CLONACIN DE UN FRAGMENTO DE DNA:

0) INTRODUCCIN La clonacin del DNA puede definirse como la recombinacin in vitro de un fragmento de DNA con un DNA vector con capacidad de replicacin autnoma. El fragmento de DNA se replicar junto con el DNA vector en la clula hospedadora y as ser posible obtenerlo en un nmero elevado de copias. Las etapas bsicas son: 1) Extraccin y fragmentacin especfica del DNA del organismo que nos interesa. 2) Unin de los fragmentos de DNA: fragmento del DNA que nos interesa + vector de transformacin y replicacin. 3) Introduccin en las clulas receptoras del DNA recombinante. 4) Seleccin de colonias aisladas que porten molculas de DNA recombinante. La clonacin nos ha abierto las puertas al estudio y aislamiento de genes, algo que hace unos aos era imaginable. Adems de permitirnos la identificacin de enfermedades genticas las tcnicas de DNA recombinante nos han abiertos nuevas puertas teraputicas.

Esquema clonacin DNA.

1) OBTENCIN DEL DNA La preparacin del DNA va a depender del organismo del que proceda. El DNA podr obtenerse mediante la extraccin a partir de la clula, generalmente con la finalidad de construir una genoteca. Bsicamente consiste en una lisis celular y la purificacin del DNA, con la finalidad de que este resulte libre de contaminantes. La lisis puede conseguirse mediante mtodos fsicos y qumicos. La pared bacteriana se degrada mediante un lisozima y se lisa con EDTA y SDS. Posteriormente las protenas y el RNA se degradan por tratamiento con proteasas (ej: Kinasa K) y con RNAasas. El DNA se podr separar de los enzimas y los restos ya que precipitar con etanol.

Este DNA purificado, en el que est representado todo el genoma del individuo lo vamos a fragmentar con el objetivo de construir lo que denominamos genotecas. Antes por tanto tendremos que fragmentar el DNA.

FRAGMENTACIN DEL DNA, ENZIMAS DE RESTRICCIN. Las endonucleasas de restriccin son enzimas que se encuentran en numerosas especies bacterianas y su funcin es la de reconocer y cortar el DNA forneo. El DNA de la propia clula no se corta y esto es porque la la secuencia que reconocera el enzima se encuentra metilada y por tanto no podr actuar. El conjunto formado por la metilasa y la endonucleasa es lo que se denomina sistema de modificacin- restriccin. Aunque los enzimas varan en algunos aspectos de sus condiciones de actuacin, se ha observado que todos ellos requieren Mg y actan a un Ph ptimo de entre 7.2 y 7.8. Existen tres tipos de endonucleasas, que identificamos con la abreviatura de tres letras correspondientes a la especie bacteriana de la que proceden. Las del Tipo I cortan de forma inespecfica en un punto que dista de la secuencia de reconocimiento alrededor de 1000 pares de bases. Las de Tipo III, aunque tambin es bastante inespecfica, corta en un punto ms cercano de la secuencia que las del tipo I, a unos 25pb. Tanto la una como la otra requieren energa a partir de ATP. Las endonucleasas de tipo II son las ms utilizadas. No requieren ATP y cortan especficamente en la secuencia de reconocimiento. Estas secuencias del DNA de doble hebra tienen entre 7/9 pb y son secuencias palindrmicas o invertidas. Aunque estas secuencias son especficas algunas endonucleasas reconocen secuencias incluidas en secuencias de reconocimiento de otros enzimas. Por ejemplo, la Sau 3 AI reconoce la secuencia GGATCC, la cual est incluida en la secuencia de reconocimiento de la Bam HI, GGATCC. Los extremos resultantes sern por tanto compatibles. En el caso de que ambas enzimas reconozcan la misma secuencia, estos enzimas se denominarn isoesquizmeros. Estos pueden cortar en distintos puntos de la secuencia o pueden diferenciarse en que uno de ellos es sensible y el otro no a las metilaciones.

