FRACCIONAMIENTO Y PRUEBAS DE TOXICIDAD DE ACEITES ESENCIALES DE ESPECIES VEGETALES

1) INTRODUCCION y JUSTIFICACION

La palabra txico deriva directamente del trmino griego (Toelkv), que quiere decir arco, refirindose al uso de algunas hierbas para envenenar las flechas, con las cuales se mataba con rapidez al enemigo. Las propiedades txicas y alucingenas son parte de las tradiciones y la cultura de muchos pueblos a lo largo del planeta. Las plantas presentan algunas sustancias activas o propiedades activas que son txicas y dainas a los animales que pueden ser alcaloides, fitotoxinas, resinoides y oxalato de calcio Los aceites esenciales pueden aplicase sobre las partes del cuerpo o inhalar por la nariz para tratar y aliviar las infecciones virales, enfermedades de la piel, dolor muscular y diversas enfermedades crnicas. Tambin calma el estado mental de una persona, promueve la regeneracin celular y alivia el estrs, la ansiedad y el dolor fsico, psicolgico y emocional. Algunos aceites esenciales estn muy concentrados y son txicos para el cuerpo humano cuando se ingieren o utilizan en la terapia de masaje tambien pueden producir reacciones alrgicas y peligrosas, dando lugar a enfermedades mortales. Debido a la gran aplicacin que tiene los aceites esenciales ya sea en campo de la medicina, industria y perfumera y por la gran diversidad de especies vegetales que se encuentran en zona del trpico Valle de Sacta, se decidi realizar un estudio sobre la toxicidad de los aceites esenciales con Artemia Salina para ver si presentan actividad toxicolgica.
3) OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL.- Realizar el fraccionamiento y las aceites esenciales de especies vegetales 3.2 OBJETIVO ESPECFICO.Realizar el pre tratamiento de las muestra vegetal (pesado, triturado) Extraer el aceite esencial de una especie vegetal con destilacin por arrastre con vapor de agua. Cromatografa en capa fina del aceite esencial usando diferentes solventes para realizar el fraccionamiento Fraccionamiento del aceite esencial en Cromatotron con diferente polaridad de solventes. Fraccionamiento del aceite esencial en columna liquida con diferente polaridad de solventes Realizar la siembra de la Artemia Salina y realizar el conteo Realizar pruebas de toxicidad con la Artemia Salina Calcular el DL50 con los resultados obtenidos. pruebas de toxicidad de

4) FUNDAMENTO TEORICO 4.1 ACEITES ESENCIALES Los aceites esenciales son mezclas de varias sustancias qumicas biosintetizadas por las plantas, que dan el aroma caracterstico a algunas flores, rboles, frutos, hierbas, especias, semillas y a ciertos extractos de origen animal. Se trata de productos qumicos intensamente aromticos, no grasos, por lo que no se enrancian, voltiles por naturaleza y poco densos. Son insolubles en agua, levemente solubles en vinagre, y solubles en alcohol, grasas, ceras y aceites vegetales. Se oxidan por exposicin al aire. Se han extrado ms de 150 tipos, cada uno con su aroma propio y virtudes curativas nicas. Proceden de plantas tan comunes como el perejil y tan exquisitas como el jazmn. Para que den lo mejor de s, deben proceder de ingredientes naturales brutos y quedar lo ms puro posible. Las plantas elaboran los aceites esenciales con el fin de protegerse de las enfermedades, ahuyentar insectos depredadores o atraer insectos benficos que contribuyen a la polinizacin. Los aceites esenciales son caractersticos de los magnoliales, los laurales, los austrobaileyales, y los piperales, y tambin de algunas familias no emparentadas con estos rdenes, como Myrtaceae, Rutaceae, las familias de apiales, Lamiaceae, Verbenaceae y Asteraceae. Estn presentes en distintas partes de la planta: en las flores en el caso de la lavanda, el jazmn y la rosa, en todo el rbol como sucede con el eucaliptus ,en las hojas como la citronela ,en la madera como el sndalo, en la raz es el caso del vetiver, en la resina que exhudan el incienso, la mirra y el benju y en la cscara de los frutos como el limn, la naranja y la bergamota. Dentro de los tejidos vegetativos, se encuentran en clulas esfricas o diferentes cavidades o canales en el parnquima, y cuando dan el olor a las flores, se encuentran en las glndulas odorferas, desde donde son liberados. El clima tambin influye: en el ms clido o hmedo se evaporan con ms facilidad las notas altas, por lo que se acentan las de fondo, motivo por el cual las fragancias nos parecen ms intensas en verano

Estructura Qumica El isopreno es la unidad qumica de los terpenoides, compuesto principal de los aceites esenciales. Estn formados principalmente por terpenoides voltiles, formados por unidades de isopreno unidas en estructuras de 10 carbonos (monoterpenoides) y 15 carbonos (sesquiterpenoides). Cada aceite lo integran por lo menos 100 compuestos qumicos diferentes, clasificados como aldehdos, fenoles, xidos, steres, cetonas, alcoholes, terpenos y muchos compuestos an por identificar.

Propiedades y Aplicacin

Todos los aceites esenciales son antispticos, pero cada uno tiene sus virtudes especficas, por ejemplo pueden ser analgsicos, fungicidas, diurticos o expectorantes. La reunin de componentes de cada aceite tambin acta conjuntamente para dar al aceite una caracterstica dominante como el de manzanilla, refrescante como el de pomelo, estimulante como el aromtico de romero o calmante como el clavo.

En el organismo, los aceites esenciales pueden actuar de modo farmacolgico, fisiolgico y psicolgico. Habitualmente producen efectos sobre diversos rganos (especialmente los rganos de los sentidos) y sobre diversas funciones del sistema nervioso. . El uso principal de los aceites esenciales es en perfumera, actan como mensajeros qumicos se mezclan con los pigmentos naturales de la piel por el cual le confiere un aroma o perfume particular y diferente a cada piel. Tambin se usa como conservadores en alimentos especialmente crnicos por sus propiedades insecticidas y acaricidas que poseen algunos aceites, se los emplea con fines de controlar algunas plagas de manera ecolgica. Los aceites esenciales se utilizan en la industria para dar sabor y aroma al caf, al t, los vinos y las bebidas alcohlicas, de la misma se utiliza en jabones, desinfectantes y productos similares y en la medicina por su efecto calmante en el dolor y su valor fisiolgico. Otro uso es en la terapia alternativa denominada aromaterapia. Por ejemplo, el aceite de lavanda se usa para las heridas y quemaduras, y el aceite de jazmn se utiliza como relajante. Precauciones y Conservacin. Es importante sealar que la mayor parte de los aceites esenciales no pueden aplicarse en su estado puro directamente sobre la piel, ya que son altamente concentrados y pueden quemar la piel. Antes de aplicarlos es necesario diluirlos en otros aceites conocidos como aceites bases o en agua. Preferentemente los aceites esenciales no deben de ser ingeridos. No deben entrar en contacto con los ojos. En caso de hacerlo deben de lavarse los ojos con abundante agua, evitando tallarse con las manos. Los aceites sintticos son calidad es muy inferior a los aceites esenciales naturales y si son aplicados en la piel causan quemaduras y alergias.

Los aceites esenciales siempre deben de estar protegido de la luz y mantenerse en botellas de vidrio de preferencia botellas de color azul, ya que este color es especfico para los aceites esenciales.

4.2 METODOS DE EXTRACCION DE ACEITES ESENCIALES Los aceites esenciales son muy inestables, voltiles, frgiles, alterables con la luz y presentan una concentracin elevada, por lo que slo se necesitan miligramos para lograr el efecto deseado Tambin se pueden sintetizar en forma artificial, que es la manera ms habitual de obtenerlos, debido a que la gran demanda de estos productos no llega a ser abastecida por las fuentes naturales. 4.2.1 DESTILACIN CON AGUA (HIDRODESTILACIN). El principio de la destilacin en agua es llevar a estado de ebullicin una suspensin acuosa de un material vegetal aromtico, de tal manera que los vapores generados puedan ser condensados y colectados. El aceite, que es inmiscible en agua, es posteriormente separado. Este sistema de extraccin es particularmente empleado en zonas rurales que no cuentan con instalaciones auxiliares para la generacin de vapor.

En la destilacin con agua el material vegetal siempre debe encontrarse en contacto con el agua. Un factor de especial importancia a considerar es el de que, si el calentamiento del extractor es con fuego directo, el agua presente dentro del extractor deber ser suficiente y permanente para llevar a cabo toda la destilacin a fin de evitar el sobrecalentamiento o carbonizacin del material vegetal, dado que este hecho provocara la formacin de olores desagradables en el producto final. El material vegetal en el extractor se aconseja mantenerlo en constante agitacin a fin de evitar aglomeracin es o sedimentacin del mismo en el fondo del recipiente, lo cual puede provocar su degradacin trmica. Algunas especies vegetales tienden a formar suspensines mucilaginosas al someterse a calentamiento en medios acuosos, lo cual dificulta severamente la extraccin del aceite esencial y la consecucin del proceso como ejemplo la destilacin de las semillas de cardamomo. Por ello es importante realizar pruebas preliminares a nivel de laboratorio antes de efectuar destilaciones a gran escala. El equipo recomendado para realizar estas pruebas preliminares es el sistema Clevenger modificado. El tiempo total de destilacin es funcin de los componentes presentes en el aceite esencial. Si el aceite contiene compuestos de alto punto de ebullicin, el tiempo de destilacin deber ser mayor, dado que generalmente no es posible colocar suficiente agua para soportar todo el ciclo de destilacin, se han diseado equipos que presentan un tubo de cohobacin lateral que permite el retorno de agua hacia la olla. Un ejemplo de este tipo de cohobacin a escala de produccin puede ser visto en la Figura 3, el cual es un esquema representativo del equipo tipo Cisirill desarrollado en el Instituto de Investigacin Cientfica e Industrial de Sri Lanka.

