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OFICINA ESPAOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Nmero de publicacin: 51 Int. Cl.7: A01N

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ESPAA

37/00 A61K 31/21 C07C 69/34 C07C 69/74 C07J 63/00

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TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA

86 Nmero de solicitud europea: 96922408 .8 86 Fecha de presentacin: 05.06.1996 87 Nmero de publicacin de la solicitud: 0857018 87 Fecha de publicacin de la solicitud: 12.08.1998

T3

54 Ttulo: Derivados de cido betulnico y usos para los mismos.

30 Prioridad: 05.06.1995 US 463071

73 Titular/es:

University of North Carolina at Chapel Hill 308 Bynum Hall, Campus Box 4105 Chapel Hill, North Carolina 27599-4105, US Panacos Pharmaceuticals, Inc.

45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI:

72 Inventor/es: Lee, Kuo-Hsiung;

16.05.2005

Kashiwada, Yoshiki; Hashimoto, Fumio; Cosentino, Louis, Mark y Manak, Mark

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:

74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel

16.05.2005

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Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. C/Panam, 1 28036 Madrid

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DESCRIPCIN Derivados de cido betulnico y usos para los mismos.
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Campo de la invencin La presente invencin se reere a cido betulnico y cido dihidrobetulnico y derivados de los mismos y a su uso como productos farmacuticos.

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Antecedentes de la invencin Retrovirus

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Los retrovirus son pequeos virus de RNA de sentido positivo de una sola hebra. Una partcula retroviral comprende dos molculas de RNA de sentido positivo de una sola hebra idnticas. Su genoma contiene, entre otras cosas, la secuencia de la DNA polimerasa dependiente de RNA, tambin conocida como transcriptasa inversa. Muchas molculas de transcriptasa inversa se encuentran en asociacin estrecha con el RNA genmico en las partculas virales maduras. Al entrar en una clula, esta transcriptasa inversa produce una copia de DNA de doble hebra del genoma viral, que a continuacin se inserta en la cromatina de una clula husped. Una vez insertada, la secuencia viral se denomina un provirus. La integracin retroviral depende directamente de protenas virales. Los extremos del DNA viral lineal (los LTRs) son los precursores inmediatos del DNA proviral integrado. Existe una duplicacin caracterstica de tramos cortos del DNA del husped en el sitio de integracin. Los genomas virales y los mRNAs de la progenie se transcriben desde la secuencia proviral insertada mediante RNA polimerasa de la clula husped en respuesta a seales reguladoras transcripcionales en las regiones terminales de la secuencia proviral, las repeticiones terminales largas, o LTRs. La maquinaria de produccin de protenas de la clula husped se usa para producir protenas virales, muchas de las cuales son inactivas hasta que son procesadas por proteasas codicadas viralmente. Tpicamente, las partculas virales de la progenie brotan de la supercie celular de una manera no ltica. La infeccin retroviral no interere necesariamente con el ciclo vital normal de una clula o un organismo infectado. Sin embargo, tampoco es siempre benigna con respecto al organismo husped. Aunque la mayora de las clases de virus de DNA puede estar implicada en la tumorignesis, los retrovirus son el nico grupo taxonmico de virus de RNA que son oncognicos. Diversos retrovirus, tales como el virus de la inmunodeciencia humana (HIV), que es el agente etiolgico responsable del sndrome de inmunodeciencia adquirida (SIDA) en seres humanos, tambin son responsables de varias enfermedades muy inusuales del sistema inmunitario de los animales superiores. Infeccin por HIV y SIDA

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El virus de la inmunodeciencia humana (HIV) es un miembro de los lentivirus, una subfamilia de los retrovirus. Muchos retrovirus son carcingenos bien conocidos. No se sabe que el HIV de por s provoque cncer en seres humanos u otros animales, pero presenta un reto formidable para el husped. El genoma viral contiene muchos elementos reguladores que permiten al virus controlar su velocidad de replicacin en clulas tanto en reposo como en divisin. De forma ms importante, el HIV infecta e invade clulas del sistema inmunitario; rompe el sistema inmunitario del cuerpo y hace al paciente susceptible a infecciones oportunistas y neoplasmas. El defecto inmunitario parece ser progresivo e irreversible, con un alto grado de mortalidad que se aproxima al 100% a lo largo de varios aos. El HIV-1 es trco y citoptico para linfocitos T4, clulas del sistema inmunitario que expresan el antgeno de diferenciacin de la supercie celular CD4, tambin conocido como OKT4, T4 y leu3. El tropismo viral se debe a las interacciones entre la glicoprotena de envuelta viral, gp120, y las molculas de CD4 de la supercie celular (Dalgleish y otros, Nature 312:763-767 (1984)). Estas interacciones, no solo median la infeccin de clulas susceptibles por HIV, sino que tambin son responsables de la fusin inducida por virus de clulas T infectadas y no infectadas. Esta fusin celular da como resultado formacin de sincitios multinucleados gigantes, muerte celular y agotamiento progresivo de clulas CD4 en pacientes con SIDA. Estos sucesos dan como resultado inmunosupresin inducida por HIV y sus secuelas subsiguientes, infecciones oportunistas y neoplasmas. Adems de las clulas T CD4+, la gama de huspedes de HIV incluye clulas del linaje fagoctico mononuclear (Dalgleish y otros, previamente), incluyendo monocitos sanguneos, macrfagos tisulares, clulas de Langerhans de la piel y clulas del retculo dendrtico dentro de los ndulos linfticos. El HIV tambin es neurotrpico, capaz de infectar monocitos y macrfagos en el sistema nervioso central provocando un dao neurolgico grave. Los macrfagos/monocitos son un reservorio principal de HIV. Pueden interactuar y fusionarse con clulas T que tienen CD4, provocando el agotamiento de las clulas T y contribuyendo as a la patognesis del SIDA. Frmacos anti-HIV