A su vez, los fragmentos obtenidos podrn ser extremos romos, si cortan ambas cadenas en el centro de la secuencia, o cohesivos, si cortan enlaces separados unos pocos nucletidos en cada cadena complementearia. Una vez que se ha fragmentado el DNA, podemos separar el fragmento que nos interesa mediante una electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo debido a la digestin obtendremos numerosos fragmentos de distintos tamaos donde tambin influir el tiempo que hemos dejado al enzima para que acte. Por ello es mucho ms prctico construir, antes de clonar nuestro fragmento, una librera de DNA. Por ltimo decir que en la actualidad, mediante programas de ordenador podemos situar todos los posibles puntos de corte de enzimas de restriccin, obteniendo as lo que se denomina mapa de restriccin. GENOTECAS Una librera de DNA es una coleccin de los fragmentos derivados del genoma de un organismo. El paso previo va a ser la purificacin y la digestin parcial del DNA mediante los mtodos descritos. Una vez fragmentado lo sometemos a un proceso de separacin como por ejemplo utilizando una centrifugacin en gradiente de sacarosa, con el objetivo de eliminar los fragmentos pequeos. Obtendremos al final una poblacin de bacterias o bacterifagos siendo cada una de ellas portadoras de distintos DNA recombinantes. Este tipo de libreras es la denominada librera genmica. El problema con estas libreras es que es que la mayor parte del DNA genmico es no codificante por lo que la mayor parte de nuestros fragmentos contendrn intrones. Por lo tanto es mucho ms efectivo construir una librera de cDNA o DNA complementario. En los clones de cDNA no hay secuencias intrnicas ya que se han eliminado debido al proceso de maduracin que sufre el mRNA primario. Por ello contienen una secuencia codificante continua. La sntesis de cDNA se realiza en dos etapas : -Sntesis de DNA de una hebra a partir del mRNA con la transcriptasa inversa. -Sntesis de la hebra complementaria mediante la DNA polimerasa. La extraccin del RNA sigue el mismo protocolo que la extraccin del DNA: lisi, eliminacin de las protenas de SDS y fenol. Hay que eliminar de forma rpida las RNAasas y para ello se utilizan inhibidores como el DEPC ( dietilpirocarbonato), que modifica el RNA por carboximetilacin.

Una vez que ya tenemos los RNAs purificados tenemos que separar los mRNAs que slo constituyen un pequo % del RNA total. Para ello realizamos una cromatografa en oligo T- celulosa o en poliU- sefarosa. Los mRNAs se retendrn gracas a la cola de poliA que presentan en el extre 5`. Para separar un tipo determinado de mRNA lo podemos hacer mediante la tcnica de inmunoprecipitacin de los polisomas durante la traduccin in vitro. El problema que haba antes con las transcriptasas inversas que se utilizaban, del virus AMV, es que poseia actividad RNAsa por lo que se obtenan fragmentos muy pequeos. A los enzimas que se utilizan en la actualidad se les elimina el extremo carboxilo terminal, que es dondo sem encuentra la actividad RNAsa. La transcriptasa inversa requiere un cebador. Este puede ser un oligo T que ser complementario a la cola de poli A o si conocemos la secuencia podemos sintetizart in vitro un cebador complementario. De esta forma nuestro cDNA tendr slo la secuencia codificadora. Una vez que tengamos nuestro RNA-DNA tenemos que eliminar el RNA para sintetizar la otra hebra con la polimerasa I. La horquilla que nos queda en el extremo 3` habr que eliminarla con una nucleasa como la S1. Es importante que en el caso de que sinteticemos la genoteca a partir de la protena, tener en cuenta que el cdigo gentico es degenerado; es decir, que un aminocido puede ser codificado por ms de un triplete de bases. Otro uso de la construccin de las libreras de cDNA es la de poder definir diferencias de expresin gnica entre dos tipos celulares muy parecidos. Se denomina Hibridacin substractiva. Obtenemos el mRNA de la protena que nos interesa en un tipo celular y obtenemos su cDNA. Este cDNA lo hibridamos con exceso de mRNA del segundo tipo celular. El hecho de que no se hibriden implica que esta protena solo se sintetiza en uno de los tipos celulares. Este mtodo se utiliz por primera vez identificando protenas receptoras de membrana que estaban en los linfocitos T y no en los B. Por ltimo con respecto a otros tipos de genotecas tenemos por ejemplo la genoteca especfica de cromosomas. Los cromosomas los obtenemos mediante una citometra de flujo. Con este mtodo los separamos en funcin de la proporcin de bases A/T. Obtendremos una genoteca que tiene el DNA de un determinado cromosoma. Una vez que ya tengamos nuestra librera tendremos que aislar el fragmento que queremos clonar de entre todos los segmentos representados en la misma. Nuestro fragmento podr ser identificado mediante su hibridacin mediante una secuencia de DNA marcada y complementaria, lo que se denomina sonda. Las sondas pueden construirse de varias formas, dependiendo de la informacin que tengamos acerca del gen. Si la protena de inters ha sido identificada, a partir de su secuencia de aminocidos podremos sintetizar fragmentos complementarios, eso s, teniendo en cuenta los distintos tripletes para cada aminocido. Si disponemos por ejemplo de anticuerpos que reconozcan la protena que codifica el gen podemos identificar el clon que est sintetizando esa protena. Del mismo modo, si la protena es receptora, podremos utilizar una molcula que acte como ligando. Para estos dos mtodos es necesario que al construir la librera hayamos utilizado un vector que permita la sntesis de protenas codificadas por el DNA exgeno, lo que se denominan vectores de expresin.