Fig. 3 Representacin esquemtica del Equipo tipo CISIRILL. (Tuley de Silva, 1995).

Los aceites esenciales obtenidos mediante destilacin en agua normalmente presentan notas ms fuertes y un color ms oscuro con respecto a los producidos por otros mtodos. Es posible decir, en general, que los aceites producidos por destilacin en agua son de menor calidad que los producidos por otros mtodos por las siguientes razones: Algunos componentes como los steres son sensibles a la hidrolisis, mientras que otros componentes tales como los hidrocarburos monoterpnicos acclicos o los aldehdos, son susceptibles de

polimerizacin. (El pH del agua frecuentemente es bajo, hecho que facilita la realizacin de reacciones hidrolticas o conversiones (Koedam y col., 1980). Los compuestos oxigenados, tales como los fenoles, tienden a ser parcialmente solubles en el agua de destilacin, hecho por el cual es imposible la remocin completa de estos compuestos. Los tiempos requeridos de destilacin son demasiado largos, lo cual se asocia a un detrimento de la calidad del aceite obtenido. Por otra parte, este sistema presenta la desventaja de presentar un a menor eficiencia en energtica con respecto a la destilacin con vapor o vapor/ agua, adems de que, al ser realizada como un arte, normalmente no se opera bajo condiciones ptimas de tiempo y temperaturas tomando como punto de control la calidad del aceite obtenido. Sin embargo, este mtodo es til cuando el material vegetal tiende a aglomerarse cuando el vapor pasa a travs de l. Una ventaja adicin al es que el costo involucrado para la fabricacin del equipo es de los ms bajos comparativamente entre los mtodos en unciados, adems de que su operacin no requiere de servicios de energa elctrica, vapor, aire u otros. La duracin de la destilacin son largas en estos equipos a causa de la concepcin del sistema de calentamiento y de enfriamiento, que limitan los rendimientos en esencia. El tiempo de destilacin es en realidad muy variable, y debe definirse en funcin de la calidad de producto que se quiere obtener. En algunos casos, como por ejemplo en la esencia de eucalipto tipo eucaliptol, se pueden lograr productos muy distintos segn se destile poco tiempo o mucho: en el primer caso se consigue una esencia muy rica en eucaliptol, y con un bajo costo, pero carente de productos ms pesados, que resultan fundamentales para su uso como sabor. Para determinar estos tiempos conviene saber que en una hidrodestilacin o destilacin por arrastre con vapor, los primeros componentes voltiles que se extraen son los ms solubles en agua. De esta manera durante la extraccin se realiza una suerte de destilacin fraccionada de la esencia contenida en la planta. 4.2.2 DESTILACIN POR ARRASTRE CON VAPOR DE AGUA (HIDRODIFUSION) La extraccin por arrastre con vapor de agua, puede considerarse el ms sencillo, seguro e inclusive, el ms antiguo, ya que se menciona en textos tan antiguos como la Biblia. Est basado en que la mayor parte de las partes olorosas que se encuentran en una materia vegetal pueden ser arrastradas por el vapor de agua. La destilacin por arrastre con vapor que se emplea para extraer la mayora de los aceites esenciales es una destilacin de mezcla de dos lquidos inmiscibles y consiste, en resumen , en una vaporizacin a temperaturas inferiores a las de ebullicin de cada uno de los componentes voltiles por efecto de una corriente directa de vapor de agua, el cual ejerce la doble funcin de calentar la mezcla hasta su punto de ebullicin y disminuir la temperatura de ebullicin por adicionar la tensin de vapor del vapor que se inyecta, a la de los componentes voltiles de los aceite esenciales. Los vapores que salen del cuello de cisne se enfran en un condensador donde regresan a la fase lquida, los dos productos inmiscibles, agua y aceite esencial y finalmente se separan en un decantador o vaso florentino. La destilacin por arrastre con vapor de agua, no ha podido ser sustituida por la extraccin con solventes orgnicos o con calentamiento directo por la gran cantidad de ventajas que tiene en relacin a estos dos ltimos sistemas y que pueden resumirse en: El vapor de agua es muy econmico en comparacin al costo de los disolventes orgnicos. Asegura que no se recaliente el aceite esencial. No requiere el uso de equipos sofisticados.

El clculo de la cantidad de vapor necesaria para separar una determinada cantidad de aceite esencial en funcin de la temperatura y la presin a la que se realiza la destilacin se efecta usan do las ecuaciones clsicas empleadas en la destilacin de lquidos inmiscibles. En el momento del arrastre con vapor, la suma de la presiones parciales PA y P H2O (aceite esencial y agua) es igual a la presin total existente en el extractor, que en este caso es la atmosfrica. La ecuacin fundamental del arrastre con vapor se deduce de la ley de los gases perfectos, segn las cuales las presiones de vapor de los componentes de una mezcla gaseosa son proporcionales al nmero de molculas presentes. dQ dA PH2O PA (1)

Siendo Q la cantidad total de agua en moles, necesaria para realizar el arrastre y A el nmero de moles del aceite esencial voltil existen te en el extractor. Para integrar la ecuacin anterior es necesario conocer la relacin entre PH2O y PA y e l resto de las variables existentes. La presin de vapor del aceite depende de la concentracin de aceite en la carga y puede calcularse en funcin de A y de C (siendo C los moles de los componentes no voltiles en la carga) y de la tensin de vapor del componente puro (aceite esencial), con base en la ley de Raoult. Hay que tomar en cuenta la vaporizacin del aceite esencial que se efecta durante el inmediato paso del vapor de agua a travs de la carga (hojas, semillas, parte area, races, tubrculos) y en consecuencia la presin de vapor de A en fase gaseosa ser menor que la correspondiente de equilibrio a esa temperatura. Para resolver esta desviacin se corrige la ley de Raoult con un coeficiente de eficiencia E, que siempre ser inferior a la unidad y ser funcin de las condiciones reinantes dentro del extractor de destilacin. Siendo A la tensin de vapor del aceite esencial, obtendremos:

Pa = E * A

A A + 1

(2)

La presin de vapor del agua, que es constante cuando se han establecido las condiciones de operacin y existe condensacin , es igual a la tensin de vapor del agua a la temperatura de la misma dentro del extractor y que se expresa en todo momento, como la diferencia entre la presin total (la atmosfrica) y la del componen te voltil.

A P H 2 O = P tot - P a = P tot - E .A A+1 (3)

Relacionando las tres ecuaciones anteriores (1), (2) y (3) podemos deducir la ecuacin correspondiente al proceso de arrastre con vapor de agua: Q A P H2O E.A

(4) Si se multiplica a ambos miembros por los Pesos Moleculares respectivos del agua y del aceite esencial nos queda: W agua WA Q. PM agua A. PMA P agua PM agua E.A.PM A

Siendo agua la relacin en peso de la cantidad de vapor de agua necesaria para obtener una determinada cantidad de aceite esencial mediante arrastre con vapor. Como es imposible de- terminar el peso molecular de un aceite esencial, lo que se hace en la prctica es utilizar un pro- medio ponderado de los pesos moleculares de los componentes mayoritarios presentes en el aceite esencial. Adems de esto es necesario disponer de un a curva donde se relacin de la tensin de vapor del aceite esencial a distintas temperaturas. Si no se dispone de estos datos, se calcula la relacin por separado para cada uno de los componentes principales. La determinacin del coeficiente de eficiencia en los arrastres con vapor tratndose de lquidos fue estudiado por Carey, quien dedujo que era funcin del espesor de la capa lquida l, del dimetro medio de la burbuja d y de una constante K caracterstica de la sustancia destilada, que est relacionada con la difusividad de la misma en estado gaseoso. La relacin exponencial propuesta fue:

- K 1 /d E = 1-e (5)

Para clculos prcticos y tratndose de lquidos, E oscila entre 0,5 y 0,7. Cabe sealar que cuan do se efecta el arrastre con vapor de agua de un aceite esencial en - cerrado en una pared vegetal de una planta , los coeficientes dependern no slo de lo compacta- do del material, sino tambin de factores tales como la permeabilidad del material celulsico para permitir el paso del aceite voltil. Para dar un ejemplo de cmo se calcula la relacin entre el gasto de vapor necesario y la cantidad de esencia obtenida, se analizar el caso de la esencia de trementina. Sus componentes principales son el y pineno (53 y 35% respectivamente), por lo que el peso molecular a utilizar ser 136 (correspondiente a los dos ismeros del pineno) y 18 para el agua. Tomando el dato de la bibliografa (Badger y McCabe, 1936), a 95.5C la tensin de vapor () de la esencia trementina es de 114 mm de Hg, y la del agua es de 646 mm de Hg. Teniendo en cuenta un valor de eficiencia de 0,6 queda: W agua WA 646 mm Hg. 18 0,6. 114 mm Hg. 136 1,25

En la Figura 4 se muestra un esquema de un equipo de extraccin por arrastre con vapor de agua a nivel piloto desarrollado en el CIATEJ.

