Mtodos de Siembra y Tcnica Asptica

Apartados de este ejercicio

A. Finalidad del ejercicio B. Mtodos de siembra C. Tcnica asptica D. Asa e hilo de platino: Pasos para la manipulacin en condiciones aspticas E. Placas petri: Pasos para la manipulacin en condiciones aspticas F. Recipientes de vidrio; tubos, matraces, etc.: Pasos para la manipulacin en condiciones aspticas G. Pipetas de vidrio estriles: Pasos para la manipulacin en condiciones aspticas H. Asa de Drigalski o asa acodada de vidrio: Pasos para la manipulacin en condiciones aspticas

A. Finalidad del ejercicio

El objeto de este ejercicio es comprender la tcnica ms importante, ms distintiva y ms esencial en un laboratorio de microbiologa: La tcnica asptica en los mtodos de siembra. Se intenta mostrar o dar a conocer algunas de sus caractersticas. Para ello, se describen algunos mtodos de siembra, algunas reglas generales y algunos ejemplos de casos concretos.

B. Mtodos de siembra
Mtodos de siembra Existen muchos mtodos de siembra o de transferencia de microorganismos o de inocular medios de cultivo. Generalmente se realiza en 3 etapas: 1)Esterilizar el asa, hilo o pipeta de siembra; 2)Obtener o extraer el inculo y 3)Transferirlo al medio estril A continuacin se describen algunos ejemplos: En tubo En medio lquido con asa

Transferir aspticamente, con el asa de siembra, una pequea muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estril. Sumergir el asa en el lquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recin sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.

En medio lquido con pipeta

Introducir aspticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada en el medio lquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una cantidad establecida de material que se transfiere al tubo con medio de cultivo estril. Incubar en estufa a la temperatura y tiempo adecuados

En medio slido (agar inclinado)

Con el asa de siembra estril tomar los microorganismos de la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el rea inclinada. Incubar en estufa a la temperatura y tiempo adecuados. En ocasiones los medios slidos en agar inclinado deben sembrarse "en picadura y en estra". En este caso debe sembrarse con hilo de siembra y consiste en introducir primero el hilo en la parten no inclinada del agar (fondo del tubo) haciendo una lnea recta y posteriormente sembrar en zig-zag sobre la superficie inclinada.

En medio semislido La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporcin menor de agar que los medios slidos y que se introduce en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirndolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura. Este mtodo de siembra se utiliza normalmente para comprobar si el microorganismo es inmvil ( si solo crece a lo largo de la lnea de siembra) o es mvil (en el caso de crezca desplazndose ms all de la

lnea de siembra). Por esta razn es muy importante realizar esta siembra adecuadamente ya que una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivn podra originar un patrn de crecimiento que se interpretara errneamente como movilidad bacteriana. Incubar en estufa a la temperatura y tiempo adecuados. En placa de petri Extensin en superficie con asa acodada o asa de Driglasky

Depositar sobre la superficie de una placa con agar una gota 0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del asa de Driglasky, previamente esterilizada, en todas las direcciones hasta que est completamente seco. Incubar la placa, en posicin invertida, a la temperatura y tiempo adecuados segn el tipo de microorganismo. Incubar la placa en posicin invertida para evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas. Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.

Estra mltiple en superficie

Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el agar. Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicin invertida. Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de un cultivo que contenga un elevado nmero de bacterias.

Homogenizacin

en masa

En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar ) fundido y atemperado aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la placa (movimientos circulares y de vaivn). De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La homogeneizacin de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotacin del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, tras homogeneizacin, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posicin invertida).

C. Tcnica asptica
Tcnica asptica Ya hemos visto que existen diversas tcnicas de inoculacin, ya sea en tubo de ensayo, placa de Petri, matraz, etc., siendo necesario en cualquiera de ellas, hacerlo en condiciones aspticas, es decir, tomando todas las precauciones necesarias para evitar la contaminacin tanto de los cultivos como de la persona que est realizando la siembra, para lo cual se requiere: Algunas reglas generales Limpiar el rea de trabajo utilizando algn desinfectante como puede ser solucin de benzal u otro.

Esterilizar el asa de siembra calentndola al rojo en la parte ms alta de la llama del mechero antes y despus de la siembra.