Las sondas de DNA pueden ser de una o doble hebra. Las de una hebra tienen la ventaja de que no se van a formar hbridos compuestos por dos sondas autohibridadas. Estas sondas tendrn que ser marcadas, marcaje que ha sufrido grandes avances desde los aos setenta. Hasta los 70 se utilizaban mtodos radioactivos pero a partir de este ao que se desarrollaron nuevas tcnicas como el marcaje enzimtico y el marcaje qumico. El marcaje enzimtico puede ser terminal o interno. Un ejemplo de marcaje interno es el de Nick Translation o desplazamiento de mella. En este mtodo se participan una DNAsa y una DNA polimerasa. La DNAsa hidrolizar enlaces fosfodiester dando lugar a mellas al azar. Los extremos 5fosfato permiten que acte la DNA polimerasa. Esta con su actividad exonucleasa 5- 3 eliminar nucletidos del extremo 5, y con su actividad polimerasa 5- 3 aadir nuevos nucletidos marcados. Por tanto, el resultado final es la sustitucin de nucletidos no marcados por nucletidos marcados. Una vez que tenemos sintetizada nuestra sonda de DNA podremos utilizarla para localizar el clon que contiene nuestro gen. Para ello realizamos una hibridacin in situ aprovechando las interacciones que se establecen entre bases complementarias. Transferimos mediante un papel de filtro miembros de cada colonia bacteriana que hemos cultivado en la placa. Este proceso es lo que se denomina blotting. A estos miembros de las distintas colonias que se han adherido al papel, rplicas, se les somete a un proceso de lisis celular y desnaturalizacin. Posteriormente se les aade la sonda que hemos sintetizado, por ejemplo una sonda marcada radioactivamente. Mediante una autorradiografa podremos detectar las colonias que contienen nustro fragmento de DNA. AMPLIFICACIN DEL GEN MEDIANTE PCR.

La reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica que nos permite obtener artificialmente mltiples copias de nuestro fragmento de DNA, ahorrndonos todos los procesos descritos anteriormente. Este proceso requiere: Dos cebadores. Una DNA polimerasa termoestable, la ms utilizada es la Taq. Nucletidos de DNA. DNA que queremos amplificar. Una vez desmaturalizado nuestro DNA aadimos ambos cebadores que hibridarn uno con cada hebra. La DNA polimerasa entonces podr sintetizar las hebras complementarias. Estas hebras sintetizadas servirn como molde para el ciclo siguiente y as sucesivamente. A medida que se repiten los ciclos los productos de DNA unidos a los cebadores se amplifican en proporciones geomtricas: 2,4, 8, 16 Las ventajas de esta tcnica son varias. En primer lugar, requiere pequeas cantidades de DNA. Adems el proceso es mucho ms rpido. Sin embargo para poder realizarlo es necesario conocer la secuencia para sintetizar los cebadores. Por otro lado es muy fcil contaminar el DNA y es complicado aplicarlo a secuencias de ms de 1kb Por ltimo decir que la PCR puede utilizarse para amplificar cDNA a partir de RNA, lo que se denomina como RT- PCR. sta tcnica requiere un primer ciclo con la transcriptasa inversa. Por tanto, mediante la tcnica del PCR se pueden amplificar genotecas tanto genmicas como de cDNA

2) UNIN DE LOS FRAGMENTOS DE DNA A NUESTRO VECTOR. Por lo tanto ya tenemos DNA aislado, hemos fragmentado el DNA de nuestro vector y queremos insertar en l nuestro gen, con el objetivo de clonarlo. Vectores de clonacin. Un vector es una molcula de DNA con un origen de replicacin autnomo y que posee zonas donde pueden introducirse fragmentos de DNA exgeno. As, el DNA exgeno se replica como parte del vector en la clula receptora y hospedadora. Plsmidos. Molculas de DNA bihebra circular extracromosmico que se heredan de manera estable. Suelen conferir a la clula que hospedan alguna caracterstica fenotpica como la resistencia a antibiticos. Estn clasificados en dos grupos: estrictos, si su replicacin est acoplada a la del DNA de la clula hospedadora; y relajados, si se replican independientemente. Para ser utilizados como vectores los plsmidos deben cumplir unas caractersticas: pequeo tamao (mejor manipulacin y aislamiento); replicacin relajada (permite obtener el DNA clonado en grandes cantidades); y presencia de puntos de corte nicos (permiten seleccionar las clulas que porten el plsmido recombinante). Plsmidos con origen de replicacin en bacterias El plsmido bacteriano ms ampliamente usado es el pBR322 (plsmido de Bolvar y Rodrguez), ste posee un origen de replicacin en E.colimulticopiativo o relajado, un tamao pequeo y posee 20 sitios de corte nicos para enzimas de reestriccin de los cuales 6 se encuentran dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, otros dos dentro de su promotor y tres dentro del gen de resistencia a la ampicilina. De modo que las

