Tincin de Gram

A. Objetivo del ejercicio Ejercitarse en interpretar los resultados de la tincin de Gram para adiestrase y ser capaces de diferenciar las bacterias gram positivas de las gram negativas B. Fundamentos de la tincin de Gram Esta tincin fue desarrollada empricamente por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificacin bacteriana. La tincin de Gram requiere cuatro soluciones: Primer colorante: Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta. Solucin mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como, p.ej., el Lugol. Agente decolorante: es un disolvente orgnico, p.ej. alcohol-acetona (1:1). Colorante de contraste: Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como, p.ej., la safranina o la fucsina.

La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas (G+) y Gram negativas (G-). Los dos grupos bacterianos que distingue esta tcnica difieren en el color con el que finalmente aparecen.

Las bacterias Gram+ se teirn de azul por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos.

Las bacterias Gramperdern la coloracin inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la safranina. La diferencia est determinada por la composicin de su envoltura celular. Las Gram+ poseen una malla de peptidoglicano en su parte ms externa, mientras que las Gram-, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la clula.

C. Materiales y reactivos

Portaobjetos para frotis bacterianos Solucin de cristal violeta al 1% Solucin de safranina al 0,5% Solucin diluida de yodo (Lugol) Alcohol-acetona (1:1) o bien alcohol al 95% Cubeta de tinciones Microscopio y aceite de inmersin

D. Procedimiento de la tincin (Ver pelcula de la tincin)

1 Preparar los frotis bacterianos y fijar a la llama

2. Teir con cristal violeta 2 min. 3. Quitar el exceso de colorante sin lavar con agua

4. Cubrir con Lugol 1 min. 5. Quitar el exceso de Lugol sin lavar.

6. Decolorar con alcohol de 96 o alcohol-acetona durante 1 minuto 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

8. Teir con safranina 1min. 9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.

10. Secar la preparacin al aire.

11. Examinar al microscopio poniendo previamente aceite de inmersin.

E. Interpretacin de los resultados

Gram Positivos
De violeta fuerte a azul claro Forma: cocos y bacilos (finos, gruesos, ramificados) Agrupaciones: racimos, cadenas, tetradas Cocos Gram positivos en racimos

Gram negativos
De rosa a rojo intenso Forma: cocos, bacilos y vibrios Agrupaciones: aislados, en parejas (diplos) Cocos Gram negativos en diplos (diplococos)

Staphylococcus sp Cocos Gram positivos en cadenas

Neisseria sp. y Moraxwella sp. Bacilos Gram negativos finos

Streptococcus sp Cocos Gram positivos en tetradas

Enterobacteriaceae como E. coli Bacilos Gram negativos cocobacilos

Micrococcus sp. Bacilos Gram positivos gruesos

Haemophylus sp. Bacilos Gram negativos curvados

Clostridium perfringens Bacilos Gram positivos finos

Vibrio sp y Campylobacter sp. Bacilos Gram negativos fusiformes

Listeria sp. Bacilos Gram positivos ramificados

Fusobacterium sp.

Actinomyces sp. y Nocardia sp. Bacilos Gram positivos irregulares

Bifidobacterium bifidus