Figura 4.- Equipo piloto de extraccin de aceites esenciales tipo CIATEJ.

En los diseos ms modernos de destiladores de este tipo, el vapor se genera dentro de una camisa en el cuerpo del extractor, lo que significa un importan te ahorro de energa, pues el calor que irradia esta camisa hacia adentro sirve para precalentar el material vegetal en el interior del extractor, reduciendo la cantidad de vapor necesaria para llegar a la temperatura de destilacin de la esencia. La destilacin de plan tas aromtica y medicinal, se efecta, a menudo, con vapor directo, en extractores con capacidades que varan de 50 litros para los de nivel de laboratorio, a los de 1.000 a 6.000 litros para las instalaciones de gran envergadura. Varios recipientes pueden ser colocados en una misma planta, segn la importancia de la produccin y el ritmo de la destilacin. La mayora de los equipos est compuesto de dos recipientes de capacidad de 1.500 litros, los cuales pueden ser ocupados alternativamente: mientras una unidad est en proceso de extraccin, la otra est en operacin de carga o descarga de material vegetal, esto redunda en un ahorro de tiempo importante para los costos de produccin. La destilacin de plantas aromticas se efecta generalmente con bajas presiones, con el fin de no deteriorar los constituyentes del aceite esencial por efecto de una temperatura muy elevada. Sin embargo, es necesario para cierto tipo de esencias como es el caso del vetiver (Vetiveria zizanoides) o clavo de olor (Eugenia caryophyllata) de operar con presin es de 1 a 2 bar. Se logra reducir el tiempo de destilacin y conducir a un mejor rendimiento, sin perjudicar la calidad de la esencias.

Formacin de emulsiones en el proceso de arrastre con vapor Es necesario mencionar que cuando se realizan destilaciones hetero-azeotrpicas de plantas aromticas utilizando unidades de extraccin con vapor, una vez efectuada la condensacin de dos lquidos no miscibles, se obtienen generalmente en el recipiente de decantacin emulsiones de tipo directa, es decir aceite en agua y emulsiones inversas de agua en aceite, que son muy estables y difciles de separar. Estas emulsiones, llamadas trmicas, de aspecto lechoso, tienen dimetro de gotas de algunos micrones.

Durante la destilacin de una planta aromtica se presenta un fenmeno de separacin de fases que ni la simple decantacin o la cohobacin permiten la recuperacin de los aceites esenciales. Adems, es pertinente indicar que las emulsiones que se forman representan un doble inters para que sean tratadas. Por un lado es deseable recuperar la esencia que se podra perder, sobre todo cuan do son de alto costo. Y por otro lado se contribuye al mantenimiento del ecosistema mediante un tratamiento que permite la descontaminacin del agua de condensacin. En las empresas destiladoras de aceites esenciales efectan la separacin en un recipiente denomina- do vaso florentino. La mayor parte de las tcnicas de separacin de fases de una emulsin se basan sobre la ecuacin de Stokes, que expresa la relacin que existe entre la velocidad ascencional o de sedimentacin de una microgota de la fase dispersa en el seno de una fase continua. . g . dE2 W = 18. A. .c En la ley de Stokes se encuentran expresadas el conjunto de tcnicas de separacin aceleradas que pueden ser aplicadas para separar emulsiones de tipo secundario. Para acelerar la velocidad ascencional o de sedimentacin de la fase dispersa, se puede influir directamente o indirectamente sobre los 4 parmetros que condicionan esta ltima. 1. Si se influye sobre la viscosidad (c) de la fase continua se disminuye su valor por la elevacin de la temperatura. A esta tcnica se le conoce como tratamiento trmico. 2. Para el caso de querer influir sobre la diferencia de densidad entre fases () s e puede aumentar en ciertos casos de manera artificial por la tcnica de flotacin con aire. Tambin se puede provocar esto, saturando la fase acuosa con una sal (agregando un exceso de sal de mesa por ejemplo). Esto provoca la separacin de cualquier elemento que permanezca en la fase acuosa en un equilibrio metaestable. 3. Cuando se desea influir sobre la aceleracin de la gravedad (g) se sustituye por un aceleracin centrifuga. En estos casos se emplea la centrifugacin median te el uso de hidrociclones. 4. Influir sobre el dimetro (dE2) de las microgotas de la emulsin que se desea separar. Podemos notar que en este caso se trata del parmetro de accin ms sensible ya que se encuentra elevado al cuadrado. En este caso se provoca una aglomeracin de microgotas de fase dispersa, para obtener macrogotas que sean fciles de separar. Dos tcnicas de principios muy diferentes pueden asegurar la coalescencia de microgotas: a) La electrocoalescencia, aplicable slo cuando la fase contina es no conductora de la electricidad. b) La coalescencia sobre lechos fibrosos o granulares aplicables en todos los casos, sobre todo en la separacin de aceites esenciales emulsionados en agua.

4.2.3 DESTILACIN CON AGUA - VAPOR. En este caso el vapor puede ser generado median te una fuente externa o dentro del propio cuerpo del extractor, aunque separado del material vegetal. La diferencia radical existen te entre estos sistemas y el anteriormente mencionado es que el material vegetal se encuentra suspendido sobre un tramado (falso fon do) que impide el contacto del material vegetal con el medio lquido en ebullicin . Este sistema reduce la capacidad neta de carga de materia prima dentro del extractor pero mejora la calidad del aceite obtenido. En la Figura 5 se muestra un equipo tradicional de un proceso de destilacin vapor - agua:

Figura 5.- Equipo tradicional de destilacin vapor - agua. Si la cantidad de agua contenida en el extractor no es suficiente para sostener el proceso de destilacin, es conveniente utilizar un sistema de cohobacin a travs del cual, el agua ya condensada es retornada al cuerpo del extractor para volver a ser calentada. A continuacin se describe algunos aspectos importantes a considerar referentes al mecanismo de cohobacin. Aplicacin de la cohobacin La cohobacin es un procedimiento que solamente puede ser utilizado para la destilacin de vapor y destilacin agua-vapor. Como ya se ha mencionado, el sistema de cohobacin involucra el retorno del condensado de agua (una vez separado el aceite esencial) al cuerpo del extractor.

Este hecho permite minimizar las prdidas de componentes oxigenados, particularmente los fenoles que presentan una gran solubilidad en agua. El reuso del agua condensada permitir que sta llegue a saturarse con los constituyentes disueltos de tal manera que no ser capaz de disolver mayor nmero de componentes.

Para la mayora de los aceites, las prdidas reportadas utilizando este sistema no rebasa, ms que para aceites ricos en fenoles, el 0,2%. La destilacin con agua-vapor de plantas aromticas se efecta, desde hace muchos aos, en equipos artesanales de pequeas capacidades que trabajan a fuego directo, los cuales no estn muy difundidos an en el caso de pases en vas de desarrollo. 4.2.4 DESTILACIN PREVIA MACERACIN En algunos casos la plantas aromticas requieren ser sometidas a un proceso de maceracin en agua caliente para favorecer la separacin de su aceite esencial ya que sus componentes voltiles estn ligados a otras sustancias, formando componentes glicosidados. El mtodo se aplica para extraer el aceite de semilla de almendras amargas, bulbos de cebolla, bulbos de ajo, semillas de mostaza, hojas de gaulteria y hojas y corteza de abedul. En el Cuadro 3 se muestran las reacciones enzimticas previas reportadas (Guenther, 1952; Block, 1985) para estos materiales vegetales

PLANTA

PRECURSOR

ENZIMA

PRODUCTO AROMATICO salicilato de metilo + primaverosa benzaldehido + glucosa + HCN

Gaulteria

gaulterina (ormootropiside) amigdalina (mandelonitrilo gentiobisido) sinigrina (mirosinato de potasio)

primaverosidasa

Almendra amarga

emulsina

Mostaza negra

mirosinasa

isotiocianato de alilo + glucosa + KHSO4

Cebolla

cebolla alilos mezcla de sulfxido de S-alquil cistena

alilasa

disulfuro de dipropilo + propionaldehido (mayor)

Ajo

ajo alilos sulfxido de S-alil cistena

alilasa

disulfuro de dialilo (mayor)

Cuadro 3.- Ejemplos de aceites esenciales producidos por reacciones enzimticas

4.2.5 DESTILACIN SOMETIDA A UNA DEGRADACIN TRMICA Es utilizado por ejemplo para producir la brea del abedul y para obtener el aceite de enebro, en un proceso en el cual sucede una degradacin trmica. Segn Guenther (1952) , para el caso de la produccin del aceite de enebro, la madera del tronco, las ramas y las races de la especie Juniperus oxycedrus L. son fragmentadas en pedazos que se amontonan sobre una plancha cncava que posee en el centro un tubo conductor con orientacin hacia abajo del colector. En otro recipiente de hierro se coloca carbn, el cual se quema hasta alcanzar un color rojo intenso, el resultado del calor extremo que genera esta combustin se transmite hacia los fragmentos de madera, sta sufre una descomposicin trmica que permite la liberacin

del aceite esencial. Una vez extrada esta esencia se mezcla con las sustancias piroleosas de la madera carbonizada dan- do como producto un lquido viscoso homogneo de color pardo oscuro con un fuerte olor a humo. En la Figura 7 se representa en forma esquemtica.