clulas de E.coli que porten este plsmido sern resistentes a ambos antibiticos mientras que las que porten un plsmido recombinante sern sensibles a aquel antibitico en cuyo gen se ha producido la insercin de DNA exgeno y resistentes al otro. As resulta sencilla la seleccin de bacterias transformadas con el plsmido recombinante.

Plsmido pBR322 mostrando algunos sitios de restriccin tiles para la clonacin. Para esta seleccin por resistencia a antibiticos se han desarrollado plsmidos que permiten la seleccin directa en un solo medio como los que tienen junto con un gen de resistencia a un antibitico el fragmento lacZ' suficiente para completar la seleccin del operon lac de E.coli que codifica para la galactosidasa. En el lacZ' se ha creado un sitio de clonaje mltiple, pequea zona de DNA donde estn presentes sitios de corte nicos de varias enzimas de restriccin en los cuales se introduce el DNA exgeno. La serie de plsmidos pUC son tratados en un medio con IPTG (inductor de la sntesis de -galactosidasa en E.coli), ampicilina y X-gal, lo que les hace dar lugar a colonias resistentes al antibitico y de color azul (se rompe el X-gal) pues producen galactosidasa funcional. El ms representatico es el pUC19, que lleva un origen de replicacin en Escherichia coli y el gen de resistencia a la ampicilina.

Plsmido pUC19.

Plsmidos con origen de replicacin en levaduras. Las levaduras son las eucariotas ms utilizadas como vectores por el pequeo tamao de su genoma y su corto ciclo celular lo que les hace fcilmente manejables. Y adems, casi todas las levaduras son aptas para el consumo humano lo que las hace muy buenas candidatas para la produccin a nivel industrial de protenas heterlogas. La gran mayora de este tipo de vectores son lanzadera o shuttle lo que significa que poseen adems de un origen de replicacin y un gen que permita la seleccin en la levadura, un origen de replicacin y un gen que permita la seleccin y amplificacin en E.coli. El gen lacZ tambin se expresa en levaduras, habindose construido plsmidos lanzadera especialmente tiles para la clonacin y estudio del funcionamiento de promotores en levaduras. Los plsmidos ms importantes de este tipo son los YACs, que contienen secuencias telomricas en ambos extremos. Permiten clonar fragmentos muy grandes, de 150 a 1000kb, siendo utilizadospara el genoma humano o de eucariotas superiores Virus y bacterifagos. Se utilizan virus y bacterifagos como vectores porque su rendimiento de infeccin es superior al que se obtiene en la transformacin con plsmidos aunque su manipulacin es ms compleja. Los vectores virales admiten y replican de manera estable insertos mayores que los plsmidos. La infeccin viral permite que cada clula hospedadora contenga muchas copias del gen exgeno y que ste se exprese abundantemente bajo el control de los promotores de los virus que son muy activos. El bacterifago ms conocido es el de E.coli, cuyo genoma consta de un DNA bihebra de 50kb de tamao y que presenta en sus extremos 5', 12 nucletidos monohebra con secuencias complementarias denominados extremos cos, que, al

emparejarse, permiten que la molcula se circularice al introducirse en la clula hospedadora y as se pueda tambin empaquetar el DNA dentro de la cpsida viral. La parte central del DNA del bacterifago sirve para asegurar su integracin en el cromosoma de la bacteria hospedadora durante la fase lisognica pero no es indispensable para la replicacin del virus y, por tanto, puede ser interrumpida o sustituida y eliminada por el DNA exgeno a clonar. Si no es sustituido el DNA no esencial por el DNA exgeno no se produce el empaquetamiento dado el pequeo tamao de la molcula de DNA resultante, lo que se utiliza para seleccionar fagos recombinantes.

