INTRODUCCION TEORICA

FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRA
Introduccin : La espectrofotometra es uno de los mtodos de anlisis ms usados, y se basa en la relacin que existe entre la absorcin de luz por parte de un compuesto y su concentracin. Cuando se hace incidir luz monocromtica (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido. Dependiendo del compuesto y el tipo de absorcin a medir, la muestra puede estar en fase lquida, slida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagntico, la muestra es generalmente disuelta para formar una solucin. Cada sustancia tiene su propio espectro de absorcin, el cual es una curva que muestra la cantidad de energa radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagntico, es decir, a una determinada longitud de onda de la energa radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiacin que es distinta a la que absorbe otro compuesto (Fig. 1)

Absorbancia (A)

Longitud de Onda (nm) Fig. 1 Espectro de absorcin de dos compuestos diferentes. El mtodo espectrofotomtrico se rige por dos leyes fundamentales : Ley de Lambert y Ley de Beer. 1.- Ley de Lambert. : Esta ley establece que cuando pasa luz monocromtica por un medio homogneo, la disminucin de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida diminuye exponencialmente al aumentar aritmticamente el espesor del medio absorbente (Fig. 2):

P0

B
Fig. 2. Ley de Lambert La siguiente relacin matemtica da cuenta de esta ley: P / P0 = e kb Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida b : Espesor del medio absorbente k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza del medio. 2.- Ley de Beer : La intensidad de un haz de luz monocromtica disminuye exponencialmente al aumentar aritmticamente la concentracin de la sustancia absorbente, cuando este haz pasa a travs de un medio homogneo (Fig. 3).

P0 c
Fig. 3. Ley de Beer

La relacin matemtica que da cuenta de esta ley se muestra a continuacin : P / P0 = e -kc donde : Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida c : Concentracin de la solucin k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de concentracin de la solucin, y frecuentemente, de la naturaleza del medio. Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer log P0 / P = a b c A = log P0 / P = - log T donde : a : Absortividad c : Concentracin de la solucin b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta) P/Po= T : Transmitancia A=abc

la luz incidente, de la

Los trminos absorbancia y transmitancia son definidos a continuacin Transmitancia (T) : Es la razn entre la luz monocromtica transmitida (P) por una muestra y la energa o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energa radiante incidente como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda. T = P / P0 = 10-abc %T = 100 P / P0

Se acostumbra a considerar la transmitida como la razn de la luz transmitida por la muestra y la luz transmitida por un estndar arbitrario. Este estndar puede ser el liquido (solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco analtico (solucin que contiene todos los componentes de la solucin problema menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de este estndar no es necesariamente 100%, es necesario especificar el estndar con el cual la muestra es comparada. Absorbancia(A) : Se define como la cantidad de energa radiante absorbida por una sustancia pura o en solucin. Matemticamente, corresponde al logaritmo negativo de la transmitancia.T, transmitancia expresada como fraccin decimal %T, transmitancia expresada como porcentaje. A = - log T = 2 log %T Pero. T = P / P0 = 10-abc Luego A = - log ( P / P0 ) = - log 10-abc A = abc Esta ecuacin indica que la absorbancia es una funcin lineal de la concentracin, donde a es una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a depende de las unidades de b y c. Si la concentracin c est expresada en moles por litro y la longitud de la cubeta b en centmetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar( ) . Luego A= bc Mediciones de transmitancia y absorbancia. Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparacin entre la muestra problema y un estndar arbitrario o referencia. Como la referencia debe poseer un porcentaje de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.

Seleccin de longitud de onda de trabajo. La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de onda en la cual la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es mxima, y recibe la denominacin de Lambda mximo (max). Para seleccionar el max., se hace un espectro de absorcin o curva espectral, y que consiste en una grfica de la absorbancia de una solucin de la sustancia absorbente de concentracin adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se determina el max. (Fig.4).

1 3 2

max = 1

En este caso

(nm)
Fig. 4 . Curva espectral
Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda donde se espera que absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se realizan en la zona visible del espectro electromagntico (380 a 800nm). En el caso de sustancias no coloreadas, las mediciones se realizan en la regin ultravioleta del espectro electromagntico (200 a 380nm).

Curva de Calibracin. Uno de los mtodos ms utilizados para determinar la concentracin de una muestra problema, es el mtodo de la curva de calibracin. Esta curva de calibracin es una grfica que relaciona la concentracin de al menos cinco soluciones de estndar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda mxima ( max) (Fig. 5).

C Fig. 5. Curva de Calibracin

Una vez obtenida la grfica se determina la funcin matemtica que presenta dicha recta a travs del tratamiento estadstico de regresin de los mnimos cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la concentracin de un analito. La siguiente ecuacin matemtica corresponde a dicha funcin:

A=mc+n

(Ecuacin 1)

A : Absorbancia. n : Intercepto de la recta m : Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de la muestra y el espesor b de la cubeta. 8

Luego se mide la absorbancia de la solucin problema y se interpola su valor en la grfica o se reemplaza en la ecuacin (1), para obtener el valor de concentracin del analito. La concentracin de la solucin problema debe estar comprendida en el rango de concentracin que comprende la curva de calibracin. Si la concentracin de la solucin problema es menor que la concentracin del estndar ms diluido, debe usarse el mtodo de adicin estndar, que consiste en adicionar un volumen determinado de un estndar concentrado a la solucin problema, antes de realizar la lectura y que permite que esta lectura este dentro de las obtenidas para la curva de calibracin. En el caso contrario, si la concentracin del analito es mayor que la concentracin del estndar ms concentrado la solucin problema deber ser diluida.