En forma reciente Chalchat y col. (1990) demostraron que muchos hidrocarburos sesquiterpnicos soportan estas condiciones drsticas de destilacin. Como resultado, la cantidad de aceite que se descompone no es tan grande, sin embargo para ciertos hidrocarburos sesquiterpnicos ocurren ciertos reacomodamientos. Finalmente, es de inters mencionar que el enebro francs se produce por esta tcnica con la especie Juniperus oxycedrus L., de la misma manera que el aceite de enebro espaol a partir de las especies Juniperus phoenicea L. o Juniperus sabina L.

4.2.6 PROCESOS DE EXPRESIN APLICADOS A LOS CTRICOS Estos procesos son generalmente aplicados a los frutos de los agrios y su aplicacin se conocen desde el ao 1776. Rodano clasific en varias etapas los fenmenos que ocurren durante la extraccin del aceite siendo stas las siguientes: a) Laceracin de la epidermis y de las celdas que contienen la esencia. b) Creacin en la cscara de reas con presin mayor que sus circundantes a travs de las cuales el aceite fluye al exterior. c) Abrasin de la cscara, con la formacin de pequeas partculas de la raspadura. La extraccin del aceite se realiza sobre la fruta entera o sobre la cscara, y en ambos procesos se puede realizar con un proceso manual o mecnico.

En el Cuadro 4 se da una clasificacin de estos tipos de procesos

PRODUCTO PROCESADO

Sistema

PROCESO ESCUDILLA SISTEMA DE CUCHARA RALLADOR CIRCULAR

Manual Fruto Mecnico Manual Cascara Mecnico

POR STRIADURA PELADORAS ESPECIALES ESPONJA POR AFUMATURA POR PRESIN ESPECIALES

Cuadro 4.- Procesos extractivos aplicados para la extraccin de aceites esenciales de ctricos (Haro Guzmn, 1969). Todos los mtodos anteriormente mencionados se basan en la ruptura de las glndulas secretoras de aceite y en recolectar en forma inmediata la esencia, para evitar ser absorbida por la corteza esponjosa que resulta despus de este tipo de procesos. Por esta razn todas las mquinas que procesan los ctricos cuentan con un sistema de aspersin de agua que moja constantemente la superficie del fruto. Cabe sealar que para efectuar una buena seleccin del proceso a aplicar, es necesario considerar la disponibilidad y los volmenes de materia prima a procesar. Adems, cada uno de estos procesos puede ten er un a influencia considerable en lo que respecta a la calidad del aceite esencial. La Figura 8 representa un diagrama de una mquina de extraccin de aceite esencial de ctricos por sistema peladura

4.2.7 EXTRACCIN POR MICROONDAS. Es una tcnica patentada originalmente en Canad (Par y col., 1989). Consiste en aprovechar el mismo proceso de los hornos a microondas caseros, es decir en calentar el agua contenida en el material vegetal, que a su vez est inmerso en un disolvente transparente a las microondas, como pueden ser el Cl4C, el hexano o el tolueno. Al aumentar la temperatura del medio, se rompen las estructuras celulares que contienen a la esencia por efecto de su presin de vapor. La esencia es as liberada y disuelta en el disolvente presen te en el medio. La principal ventaja de esta tcnica es su velocidad, pues pueden lograrse extracciones en minutos, cuando comparativa- mente una tcnica tradicional como la hidrodifusin necesita 4 varias horas La implementacin del sistema de microondas a escala industrial, si bien es factible tecno- lgicamente, implica una fuerte inversin econmica. Adems, deben tenerse en cuenta que, como en cualquier cambio de las tecnologas tradicionales, los productos obtenidos suelen diferir en calidad de los normalmente ofrecidos en el mercado internacional, y pueden por lo tanto significar un problema para competir con el producto comercialmente consagrado 4.2.8 EXTRACCIN CON FLUIDOS EN ESTADO SUPERCRTICO. Introduccin En un diagrama temperatura-presin que muestre los dominios de los tres estados fsicos, slido, lquido y gaseoso, se puede observar una interrupcin de la curva que delimita los estados lquido y gaseoso (Figura 10); la abscisa correspondiente a dicha interrupcin corresponde a la temperatura crtica, ms all de este punto se vuelve imposible la licuefaccin del gas independientemente de la presin aplicada. La temperatura crtica est asociada a un a presin crtica; ambos valores fijan los valores mnimos del dominio, denominado como estado supercrtico (T>Tcrit; P >P crit).

Figura 10.- Diagrama de fases presin-temperatura para una sustancia pura.

Bajo condiciones supercrticas, las propiedades de transporte del solvente se modifican; por ejemplo, un fluido en estado supercrtico posee una densidad similar a la de los lquidos, una alta compresibilidad, muy baja viscosidad y alta difusividad. A medida que un fluido supercrtico intensifica su poder disolvente con una alta densidad, una baja viscosidad y una menor tensin superficial, se logran mejores penetraciones y difusin en el material de extraccin. La extraccin con fluidos en estado supercrtico presenta algunas ventajas sobre los mtodos extractivos tradicionales, algunas de estas ventajas dependen directamente del disolvente. Algunos de los efectos a considerar debern ser: 1) El disolvente debe mostrar afinidad por los compuestos a extraer para poder solubilizarlo. 2) El disolvente debe ser inerte con respecto a los materiales con los que est en contacto bajo las condiciones de extraccin. 3) El disolvente deber tener valores de temperatura y presin crticas relativamente moderados. 4) El disolvente debe ser barato, no txico, de preferencia no inflamable y fcil de conseguir en altos grados de pureza. El dixido de carbono es el disolvente de mayor utilizacin en el procesamiento de alimentos en los ltimos aos, debido a que rene la mayor parte de las caractersticas mencionadas. Una comparacin de las condiciones crticas del dixido de carbono con las condiciones de otros disolventes puede ser vista en el Cuadro 5. Fundamentos El principio bsico para la extraccin con fluidos en estado supercrtico se basa en el cambio de propiedades de transporte y de solubilidad que presenta un solvente en este estado. Para el caso del dixido de carbono como fluido en estado supercrtico dos factores compiten en la influencia de la solubilidad de los solutos. Al incrementar la temperatura se incrementa la presin de vapor del soluto y por lo tanto su solubilidad. Sin embargo, simultneamente a un incremento en la temperatura se disminuye la densidad del CO2, con lo cual tiende a decrecer la solubilidad del soluto. Conforme la presin se incrementa por encima del punto crtico del dixido de carbono (7.38 mPa), la densidad del fluido se vuelve menos dependiente de la temperatura y la presin de vapor del soluto se vuelve dominante, de manera que la solubilidad del soluto se incrementa con la temperatura. Un mximo de solubilidad puede ocurrir, pero la solubilidad de un soluto siempre se incrementa cuando aumenta la densidad del fluido supercrtico. Aplicaciones Si bien las aplicaciones industriales de la extraccin con fluidos en estado supercrtico son limitadas, sus aplicaciones potenciales son numerosas y son actualmente el objeto de trabajos de investigacin. Entre las aplicaciones positivas para las cuales el extracto constituye la fase noble, citemos la preparacin de extractos de lpulo, de sustancias aromticas extradas de especias, de caf, de ciertas frutas, la separacin de sustancias aromticas a partir de biomasa. Las aplicaciones negativas tendientes a eliminar las sustancias indeseables como la cafena del caf o del t han suscitado un inters creciente ligado a la moda de alimentos ligeros: empobrecimiento calrico por eliminacin de grasas, eliminacin del colesterol de la mantequilla y de productos del huevo, desalcoholizacin de cerveza y vino, etc. A nivel industrial, se encuentran por ejemplo algunas fbricas de extraccin de lpulo y de descafeinizacin en Alemania. En Francia, existe una plata- forma de ensayo en Pierrelatte (CEA) y una fbrica productora de un cierto nmero de extractos en Grasse. A pesar de estos pocos ejemplos de aplicacin industrial, existen an varias complicaciones que limitan el uso de la tecnologa de extraccin con fluidos en estado supercrtico: existen conocimientos limitados de ciertas propiedades de los fluidos supercrticos (intercambio de calor), el consumo energtico y el reciclado del solvente no ha sido optimizado, existen riesgos de trabajo debido a las altas presiones, y la inversin en equipamiento es muy superior a las instalaciones de extraccin con solventes clsicos. De tal manera que la extraccin con fluidos supercrticos se justifica nicamente en productos de alto valor agregado y fabricado en cantidades suficientes para que las instalaciones se amorticen en un periodo razonable y para

aquellos productos que se obtengan con una calidad superior respecto a otras calidades obtenidas por tcnicas menos costosas 4.2.9 ENFLEURAGE

Mtodo tradicionalmente utilizado para extraer aceite esencial de flores delicadas como el jazmn y la rosa. Para esto se utilizan grasas naturales con puntos de ablandamiento alrededor de 40 C, normalmente manteca de cerdo RBD (Refinada, Blanqueada, Desodorizada). Se extiende en bandejas en profundidad no mayor a 0.5 cm y sobre ella se colocan los ptalos de flores el material vegetal, desde donde se van a extraer los principios odorficos, el contacto puede durar de 3 a 5 das. Luego el material vegetal es removido y reemplazado por material fresco, esta operacin se repite buscando la saturacin de la grasa. Posteriormente la grasa impregnada del principio activo, se lava con alcohol libre de congneres (alcohol de perfumera), relacin 1/1 dos veces consecutivas. El alcohol se filtra y se destila a vaco ( 21 in Hg, T 30 C) hasta recuperar un 80 % del volumen de alcohol, como mnimo, en el fondo queda un residuo llamado absolute. Este mtodo tambin puede seguirse de forma fcil en casa, para preparar aceites aromticos (sustituyendo la grasa por un aceite) o bien seguir hasta la extraccin alcohlica. 4.2.10 EXTRACCIN CON DISOLVENTES