Csmidos y fagmidos. Los csmidos son vectores hbridos desarrollados por combinacin de plsmidos y del genoma del fago . Constan de una molcula de DNA de 5kb que lleva genes de resistencia a antibiticos, el origen de replicacin de un plsmido bacteriano, los extremos cos del DNA del fago y sitios nicos de restriccin para la insercin del DNA a clonar. Los csmidos recombinantes pueden empaquetarse in vitro en partculas de fago para infectar las clulas hospedadoras en las que el DNA se inyecta y circulariza como fago pero se replica como plsmido. La seleccin de bacterias se hace, por eso, por resistencia a antibiticos. Los fragmentos de DNA clonados pueden ser muy grandes, de hasta 47kb por lo que son adecuados para la construccin de genotecas eucariticas.

Representacin de un csmido. Los fagmidos son plsmidos bacterianos unidos a un origen de replicacin de un fago de DNA monohebra. Sin embargo, permiten obtener el DNA de cada hebra por separado con un fago auxiliar Elementos trasponibles. Tambin llamados trasposones. Son secuencias de DNA mviles que son capaces de insertarse en otras zonas del genoma y cambiar genes de lugar. Los ms sencillos se denominan secuencias de insercin o IS y su longitud aproximada es de 1kb. Codifican una nucleasa especfica o transposasa y poseen secuencias repetidas invertidas en ambos extremos de unos 20pb. Despus de la transposicin, la secuencia receptora (4-12pb) aparece duplicada pero no invertida a ambos lados de la IS. El mecanismo de la transposicin se basa en la unin de las secuencias repetidas invertidas de los extremos de la IS a su propia transposasa que va haciendo cortes en bisel en las zonas de los DNAs donante y receptor de la IS. La transposicin puede ser conservativa si slo interviene una copia del transposn o replicativa si el transposn se duplica al desplazarse. La secuencia receptora es diferente para cada insercin por lo que los transposones se insertan en regiones inespecficas del genoma No slo se han encontrado elementos transponibles en bacterias sino tambin en organismos eucariotas, en donde son ms abundantes los retrotransposones en los que la transposicin ocurre mediante un intermediario de RNA.

Mecanismo simplificado de la integracin de una secuencia de insercin en un DNA receptor. Fusin del vector con el segmento de inters: Para unir los fragmentos de DNA al vector utilizamos las DNA ligasas. Para ello hay que tener en cuenta los extremos que se nos han originado a partir de la accin de los enzimas de restriccin. Como hemos dicho antes los extremos pueden ser cohesivos y romos ( en donde la eficacia es menor), ya que la unin de los extremos cohesivos se ve facilitada por las secuencias complementarias que se van a poder aparear.

Sin embargo, mientras que el DNA de extremos romos se puede unir a cualquier otro DNA de extremos romos, en el caso de la unin de extremos cohesivos, es necesario que stos sean compatibles. En el caso de que esto no sea as podemos

convertir un tipo de de sitio para un enzima en otro distinto; es decir, que podemos convertir los extremos cohesivos en romos. Tendremos que distinguir dos casos. En primer lugar, que los extremos sean 5` por lo que utilizaremos la DNA polimerasa. Por otro lado, que los extremos sean 3`, en tal caso lo tratamos con la nucleasa S1. Otra forma de volver compatibles los extremos de DNA es a travs de la utilizacin de adaptadores o linkers. stos son oligonucletidos sintticos de doble hebra con extremos romos y que presentan un sitio de corte especfico para un enzima de restriccin. Esto permite que una vez que acte el enzima se generen extremos cohesivos complementarios a los del vector. Adems estos adaptadores nos permiten que una vez que tengamos el clon podremos recuperar nuestro fragmento y tambin que al insertar nuestro cDNA ste lo haga en la orientacin adecuada. Con el uso de DNA ligasas hay que evitar en primer lugar que el DNA del vector no se recircularice y para ello se eliminan los fosfatos del extremo 5` mediante la fosfatasa alcalina. Dentro de las ligasas ms utilizadas estn la T4 que requiere ATP y se utiliza con extremos romos, y la ligasa de E. Coli que requiere NAD. Otro mtodo de unin aparte de las ligasas es la unin mediante colas homopolimricas. Consiste en aadir colas hmopolimricas, como poliC y poliG a los extremos de inserto y al vectror. Ambas molculas se unirn por apareamiento. En el caso de que el DNA que queremos insertar sea producto de la PCR, los extremos no son exactamente romos sino que tienen una protuberancia 3`A, por lo que habr que tratarlos con la S1 o con la polimerasa. Actualmente se comercializan plsmidos con extremos protuberantes T por lo que los extremos sern complementarios.

