Procedimentos de Anlises Microbiolgicas - PAM Aula Prtica Anlise de gua por membrana filtrante.

. MEMBRANA FILTRANTE Este mtodo especialmente empregado para amostras com baixa contagem microbiana. Embora, relativamente grande volume de gua (100 mL) pode ser passado pela membrana sem obstru-la, somente pouca amostra de diluente homogeneizado de certos tipos de alimentos podem ser usados para uma membrana simples. As membranas utilizadas so de celulose, com poros de tamanhos capazes de reter bactrias (geralmente 0,45m), mas permitem que gua ou diluentes passem por ela.

MEMBRANA FILTRANTE - PESQUISA DE COLIFORMES

HOLDER

KITASSATO

MEMBRANA FILTRANTE

MATERIAL UTILIZADO:

VIDRARIA: Placas de Petri estreis; Lminas de Vidro para microscopia MEIOS DE CULTURA: Agar Endo; Trplice Agar Modificado (IAL); Caldo BHI (Brain Heart Infusion com cepas controle); Reagentes para Colorao de Gram EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS: Estufa Bacteriolgica 35/37 C; Bico de Bunsen; Ala de Platina; Agulha de Platina; Cuba para descarte de material contaminado. 1

TCNICA: - Coletar a amostra de gua a ser analisada em frascos de vidro (previamente esterilizado); - Ligar o Bico de Bunsen; - Montar o Holder (previamente esterilizado); - Lavar o Holder com gua destilada estril, sem colocar a membrana. - Flambar a pina; - Montar o Holder com a membrana filtrante (0,45m); - Colocar 100 mL da gua coletada; - Ligar a bomba a vcuo; - Aps a filtrao de 100 mL da amostra, a membrana transferida para a superfcie do meio Agar Endo; - Descartar a gua que foi filtrada; - Lavar o Holder com 150 mL de gua destilada estril; - Incubar as placas a 35C/24hs - Aps esse perodo, efetua-se a contagem das colnias tpicas de coliformes (com colorao vermelhoescura e/ou com brilho metlico superficial); - Para confirmao da presena de E. coli e outros coliformes na amostra, repica-se algumas colnias caractersticas Endo Agar para as provas bioqumicas; - Incubar os tubos das provas bioqumicas a 35C/24hs.

PROVAS BIOQUMICAS PARA CONFIRMAO DE COLIFORMES FECAIS - IMVC Produo de Indol Princpio - O teste visa a habilidade de um organismo produzir Indol a partir de triptofano. Organismos produtores de triptofanase degradam o triptofano produzindo indol mais cido pirvico mais amnia. O indol reage com paradimetilbenzaldedo presente no reagente de Kovacs, formando uma cor vermelha na camada de lcool. O HCL presente no reagente de Kovacs serve apenas para acelerar a reao. Procedimento - Transferir colnia suspeita para tubo de ensaio contendo gua triptonada ou caldo triptofano (5mL). Incubar 35C/24 h. Adicionar 5 gotas do reagente de Kovacs e agitar levemente. Observar se h formao de um halo vermelho violeta na superfcie do meio de cultura (teste positivo), ou se o anel permanece na cor amarela do reagente (teste negativo). E. coli pode ser + ou-. Utilizao do Citrato Teste usado para determinar se o microrganismo capaz de utilizar citrato como nica fonte de carbono para o metabolismo, resultando em alcalinidade. Um organismo que capaz de utilizar o citrato como nica fonte de carbono, tambm utiliza sais de amnia presente no meio como nica fonte de nitrognio. Os sais de amnia so quebrados para dar amnia, resultando em alcalinidade. A utilizao do citrato (reao positiva), resulta numa reao alcalina e o indicador muda de verde para azul. No havendo crescimento o citrato no utilizado e a cor permanece verde. Procedimento - Repicar as colnias para o meio gar citrato de Simmons. Incubar a 30C /24-48 h. E.coli citrato(-) negativo Teste de Vermelho de Metila Princpio - O vermelho de metila usado para testar a produo de cido orgnico, formado durante a fermentao da glicose. O teste se baseia fundamentalmente na fermentao da glicose por certos organismos para produo de diferentes quantidades de cidos: cido actico, cido ltico, cido frmico, alm de CO2, H2 e etanol. Procedimento - Em tubos contendo caldo-glucose-fosfato, inocular pequena quantidade da colnia suspeita e incubar a 35C/96 h. Aps o perodo de incubao, adicionar gotas da soluo de vermelho de metila a cada 2,5 mL de cultura, observando imediatamente a colorao vermelha do meio (teste positivo) ou amarela (teste negativo). E. coli VM positiva. Teste de Voges Proskauer Princpio - O teste de VP consiste em se detectar a presena de acetilmetilcarbinol ou acetona, produzido pelo metabolismo de certos organismos. Durante o processo de fermentao da glicose, determinados organismos produzem acetilmetilcarbinol ou acetona, produto originrio da condensao de 2 molculas de cido pirvico seguido de descarboxilao. A reao de VP atribuda oxidao atmosfrica da acetona que transformada em diacetila, que reagindo com KOH e com a peptona constituinte do meio, produz colorao rsea ou vermelho. A reao de VP se processa muito lentamente e pode ser acelerada pela adio de certos catalisadores, como por exemplo, o - naftol. Procedimento - Em tubos contendo caldo glucose fosfato, inocular colnias suspeitas e incubar a 30C por 24/48 h. Adicionar ao meio previamente inoculado, 0,5 mL de uma soluo de naftol 5% mais 0,5 mL de hidrxido de potssio a 40%. Agitar vigorosamente o tubo. O aparecimento de uma cor vermelha ou rsea, usualmente dentro de 20 min. a 1hora indica VP positivo. E. coli VP negativa. Resultado: IMVC Indol- positivo ou negativo Vermelho de metila- positivo Voges Proskauer- negativo Citrato- negativo

E. coli