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Se estn realizando actualmente esfuerzos intensivos para desarrollar terapias para prevenir o intervenir en el desarrollo de los sntomas clnicos en individuos infectados con HIV. En su mayor parte, los esfuerzos se han enfocado al uso de frmacos anlogos a nuclesidos tales como la AZT (azidotimidina) y a otros derivados de didesoxinuclesidos tales como ddA, ddT, ddI y ddC. Estos frmacos inhiben la enzima viral transcriptasa inversa, inhibiendo de ese
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modo la infeccin de clulas de novo. Sin embargo, una vez que la infeccin viral se ha establecido dentro de una clula, la replicacin viral utiliza enzimas de la clula husped. As, los frmacos que inhiben solo la transcriptasa inversa tienden a tener efectos limitados. Aunque la extensin del virus libre dentro del organismo puede bloquearse, los mecanismos de la formacin de sincitios y la patognesis a travs de extensin intercelular directa permanecen. De acuerdo con esto, existe una necesidad de proporcionar nuevos frmacos anti-HIV que no estn limitados a inhibir la transcripcin inversa como su mecanismo de accin. Se estn realizando actualmente diversos esfuerzos para desarrollar agentes teraputicos para detener la replicacin del virus de inmunodeciencia humana (HIV). Aunque varios inhibidores de transcriptasa inversa (RT) de HIV-1 nucleosdicos, incluyendo AZT, ddI, ddC y D4T, han sido aprobados por la FDA y se usan clnicamente, todos estos compuestos tienen efectos secundarios adversos y el HIV muta tan rpidamente que el virus ha desarrollado resistencia a estos frmacos. Por lo tanto, se necesitan urgentemente compuestos que posean potente actividad anti-HIV con diferentes modos de accin para ayudar a las terapias anti-HIV existentes. Actualmente, el desarrollo de nuevos agentes anti-HIV se enfoca a descubrir diferentes compuestos que tengan nuevas estructuras o nuevos mecanismos de accin. Se ha empleado mucho esfuerzo en productos naturales derivados de plantas como nuevos compuestos principales para agentes anti-HIV, as como desarrollar modicaciones de estos compuestos principales. La modicacin estructural adecuada de las estructuras principales iniciales puede proporcionar derivados con actividad muy mejorada. Como un ejemplo, algunos de los presentes inventores aislaron e identicaron la suksdorna como un compuesto anti-HIV a partir de Lomatium suksdori. Modicaciones subsiguientes de la suksdorna daban 3,4-di-O-(-)-canfanoil-(+)-ciskelactona (DCK), compuesto que ha demostrado una actividad inhibidora extremadamente potente contra la replicacin de HIV en clulas linfocticas H9 con un valor de EC50 de 0,0004 M y un valor del ndice teraputico (T.I.) de 136.719. Previamente, se aislaron cido betulnico y cido platnico como principios anti-HIV de Syzigium claviorum. El cido betulnico (1) y el cido platnico (12) exhiban actividad inhibidora contra la replicacin de HIV-1 en clulas linfocticas H9 con valores de EC50 de 1,4 M y 6,5 M, respectivamente, y valores del T.I. de 9,3 y 14, respectivamente. La hidrogenacin de cido betulnico daba cido dihidrobetulnico (6), que mostraba una actividad anti-HIV ligeramente ms potente con un valor del EC50 de 0,9 y un valor del T.I. de 14. Basndose en estos hallazgos, se ha llevado a cabo la modicacin de estos compuestos principales, cido betulnico y cido dihidrobetulnico, y ha conducido al descubrimiento de potentes agentes anti-HIV adicionales. Un nmero de triterpenoides, incluyendo el cido betulnico, tiene varias aplicaciones mdicas conocidas, incluyendo el uso como un frmaco anticancergeno. Anderson y otros, en WO 95/04526, analizan derivados de triterpenoides que se han usado en la terapia del cncer, incluyndose actividad contra poliaminas que son requeridas por las clulas para crecer a una velocidad ptima. Se ha encontrado que algunos de estos triterpenoides intereren con la sntesis enzimtica de poliaminas requeridas para el crecimiento celular ptimo, y as inhiben el crecimiento de clulas cancergenas, particularmente inhibiendo ornitina descarboxilasa. Tambin se ha presentado que el cido betulnico posee actividad antiinamatoria, que puede deberse a su capacidad para inhibir enzimas implicadas en la biosntesis de leucotrienos, incluyendo 5-lipoxigenasa. Chan, en la Patente Britnica 1.415.601, describe que pueden incluirse derivados de cido dihidrobetulnico en composiciones farmacuticas, pero no hay ninguna sugerencia en cuanto a qu uso tienen estos compuestos.
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T. Fujioke y otros en Journal of Natural Products, 1994, vol. 57, m. 2, pginas 243-247, describen derivados de cido betulnico como agentes anti-SIDA; EP 0 542 622 describe composiciones farmacuticas que tratan de derivados de lupano;

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H. Otsuka y otros, en Chem. Pharm. Bull., 1981, vol. 29, m. 11, pginas 3099-3104, describen derivados de cido betulnico adicionales. Sumario de la invencin