3) INTRODUCCIN DEL DNA EN CLULA HUSPED: TRANSFORMACIN. Cuando el DNA exgeno ha sido ligado en el vector, debe entonces introducirse en la clula hospedadora. Las ms usada es E. coli pues, o bien la clonacin se realiza directamente en esta bacteria o bien se utiliza para la amplificacin del DNA recombinante. Esto hace que la mayora de los vectores desarrollados para clulas eucariticas son lanzadera o shuttle, poseyendo tambin orgenes de replicacin y genes marcadores de E. coliadems de los de sus clulas hospedadoras caractersticas. Transformacin mediada por Ca2+. Las clulas con capacidad de ser transformadas (de captar DNA) se denominan competentes. Esta transformacin consiste en tratar la membrana del E.coli, que usualmente es muy impermeable, con ClCa a 0C de modo que queda afectada la pared celular y el DNA es capaz de adherirse a los sitios accesibles de dicha pared. Despus un corto choque trmico a 42C favorece la incorporacin del DNA. Las clulas se recuperan por incubacin en un medio completo a 37C durante 1h antes de ser sembradas en el medio selectivo correspondiente. Sin embargo, con este mtodo solo resultan transformadas un nmero tal de clulas que no supera el 1%. Otros mtodos se basan en transformar protoplastos en lugar de clulas completas de modo que se trata la pared celular con enzimas lticas y, a continuacin los protoplastos obtenidos se ponen en contacto con el DNA en un medio en presencia de

Ca y de PEG. Finalmente, los protoplastos regeneran sus paredes en un agar semislido dando lugar a clulas de levadura transformadas viables. Electroporacin. Sirve tanto para clulas de mamfero o de plantas como para levaduras y bacterias. Consiste en un proceso fsico que, de modo transitorio y por accin de un breve pulso elctrico, permeabiliza las membranas tanto de clulas procariotas como eucariotas, al hacer que se formen poros en las mismas, permitiendo la entrada en la clula de molculas de DNA grandes e incluso de partculas vricas. Es un mtodo bastante ineficaz puesto que de cada 1000 clulas, slo una de ellas recibe el DNA. Segn el tamao de la clula se necesita mayor o menor voltaje de modo que cuanto ms pequea es la clula, mayor voltaje se necesita para que se formen los poros en la membrana. Cuando cesa el pulso elctrico, los poros se cierran. Lipofeccin. Consiste en la utilizacin de liposomas capaces de unirse tanto al DNA como a la superficie celular, ambos cargados negativamente. Se utiliza mucho con clulas de mamfero. El DNA transferido no se integra en el genoma, sino que los genes se expresan de modo transitorio. Microinyeccin. Los sistemas de microinyeccin de genes en oocitos, huevos y embriones de animales permiten el estudio de los genes transferidos durante el desarrollo embrionario normal. Estos mtodos permiten la introduccin de cualquier DNA en cualquier clula sin necesidad de presin selectiva para mantenerlo si bien se necesita un equipamiento costoso y mucha prctica con la desventaja de que se pueden tratar un nmero reducido de clulas cada vez. Se utilizan tambin para introducir vectores plasmdicos en ncleos de protoplastos vegetales. La microinyeccin se realiza al microscopio con capilares de vidrio de dimetro entre 0,1 y 0,5 mm y con ayuda de un micromanipulador. Biobalstica. Consiste en utilizar microproyectiles a velocidad supersnica para introducir cidos nucleicos y otras sustancias en clulas o tejidos intactos. Es una tecnologa aplicable a todo tipo de clulas, procariotas y eucariotas, e incluso orgnulos como cloroplastos o mitocondrias. Los microproyectiles se sitan en la superficie de un transportador macroscpico denominado macroproyectil, de polietileno, y son impulsados por una descarga o explosin de gas. El gas que recubre las clulas o tejido a bombardear se retira con una bomba de vaco ya que provoca deceleracin de los microproyectiles. Se usa sobre todo el helio puesto que un gas ligero minimiza ese problema. Fusin de protoplastos. Consiste en la mezcla directa de protoplastos bacterianos portando un alto nmero de copias de un plsmido determinado de inters, con clulas de mamfero en cultivo. Despus de la fusin de las membranas en presencia de PEG, el contenido de las bacterias pasa al citoplasma de las clulas eucariotas y el DNA plasmdico se transfiere al ncleo. Se obtienen muchas copias del DNA exgeno integradas en tandem en el cromosoma hospedador. Esta tcnica no slo se usa para la transferencia de DNA plasmdico de una bacteria a una clula eucariota, sino que tambin se aplican a la transferencia, inter o