Amuestra

Cmuestra
Fig. 6. Interpolacin Grfica

Al hacer la curva de calibracin, se debe emplear la longitud de onda de mxima absorbancia (max.), para obtener una recta con la mxima pendiente y as tener mayor sensibilidad y precisin al hacer las mediciones. La medicin de la absorbancia de la solucin problema debe hacerse a la misma longitud de onda que fue hecha la curva de calibracin.

TRABAJO PRCTICO N2 TEJIDOS DUROS MINERALIZADOS ESMALTE Y HUESO INTRODUCCION La parte dura de un diente est compuesta por tres tejidos mineralizados: esmalte, dentina y cemento. El esmalte es de origen epitelial bucal y tiene caractersticas qumicas - biolgicas nicas. La dentina y cemento son de origen mesodermico y tienen caractersticas qumicas - biolgicas similares al hueso. El esmalte adulto tiene solo un 0,5% de protena en peso, en comparacin con el 20% de hueso y dentina El esmalte humano tiene un componente inorgnico entre un 95-96%, para dentina, cemento y hueso estos valores estn alrededor de un 70%. Los componentes minerales de esmalte, dentina, cemento y hueso estn formados por cristales de fosfato de calcio bsicos con una distribucin espacial de sus tomos equivalentes a la hidroxiapatita mineral. La disolucin del tejido mineral dentario, es el mecanismo principal de la caries. Los factores que controlan la disolucin es un proceso complejo, donde factores como impurezas, tamao del cristal, defectos cristalinos, afectan la velocidad de disolucin. Objetivos : Visualizar la desmineralizacin cida del diente y hueso. Determinar espectrofotomtricamente uno de sus productos de disolucin, fosfato. Comparar la velocidad de desmineralizacin entre diente y hueso. 1. Desmineralizacin cida de dientes y huesos Materiales necesarios 3 Dientes y 3 huesos HCl 0,05 M Acido lctico 0,05 M y concentrado Tubos de ensayo Pinzas Etapa experimental : Tome tres dientes y tres trozos de hueso y colquelos en tubos de ensayo, agrgueles las siguientes soluciones durante el tiempo indicado para cada uno de ellos. d. e. f. 5ml de HCl 0,05 M por 5 minutos 5ml de cido lctico 0,05 M, por 30 minutos 5ml de cido lctico concentrado, por 30 minutos

Retire los trozos de diente y hueso de cada tubo con la pinza y rotule las soluciones obtenidas indicando tipo de slido, cido, tiempo de incubacin y el nmero de su grupo. 2. Determinacin de fosfatos Principio: El fosfato de naturaleza inorgnica presente en el material biolgico, forma con el molibdato de sodio un fosfomolibdato, que por reduccin, se convierte en azul de molibdeno, determinable por espectrofotometra; y que es proporcional a la cantidad de fosfato inorgnico presente: Materiales Espectrofotmetros Reactivo 1 : Solucin Bisulfito - Borato : 0,19 M - 5,2 x 10-2 M. Reactivo 2 : Solucin Molibdato de Sodio - Acido Sulfrico : 0,1M - 2,6 N. Reactivo 3 : Solucin Reductora (Sulfato P - Metilaminofenol)- Bisulfito : 2,9 x 10-2M - 0,32M Reactivo 4 : Solucin Sulfito - Carbonato (Desproteinizadora) 5,5,x 10-2M - 0,4M Reactivo 5 : Solucin Patrn Fosfato : 5mg P/100ml solucin. Matraces aforados de 10 ml o tubos de ensayo Pipetas de 1 ml graduadas al 0.1 Pipetas de 2 ml Reloj de alarma Agua destilada 10

Curva de Calibracin : a.- Marque 5 matraces aforados de 10 ml segn la siguiente tabla y agregue a cada uno de ellos los reactivos correspondientes y en el orden determinado. Cumpla con cada etapa de la reaccin:
N Matraz 1 2 3 4 5 Vol. Reactivo 5 (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4

b.- Agregar a cada matraz

1,0 ml de reactivo 1 0,2 ml de reactivo 2 0,2 ml de reactivo 3

c.- Tapar los matraces, mezclar bien y dejar reposar por 15 minutos a temperatura ambiente. d.- Agregar a cada matraz : 2 ml de reactivo 4 e.- Mezclar bien, enrasar con agua a 10 ml y medir transmitancia a 750 nm. f.- Llene la siguiente tabla y calcule A = 2 - log T Matraz N 1 2 3 4 5 Reactivo 5 (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 mg P/100 ml 0 0.05 0.10 0.15 0.20 %T A

g.- Grafique en papel milimetrado mg P/100 ml v/s A y calcule a partir de estos datos la ecuacin de regresin correspondiente. Soluciones Muestras: a. Tome 1 ml de las soluciones muestras clorhdricas y dilyalas a 50 ml con agua. b. Tome 1 ml de las soluciones muestras clorhdricas diluidas y llvela a un matraz de 10 ml, repita todos los pasos de la curva de calibracin a partir del punto b. c. Tome 1ml de las muestras acticas y lcticas (sin diluir) y transfiralas a matraces de 10 ml y proceda en forma similar al punto anterior Clculos: Muestras clorhdricas. El valor de concentracin obtenido por interpolacin o a travs de la ecuacin de regresin se multiplica por 10 y luego por 50. Se expresa como mg de P por 100 ml. Muestras acticas y lcticas. El valor de concentracin obtenido por interpolacin o a travs de la ecuacin de regresin se multiplica por 10 . Se expresa como mg de P por 100 ml. Cuadro Resumen: Complete el siguiente cuadro con sus resultados experimentales. Concentracin de fosfato mg/100 ml Diente Hueso Acido clorhdrico 0.05 M Acido lctico 0.05 M Acido lctico concentrado . NOTA : Si utiliza tubos de ensayo, complete a 10 ml sumando los volmenes utilizados y completando con agua destilada por diferencia.

11