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Se ha encontrado que los derivados aclicos de cido betulnico de acuerdo con la presente invencin tienen potente actividad anti-HIV. Los grupos hidroxi en el carbono 3, cido carboxlico en el carbono 17 y exometileno en el carbono 20 en el cido betulnico pueden modicarse fcilmente. Se ha encontrado que introducir un grupo acilo substituido o no substituido de 2 a 20 tomos de carbono en el grupo hidroxi en el carbono 3 del cido betulnico puede ser fcilmente ecaz para producir los correspondientes derivados 3-O-aclicos. As, el cido betulnico se trat con anhdrido 3,3-dimetilglutrico o anhdrido digliclido en piridina en presencia de dimetilaminopiridina para producir los derivados 3-O-aclicos (4, 5) correspondientes. En contraste, un tratamiento similar del cido betulnico con anhdrido dimetilsuccnico produca una mezcla de 3-O-(2,2-dimetilsuccinilo) y cido 3-O-(3,3-dimetilsuccinil) betulnico (2 y 3). La mezcla se separ satisfactoriamente mediante HPLC a escala preparativa que daba muestras puras. Las estructuras de estos ismeros se asignaron mediante exmenes de COSY de 1 H-13 C de intervalo largo. Los compuestos de la presente invencin tienen la siguiente frmula:

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donde R puede ser un grupo mono- o di-carboxiacilo, substituido o no substituido, de 2 a 20 tomos de carbono y R puede ser H o un grupo alquilo substituido o no substituido de 2 a 10 tomos de carbono o arilo, tal como acetilo, bencilo, etc.
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De particular inters son los compuestos de la frmula:

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Los ensayos anti-HIV indicaban que el cido 3-O-(3,3-dimetilsuccinil)betulnico (3) demostraba una actividad anti-HIV extremadamente potente en linfocitos H9 infectados agudamente con valores del EC50 de menos de 1,7 x 105 M. Este compuesto exhiba valores del T.I. notables de ms de 970.000 y ms de 400.000. En contraste, el compuesto 2, el ismero 2,2-dimetlico, mostraba actividades anti-HIV con valores del EC50 de 2,7 y valores del T.I. de 5,9 que eran signicativamente inferiores que los de 3. Los compuestos 4, 5 tambin exhiban potentes actividades anti-HIV con EC50 que variaba de 0,01 a 2,3 x 103 M y valores del T.I. de 1172 a 1974. Los grupos acilo en el carbono 3 de los compuestos ms activos tienen grupos dimetilo u oxgeno en la posicin del carbono 3. Puesto que los pares aislados del oxgeno en el grupo diglicolo podran corresponder a los grupos dimetilo en el carbono 3, en los grupos dimetilsuccinilo o dimetilglutarilo, estos tres grupos acilo son estructuralmente similares entre s. Esta observacin sugiere que el tipo de grupo acilo podra ser importante para la actividad anti-HIV mejorada. Como un mecanismo de estudio de accin, se investig la actividad inhibidora de los compuestos 1-5 contra tanscriptasa inversa de HIV-1. Los compuestos probados no exhiban actividad de transcriptasa inversa de HIV a una concentracin de 100 g/l. Recientemente, otros derivados de cido betulnico, por ejemplo RPR103600, se han presentado como agentes anti-HIV. Se mostraba que inhiban la fusin de la membrana inducida por HIV. Por lo tanto, los compuestos 1-5 tambin se evaluaron con respecto a la actividad inhibidora contra la fusin de la membrana inducida por HIV. Los compuestos 2-5 inhiban la formacin de sincitios en un intervalo de concentracin 20-40 g/ml, sugiriendo que un efecto inhibidor contra la fusin de membrana inducida por HIV podra estar implicado en su mecanismo de accin. Sin embargo, la actividad anti-HIV del compuesto 3 es 540.000 veces mayor que la del compuesto 2, aunque estos compuestos inhiban la formacin de sincitios a la misma concentracin. Se present que el compuesto RPR103611 inhiba la formacin de sincitios a 3 g/ml y para este propsito era aproximadamente 10 veces ms potente que los compuestos 2-5 en este ensayo. Sin embargo, la lnea celular usada para ensayar los compuestos de la presente invencin, CEM4, era diferente de la lnea celular usada en la literatura, H9. Las actividades anti-HIV del compuesto 3 en clulas H9 y PMBCs eran aproximadamente de 10 a 1000 veces mayores que las de RPR103611 presentadas en la literatura. Esta observacin indicaba que al menos otro mecanismo de accin distinto a la inhibicin de la formacin de sincitios podra estar implicado en la actividad anti-HIV mostrada por estos compuestos. La invencin tambin se dirige a al menos uno de los derivados de cido betulnico, opcionalmente en combinacin con uno cualquiera o ms de los agentes teraputicos anti-SIDA conocidos o un inmunoestimulante para usar en el tratamiento de un sujeto infectado con HIV-1. La presente invencin tambin incluye un conjugado de un derivado de cido betulnico para usar segn se describe previamente con CD4 soluble, derivados de CD4, anticuerpos especcos para CD4 o glicoprotenas codicadas por HIV tales como gp120 y gp41, o anticuerpos para las mismas. Otras caractersticas, ventajas, modalidades, aspectos y objetivos de la presente invencin estarn claros para los expertos en las reas de la tcnica pertinente, basndose en la descripcin, las enseanzas y la gua presentadas aqu.

