Kromatografik Yntemler ve HPLC Yntemi *

Kromatografi Nedir? Kromatografi, bir karmda bulunan bileenlerin birbirinden ayrlmasn gerekletiren ve bu sayede kalitatif ve kantitatif analizlerinin yapld yntemlerin genel addr. Bu yntemlerde alma dzenei temel olarak iki bileenden oluur. Bu bileenlere sabit faz (stationary phase) ve hareketli faz ya da mobil faz (mobile phase) ad verilir. Mobil fazn ierisinde yer alan bileenler, sabit faza ait dolgu maddesiyle etkilemeleri sebebiyle, bir miktar tutulurlar. Bu tutulma, rnekteki farkl bileenler iin farkl miktarlarda olur. Bylece bileenler sabit fazn sonlarna doru, farkl hzlarda ilerledikleri iin, birbirinden ayrlm vaziyette sabit faz farkl zamanlarda terkederler. Bu ekilde sabit fazdan kan bileenlerin deriimleri uygun bir biimde llr ve zamana veya mobil fazn kullanlan hacmine kar y-ekseninde iaretlenerek kromatogram denilen grafikler elde edilir. Kromatografinin Temel Prensibi ve Tanmlar Mobil faz (mobile phase): rnek Bileenlerini, sabit faz (kolon) boyunca tayan, eitli fiziksel ve kimyasal zelliklere sahip zelti veya zc karmlar. Kullanlacak mobil fazn seiminde, analizi yaplacak rnek madde bileenlerinin zellikleri, kullanlacak sabit faz ve dedektrn zellikleri vb. birok parametreye dikkat edilmelidir. Sabit faz (stationary phase): Mobil faz ierisinde gelen rnee ait bileenlerin etkileime girdikleri ve belirli lde alkonulduklar fazdr. Kromatografi tekniinin eidine gre tasarlanm ve ok deiik materyallerden ok farkl llerde imal edilmi ve kolon olarak adlandrlm sabit fazlar mevcuttur.

zellikle gaz ve sv kromatografileri iin ticari boyutta olduka fazla marka ve boyutta kolon retimi yaplmaktadr. Sv kromatografisinin bir eidi olan yksek performas sv kromatografisi (HPLC) uygulamalarnda kullanlan kolonlar daha ok 30-300 mm uzunluunda yaklak 5 mm i apnda metalik boru eklinde olup i yzeyleri ok deiik zelliklerde kaplama materyalleri ile kaplanarak, analizi yaplacak madde gruplar iin modifiye edilebilmektedir. Alkonma (retention): Mobil faz ierisinde gelen, analizi yaplacak maddeye ait bileenlerin sabit faz ile etkileime girerek belirli oranda tutulmas daha dorusu yavalatlmas ve bylece daha ge olarak sabit faz terk etmesi olaydr. Bu zellikten yola klarak, belirli sabit analitik koullar altnda, her kimyasal madde iin parmak izi nitelii tayan alkonma zaman (retention time-tR) tanm tretilmitir. Bu kavram belirli sabit deneysel koullarda analizi yaplan maddenin sabit faz terketmesi iin geen sreyi gstermektedir. t0 = kolona ait l zaman (column dead time) tR = alkonma zaman (retention time) tR = net alkonma zaman (net retention time) tR = t0 + tR Pompa (pump): Sv kromatografisinde, zellikle de HPLC donanmnda temel bir bileendir. HPLC uygulamalarnda mobil faz oluturan zc karmlarnn, enjektr, kolon ve dedektr ierisinden belirli, sabit veya deiken bir hzda, belirli basn altnda gemesini salar. Modern HPLC donanm pompalar bilgi ilemci kontroll olup, ok eitli firma tarafndan deiik modellerde retilmektedir. Dedektr (dedector): Kolonda ayrm yaplan analizlenecek maddeye ait bileenlerin alkonma zamanlarna gre srayla ierisinden geerken miktar

tayinlerinin yapld HPLC donanmdr. Kullanlacak dedektrn tr analizlenecek maddenin fiziksel ve kimyasal zelliklerine gre seilmelidir. Dedektrler lmn yaptklar, analizlenecek maddeye ait, fiziksel zellie gre u ekilde snflandrlrlar: Ultraviyole/grnr blge dedektr (ultraviolet/visible dedector-UV/VIS) Fotodiyot array dedektr (photodiode array dedector-DAD) Floresans dedektr (fluorescence dedector-FLD letkenlik dedektr (conductivity dedector-CDD) Refraktif indeks dedektr (refreactive index dedector-RID) Elektrokimyasal dedektr (electrochemical dedector-ECD) Ktle dedektr (mass dedector-MS) Evaporatif k datc dedektr (evaporative ligth scattering dedector-EL)