Flamear las bocas de los recipientes antes y despus de tomar la muestra a inocular.

Realizar la siembra en el menor tiempo posible a efecto de minimizar el tiempo de exposicin en el que puede ocurrir la contaminacin.

Algunas casos concretos como ejemplo En los prximos apartados de este ejercicio se vern algunos ejemplos concretos de pasos a llevar acabo para la manipulacin en condiciones aspticas

D. Asa e hilo de platino: Pasos para la manipulacin en condiciones aspticas:

Pasos o Fases para la manipulacin en condiciones aspticas del asa o hilo de platino

Esterilizar

Forma de esterilizacin Situar el asa aproximadamente perpendicular a la mesa de trabajo y flamear hasta que el filamento alcance un rojo vivo en toda su longitud. Cuando se quiera introducir en recipientes de cuello estrecho (Tubos, matraces, frascos, etc.) debes flamear tambin la parte del mango que vaya a estar dentro del recipiente durante algn momento de la manipulacin. Es necesaria la esterilizacin para evitar que se contamine la muestra que se va a manipular. RECUERDA que el asa SIEMPRE debe esterilizarse ANTES y DESPUS de su utilizacin.

Enfriar y utilizar

Forma de enfriar el asa despus de su ESTERILIZACIN, SIEMPRE se debe dejar enfriar unos segundos en la zona asptica. Es necesario dejarla enfriar para que al ponerla en contacto con la muestra a manipular no esterilice sta (destruya los posibles microorganismos) por la elevada temperatura. Se deja enfriar dentro de la zona asptica (zona libre de microorganismos) para que no se vuelva a contaminar antes de su utilizacin.

Uso del asa o hilo de siembra. Despus de ENFRIARSE, puede ser utilizada para diferentes tipos de siembra. NUNCA debe de salir de la zona asptica para

evitar que se vuelva a contaminar.

ESTERILIZACIN despus de su utilizacin. Esterilizar DESPUS de la utilizacin SIEMPRE hay que volver a esterilizar el asa antes de dejarla en el puesto de trabajo PARA EVITAR CONTAMINAR el ambiente, el puesto de trabajo y/o el personal.

E. Placas petri
Pasos o Fases para la manipulacin en condiciones aspticas de las placas de Petri

COLOCAR la placa en el puesto de trabajo. Colocar Siempre hay que colocar la placa INVERTIDA dentro de la zona asptica que origina el mechero.

ABRIR la placa en condiciones aspticas. Forma de ABRIR la placa en condiciones aspticas: Abrir La APERTURA de la placa SIEMPRE orientada hacia la llama del mechero. La TAPA de la placa debe colocarse boca arriba dentro de la zona asptica que origina el mechero como se muestra en el esquema.

Utilizar

Si en algn momento durante la utilizacin y/o manipulacin ponemos la placa Petri abierta (base y/o tapa) fuera de la zona asptica se CONTAMINAR con los microorganismos del ambiente o con nuestros propios microorganismos.

CERRAR y COLOCAR la placa despus de utilizarla. Se CIERRA La placa despus de utilizarla dentro de la zona asptica y al final SIEMPRE tiene que quedar invertida como se muestra en el esquema. Si en algn momento durante la manipulacin ponemos la placa Petri abierta o semiabierta fuera de la zona asptica se CONTAMINAR con los microorganismos del ambiente o con nuestros propios microorganismos.

Cerrar y colocar

F. Recipientes de vidrio: tubos, matraces, etc.

Pasos o Fases para la manipulacin en condiciones aspticas de los recipientes de vidrio: tubos, matraces, etc.

COLOCAR los tubos o matraces en el puesto de trabajo. Siempre que contengan algn producto en su interior (medio de cultivo, suspensin de microorganismos...) o estn estriles, deben estar tapados con una torunda de algodn o con un tapn. Los tubos o matraces a utilizar se colocan en una gradilla a la izquierda en el puesto de trabajo. Esta colocacin facilita la manipulacin del material de vidrio en condiciones aspticas.