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Se ha descubierto inesperadamente que los compuestos de la presente invencin tienen actividad anti-retroviral, proporcionando as compuestos y composiciones adecuados para tratar infecciones retrovirales, opcionalmente con ingredientes farmacuticamente activos adicionales, tales como compuestos anti-retrovirales, anti-HIV y/o inmunoestimulantes o anticuerpos antivirales o fragmentos de los mismos. Por el trmino actividad anti-retroviral o actividad anti-HIV se entiende la capacidad para inhibir al menos uno de: (1) unin retroviral a clulas;

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(2) entrada viral en clulas; (3) metabolismo celular que permite la replicacin viral;
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(4) inhibicin o extensin intercelular del virus; (5) sntesis y/o expresin celular de antgenos virales;
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(6) actividad de enzimas codicadas por virus (tales como transcriptasa inversa y proteasa); y/o (7) cualesquiera acciones patgenas retrovirales o de HIV conocidas, tales como, por ejemplo, la inmunosupresin. As, cualquier actividad que tienda a inhibir cualquiera de estos mecanismos es actividad anti-retroviral o actividad anti-HIV.

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Descripcin detallada de la invencin Un derivado de cido betulnico de la presente invencin puede usarse para el tratamiento de una infeccin retroviral (por ejemplo, HIV) solo o en combinacin con otros modos de terapia conocidos en la tcnica. Tales modos de terapia pueden incluir quimioterapia con frmacos tales como, pero no limitados a, al menos uno de AZT, ddC, ddA, ddT, ddI o cualesquiera otros frmacos o anticuerpos anti-retrovirales en combinacin entre s, o asociados con un agente teraputico basado biolgicamente, tal como, por ejemplo, CD4 soluble, anticuerpos para CD4 y conjugados de CD4 o anti-CD4, o segn se presenta adicionalmente aqu. Debido a que los derivados de cido betulnico de la presente invencin son relativamente menos txicos o substancialmente atxicos para clulas normales, su utilidad no est limitada al tratamiento de infecciones retrovirales establecidas. Por ejemplo, un derivado de cido betulnico de acuerdo con la presente invencin puede usarse para tratar productos sanguneos, tales como los mantenidos en bancos de sangre. El suministro de sangre de una nacin se prueba actualmente con respecto a anticuerpos para HIV. Sin embargo, la prueba todava es imperfecta y las muestras que dan pruebas negativas todava pueden contener virus HIV. Tratar la sangre y los productos sanguneos con los derivados de cido betulnico de la presente invencin puede aadir un margen de seguridad adicional destruyendo cualquier retrovirus que pueda haber quedado sin detectar. Composiciones Farmacuticas
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Las composiciones farmacuticas de la presente invencin pueden comprender al menos uno de los derivados de cido betulnico. Las composiciones farmacuticas de acuerdo con la presente invencin tambin pueden comprender adicionalmente otros agentes anti-virales tales como, pero no limitados a, AZT, ddI, 2--uoro-ddI, ddA, ddG, ddC, 2--uoro-ddC, d4T, AzddU, fosfonilmetoxietiladenina o CD4 soluble o inmunomoduladores, por ejemplo, segn se presenta ms adelante. Para una revisin de los agentes teraputicos en infecciones por HIV, vase Mitsuya H. y otros, FASEB J. 5: 2369-2381 (1991), referencia que se incorpora por la presente mediante referencia. Agentes antivirales adecuados adicionales para uso ptimo con un derivado de cido betulnico de la presente invencin pueden incluir, pero no se limitan a, AL-721 (mezcla de lpidos) fabricada por Ethigen Corporation and Matrix Research Laboratories; Amphotericin B methyl ester; Ampligen (RNA desapareado) desarrollado por DuPont HEM Research; anticuerpo anti-SIDA (Nisshon Food) 1 AS-101 (inmunoestimulante basado en metal pesado); AZT (azidotimidina/Retrovir/Zidobudine) fabricado por Burroughs Wellcome; Betaseron (-interfern), fabricado por Triton Biosciences (Shell Oil); hidroxitolueno butilado; Carrosyn (polimanoacetato); Castanospermine; Contracan (derivado de cido esterico); Creme Pharmatex (que contiene cloruro de benzalconio) fabricado por Pharmelac; CS-87 (derivado no substituido en 5 de Zidovudine); Cytovene (ganciclovir) fabricado por Syntex Corporation; ddC (didesoxicitidina) fabricada por Hoffman-La Roche y otros anlogos nucleosdicos; sulfato de dextrano; D-penicilamina (3mercapto-D-valina) fabricada por Carter-Wallace and Degussa Pharmaceutical; Foscarnet (fosfonoformiato trisdico) fabricado por Astra AB; cido fusdico fabricado por Leo Lovens; glicirricina (un constituyente de la raz de regaliz); HPA-23 (21-tungsto-9-antimoniato amnico) fabricado por Rhone-Poulenc Sant; agente antiviral de virus inmune humano desarrollado por Porton Products Internacional; Ornidyl (eornitina) fabricado por Merrell-Dow; nonoxinol; isetionato de pentamidina (PENTAM-300) fabricado por Lipho Med; Peptide T (secuencia octapeptdica) fabricado por Peninsula Laboratories; Phenytoin (Warner-Lambert); Ribavirin; Rifabutin (ansamicina) fabricada por Adria Laboratories; rsT4 (T4 soluble recombinante) fabricada por Biogen, Genetech and Smith, Kline Beecham; Trimetrexate fabricado por Warner-Lambert Company; SK-818 (agente antiviral derivado de germanio) fabricado por Sanwa Kagahu; suramina y anlogos de la misma fabricados por Miles Pharmaceuticals, UA001 fabricado por Ueno Fine Chemicals Industry; Wellferon (-interfern) fabricado por Borroughs Wellcome; Zovirex (aciclovir, AZT), fabricado por Burroughs Wellcome. Las composiciones farmacuticas de la presente invencin tambin pueden comprender inmunomoduladores. Imunomoduladores adecuados para el uso ptimo con un derivado de cido betulnico de la presente invencin de acuerdo con la presente invencin pueden incluir, pero no se limitan a: ABPP (Bropririmine): Ampligen (RNA desapareado) DuPont/HEM Research); anticuerpo anti-interfern humano (Advance Biotherapy and Concepts); anticuerpo antiSIDA (Nisshon Food); AS-101 (imunoestimulante basado en metal pesado); cido ascrbico y derivados del mismo; interfern-; Carrosyn (polimanoacetato); Ciamexon (Boehringer-Mannheim); ciclosporina; cimetidina; CL-246.738 (American Cyanamide); factores estimulantes de colonias, incluyendo GM-CSF (Sandoz; Genetics Institute); dinitroclorobenceno; interfern-; interfern-gamma; glucano; gammaglobulina hiperimune (Bayer); IMREG-1 (dializado de leucocitos) e IMREG-2 (IMREG Corp.); inmutiol (dietiltiocarbamato sdico) (Institut Merieux); interleuquina 1 o interleuquina 2 (Cetus Corporation; Hoffman-LaRoche; Immunex); isoprinosina (inosina pranobex); Krestin(Sankyo);
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LC-9018 (Yakult); lentinano (Ajinomoto/Yamanouchi); LF-1695 (Fournier), metionina-encefalina (TNI Pharmaceuticals; Sigma Chemicals); Minophagen C; tripptido muramlico, MTP-PE (Ciba-Geigy); naltrexona (Trexan DuPont); Neutropin, inmunomodulador de RNA (Nippon Shingaku); shosaikoto y ginseng; factor humoral tmico; TP-05 (Thymopentin, Ortho Pharmaceuticals); Thymosin factor 5 y Thymosin 1; Thymostimulin; TNF (Factor de necrosis tumoral)fabricado por Genentech; y preparaciones de vitamina B. El sujeto animal preferido de la presente invencin es un mamfero. Por el trmino mamfero se entiende un individuo perteneciente a la clase Mammalia. La invencin es particularmente til en el tratamiento de pacientes humanos.
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El trmino tratar signica administrar a sujetos un derivado de cido betulnico o cido dihidrobetulnico con propsitos que pueden incluir la prevencin, la mejora o la cura de una patologa relacionada con retrovirus.
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Se considera que los medicamentos se proporcionan en combinacin entre s si se proporcionan al paciente simultneamente o si el tiempo entre la administracin de cada medicamento es tal que permite un solapamiento de la actividad biolgica. En una modalidad preferida, al menos un derivado de cido betulnico comprende una sola composicin farmacutica.