El trmino oleorresina se utiliza para designar a los exudados naturales ricos en aceites esenciales; sin embargo, es tambin utilizado para nombrar los extractos obtenidos mediante utilizacin de disolventes orgnicos en especies aromticas, una vez que el disolvente ha sido removido completamente. Las oleorresinas de especies herbceas contienen, adems de los aceites esenciales, los aceites vegetales fijos, pigmentos, y algunos otros principios activos. La composicin final es funcin del disolvente utilizado. El proceso de obtencin de oleorresinas en una simple etapa se muestra en la Figura 12:

MATERIA PRIMA

MOLIDO

EXTRACCIN CON DISOLVENTE

ESTANDARIZACIN DE OLEORRESINA

REMOCIN DE DISOLVENTE

FILTRACION

ADITIVOS

RECUPERACIN DE DISOLVENTE

TRATAMIENTO DE DESECHOS

Figura 12.- Diagrama del proceso de obtencin de oleorresinas en una simple etapa. En primera instancia, la hierba o especia se muele para que la penetracin del disolvente sea ms rpida y completa. El tamao de partcula y el tipo de equipo a utilizar son datos de especial importancia que requieren ser determinados experimentalmente.

Cualquier etapa de molienda previa provoca la prdida de componentes voltiles. Es por ello que es conveniente evitar al mximo este detrimento de calidad. El uso de molinos criognicos es recomendado para asegurar la menor prdida de voltiles en la muestra. Algunas sustancias criognicas utilizadas son: el nitrgeno lquido y el CO2lquido. Los procesos de extraccin pueden ser de una sola etapa o de dos etapas. El proceso de extraccin en dos etapas requiere del uso de un destilador con arrastre con vapor a fin de separar el aceite esencial antes de la extraccin. Los disolventes posibles de utilizar y la cantidad de disolvente residual permitido estn regulados por las leyes de cada pas, exigindose en general valores menores a las partes por milln. En los Estados Un idos de Amrica, los disolventes permitidos a utilizar son: acetona, cloruro de metileno, hexano, alcohol isopropilico, alcohol metlico. Sin embargo, los solventes clorados cada vez tienen mayores restricciones para su uso. En la extraccin en una sola etapa, la oleorresina se extrae a partir de la especie utilizando el disolvente seleccionado. La mezcla se separa y el disolvente es cuidadosamente removido llevando consigo a la oleorresina. Sin embargo, en la extraccin con doble etapa, la especie es inicialmente sometida a un proceso de destilacin por arrastre con vapor a fin de extraer el aceite esencial contenido. Posteriormente, la materia residual se seca y se somete a una extraccin semejan te a la de una sola etapa. Una vez removido el disolvente (operacin que requiere menor cuidado con respecto al de una sola etapa debido a que la muestra ya no contiene los voltiles), la porcin no voltil de la oleorresina se combina con la porcin voltil con el fin de formar un producto de caractersticas estandarizadas. En ambos procesos, la extraccin de la oleorresina sigue el mismo diagrama de flujo: La planta se coloca dentro de una canasta, molida hasta un tamao de partcula que no permita la prdida del material vegetal y la canasta se coloca en un vaso reactor con camisa de calentamiento. Se adiciona una cantidad conocida de disolvente que permita el lavado de los componentes vegetales y se permite la interaccin de la materia prima con el disolvente durante cierto tiempo a una temperatura constante controlada. El proceso antes descrito puede ser llevado a cabo en sistema batch o en sistema continuo. La etapa de remocin del disolvente normalmente es llevada a cabo mediante destilacin fraccionada a vaco. En un inicio, la evaporacin es muy sencilla de realizar, sin embargo, a medida que el disolvente llega a una concentracin cercan a al 1% en la muestra, la presin de vaco debe incrementarse a fin de evitar el incremento de temperatura de ebullicin. As mismo, es conveniente bajar la velocidad de flujo de evaporacin para incrementar la eficiencia de la destilacin fraccionada. Normalmente, es imposible evitar la prdida de voltiles junto con el disolvente removido, por lo cual es recomendable incorporar un segundo sistema de destilacin fraccionada aplicable a ciertas fracciones a fin de separar compuestos voltiles de inters. La fraccin ligera as recuperada deber incorporarse nuevamente a la oleorresina obtenida. La estandarizacin, que involucra ya sea la incorporacin de algn aceite esencial o incluso de algn aceite vegetal, es una etapa necesaria a realizar a fin de restaurar el perfil aromtico original de la materia prima en la oleorresina. Cualquier adicin de otros aditivos deber ser declarada en la etiqueta del producto. Debido a que las oleorresinas son lquidos muy viscosos, la adicin de estos aditivos tiene el fin de bajar la viscosidad. El mezclado normalmente se efecta mediante la utilizacin de un molino coloidal, un agitador con alto esfuerzo de corte o un homogeneizador.

4.3 CROMATOGRAFA La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una seal que puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla. La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente: Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser usados posteriormente). Medir la proporcin de los componentes de la mezcla En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeas. 4.3.1 CROMATOGRAFIA PLANA En la cromatografa plana la fase estacionaria esta sujeta por una placa plana o en los poros de un papel. En este caso la fase mvil se mueve a travs de la fase estacionaria por accin capilar o por la influencia de la gravedad CROMATOGRAFA CAPA FINA (TLC) La cromatografa en capa fina, que comenz a usarse hacia 1950, es muy simple, barata, sensible y eficiente. Es especialmente til cuando se quiere determinar el nmero de componentes de una mezcla o identificar los compuestos existentes en una mezcla. En la cromatografa de capa fina, un adsorbente est depositado formando una delgada capa sobre una placa de vidrio, papel de aluminio u otros materiales, por la que ascienden, arrastradas por un disolvente (eluyente), una o ms sustancias que se pretenden separar o identificar. Con la ayuda de un capilar de vidrio, una pequea cantidad de muestra se deposita sobre el adsorbente, muy cerca del extremo inferior de la placa. Una vez depositada la muestra, se introduce la placa en una cubeta de cromatografa, que contiene en el interior el disolvente con el que va a desarrollarse el cromatograma. La altura del disolvente en dicho frasco o cubeta debe ser tal, que ste no toque la zona donde se encuentra la pequea mancha de producto depositado. La placa se coloca en posicin vertical, ligeramente inclinada.

El disolvente asciende entonces por capilaridad a lo largo de la placa, arrastrando a los compuestos a diferentes velocidades, segn el grado de adsorcin de stos producindose as su separacin. Transcurridos unos minutos, cuando el frente del disolvente se encuentra prximo al extremo de la placa, se saca sta de la cubeta, se deja secar y se examina. Los diversos compuestos se localizan directamente si son coloreados, o con la ayuda de un indicador o luz ultravioleta, si son incoloros. Los compuestos que avanzan a lo largo de la placa se ven atrados por fuerzas electrostticas sobre la superficie del adsorbente, interaccionando el disolvente con ambos. Esta interaccin competitiva establece las velocidades relativas con que ascienden por la capa de adsorbente, el frente de disolvente y un determinado compuesto. Cuanto mayor es la polaridad de los compuestos, ms intensamente se ven stos atrados por el adsorbente. Se puede establecer el orden aproximado de polaridad: cidos carboxlicos <aminas <alcoholes y tioles <aldehdos, cetonas y steres <halogenuros de alquilo y arilo <hidrocarburos no saturados <hidrocarburos saturados La actividad del adsorbente tambin influye en el grado de emigracin del soluto, de manera anloga a la ya considerada anteriormente. Los adsorbentes ms utilizados en cromatografa en capa fina, son la gel de slice y la almina activada dependiendo su grado de adsorcin del contenido en agua. La polaridad del disolvente influye asimismo en la velocidad de ascensin del soluto a lo largo de la capa de adsorbente. A mayor polaridad del disolvente, mayor grado de ascensin del soluto por la placa, pudindose establecer un orden orientativo de polaridad creciente de los disolventes: ter de petrleo <tetracloruro de carbono <ciclohexano <ter etlico <acetona <benceno <acetato de etilo <cloroformo <etanol <metanol <agua <piridina <cido actico

Bajo unas determinadas condiciones experimentales, un compuesto dado puede recorrer una cierta distancia a lo largo de la placa. Se denomina RF a la relacin existente entre la distancia recorrida por el compuesto y la recorrida por el disolvente en el mismo tiempo, es decir: RF= (distancia recorrida por el compuesto) / (distancia recorrida por el disolvente) Naturalmente, los valores de RF para un determinado compuesto varan ampliamente con los cambios de disolvente. El valor de RF para un compuesto dado depende de su estructura y es una constante fsica de ste, lo mismo que lo es su punto de fusin. Puede calcularse el valor de RF para cada compuesto en cualquier cromatograma, bajo unas determinadas condiciones experimentales. La importante influencia de las condiciones experimentales hace imposible la elaboracin de tablas con valores de RF. Los datos ms importantes que deben registrarse cuando se estudia un cromatograma, son: 1) Adsorbente utilizado. 2) Espesor y grado de activacin de ste. 3) Disolvente utilizado para el desarrollo del cromatograma. 4) Cantidad de muestra depositada en la placa. 5) Mtodo utilizado para detectar los compuestos. 6) Valor de RF para cada sustancia. Para calcular el valor de RF. de un compuesto dado, se miden la distancia recorrida por este desde donde se deposit en la placa y la distancia recorrida por el disolvente. La medida se realiza desde el centro de la mancha. Los mejores datos se obtienen cuando las manchas no superan los 5 mm de dimetro.
4.3.2 CROMATOGRAFIA COLUMNA ( CC ) 4.3.2.1 CROMATOGRAFA DE GASES (GC) La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacta con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. a) La cromatografa gas-slido (GSC) En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. b) La cromatografa gas-lquido (GLC) o (GC) La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte. La GC se lleva a cabo en un cromatgrafo de gases. ste consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema de inyeccin de muestra, la columna (generalmente dentro de un horno), y el detector.