Kromatogram (Chromotogram): Kromatografik analiz sonucunda elde edilen grafiktir. Y-ekseni, kullanlan dedektrn lt fiziksel zellii (absorbans, fluoresans, iletkenlik, akm, krlma indisi vb.), X-ekseni ise zaman gstermektedir (alkonma zaman iin kolaylk olmas bakmndan genellikle dakika cinsinden). Zamana kar Y-ekseninde llen fiziksel zelliin artp tekrar azalmas eklinde oluan pik eklindeki erilerin herbiri analizlenen maddeye ait bir bileeni gstermektedir. Bu piklere ait deerler (pik alan, ykseklii, vb.) kullanlarak kalitatif ve kantitatif analizler yapmak olasdr. Hacim ak hz (volume flow rate): F ile sembolize edilir, birimi cm3/saniye veya cm3/dakika olup, alkonma zamannn alkonma hacmine blnmesiyle hesaplanr: F=VR / tR Lineer ak hz (linear flow rate): U ile sembolize edilir, kolon uzunluunun (L) kolon l zamanna (to) blnmesiyle hesaplanp birimi cm/saniyedir:

U=L/t0. Lineer ak hz, kolonun enine kesitinden bamsz olup, zc molekllerinin kolon boyunca hareketleri srasndaki ortalama hzlarn gsterir. znrlk (resolution): R ile sembolize edilir. Birbirini takip eden 2 adet bileene ait piklerin birbirinden ayrmlarnn baarsn (orann) gsterir. Takip eden piklere ait maksimalar aras mesafenin 2 pike ait geniliklerin (birimi dakika) toplamna blnmesiyle hesaplanr. R= [2(tR2-tR1)] / W1+W2. Takip eden pikler iin iyi bir znrlkten bahsedebilmek iin hesaplanan R deerinin 1-1,5 civarnda olmas istenir. Kromatografik Yntemlerin Tarihesi Sv bir mobil fazn kullanld kromatografik yntemlerin (Sv kromatografisi) tarihesi Rus botaniki M. S. Twsettin 1906 ylnda yapt ve yaymlad almalarna kadar uzanr . nceleri dz yzlemsel yapda sabit fazlar kullanlm ve bu teknikler daha sonra kat kromatografisi ve ince tabaka kromatografisi olarak isimlendirilmitir. Modern sv kolon kromatografisi ise 1969 ylnda HPLCnin kullanma girmeye balamasyla gelime gstermitir. Kromatografik Yntemlerin Snflandrlmas Kromatografik yntemler kullanlan mobil fazn sv veya gaz olmasna gre; Sv Kromatografisi ve Gaz Kromatografisi olmak zere balca 2 ana grupta snflandrlabilir. Bunun haricinde kromatografik yntemler, alkonulma mekanizmas ve alma metoduna gre de 2 ekilde snflandrlabilir: Alkonma Mekanizmasna Gre: - Adsorpsiyon Kromatografisi (Analizlenecek madde hem mobil faz hem de sabit faz oluturan molekllerle etkileim ierisindedir. Polar maddeler polar, apolar maddeler ise apolar sabit faz tarafndan daha fazla tutulurlar)

- Partisyon (Dalm) Kromatografisi (Adsorpsiyon kromatografisinden farkl olarak bu yntemde sabit fazda svdr. Sv sabit fazn getirdii zorluklar uygulama alann kstlamaktadr) - Size Exclusion Kromatografisi (Analizlenecek maddelere ait molekller boyutlarna gre ayrlmaktadr. Bu ilem iin ok deiik por aplar ieren dolgu maddesiyle doldurulmu kolonlar kullanlmaktadr. Bylece deiik aplardaki porlar birer elek gibi davranarak maddeleri boyut-aplarna gre alkoymaktadr) - Afinite Kromatografisi (Alkonma mekanizmas maddeye zgn olmakta ve anahtar-kilit modeline uygun biyolojik materyaller dolgu malzemesi olarak kullanlmaktadr. kstlamaktadr) - yon Deiim Kromatografisi (Ykl bir maddenin ters ykle yklenmi kat bir sabit fazla tutulmas prensibine dayanr) alma Metoduna Gre: (daha az kullanlan, rnein kolondan uzaklatrlma mekanizmasna gre yaplm bir snflandrmadr) - Elsyon Olutumu Kromatografisi (Elution development chromatography) -Yerdeitirme Chromatography) - Frontal Analiz Kromatografisi (Frontal Analysis Chromatography). HPLC Donanm Oluumu Kromatografisi (Displacement Development Maliyetinin ok yksek olmas uygulama alann

