar que el extendido tenga grosor homogneo y adecuado . Si es demasiado fino, es posible producir un resultado falso negativo . Si es muy grueso, el material puede desprenderse durante la coloracin o puede resultar difcil la visualizacin de bacilos debajo de una capa gruesa de mucus . Se puede adquirir entrenamiento poniendo un papel impreso debajo del extendido . El grosor adecuado es el que permite ver pero no leer un texto impreso a travs del preparado . Una vez adquirido el entrenamiento, es preferible no repetir rutinariamente este proceso para evitar tocar y transferir muestras con los papeles impresos . Dejar el extendido en un soporte ubicado al costado de la mesada para que se seque a temperatura ambiente . El extendido no debe ser calentado a la llama mientras est hmedo pues el calor fuerte altera la estructura de los bacilos y su posterior tincin; adems puede generar aerosoles . Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solucin de hipoclorito de sodio al 1%; este frasco ir al autoclave o directamente a incineracin . Los extendidos deben ser coloreados de inmediato, ya que algunos bacilos pueden permanecer vivos despus de fijados con calor hasta que incorporan la fucsina.

TINCION La tcnica de Ziehl Neelsen Coloracin Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente 5 cm entre una y otra una sobre un soporte dentro del lavatorio de coloracin; Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada . Si el nmero de baciloscopias a colorear es pequeo, se puede filtrar la fucsina directamente cuando se la deposita sobre el extendido a travs de un pequeo embudo con papel de filtro . Colocar sobre el soporte las lminas fijadas conservando el orden numrico con el extendido hacia arriba y manteniendo una separacin de al menos 1 cm entre ellas . Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada recien filtrada . Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivn, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos . No calentar con mechero . En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado . En el trmino de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisin de vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus lpidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal . Con una pinza, levantar cuidadosamente la lmina portaobjetos desde el extremo ms cercano al operador . Enjuagar con abundante agua a baja presin , con un frasco o un grifo . Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solucin de fucsina . Girar el extendido y lavar con cuidado tambin la parte posterior .

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BACTERIOLOGIA Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y as evitar diluir los reactivos que se utilizarn a continuacin .

Decoloracin Cubrir la totalidad del extendido con solucin decolorante y dejar actuar aproximadamente 2 minutos Enjuagar con abundante agua a baja presin. Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes ms gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado) . Si se observan cmulos rojos o coloracin rosada intensa, volver a cubrir con solucin decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y enjuagar nuevamente . Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos Coloracin de fondo Cubrir todo el extendido con solucin de azul demetileno . Dejar actuar durante un minuto. Enjuagar las lminas en ambas caras con agua a baja presin y limpiar la parte inferior con un algodn si ha quedado coloreada . Observar si las lminas conservan la numeracin clara y visible. Si no es as volver a numerarlas . Dejar secar las lminas a temperatura ambiente, apoyndolas en posicin vertical en un soporte sobre un papel absorbente . No apoyar papel absorbente sobre el extendido

Resultados: Bacterias Acido Resistentes: color rojo Bacterias No acido resistentes: color azul OBSERVACION MICROSCPICA Y LECTURA DE EXTENDIDOS La observacin microscpica debe cumplir principalmente dos objetivos: determinar si en el extendido hay BAAR si los hay, cuantificar aproximadamente la riqueza en bacilos . Caractersticas morfolgicas del bacilo de la tuberculosis Los bacilos acidorresistentes tienen entre 1 y l0 m de largo . Con la coloracin de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacndose claramente contra el fondo azul .En la muestras de esputo pueden presentarse aislados, apareados o agrupados . Es muy difcil distinguir el bacilo de la tuberculosis de otras micobacterias por examen microscpico . Algunas micobacterias que no son M. tuberculosis pueden aparecer como bastones muy largos o como bacilococos .Otros microorganismos pueden presentar distintos grados de cidorresistencia, como Rhodococous spp ., Nocarda spp ., Legionella spp . y los quistes de Crptosporidio e Isospora spp . Se observan como cocos, bacterias con formas variadas (pleomrficas), filamentos que a veces estn cortados, o como esferas de gran tamao si se las compara con las bacterias.

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INFORME DE LOS RESULTADOS La siguiente es la escala adoptada internacionalmente para el informe de los resultados de extendidos examinados por la tcnica de Ziehl Neelsen: Resultado del examen Informe microscpico No se encuentran BAAR en los 100 campos observados Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos observados No se observan bacilos cidoalcohol resistentes

N exacto de bacilos en 100 campos

Se observa entre 10 y 99 BAAR Positivo (+) en 100 campos observados Se observan de 1 a 10 BAAR Positivo (++) por campo en 50 campos observados Se observan ms de 10 BAAR por campo en 20 campos observados Positivo (+++)

El informe utilizando la escala semicuantitativa estandarizada asegura la resultados y permite evaluar - la gravedad de la enfermedad - la infectividad del paciente - la evolucin del paciente bajo tratamiento.

reproducibilidad de los

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REACTIVOS PARA LA TECNICA DE ZIEHL NEELSEN Fucsina bsica fenicada Fucsina 3% - Fucsina bsica* 3 g - Etanol 95 100 ml Disolver por agitacin suave . Fenol 5% - Cristales de fenol 5 g - Agua destilada 100 ml Disolver los cristales en el agua (puede ser preciso calentar suavemente) Manipular el fenol con guantes y cuidadosamente . Fucsina fenicada . Solucin de trabajo Combinar 10 ml de la solucin de fucsina al 3% con 90 ml de la solucin de fenol 5%, filtrar pasando por un embudo con papel de filtro antes de usar . Guardar todas las soluciones en frascos muy limpios, con cierre hermtico Rotularlos con el nombre del reactivo y con las fechas de preparacin y vencimiento . Almacenar a temperatura ambiente, al abrigo de la luz . Solucin decolorante Agregar siempre el cido al alcohol, suavemente, y no al revs porque la temperatura de la solucin aumenta explosivamente . - Acido clorhdrico (35%) 30 ml - Etanol 95 970 ml Mantener el envase hermticamente tapado . Donde sea difcil adquirir alcohol, puede utilizarse la siguiente solucin decolorante a base de cido sulfrico: - cido sulfrico concentrado (calidad tcnica) 25 ml - Agua destilada csp 100 ml Agregar el cido al agua, lentamente, agitando suavemente . Rotular la botella con el nombre del reactivo y con las fechas de preparacin y vencimiento . Almacenar a temperatura ambiente . Solucion de contraste Azul de metileno - Cloruro de azul de metileno* 3 g - Agua destilada 1000 ml * Cloruro de metiltionina, Methylthionine Chloride. Contenido de colorante 82% Disolver el azul de metileno en el agua agitando suavemente, guardar la solucin resultante en una botella color mbar . Rotular la botella con el nombre del reactivo y con las fechas de preparacin y vencimiento . Almacenar a temperatura ambiente y filtrar antes de usar.

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