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Composiciones farmacuticas para la administracin de acuerdo con la presente invencin pueden comprender al menos un derivado de cido betulnico de acuerdo la presente invencin en una forma farmacuticamente aceptable opcionalmente combinado con un portador farmacuticamente aceptable. Estas composiciones pueden administrarse mediante cualquier medio que alcance sus propsitos pretendidos. Las cantidades y los regmenes para la administracin de un derivado de cido betulnico de acuerdo con la presente invencin pueden ser determinados fcilmente por los expertos normales en la tcnica clnica del tratamiento de una patologa retroviral. Por ejemplo, la administracin puede ser mediante ruta parenteral, tal como subcutnea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdrmica o bucal. Alternativamente, o simultneamente, la administracin puede ser mediante la ruta oral. La dosicacin administrada depende de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento previo o simultneo, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Las composiciones dentro del alcance de esta invencin incluyen todas las composiciones que comprenden al menos un derivado de cido betulnico de acuerdo con la presente invencin en una cantidad ecaz para alcanzar su propsito pretendido. Aunque las necesidades individuales varan, la determinacin de intervalos ptimos de cantidades ecaces de cada componente est dentro de la experiencia de la tcnica. Dosicaciones tpicas comprenden de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las dosicaciones preferidas comprenden de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del ingrediente activo. Las dosicaciones ms preferidas comprenden de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. La administracin teraputica tambin puede incluir administracin previa, simultnea, subsiguiente o adjunta de al menos un derivado de cido betulnico adicional de acuerdo con la presente invencin u otro agente teraputico, tal como un agente antiviral o inmunoestimulante. En tal sistema, la dosicacin del segundo frmaco puede ser preferiblemente la misma que o diferente de la dosicacin del primer agente teraputico. Preferiblemente, los frmacos se administran en das alternos en las cantidades recomendadas de cada frmaco. La administracin de un compuesto de la presente invencin tambin puede incluir opcionalmente terapia previa, simultnea, subsiguiente o adjunta usando reforzadores del sistema inmunitario o imunomoduladores. Adems de los compuestos farmacolgicamente activos, una composicin farmacutica de la presente invencin tambin puede contener portadores farmacuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y adyuvantes que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacuticamente. Preferiblemente, las preparaciones, particularmente las preparaciones que pueden administrarse oralmente y que pueden usarse para el tipo de administracin preferido, tales como tabletas, grageas y cpsulas, y tambin preparaciones que pueden administrarse rectalmente, tales como supositorios, as como soluciones adecuadas para la administracin mediante inyeccin u oralmente, contienen de aproximadamente 0,01 a 99 por ciento, preferiblemente de aproximadamente 20 a 75 por ciento de compuesto o compuestos activos, junto con el excipiente. Las preparaciones farmacuticas de la presente invencin se fabrican de una manera que es conocida de por s, por ejemplo, por medio de procedimientos de mezcladura, granulacin, elaboracin de grageas, disolucin o liolizacin convencionales. As, pueden usarse preparaciones farmacuticas para uso oral combinando los compuestos activos con excipientes slidos, opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la mezcla de grnulos, despus de aadir adyuvantes adecuados, si se desea o es necesario, para obtener tabletas o ncleos de gragea. Excipientes adecuados son, por ejemplo, cargas tales como un sacrido, por ejemplo, lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa y/o fosfatos clcicos, tales como fosfato triclcico o hidrogenofosfato clcico; as como aglutinantes tales como pasta de almidn, usando, por ejemplo, almidn de maz, almidn de trigo, almidn de arroz, almidn de patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sdica y/o polivinilpirrolidona. Si se desea, pueden aadirse agentes desintegrantes tales como los almidones mencionados
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previamente y tambin carboximetilalmidn, polivinilpirrolidona reticulada, agar o cido algnico o una sal de mismo, tal como alginato sdico. Los adyuvantes son, sobre todo, agentes reguladores del ujo y lubricantes, por ejemplo, slice, talco, cido esterico o sales del mismo, tales como estearato magnsico o estearato clcico, y/o polietilenglicol. Los ncleos de gragea se proveen de revestimientos adecuados, que, si se desea, son resistentes a los jugos gstricos. Para este propsito, pueden usarse soluciones de sacrido concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arbiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dixido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgnicos o mezclas de disolventes orgnicos adecuados. Para producir revestimientos resistentes a los jugos gstricos, se usan soluciones de preparaciones de celulosa adecuadas tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. Pueden aadirse colorantes o pigmentos a las tabletas o los revestimientos de gragea, por ejemplo, para la identicacin o para caracterizar combinaciones de dosis de compuestos activos. Otras preparaciones farmacuticas que pueden usarse oralmente incluyen cpsulas de ajuste a presin hechas de gelatina, as como cpsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plasticante tal como glicerol o sorbitol. Las cpsulas de ajuste a presin pueden contener los compuestos activos en la forma de grnulos que pueden mezclarse con cargas, tales como lactosa, aglutinantes, tales como almidones, y/o lubricantes, tales como talco o estearato magnsico, y, opcionalmente, estabilizantes. En las cpsulas blandas, los compuestos activos se disuelven o suspenden preferiblemente en lquidos adecuados, tales como aceites grasos o parana lquida. Adems, pueden aadirse estabilizantes. Preparaciones farmacuticas posibles que pueden usarse rectalmente incluyen, por ejemplo, supositorios que consisten en una combinacin de los compuestos activos con una base para supositorios. Bases para supositorios adecuadas son, por ejemplo, triglicridos naturales o sintticos o hidrocarburos parafnicos. Adems, tambin es posible usar cpsulas rectales de gelatina que consisten en una combinacin de los compuestos activos con una base. Posibles materiales de base incluyen, por ejemplo, triglicridos lquidos, polietilenglicoles o hidrocarburos parafnicos. Formulaciones adecuadas para la administracin parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo sales solubles en agua. Adems, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyeccin oleosas apropiadas. Disolventes o vehculos liplos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de ssamo, o steres de cido graso sintticos, tales como oleato de etilo o triglicridos. Suspensiones acuosas para inyeccin que pueden contener substancias que incrementan la viscosidad de la suspensin incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sdica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensin tambin puede contener estabilizantes. Una formulacin farmacutica para la administracin sistmica de acuerdo con la invencin puede formularse para la administracin enteral, parenteral o tpica. En efecto, los tres tipos de formulacin pueden usarse simultneamente para alcanzar la administracin sistmica del ingrediente activo. Formulaciones adecuadas para la administracin oral incluyen cpsulas de gelatina duras o blandas, grageas, pldoras, tabletas, incluyendo tabletas revestidas, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberacin controlada de las mismas. Formas de dosicacin slidas adems de las formuladas para la administracin oral incluyen supositorios rectales.
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Los derivados de cido betulnico de la presente invencin tambin pueden administrarse en la forma de un implante cuando se combinan con un portador de liberacin lenta biodegradable. Alternativamente, los derivados de cido betulnico de la presente invencin pueden formularse como un parche transdrmico para la liberacin continua del ingrediente activo. Formulaciones adecuadas para la administracin tpica incluyen cremas, geles, gelatinas, muclagos, pastas y pomadas. Soluciones inyectables adecuadas incluyen soluciones inyectables intravenosas, subcutneas e intramusculares. Alternativamente, los derivados de cido betulnico pueden administrarse en la forma de una solucin para infusin o como una inhalacin nasal o un aerosol. Habiendo ahora descrito generalmente la invencin, la misma se entender ms fcilmente a travs de la referencia a lo siguiente: Los derivados de cido betulnico de la presente invencin se sintetizaron todos sometiendo a reujo una solucin de cido betulnico (1), dimetilaminopiridina (1 equivalente-mol) y un anhdrido apropiado (2,5-10 equivalentes-mol) en piridina anhidra (5-10 ml). La mezcla de reaccin se diluy a continuacin con agua de hielo y se extrajo con CHCl3 . La capa orgnica se lav con agua, se sec sobre MgSO4 y se concentr bajo presin reducida. El residuo se cromatogra usando columna de gel de slice o HPLC a escala semipreparativa para dar el producto. Ejemplo 1