Diagrama de un cromatgrafo de gases

Gas portador

El gas portador cumple bsicamente dos propsitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones: - Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria) - Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa - Fcilmente disponible y puro - Econmico - Adecuado al detector a utilizar
El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reaccin con el analito o la columna. Generalmente se emplean gases como el helio, argn, nitrgeno, hidrgeno o dixido de carbono, y la eleccin de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. El almacenaje del gas puede ser en balas normales o empleando un generador, especialmente en el caso del nitrgeno y del hidrgeno. Luego tenemos un sistema de manmetros y reguladores de flujo para garantizar un flujo estable y un sistema de deshidratacin del gas, como puede ser un tamiz molecular. Generalmente la regulacin de la presin se hace a dos niveles: un primer manmetro se sita a la salida de la bala o generador del gas y el otro a la entrada del cromatgrafo, donde se regula el flujo. Las presiones de entrada varan entre 10 y 25 psi, lo que da lugar a caudales de 25 a 150 mL/min en columnas de relleno y de 1 a 25 mL/min en columnas capilares. Para comprobar el caudal se puede utilizar un rotmetro o un simple medidor de pompas de jabn, el cual da una medida muy exacta del caudal volumtrico que entra a la columna. La pureza de los gases es sumamente importante, se requieren niveles 4.5 o mayores es de 99.995 % de pureza. Sin embargo, debido al cuidado que se debe tener con la fase activa de la columna, se hace completamente necesario la instalacin de trampas a la entrada del Gas carrier, estas trampas obviamente tienen una capacidad limitada, pero son importantsimas al momento de usar el Cromatografo. Estas trampas evitan el ingreso de Hidrocarburos, agua, CO entre otros. Sistema de inyeccin de muestra La inyeccin de muestra es un apartado crtico, ya que se debe inyectar una cantidad adecuada, y debe introducirse de tal forma (como un "tapn de vapor") que sea rpida para evitar el ensanchamiento de las bandas de salida; este efecto se da con cantidades elevadas de analito. El mtodo ms utilizado emplea una microjeringa (de capacidades de varios microlitros) para introducir el analito en una cmara de vaporizacin instantnea. Esta

cmara est a 50 C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil, y est sellada por una junta de goma de silicona septa o septum.

Inyector de muestra para un GC

Si es necesaria una reproducibilidad del tamao de muestra inyectado se puede usar una vlvula de seis vas o vlvula de inyeccin, donde la cantidad a inyectar es constante y determinada por el tamao del bucle de dicha vlvula. Si la columna empleada es rellena, el volumen a inyectar ser de unos 20 L, y en el caso de las columnas capilares dicha cantidad es menor, de 1 L, y dependiendo del tipo de columna capilar es que si se utiliza todo el volumen de muestra inyectado. Para obtener menor cantidad de volumen, se utiliza un divisor de flujo (la inyeccin se conoce como modo "Split") a la entrada de la columna que desecha parte del analito introducido. Si se utiliza todo el volumen de muestra la inyeccin es de tipo "Splitless". El modo Splitless, se emple ms para determinar pequeas cantidades o trazas (determinaciones ambientales). Si se inyecta 1 microlitro de solvente, por ejemplo agua al pasar a la fase vapor su volumen se multiplicar por mil. Es decir, un microlitro de agua pasara a ser 1 mL de agua en gas, como el volumen del puerto de inyeccin es limitado, se emplean split pulsado u otras configuraciones para garantizar el ingreso adecuado de las muestras. En caso de muestras slidas, simplemente se introducen en forma de disolucin, ya que en la cmara de vaporizacin instantnea el disolvente se pierde en la corriente de purga y no interfiere en la elucin. Segn las curvas de Van Demter (HEPT vs. Velocidad Lineal), el mejor gas a usar en la columna cromatogrfica como portador de los analitos es el hidrgeno, sin embargo dada su peligrosidad, es ms usado como gas de encendido en el detector FID, junto con el aire. Luego vienen, respectivamente, helio y nitrgeno. El gas hidrgeno es el mejor carrier, pero los flujos que manejan los cromatgrafos no son peligrosos, adems a la salida de ellos existen restrictores de llama que evitan la propagacin de un posible incendio. Por eso siempre se recomienda el uso de hidrgeno, primero por su bajo precio respecto a los otros gases y por la resolucin de los picos que se muestran en los cromatogramas. Los riesgos de peligrosidad son mnimos si se CONOCE que la relacin para la ignicin entre aire e hidrgeno es 10 a uno (por cada 10 mL de H2, 1 de Aire), y se tiene que estar en presencia de una chispa o zona de calentamiento alta. Columnas y sistemas de control de temperatura En GC se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno y las tubulares abiertas o capilares.. La longitud de estas columnas es variable, de 2 a 60 metros, y estn construidas en acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln. Debido a su longitud y a la necesidad de ser introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicolidal con longitudes de 10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.

La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separacin de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisin de dcimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullicin del analito o analitos, como tambin la mxima temperatura de funcionamiento de la columna (fase estacionaria), y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente superior a l. Para estos valores, el tiempo de elucin va a oscilar entre 2 y 30-40 minutos. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullicin, se ajusta la llamada rampa de temperatura con lo cual sta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elucin ya que aunque a mayor temperatura la elucin es ms rpida, se corre el riesgo de descomponer el analito. Detectores El detector es la parte del cromatgrafo que se encarga de determinar cundo ha salido el analito por el final de la columna. Las caractersticas de un detector ideal son: Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisin cundo sale analito y cuando sale slo el -8 -15 gas portador. Tienen sensibilidades entre 10 y 10 g/s de analito. Respuesta lineal al analito con un rango de varios rdenes de magnitud. Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal de salida. Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde temperatura ambiente hasta unos 350400 C, temperaturas tpicas trabajo. Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de analito debe dar salidas de seal iguales. Alta fiabilidad y manejo sencillo, o a prueba de operadores inexpertos. Respuesta semejante para todos los analitos, o Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido nmero de analitos.

Algunos tipos de detectores: Detector de ionizacin de llama (FID, Flame Ionization Detector). Detector de conductividad trmica (TCD, Thermical Conductivity Detector). Detector termoinico (TID, ThermoIonic Detector). Detector de captura de electrones (ECD, Electrn-Capture Detector). Detector de emisin atmica (AED, Atomic Emission Detector).

Otros detectores minoritarios son el detector fotomtrico de llama (PFD), empleado en compuestos como pesticidas e hidrocarburos que contengan fsforo o azufre. En este detector se hace pasar el gas eluido por una llama hidrgeno/oxgeno donde parte del fsforo se convierte en una especie HPO, la cual emite a = 510 y 526 nm, y simultneamente el azufre se convierte en S2, con emisin a = 394 nm. Dicha radiacin emitida se detecta con un fotmetro adecuado. Se han podido detectar otros elementos, como algunos halgenos, nitrgeno, estao, germanio y otros. En el detector de fotoionizacin (PID), el gas eluido al final de la columna se somete a una radiacin ultravioleta con energas entre 8,3 y 11,7 eV, correspondiente a una = 106-149 nm. Mediante la aplicacin de un potencial a la celda de ionizacin se genera una corriente de iones, la cual es amplificada y registrada. Columnas y tipos de fases estacionarias Columnas de relleno

Las columnas de relleno o empacadas consisten en unos tubos de vidrio, metal (inerte a ser posible como el acero inoxidable, Niquel, Cobre o Aluminio) o tefln, de longitud de 2 a 3 metros y un dimetro interno de unos pocos milmetros, tpicamente de 2 a 4. El interior se rellena con un material slido, finamente dividido para tener una mxima superficie de interaccin y recubierto con una capa de espesores entre 50 nm y 1 m. Para que puedan introducirse en el horno, se enrollan convenientemente.