Colocar

ABRIR los tubos o matraces en condiciones aspticas. Abrir La posicin del tubo o recipiente de vidrio ser oblicua, dirigiendo la apertura hacia la llama del mechero. El algodn se toma con el dedo meique de la mano opuesta a la que sostiene el recipiente.

FLAMEAR la boca de los tubos o matraces. flamear, utilizar y flamear Despus de abrir el tubo o matraz en condiciones aspticas, se flamea la boca durante unos segundos mediante un movimiento de rotacin. Despus de su utilizacin y antes de cerrarlo hay que volver a flamear.

CERRAR y COLOCAR el tubo o matraz. Cerrar Despus de flamear CERRAR el tubo o matraz y colocarlo.

G. Pipetas de vidrio estriles

Pasos o Fases para la manipulacin en condiciones aspticas de las pipetas de vidrio estriles

Colocar

COLOCAR las pipetas estriles en el puesto de trabajo. Colocar como se muestra en el esquema.

ABRIR las pipetas en condiciones estriles. Abrir Se agarra con la mano izquierda la pipeta estril por la punta y se desenvuelve con la derecha por la parte de atrs.

FLAMEAR las pipetas. Flamear Despus de abiertas se flamean ligeramente como indican las flechas del esquema.

PIPETEAR en condiciones estriles. Pipetear Procurar mantener la pipeta lo ms horizontal posible.

UTILIZAR las pipetas en condiciones estriles. Utilizar Procurando que no se vierta muestra en el puesto de trabajo.

COLOCAR las pipetas despus de su utilizacin. Despus de su utilizacin colocar las pipetas dentro de un recipiente. Si la muestra que se ha pipeteado contiene microorganismos el recipiente debe de tener un desinfectante (normalmente leja).

Colocar

H. Asa de Drigalski o asa acodada de vidrio

Pasos o Fases para la manipulacin en condiciones aspticas del asa de Drigalski o asa acodada de vidrio

Colocar

COLOCAR en el puesto de trabajo Como se muestra en el esquema

Introducir en alcohol y Flamear

ESTERILIZAR Siempre hay que esterilizar el asa antes de UTILIZARLA. Para lo que PRIMERO se introduce en alcohol y posteriormente se flamea como se muestra en el esquema.

Despus de la esterilizacin se deja enfriar, Enfriar durante unos segundos en la zona asptica (como se muestra en el esquema), o apoyndola sobre el interior de la tapa de la placa que se va a sembrar.

Despus de estril y fra se utiliza para extender una muestra lquida en una placa. Utilizar Una vez aadida la muestra, en condiciones estriles en la placa, los movimientos para extender sta de forma homognea por toda la superficie de la placa se muestran en el esquema.

ESTERILIZACIN despus de su utilizacin. Introducir en alcohol y flamear DESPUS de la utilizacin SIEMPRE hay que volver a esterilizar el asa antes de dejarla en el puesto de trabajo PARA EVITAR CONTAMINAR el ambiente, el puesto de trabajo y/o el personal.

Caractersticas de los cultivos bacterianos

Algunas veces las especies bacterianas se pueden identificar basndose en el aspecto que tienen sobre o dentro de distintos medios. La pigmentacin, el tamao y la forma de las colonias bacterianas tal y como se va desarrollando en placas de agar pueden proveer elementos de identificacin cuando se observan tanto bajo luz reflejada como transmitida. La observacin de las caractersticas de crecimiento de los organismos en cultivos en caldo puede ser de gran utilidad. Hay ciertos peligros que pueden presentarse en el momento de hacer el examen del cultivo; los principales son la contaminacin y la variacin de especies. Ambos problemas se deben evitar para lograr buenos resultados. Las variaciones de especies se pueden deber a (1) una modificacin inducida por el ambiente de una caracterstica genticamente controlada, (2) mutaciones espontneas no dirigidas y (3) la adquisicin de una nueva variedad de genes como consecuencia de la reproduccin sexual. Por lo comn, el primero de estos factores tiene un efecto temporal, es decir, se manifiesta slo en tanto prevalezcan las condiciones del medio ambiente. Sin embargo, el segundo y tercer factores ejercen una influencia permanente. En las figuras siguientes, se describen algunos ejemplos de tipos de crecimiento asociados con cultivos en agar y en caldo.