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cido 3-O-(2,2-dimetilsuccinil)betulnico (2) Se prepar cido 3-O-(2,2-dimetilsuccinil)betulnico (2) como previamente usando una solucin de cido betulnico, dimetilaminopiridina y anhdrido dimetilsuccnico en piridina anhidra. El rendimiento era 3,1%. La cristalizacin
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en metanol daba agujas incoloras, punto de fusin 279-280C; []D 19 + 36,2 [c=0,35, CHCl3 -MeOH (1:1)]; FABMS positivo m/z 585 (M+H)+ ; FABMS negativo m/z 583 (M-H) ; HR-FABMS calculado para C36 H57 O6 585,4155, encontrado m/z 585,4156; 1 H NMR (piridina-d5 ): 0,75, 0,93, 1,03 (x2), 1,06 (cada 3H, s; 4-(CH3 )2 , 8-CH3 , 10-CH3 , 14CH3 ), 1,49 (6H, 2,2-CH3 x2 ), 1,80 (3H, s, 20-CH3 ), 2,94 (2H, s, H2-3), 3,55 (1H, m, H-19), 4,77 (1H, dd, J=5, 11,5 Hz, H-3), 4,79, 4,95 (cada 1H, s ancho, H-30). Ejemplo 2 cido 3-O-(3,3-dimetilsuccinil)betulnico (3)
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Rendimiento 70% (partiendo de 542 mg de 1); la cristalizacin en MeOH daba agujas incoloras; pf 274-276C; []D 19 + 23,5 (c=0,71), CHCl3 -MeOH (1:1)]; FABMS positivos m/z 585 (M+H)+ ; FABMS negativos m/z 583 (M-H) ; HR-FABMS calculado para C36 H57 O6 585,4155, encontrado m/z 585,4161; 1 H NMR (piridina-d5 ): 0,73, 0,92, 0,97, 1,01, 1,05 (cada 3H, s; 4-(CH3 )2 , 8-CH3 , 10-CH3 , 14-CH3 ), 1,55 (6H, s, 3-CH3 x 2), 1,80 (3H, s, 20-CH3 ), 2,89, 2,97 (cada 1H, d, J=15,5 Hz, H-2), 3,53 (1H, m, H-19), 4,76 (1H, dd, J=5,0, 11,5 Hz, H-3), 4,78, 4,95 (cada 1H, s ancho, H-30). Ejemplo 3