El material de relleno ideal consiste en pequeas partculas, esfricas y uniformes, con una buena resistencia mecnica, para tener una mxima superficie donde interaccionar la fase estacionaria y el analito. La superficie especfica mnima ha de ser de 1 m/g. Como todos los componentes de columnas para GC, debe ser inerte a altas temperaturas (~400 C) y humectarse uniformemente con la fase lquida estacionaria durante el proceso de fabricacin. El material preferido actualmente es la tierra de diatomeas natural, debido a su tamao de poro natural. Estas especies, ya extinguidas, utilizaban un sistema de difusin molecular para tomar nutrientes del medio y expulsar sus residuos. Por tanto, debido a que el sistema de absorcin superficial del analito y la fase estacionaria es parecido, son materiales especialmente tiles. El tamao es crtico a la hora de darse el proceso de interaccin del analito, y a menores tamaos la eficacia de la columna es mejor. Pero existe el problema de la presin necesaria para hacer circular un caudal estable de gas portador por la columna, ya que dicha presin es inversamente proporcional al cuadrado del dimetro de dichas partculas. As, el tamao mnimo para usar presiones mximas de 50 psi es de 250 a 149 m. Columnas capilares

Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: las de pared recubierta (WCOT) y las de soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material absorbente como el empleado en las columnas de relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya que en su fabricacin se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en primer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno. Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas tubulares abiertas de slice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de slice especialmente pura, sin apenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo proceso de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliimida, de esta forma la columna puede enrollarse con un dimetro de unos pocos centmetros. Estas columnas, con propiedades como baja reactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas. Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m (para columnas normales) y 150-200 m para columnas de alta resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con dimetros de hasta 530 m, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores prestaciones. En estas columnas existe un problema debido a la absorcin del analito sobre la superficie de la slice fundida, adsorcin debida a la presencia de grupos silanol (Si-OH), los cuales interaccionan fuertemente con molculas polares orgnicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por sililacin con dimetilclorosilano (DMCS). La absorcin debida a los xidos metlicos se ve paliada en gran parte por la elevada pureza de la slice empleada. La fase estacionaria

Las propiedades necesarias para una fase estacionaria lquida inmovilizada son: 1. Caractersticas de reparto (factor de capacidad ' y factor de selectividad ) adecuados al analito. 2. Baja volatilidad, el punto de ebullicin de la fase estacionaria debe ser al menos 100 C mayor que la mxima temperatura alcanzada en el horno. 3. Baja reactividad. 4. Estabilidad trmica, para evitar su descomposicin durante la elucin. Existen como mucho una docena de disolventes con estas caractersticas. Para elegir uno, debe tenerse en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad del analito, mayor polaridad deber tener la fase estacionaria. Algunas fases estacionarias utilizadas actualmente son:

Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos, aromticos, polinucleares, drogas, esteroides y PCB. Poli(fenilmetildifenil)siloxano (10% fenilo), para steres metlicos de cidos grasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados. Poli(fenilmetil)siloxano (50% fenilo), para drogas, esteroides, pesticidas y glicoles. Poli(trifluoropropildimetil)siloxano, para aromticos clorados, nitroaromticos, bencenos alquilsustituidos. Polietilenglicol, sirve para compuestos polares, tambin para compuestos como glicoles, alcoholes, teres, aceites esenciales. Poli(dicianoalildimetil)siloxano, para cidos grasos poliinsaturados, cidos libres y alcoholes.

Generalmente, en columnas comerciales, la fase estacionaria se presenta enlazada y entrecruzada para impedir su prdida durante las operaciones de elucin o lavado. De esta forma se obtiene una monocapa adherida qumicamente a la superficie de la columna. La reaccin implicada suele ser la adicin de un perxido al lquido a fijar, inicindose una reaccin por radicales libres que tiene como resultado la formacin de un enlace carbonocarbono que adems incrementa su estabilidad trmica. Otra forma es la irradiacin con rayos gamma. Otro tipo de fase estacionaria son las quirales, lo cual permite resolver mezclas enantiomricas. Este tipo de fases suelen ser aminocidos quirales o algn derivado adaptado al trabajo en columna. El grosor de la pelcula vara entre 0,1 y 5 m; el grosor depende de la volatilidad del analito. As, un analito muy voltil requerir una capa gruesa para aumentar el tiempo de interaccin y separar ms efectivamente los diferentes componentes de la mezcla. Para columnas tpicas (dimetros internos de 0,25 o 0,32 mm) se emplean grosores de 0,25 m, y en las columnas macrocapilares el grosor sube hasta 1 m. El grosor mximo suele ser de 8 m Aplicaciones La GC tiene dos importantes campos de aplicacin. Por una parte su capacidad para separar mezclas orgnicas complejas, compuestos organometlicos y sistemas bioqumicos. Su otra aplicacin es como mtodo para determinar cuantitativa y cualitativamente los componentes de la muestra. Para el anlisis cualitativo se suele emplear el tiempo de retencin, que es nico para cada compuesto dadas unas determinadas condiciones (mismo gas portador, rampa de temperatura y flujo), o el volumen de retencin. En aplicaciones cuantitativas, integrando las reas de cada compuesto o midiendo su altura, con los calibrados adecuados, se obtiene la concentracin o cantidad presente de cada analito. 4.3.2.2 CROMATOGRAFA DE LIQUIDOS Slo aproximadamente 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografa de gases, ya sea porque no son suficientemente voltiles y no pasan a travs de la columna, o porque son trmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separacin. La cromatografa de lquidos de alto rendimiento o resolucin (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionaria. Tales interacciones esencialmente no existen en la fase mvil para la cromatografa de gases. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin. El recobro de la muestra es fcil en la HPLC. Las fracciones separadas se recolectan en forma sencilla, colocando un recipiente abierto al final de la columna. El recobro es usualmente cuantitativo (exceptuando la adsorcin irreversible en la columna) y los componentes separados son fcilmente aislados del disolvente de la fase mvil. Adicionalmente al tipo usual de compuestos orgnicos, la cromatografa lquida en columna puede manejar separaciones de compuestos inicos, productos lbiles de origen natural, materiales polimricos y compuestos polifuncionales de alto peso molecular.

a) Cromatografa de particin de alta resolucin (Lquido- lquido) La cromatografa de reparto est formada por la cromatografa Lquido-Lquido y la cromatografa unida qumicamente. Estas tcnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partculas del soporte relleno. En el segundo caso, como su nombre lo indica, la fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte. Esta tcnica actualmente es ms usada debido a que la cromatografa lquido-lquido necesita de un recubrimiento peridico de las partculas del soporte debido a la prdida de la fase estacionaria por disolucin en la fase mvil. En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas qumicamente se preparan con slice rgida o composiciones donde la slice es el elemento bsico. Estos slidos estn formados por partculas mecnicamente resistentes, porosas y uniformes. Los rellenos de columna en la cromatografa de fase unida qumicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carcter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Esta tcnica puede utilizarse en la separacin de mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, bebidas refrescantes entre otras. b) Cromatografa de adsorcin de alta resolucin (Lquido-slido) La cromatografa de adsorcin o Lquido-Slido es la forma clsica de la cromatografa de lquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un mtodo importante de la HPLC. Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y la almina, siendo la primera la preferida. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Los mtodos de la cromatografa de adsorcin y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen. En general la cromatografa Lquido-Slido es ms adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografa de reparto en fase inversa. En este tipo de cromatografa tambin se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una caracterstica particular de este mtodo es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros en mezclas. c) Cromatografa de intercambio inico de alta resolucin La cromatografa de intercambio inico est basada en la atraccin entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aninicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catinicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto. Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos, fuertes o dbiles. Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas, en cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catinico. Los grupos muy bsicos de amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y pierden entonces su capacidad. Las resinas de intercambio inico tienen aplicacin en estudios donde intervienen molculas pequeas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeos de la resina. Los intercambiadores inicos de poliestireno son tan grandes que las macromolculas muy cargadas, como las protenas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio inico de macromolculas. Los geles de intercambio inico se usan en el caso de molculas grandes (protenas y cidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones qumicas fuertes se emplean intercambiadores inicos inorgnicos. En resumen la gran variabilidad de los mtodos cromatogrficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Todas estas tcnicas tienen en comn la existencia de una fase estacionaria a travs de la cual fluye una fase mvil, as como la presencia de un mecanismo de inyeccin de la muestra y un mecanismo de deteccin de los diferentes componentes separados. La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el qumico sueco Arne Tiselius, merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta esfera. La electroforesis es una tcnica analtica de separacin de fundamento cintico basada en el movimiento o migracin de las macromolculas disueltas en un determinado medio (solucin tampn de electroforesis), a travs

de una matriz o soporte reticulado como resultado de la accin de un campo elctrico. El comportamiento de la molcula viene dado por su movilidad electrofortica y sta por la carga, tamao y forma de la misma. Cuanto mayor es la relacin carga/tamao ms rpido migra un in en el seno del campo elctrico. Esta tcnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromolculas de inters en la industria biotecnolgica y qumica. Ha sido un mtodo muy til para la separacin de protenas (enzimas, hormonas) y cidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolucin. d) Cromatografa de exclusin por tamao de alta resolucin Tambin llamada de filtracin en gel o cromatografa de permeacin en gel, se basa en la diferencia de penetracin de las molculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separacin obtenida depende del tamao de la molcula. El tiempo de elucin es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separacin por tamao difiere de las dems tcnicas de cromatografa en que no existen interacciones fsicas o qumicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una tcnica reproducible, escalable y rpida. La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de pequeo tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeo tamao tienen acceso a todo el volumen poroso y son las ltimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las molculas pequeas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las molculas se eluyen por su tamao decreciente. En resumen los factores que determinan la separacin de las molculas son el tamao del poro, el tamao de la partcula y el flujo de elucin. Los diferentes tipos de partculas usadas deben ser estables, mecnica y qumicamente, tener bajo contenido en grupos inicos, uniformidad de poro y tamao. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaos de partcula para un gel: a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la columna. Esta tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos, determinacin de glucosa y fructosa en zumos de fruta. e) Cromatografa por afinidad de alta resolucin Para esta cromatografa se requiere enlace covalente de un reactivo, llamado ligando por afinidad, con un soporte solido Los ligandos por afinidad caractersticos son anticuerpos, inhibidores de enzimas u otras molculas que en forma reversible y selectiva se enlazan a las molculas del analito en la muestra Cuando esta pasa por la columna solo son retenidas las molculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad. Las molculas que no se unen atraviesan la columna con la fase mvil, despus que se eliminan las molculas indeseables, los analitos retenidos pueden ser arrastrados cambiando las condiciones de la fase mvil.