Formas de crecimiento de las colonias

Caractersticas de los bordes de las colonias bacterianas

Caractersticas de elevacin de las colonias bacterianas

Caractersticas comunes de cultivos en caldo

Aislamiento y cultivo puro

Apartados de este tema A. Medios de Cultivo B. Obtencin de cultivos puros C. Aislamiento por agotamiento de estras D. Tandas de estras E. Buen aislamiento y comprobacin F. Seleccin de colonias para resiembra G. Verificacin de la seleccin H. Ejemplos de cultivos puros y mezclados (mixtos)

A. MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme: por ello, la variedad de medios de cultivo es tambin grande. no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Veremos una idea general sobre algunos de los constituyentes habituales de un medio de cultivo. El fundamento de los medios selectivos o diferenciales que se emplearan en otras prcticas ser explicado en cada una de ellas. Constituyentes habituales 1. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar bacteriolgico es un polisacrido, al que acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2 % en agua licua hacia los 100 C y se gelifica alrededor de los 40 C, dependiendo de su grado de pureza. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. 2. Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales (p. ej., carne, hgado, cerebro, semillas) son extrados con agua y calor, y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura. de malta, etc. 3. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne. gelatina. casena. etc.). Las peptonas

son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. 4. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. 5. Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad). y adems sales como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH. 6. Indicadores de pH. Indicadores cido-base se aaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. 7. Agentes reductores. Cisteina, tioglicolato y otros son agentes reductores que se aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los microorganismos microaerfilos o anaerobios. 8. Agentes selectivos. La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares. azida sdica, telurito potsico. antibiticos, etc.. a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. 1. Medios de cultivo generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. Normalmente se trata de medios de cultivo que no contienen agentes selectivos. 2. Medios de cultivo de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. 3. Medios de cultivo selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems. 4. Medios de cultivo diferenciales. Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee. En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general. la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente esterilizados en autoclave. Antes de su esterilizacin, los medios lquidos en caldo se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces). En ningn caso la altura del lquido en el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de ste. Si es un medio slido, habitualmente se procede a hervir el agar en un bao Maria antes de esterilizarlo. Una vez hervido, se distribuye en caliente en tubos o matraces (no en placas de Petri), se tapa y se esteriliza. Finalizada la esterilizacin en el autoclave: Los medios lquidos se dejarn enfriar a temperatura ambiente. Los medios slidos contenidos en tubos deben inclinarse para que al solidificarse, adopten la forma de agar inclinado (slant) si tal es su finalidad. Las placas de Petri pueden tambin ser preparadas ahora, vertiendo el medio an fundido y estril dentro de ellas en un ambiente asptico (p. ej., en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen). Es posible asimismo conservar el medio destinado a placas solidificado y estril en tubos, que se fundirn al bao Mara en el momento de prepararlas. Caldos y medios slidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperatura ambiente. Sin embargo, para reducir su deshidratacin y el consiguiente cambio de las concentraciones de los componentes es preferible conservarlos a 4C

Tipos de medios de cultivo

Preparacin

B. OBTENCIN DE CULTIVOS PURO

En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades ms o menos complejas.

Cultivo de una muestra de aire . Continene diversos tipos de microrganismos que dan diversos tipos de colonias

Cultivo de una muestra de sangre de un matadero de porcino. Contiene diversos tipos de colonias ccompuestas por microorganismos con morfologia diferente al observarlos con el microscopio de contraste de fase

Por eso, una tcnica esencial en Microbiologa es la de obtencin de cultivos puros, a partir de los cuales son posibles estudios sobre las propiedades del microorganismo. Cultivo puro Etapas en obtencion de cultivo puro Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Dos etapas o fases principales son necesarias para obtener un cultivo puro de una una poblacin mezclada: La muestra debe ser diluida o 'agotada' hasta que los diversos microorganismos se separen unos de otros sobre la superficie del agar para que formen, despues de la incubacin, colonias aisladas. Esta placa se denomina placa de aislamiento

Aislamiento

Resiembra

Una vez que se obtienen colonias aisladas, se efectua la resiembra cogiendo con el asa de platino de una sola colonia aislada y se transfiere a un nuevo medio. Para obtener cultivos puros es necesario recurrir a las llamadas tcnicas de aislamiento. Aunque existen otras, las tcnicas mas utilizadas emplean un medio de cultivo slido, en el que los microorganismos generan colonias separadas