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cido 3-O-(3,3-dimetilglutaril)betulnico (4) Rendimiento 59,50% (partiendo de 51,3 mg de 2); la cristalizacin en MeOH-H2 O daba agujas incoloras; pf 214215C; []D 19 + 9,8 (c=1,2, CHCl3 -MeOH [1:1]); 1 H NMR (piridina-d5 ): 0,77, 0,91, 0,95, 1,03, 1,07, 1,80 (cada 3H, s; 4-(CH3 )2 , 8-CH3 , 10-CH3 , 14-CH3 , 20-CH3 ), 4,73 (1H, dd, J=4,5, 11,5 Hz, H-3), 4,78, 4,95 (cada 1H, s ancho; H30). Anlisis Calculado para C37 H58 O6 4H2 O: C 66,24, H 9,92; encontrado C 65,91, H 9,76. Ejemplo 4 cido 3-O-diglicolil-betulnico (5)

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Rendimiento 84,7% (partiendo de 49,6 mg de 1); un polvo amorfo; []D 20 + 2,1 (c=1,1, CHCl3 -MeOH [1:1]); H NMR (metanol-d4 -CDCl3 [1:1]): 0,85, 0,88 (x 2), 0,97, 1,00 (cada 3H, s; 4-(CH3 )2 8-CH3 , 10-CH3 , 14-CH3 ),1,69 (20, CH3 ), 4,21, 4,23 (cada 2H, s; HZ-2 y 4), 4,65-475 (1H, s ancho, H-3), 4,60, 4,73 (cada 1H, s ancho, H-30). Anlisis Calculado para C34 H52 O7 4H2 O: C 69,12, H 9,21; encontrado C 69,60, H 9,03.
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Ejemplo 9 Actividad farmacolgica