intraespecfica, de material gentico entre dos lneas celulares de bacterias, de levaduras o de microhongos filamentosos. As es posible que se den fusiones mltiples entre lneas que sean naturalmente incapaces de conjugar. Las condiciones de incubacin posteriores a la fusin deben, en este caso, permitir que se regenere la pared celular para obtener clulas hbridas viables, capaces de dividirse y de formar colonias. En las clulas hbridas resultantes se recombinan los cromosomas de las clulas originales y portarn, por tanto, algunas caractersticas de ambos progenitores. Esto es bastante til cuando el carcter que se desea transmitir depende de un gran nmero de genes que pueden incluso presentar diferente localizacin cromosmica o tambin cuando no se dispone de sistemas de transformacin o vectores para alguna de las especies implicadas. 4) SELECCIN DE COLONIAS AISLADAS QUE PORTEN MOLCULAS DE DNA RECOMBINANTE. Nos queda simplemente seleccionar aquellas colonias bacterianas que expresen nuestro DNA recombinante, lo podemos hacer detectando el gen o sus productos (RNA o protena) o detectarlo por secuenciacin del genoma de cada colonia. Tcnicas de deteccin de productos gnicos: Southern blot: Consiste en extraer el DNA genmico, digerirlo con una endonucleasa de restriccin, separar los fragmentos por electroforesis y transferirlos a un papel de nitrocelulosa o de nylon, tras la desnaturalizacin por tratamiento alcalino, el DNA se hibrida con una sonda marcada complementaria a parte de la secuencia clonada con lo que nos detecta su presencia. Se denomina Northern blot a la misma tcnica aplicada al RNA y Western o Inmunoblot a la misma tcnica para las protenas. Secuenciacin directa de fragmentos de DNA: Mtodo de Sanger. Se basa en la sntesis enzimtica a partir de un primer (cebador), de secuencia complementaria a una molcula de DNA molde, por accin de una DNA polimerasa que va incorporando, al extremo 3' de la cadena en crecimiento, dNTPs (2'desoxinucletidos, de los cuales uno debe estar marcado) y ddNTPs (2',3'didesoxinucletidos) que difieren de los anteriores en que les falta el grupo hidroxilo del carbono 3' del azcar, esto significa que su incorporacin impide la formacin del enlace fosfodiester entre la cadena en crecimiento y el siguiente nuevo nucletido. Las molculas del DNA molde pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble y desnaturalizadas por accin del calor o lcalis. La calidad del DNA se obtiene tras una gran purificacin por centrifugacin a travs de gradientes de cloruro de cesio generalmente. La cantidad de molculas de RNA se debe reducir al mximo ya que compiten efectivamente con las molculas de DNA durante la reaccin de marcaje terminal. Los cebadores son oligonucletidos de entre 15 a 30 residuos y que deben ser de secuencia complementaria a la molcula de DNA molde, y con el extremo 5' bloqueado para que la sntesis se dirija en direccin 3'.

Las DNA polimerasas suelen ser muy variadas. El fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E.coli fue la primera en usarse y sirve para secuenciar fragmentos cortos de DNA. Para conseguir lecturas de secuencias ms largas, del rango de los 700-800 bases, se utilizan soluciones de terminacin que lleven una relacin de ddNTPs: dNTPs del orden de 1:30 frente a la relacin 1:10 en una secuencia de lectura de 400-500 bases. El proceso de Sanger se basa en una serie de pasos: Desnaturalizacin de la molcula de DNA de cadena doble por procesos de calor y/o lcalis. Hibridacin del cebador con la molcula de DNA. Unos 2 minutos a 65C con el descenso gradual de la temperatura hasta los 30C. Sntesis enzimtica, siendo necesaria la DNA polimerasa y los 4 dNTPs, uno marcado, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente. Parada de la reaccin de polimerizacin a 4 tubos que llevan cada uno de los ddNTPs, continuando la reaccin otros 5 minutos a 37C. As se consigue detener en un tubo la reaccin a nivel de la adenina (tubo con el ddATP), guanina (tubo con el ddGTP), y as con los otros tubos. Final de la reaccin a 0C y desarrollo de la electroforesis en condiciones desnaturalizantes.