Tcnicas de aislamiento

Aislamiento en medio de cultivo slido

Se puede demostrar que prcticamente cada colonia procede de una sola clula o de un grupo de clulas del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello, lo ms correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. Normalmente, el cultivo descendiente de una colonia es un cultivo puro. Se trata de un mtodo rpido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inculo sobre un medio slido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado nmero de bacterias, un nmero reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Al incubar sta, cada una de las bacterias originar una colonia.

Aislamiento por agotamiento en estras

C. AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO EN ESTRAS

Es el mtodo ms frecuentemente utilizado para el aislamiento en Microbiologa

Mtodo ms utilizado

Otra tcnica consiste en obtener una suspensin de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.

Recomendaciones previas

Debe colocarse la placa en posicin invertida sobre la mesa de trabajo y, tomando la parte que contiene el medio de cultivo, levantarla hasta la altura de la llama del mechero. All, con ella en posicin casi vertical, se realizarn las sucesivas tandas de estras. Para realizar las estras oscile el asa de siembra sobre la superficie del agar mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca. No haga mas presin sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es muy importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgar el agar. 1. Esterilizar el asa flamendola en el mechero hasta conseguir un rojo incandescente. 2. Enfriar el asa en la proximidad de la llama. Tomar una porcin de la muestra mediante la tcnica descrita anteriormente. 3. Transferir el inculo a un rea pequea de la superficie de la placa, prxima al borde. Extenderlo formando estras muy juntas sobre la superficie de una porcin pequea de la placa. 4. Flamear el asa de nuevo y enfriarla. Rozar una vez con el asa de siembra las estras sembradas la primera vez y realizar sobre una porcin virgen de la placa una segunda tanda de estras que no toque la primera. 5. Flamear y enfriar el asa. Repetir exactamente la operacin descrita en el punto anterior pero rozando al empezar la segunda tanda de estras. Las nuevas series de estras no deben tocar ninguna de las series anteriores. 6. Flamear el asa y tapar la placa de Petri. Esta se incubar a la temperatura adecuada en posicin invertida; de otra manera, el agua de condensacin que se ira depositando sobre la superficie del agar impedira la obtencin de colonias aisladas.

Procedimiento

D. TANDAS DE ESTRIAS
La finalidad es la misma: conseguir colonias aisladas. Lo que varia es el nmeror de tandas o la forma de realizarlas

2 tandas de estrias

3 tandas de estrias

4 tandas de estrias

Otros tipos de tandas

Radial

La finalidad es siempre la misma: conseguir colonias aisladas, es decir, un buen aislamiento. Lo mas frecuente son la siembra con 3 o 4 tandas de estrias

E. BUEN AISLAMIENTO Y COMPROBACIN DE UN BUEN AISLAMIENTO

Como se trata de obtener cultivos puros, se requiere para las resiembras utilizar colonias aisladas. Por ello, hay que utilizar

Buen aislamiento Un buen aislamiento en la siembra por agotamiento mediante tandas de estrias se consigue cuando se obtienen colonias aisladas para efectuar las resiembras

Mal aislamiento Si no se consiguen colonias aisladas, hay que repetir la siembra por agotamiento mediante estrias utilizando un mayor nmero de tandas de estrias para asegurar el buen aislamiento

Comprobacin

Una vez que dispongamos de colonias aisladas, se puede comprobar que cada una representa un solo tipo de microorganismo. Para ello se puede realizar una tincin e incluso un agotamiento por estras de la propia colonia sobre una nueva placa de Petri.