4.3.2.3CROMATOGRAFA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS (CFS) La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una tcnica hbrida entre la cromatografa de gases (GC) y la HPLC, que combina lo mejor de ambas tcnicas. Esta tcnica es importante porque permite la separacin de mezclas en las que no es adecuada la aplicacin de la GC ni de la HPLC. En concreto, se aplica a compuestos no voltiles o trmicamente inestables que no pueden ser separados mediante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su deteccin en HPLC. Instrumentacin Debida a las caractersticas de la fase mvil (alta presin y temperatura) se emplean equipos parecidos a los de HPLC, con varias diferencias: El empleo de un horno termosttico para poder controlar con precisin la temperatura de la fase mvil.

El uso de un restrictor, empleado para poder mantener por una parte la presin en el interior de la columna y por otra parte permitir la bajada de la presin a la salida para que el fluido supercrtico (SF en adelante) pase al estado gaseoso y pueda ser detectado adecuadamente el analito.

Bsicamente, un restrictor es un tubo capilar de unos 2 a 10 cm de longitud y un dimetro interno menor al de la columna (tpicamente 1/10 del dimetro), donde a la salida el SF expande y pasa al estado gaseoso y se puede mantener simultneamente la presin en el interior de la columna. A diferencia de la cromatografa de gases, en la SFC no se aumenta la velocidad de elucin modificando la temperatura, sino la presin del SF. El aumento de presin, al aumentar la densidad, permite una mayor interaccin analito-fase mvil y disminuye los tiempos de elucin. Se suele emplear en las eluciones una primera etapa isobrica para luego aumentar la presin lineal o asintticamente hasta el final de la elucin. Fases estacionarias Se pueden emplear, al igual que en la GC, las columnas capilares o de relleno, prefirindose las primeras. Las dimensiones son parecidas en longitud, de 10 a 20 m, y el dimetro interno es bastante menor, de 0,05 a 0,10 mm. La pelcula interna es de siloxano entrelazado y polimerizado. Si se emplean columnas de relleno, su dimetro interno vara entre 0,5 y 4,6 mm, y el grosor de la partcula de relleno es de 3 a 10 m. En este caso, el recubrimiento es parecido al empleando en HPLC de reparto. Fases mviles La fase mvil estrella en la SFC es el dixido de carbono, por sus excelentes propiedades: Apolar, disuelve una gran variedad de molculas orgnicas. Transparente a la radiacin ultravioleta Inodoro No txico Fcil de obtener Barato No inflamable

El CO2 tiene la ventaja de que se puede obtener fcilmente como fluido supercrtico. Su temperatura crtica es de 31C y la presin crtica de 72,9 atm, condiciones realmente asequibles y por debajo del rango de condiciones usuales en la HPLC. Otras fases mviles tambin probadas y empleadas son el etano, pentano, dietilter, amonaco, tetrahidrofurano, diclorofluorometano y xido nitroso. Detectores Se puede emplear el detector de ionizacin de llama (tambin usado en GC), por sus caractersticas de universalidad (permite detectar casi cualquier compuesto orgnico), alta sensibilidad y bajo mantenimiento. El espectrmetro de masas tambin tiene utilidad, al tener una salida en fase gas, y detectores espectrofotomtricos como el de infrarrojos, ultravioleta, el de emisin por fluorescencia, el termoinico y el fotomtrico de llama. Aplicaciones La SFC se aplica a una gran variedad de compuestos, entre los que podemos citar drogas, alimentos, herbicidas, tensioactivos, polmeros, explosivos, polmeros y aditivos para stos, impelentes, explosivos o combustibles fsiles.

4.4 ARTEMIA SALINA

Artemia salina es una especie de crustceo branquipodo del orden Anostraca propia de aguas salobres continentales, de distribucin cosmopolita. Criptobiosis Los huevos pueden permanecer metablicamente inactivos durante largos perodos (incluso de 10 aos) en condiciones de total ausencia de agua y oxgeno, y a temperaturas por debajo del punto de congelacin. Esta caracterstica inusual es llamada criptobiosis o diapausa; una vez el entorno es adecuado, la eclosin puede comenzar transcurridas las primeras ocho horas. El adulto alcanza un centmetro de largo en promedio, y su vida media es de un ao. Este rpido desarrollo, y la habilidad de sus huevos para soportar largos perodos en condiciones desfavorables, la hacen un modelo invaluable en investigaciones biolgicas, algunas incluso desarrolladas en el espacio exterior. Un conocido y repetido experimento escolar consiste en estudiar la variacin de las condiciones de salinidad del ambiente en el desarrollo de las larvas de Artemia. Alimentacin Artemia spp. son camarones minsculos de cuerpo blando, de color carmelita y transparentes a la luz; pertenecen al Phylum Arthropoda, clase Crustaceae, subclase Branchiopoda. Se conocen comnmente por el nombre de artemia .El gnero Artemia est compuesto por varias especies, de las cuales se han identificado al menos cinco especies bisexuales y varias poblaciones partenogenticas, entre ellas Artemia salina Leach, Artemia persimilis Piccinelli y Prosdocimi, Artemia franciscana Kellogg (bisexuales) y Artemia partenogenetica Bowen y Sterling Al eclosionar, las larvas nauplio tienen menos de 500 micras (5x10 m). Se alimentan de fitoplancton, en especial algas de los gneros Chlamydomonas, Tetrahedron y Dunaliella. En laboratorios y acuarios se les suele suministrar harinas de pescado, maz o soya, y tambin se suele utilizar la clara de huevo. Estas especies se encuentran distribuidas en todo el mundo en aguas de elevada salinidad, pueden crecer a temperaturas entre 6 y 35C. Se alimentan de algas y bacterias y son fuente de alimento para peces, pjaros y varios invertebrados. Las hembras producen huevos que, en condiciones externas favorables,eclosionan produciendo larvas de un tamao aproximado de 1 mm. Los huevos tambin pueden formar quistes y permanecer en esta forma por un ao o ms. Las artemias se convierten en adultos transcurridas 6 a 8 semanas, alcanzando un tamao promedio de 7mm.
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5) METODOLOGIA CL50.-Es un parmetro toxicolgico que mide la concentracin en el aire de una sustancia que mata al 50% de una poblacin de la muestra despus de exposicin a la misma PARA EXTRACTOS: Realizar la colecta, Picar el material vegetal y lavar con agua corriente e inmediatamente se utilizaron para la extraccin. Para la extraccin se utilizaron 300 g de material vegetal. Luego se procedi a la destilacin por arrastre de vapor durante 2 horas Evaluacin de la toxicidad del extracto mediante el ensayo de letalidad con Artemia salina Valorar la actividad txica in vitro del extracto mediante el ensayo de letalidad con Artemia salina evaluar 2 concentraciones del extracto: en un vaso de precipitado, con un volumen total de 10 mL de agua de mar artificial, colocar 10 larvas de A. salina y el extracto a concentracin final de 1 000, 100 y 10 g/mL. Despus de 24 h de contacto, contar las larvas que sobrevivieron. La toxicidad se expresa en porcentaje de mortalidad e interpretar: 0-10 % no txico, 11-50 % moderadamente txico, 51-90 % altamente txico y 100 % extremadamente txico. Los ensayos se realizarlo por triplicado. Los porcentajes de mortalidad llevar a grficos en funcin de la concentracin utilizada y la lnea de tendencia potencial. A partir de la ecuacin de la grfica se calcular la concentracin que es letal para 50 % de la poblacin expuesta (CL50). PARA ACEITES ESENCIALES

Moler la corteza y luego se obtener el aceite esencial empleando la tcnica de hidrodestilacin. Preparar 30 L del aceite esencial en 1 mL de diclorometano e inyectar 1 L de esta solucin en el cromatgrafo de gases. Realizar los experimentos por triplicado, para la identificacin de los compuestos se usar algunos terpenos estndar, analizados bajo las mismas condiciones instrumentales, espectros de masas experimentales e ndices de retencin de Kovts (Davies, 1990; Adams, 1995) Para la evaluacin de la CL50 del aceite esencial sobre Artemia salina, realizar ensayos preliminares con el fin de establecer el rango de concentracin que permiti la determinacin de la CL 50 por el mtodo de anlisis Probit (Finney, 1971) .Para realizar los bioensayos de letalidad preparar soluciones de 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40 ug/mL, utilizando agua de mar. Por cada bioensayo preparar tres rplicas por concentracin y en cada vial colocar 10 larvas en 10 mL de las soluciones a evaluar. La cantidad de DMSO escogido tomar en cuenta para preparar el control negativo con agua de mar artificial. El conteo de organismos muertos realizar a las 24 y 48 horas despus de colocar las larvas en las diferentes soluciones sobre bioensayos efectuados por duplicado