Mtodo de Sanger. Las reacciones se cargan en un gel de poliacrilamida al 6% al que se le aplica un voltaje entre 1500-2000 voltios durante un par de horas. La concentracin de acrilamida vara segn la resolucin que se desee (ej.solo de los 50 primeros nucletidos la concentracin oscila entre el 12-20%). Despus de la separacin

electrofortica y posterior revelado por autorradiografa, la longitud del fragmento observado es igual a la distancia entre el punto de corte y el punto de marcaje. La lectura de los geles se realiza del extremo 5' al 3'. Mtodo de Maxam y Gilbert Se basa en la capacidad de determinadas sustancias de modificar especficamente bases de la molcula de DNA. El xito del mtodo depende de la especificidad de estas reacciones de rotura, las cuales se llevan a cabo en dos etapas: primero se realiza una modificacin qumica de bases especficas y segundo esta base modificada es separada del azcar con rotura de los enlaces fosfodiester 5' y 3'. Los mecanismos qumicos de las primeras reacciones son los siguientes: G: Tratamiento con DMS (dimetil sulfato) metila al N7 de la guanina. G+A: El cido frmico debilita las uniones entre A y G, protonizando los nitrgenos del anillo de las purinas. C: En presencia de Cloruro sdico, la hidrazina slo reacciona con citosina. C+T: La hidrazina divide el anillo de T y C. Una vez que la cadena de DNA se ha cortado, un solo fragmento es radioactivo ya que nicamente se ha marcado un extremo de la misma. Este tipo de secuenciacin requiere el conocimiento del mapa de restriccin del fragmento a secuenciar. Este mtodo es ptimo para secuencias de DNA que tienen menos de 250 nucletidos a partir del extremo marcado.

Secuenciacin qumica de Maxam y Gilbert Las reacciones de este mtodo conllevan problemas, los reactivos a usar deben llevar un control de calidad y se necesitan DNAs de gran pureza; razones por las que ha sido algo desplazado por el mtodo enzimtico, aunque es realmente til para obtener informacin de secuencias de regiones internas de grandes insertos de DNA. Secuenciacin quimiolusciente. Despus de la electroforesis de los productos de la secuenciacin biotinilados, stos son transferidos y fijados a una membrana de nylon. Posteriormente son detectados mediante una reaccin quimioluminiscente. Estrategias de secuenciacin. Es importante al ir a secuenciar: el tamao de la regin a ser secuenciada, la exactitud de la secuencia requerida y las facilidades de las que se disponga. El uso ms frecuente de la secuenciacin es para detectar nuevas mutaciones o para verificar la orientacin y estructura de las construcciones de DNA recombinante. Secuenciacin Directa por delecciones seriadas o Nested deletions Se obtienen, mediante exonucleasas, una serie de fragmentos cada vez ms deleccionados que comienzan en un punto comn mantindose el otor extremo de la molcula constante e internndose progresivamente dentro de la regin a secuenciar. Las delecciones se ordenan por tamao y se secuencian de tal forma que en sucesivas lecturas pueden obtenerse secuencias que se van solapando con las anteriormente obtenidas. Siempre se utiliza el mismo primer o cebador.

Obtencin de delecciones seriadas. Secuenciacin Al Azar o Shot-gun

Se secuencian distintos fragmentos al azar y luego se introducen en el ordenador, el cual se encarga de ensamblarlos. Luego se clonan los distintos fragmentos en un vector para ser secuenciados posteriormente. Fraccionamiento al azar de una molcula de DNA molde para su posterior secuenciacin. Secuenciacin por Paseo o Primer Walking Las secuencias ya obtenidas se usan para disear nuevos primers o cebadores que nos permitan ir avanzando progresivamente a medida que avanza la secuenciacin en el fragmento de DNA a estudio. Esto requiere la sntesis de muchos oligonucletidos. Secuenciacin desde varios Ips o Puntos de Iniciacin Este mtodo permite ahorrar mucho tiempo iniciando la secuenciacin desde varios puntos a la vez. Despus de haber obtenido los IPs, hay que obtener lecturas de gran extensin que nos permitan reducir: el nmero de oligocebadores necesarios, el nmero de reacciones enzimticas, el nmero de sondas de DNA, la cantidad de secuencias solapadas y el nmero de geles necesarios de secuenciacin. Secuenciacin por Hibridacin o Sequencing by hibridization (SBH) Esta tcnica utiliza un grupo de sondas de oligonucletidos cortos de secuencia definida para la bsqueda de secuencias complementarias sobre una gran hebra de DNA molde. El patrn de hibridacin es usado luego para reconstruir la secuencia de DNA. La metodologa de hibridacin se lleva a cabo uniendo las sondas de oligonucletidos a una placa mediante sntesis dirigida por luz, marcndolos con fluorescencia y a travs de los cuales se hace pasar el DNA molde a estudio. Esta tcnica nos permite detectar cambios de bases.