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Ensayos anti-HIV La lnea de clulas T, H9, y la lnea de clulas promonocticas, U937, se mantuvieron separadamente en cultivo continuo con medio completo (RPMI 1640 con suero de ternero fetal al 10%) a 5% de CO2 y 37C. Las lneas celulares se usaron en experimentos solo cuando estaban en la fase logartmica de crecimiento; mientras que clulas mononucleares de sangre perifrica (PBMCs) no infectadas se estimularon en primer lugar con PHA (1 g/ml) durante 3 das. Todas las dianas celulares se incubaron con HIV-1 (aislado IIIB, TCID50 104 UI/ml, a una multiplicidad de infeccin de 0,01-0,01 UI/clula) durante 1 hora a 37C y 5% de CO2 . Las lneas celulares y las PBMCs se lavaron a fondo para retirar viriones no adsorbidos y se resuspendieron a 4 x 105 clulas/ml en medio completo o medio completo con 10% v/v de interleuquina 2 (IL-2), respectivamente. Partes alcuotas de 1 ml se pusieron en pocillos de placas de cultivo de 24 pocillos que contenan un volumen igual de compuestos de prueba (diluidos en el medio de cultivo apropiado). La toxicidad de cada compuesto se evalu determinando el nmero de clulas no infectadas expuestas a compuesto que permaneca despus de 4 das a 37C y 5% de CO2 . Se us un ensayo de ELISA de antgeno p24 para determinar los niveles de virus liberados en el medio de los cultivos infectados con HIV. El ensayo del antgeno p24 usaba un anticuerpo monoclonal especco anti-p24 de HIV-1 como el anticuerpo de captura revestido sobre placas de 96 pocillos. Despus de un perodo de incubacin de la muestra, se us suero de conejo que contena anticuerpos para p24 de HIV-1 para etiquetar cualquier p24 capturado: sobre la supercie de los pocillos de microvaloracin. Se usa a continuacin anti-(suero de conejo) de cabra conjugado a peroxidasa para etiquetar anticuerpos de conejo especcos para p24 de HIV-1 que se haban complejado con p24 capturado. La presencia de p24 en las muestras de prueba se revel a continuacin mediante la adicin de substrato. El corte para el ensayo de ELISA de p24 era 12,5 pg/ml. Se cuantic p24 en el medio de cultivo frente una curva estndar que contena cantidades conocidas de p24. Se determinaron las concentraciones ecaz (EC50 ) e inhibidora (IC50 ) (para la actividad anti-HIV y la citotoxicidad, respectivamente). Ensayo de transcriptasa inversa de HIV-1

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El microensayo de transcriptasa inversa de HIV-1 se adapt a partir de las tcnicas descritas por Groff y otros, J. Virol. 38:239-248 (1981) y Willey y otros, J. Virol. 62:139-147 (1988).
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Se mezclaron 10 microlitros de transcriptasa inversa IIIB de HIV-1 asociada con viriones en Triton X-100 al 1% con 50 microlitros de un cctel de reaccin que contena Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), KCl 75 mM, ditiotreitol 2 mM, MgCl 5 mM, 5 mg/ml de poli (A) [Pharmacia], 0,25 unidades/ml de oligo(dT) [Pharmacia]; 0,05% de Nonidet P40 y 10 mCi/ml de 32 P-dTTP en presencia de diversas concentraciones de compuesto de prueba. Despus de incubar durante 1 hora a 37C, se aplicaron 40 microlitros de la mezcla de reaccin a una membrana NA 45 de Schleicher & Schuell saturada con 2 x SSC (NaCl 0,3 M, citrato sdico 30 mM, pH 7,0) en un Minifold de Schleicher & Schuell sobre una lmina de papel de ltro GB003. Cada pocillo en el Minifold se lav cuatro veces con 2 x SSC. Se realiz una autorradiografa y la radiactividad se cuantic con un contador beta directo Packard Matrix (Meriden, CT) 9600. Ensayo de Fusin Celular Se realizaron fusiones celulares segn se describe en Matthews y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:5424-5428 (1987). Se incubaron clulas MOLT-4 (7 x 104 ) con clulas CEM infectadas crnicamente con HIV-1LAI (104 ) en placas de fondo plano de media rea de 96 pocillos (Costar) en 100 microlitros de medio de cultivo con las mezclas de clulas a 37C durante 24 horas. Los sincitios multinucleados se enumeraron mediante examen microscpico de todo el contenido de cada pocillo. Los resultados de las pruebas previas se muestran en la Tabla 1.
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Se efectuaron pruebas adicionales sobre varios compuestos de acuerdo con la presente invencin para la inhibicin de la replicacin de HIV-1 en linfocitos H9 y PBMCs. Estos resultados se muestran en la Tabla 2.
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La descripcin precedente de las modalidades especcas revelar as completamente la naturaleza general de la invencin que otros pueden, aplicando el conocimiento actual, modicar y/o adaptar fcilmente para diversas aplicaciones tales modalidades especcas sin apartarse del concepto genrico, y por lo tanto tales adaptaciones y modicaciones pretenden estar comprendidas dentro del signicado y la gama de equivalentes de las modalidades descritas. Ha de entenderse que la fraseologa o la terminologa presente tiene el propsito de descripcin y no de limitacin. Todas las referencias citadas en esta memoria descriptiva se incorporan por la presente mediante referencia.
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REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de la frmula
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en la que R se selecciona del grupo que consiste en

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y R es uno de hidrgeno, alquilo substituido o no substituido de 2 a 10 tomos de carbono o arilo. 2. Una composicin farmacutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicacin 1 o un ster, una sal, un ter, un sulfato o un glucurnido farmacuticamente aceptable del mismo y un portador farmacuticamente aceptable. 3. Una composicin farmacutica de acuerdo con la reivindicacin 2, que comprende adems un frmaco seleccionado de un agente anti-viral o un agente inmunoestimulante.
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4. Una composicin farmacutica de acuerdo con la reivindicacin 3, en la que dicho agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en gammaglobulina, amantadina, guanidina, hidroxibenzimidazol, interfern , interfern , interfern , tiosemicarbazonas, metisazona, rifampina, ribavirina, anlogos de pirimidina, anlogos de purina, foscarnet, cido fosfonoactico, aciclovir, didesoxinuclesidos y ganciclovir. 5. Una composicin farmacutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para usar en la inhibicin de una infeccin retroviral en clulas o tejido de un animal. 6. Una composicin farmacutica de acuerdo con la reivindicacin 5, en la que dicho animal es un ser humano.

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7. Una composicin farmacutica de acuerdo con la reivindicacin 5 6, para usar en el tratamiento de una patologa relacionada con retrovirus. 8. Una composicin farmacutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para usar en el tratamiento de una infeccin por HIV.

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