F. SELECCIN DE COLONIAS PARA LA RESIEMBRA

Tomar muestra de una colonia aislada de una placa de Petri para obtener un cultivo puro

Antes de tocar la colonia con el asa de siembra, enfriar el asa tocando la superficie del agar en una zona donde no exista crecimiento

Con el asa enfriada coger de la parte superior de una colonia aislada

Para resembrar en otra placa o en tubo

Si existen varios tipos morfolgicos de colonias que indican una poblacin mezclada, se efectan tantas resiembras como tipos morfolgicos

Despues de la incubacin, todos los organismos en el nuevo cultivo seran descendientes del mismo organismo, es decir, ser un cultivo puro

G. VERIFICACIN DE LA SELECCIN DE COLONIAS

Si tiene alguna duda sobre que colonias selecionar para el aislamiento, le aconsejamos que se adiestre sobre estos ejemplos

Placa # 1 Haga clic con el cursor sobre alguna colonia para ver la informacin que aparece en la ventana de alerta

Placa # 2 Haga clic con el cursor sobre alguna colonia para ver la informacin que aparece en la ventana de alerta

I. MORFOLOGA DE LAS COLONIAS

Colonia Una colonia es una masa visible de microorganismos que crecen sobre la superficie del agar y que proceden, generalmente, de un simple

microrganismo Las colonias difieren unas de otras en sus caractersticas morfolgicas: forma elevacin o perfil bordes aspecto superficial caracteristicas pticas

Morfologa de las colonias

- pigmentacin

Un microrganismo produce un tipo de colonias Diversos tipos de colonias en una placa indica cultivo mezclado Cultivo puro da identico tipo de colonias

Cada microorganismo suele producir sobre el mismo medio colonias con las mismas caractersticas morfolgicas Cuando en una placa de aislamiento se encuentran diversos tipos morfologicos de colonias, casi siempre indica que no es un cultivo puro

H. EJEMPLOS DE CULTIVOS PUROS Y MEZCLADOS

Cultivos puros

Cultivos mezclados

Conservacin y Mantenimiento de cultivos

Existen diversos procedimientos para conservar y mantener cultivos microbianos. El mtodo adecuado depende del tipo de miroorganismo y del perodo de tiempo de conservacin que se requiera.

Mantenimiento durante perodos cortos

El mtodo ms habitual es la refrigeracin simple, ya que entre 4 y 8C permanecen viables durante varias semanas muchos cultivos puros de bacterias, levaduras y hongos crecidos sobre medios que contienen agar. Se debe tener en cuenta que algunos microorganismos son capaces de crecer a las temperaturas comunes de refrigeracin (psicrfilos). El principal problema es que se contaminen los cultivos de bacterias con hongos que crecen mejor a esas temperaturas. La refrigeracin simple constituye tambin un mtodo de conservacin a largo plazo si se combina con la resiembra peridica de los cultivos; esta suele hacerse en pequeos tubos con agar inclinado (slant) y sembrando en superficie por estras. La periodicidad recomendable de estas resiembras oscila entre los 15 y 30 das segn el microorganismo de que se trate. A partir de 1 mes, el medio de cultivo, y el cultivo en general, empepieza a secarse demasiado.

Mantenimiento a largo plazo

Los procedimientos ms habituales son: Congelacin o crioconservacin. Para conservar cultivos congelados se recomienda que la tgemperatura sea,como mnimo, -30C por lo que no son recomendables los congeladores habituales (aproximadamente -20C). Por ello se recurre a congeladores especiales para laboratorio que alcanzan temperaturas inferiores a -70C o, incluso mejor, a nitrgeno lquido (entre -150 y -195C). Los resultados varan de un microorganismo a otro y la congelacin inicial destruye siempre una cierta proporcin de microorganismos, incluso empleando crioprotectores. Un mtodo sencillo y econmico para el mantenimiento de las cepas bacterianas es la congelacin de los cultivos en pequeos viales (1-2mL)

que contengan leche descremada estril al 10% o glicerol estril al 15% como crioprotectores. Tambin se comercializan crioviales con microperlas porosas y un medio de cultivo especial para la conservacin de cepas congeladas. Segn la tempratura, los perodos de consevacin pueden llegar a superar los 10 aos. Liofilizacin. Es un proceso que permite desecar casi totalmente una estructura biolgica, previamente congelada, sublimando bajo vaco el agua (hielo) que contiene. Los microorganismos se liofilizan en presencia de un agente protector y se guardan en ampollas selladas al vaco, con lo que se puede llegar a lograr perodos de conservacin de ms de 20 aos. Puedes ver un vdeo sobre la reconstitucin de cultivos liofilizados aqu. -