Standart HPLC donanm temel olarak 4 bileenden olumaktadr. Bu bileenler srasyla pompa, enjektr, kolon (sabit faz) ve dedektrdr. Pompa HPLC donanmnda yer alan pompalama sistemleri, ak hzna gre, pompann yapmnda kullanlan malzemeye gre ve pompann mobil faz iletme mekanizmasna gre olmak zere 3 farkl ekilde kategorize edilebilmektedir. Ak Hzna Gre - Microbore Pompa Sistemleri: ap 2 mmye kadar olan kolonlar iin kullanlr ve 1-250 mL/dak aralnda ak hz salarlar. - Standart Bore Pompa Sistemleri: Analitik HPLC uygulamalarnda en sk kullanlan pompa sistemi olup 100 mL 10 mL/dak aralnda ak hz salarlar. Yar preperatif HPLC uygulamalarnda i ap 12 mmye kadar olan kolonlar iin tercih edilirler. - Preperatif Pompa Sistemleri: Analitik HPLC uygulamalarnn dndakir alma alanlarnda kullanlr ve 10 mL/dakdan byk ak hz salarlar. Pompann Yapld Malzemeye Gre - Metalik: En ok tercih edilen metalik malzeme, mekanik dayankll, anma direnci ve iyi termal stabilitesi nedeniyle 316 paslanmaz eliktir. Mobil fazn bileenlerinden ok az (rn. Hidroklorik asit) 316 paslanmaz elie zarar verebilir. Bir dier metalik malzeme alternatifi ise titanyumdur. Mekanik dayankllk zellikleri 316 paslanmaz elie benzemekle birlikte, anma direnci ve kimyasallara kar inertlii daha fazladr. Titanyum ve elik materyaller 6000 psi basnca kadar dayankldrlar. Metalik materyallerin sakncalar olarak ise yksek maliyetleri, kuvetli asidik ortamlara dayankszlk, biyolojik rneklerle geimsizlik saylabilir.

- Ametalik: Metalik pompalarn bahsedilen sakncalar sebebiyle ametalik materyaller de pompa imalinde kullanlmaktadr. Bu amala en ok polietiletilketon (PEEK), politetrafloroetilen (TEFLON) ve seramik mateyaller tercih edilmektedir. TEFLON biyolojik rnekler ve asidik ortamlarla geimli olmakla birlikte 2000 psi basncn zerisi iin dayankl deildir. PEEK ise 5000 psi basnca kadar dayankl olup 316 paslanmaz elie zarar veren asidik zeltilere dayankldr. Ancak HPLC uygulamalarnda kullanlan bir ok organik zclere dayankszdr. Seramik yap materyali olarak safir 20 yl akn sredir pompalarda zellikle piston paralarnn imalatnda kullanlmaktadr. Bu tr malzemeler iyi kimyasal stabiliteye sahip olmakla beraber ok yksek maliyetleri uygulamalarnda kstlamalar getirmektedir. Mobil Faz letim Mekanizmasna Gre - rnga Tip Pompalar: daha az ok olduu kullanlmamakla uygulamalarda birlikte (rn. ak hznn Kapiller sv 100mL/dakdan

kromatografisi uygulamalar) tercih edilmektedirler. 10-50 mL hacminde bir rngaya pistonun elektrik motoruyla ittirilmesiyle ak salanmaktadr. Salanabilecek mobil faz ak sresi rngann hacmi ile snrl olup, yeniden dolum srasnda ak kesilmek zorundadr. - Piston Pompalar: Modern HPLC donanmnn standart parasdr. Yaps 2 ksm hareketli paradan oluur. Bunlar, check valveler ve pistondur. Enjektr HPLC donanmn oluturan enjektr rnein sabit faz (kolon) ncesinde mobil faza enjekte edilmesi iin kullanlr. Elle kumanda edilen manuel ve bilgisayar kumandal oto-enjektrler olmak zere 2 eidi bulunmaktadr.

- Manuel Enjektrler(Manuel Injector): rnein enjekte edilebilmesi iin enjektr nce doldurma pozisyonuna (load position) getirilerek rnek, istee gre seilebilen sabit hacimli, loop ierisine doldurulur. Loopa doldurulan rnek hacmi loop sabit hacmini geerse, fazla olan ksm darya otomatik olarak atlr. Daha sonra enjektrn kolu enjeksiyon pozisyonuna (inject position) getirilerek rnek mobil faz ierisine enjekte edilmi olur. Kullanlan loop hacimleri ok deiken olup genellikle 5 mL 5 mL aralnda deiir. Loop hacmi kldke tekrarlanabilirlik adna yaplan hata oran da bymektedir. - Oto-enjektrler(Autosampler): 2 tip oto-enjektr mevcuttur. Bunlar XY tipi ve carousel tipidir. XY tipinde enjektr hareketli olup belirtilen koordinatlara giderek rnei iesinden ekmekte ve loop vastasyla mobil faza enjekte etmektedir. Bunun iin seilen rneklere ait bilgilerin, gerekli yazlm kullanlarak, nceden bilgi ilemciye girilmesi gerekmektedir. Carousel tipinde ise rnekler dnen, dairesel ekilli bir tayc vastasyla sabit bir enjektrn altna tanmaktadr. Kolon Modern HPLC donanmnn 4 temel yap tandan birisi olan kolon, karmak rneklerde bileenlerin birbirinden iyi znrlkle ayrmndan sorumlu sabit fazdr. Kolon imalatnda yap materyali olarak 316 paslanmaz elik, TEFLON, cam veya PEEK en sk tercih edilenlerdir. Kolonun ayrm gc ve performans yapld materyalden ok, i yzeyine yaplan kaplamada kullanlan malzemenin kimyasal ve fiziksel zelliklerinden etkilenmektedir. Kullanlan bu tr kaplama malzemeleri ok eitli olup, kullanlacak mobil fazn ve uygulanacak HPLC metodunun zelliklerine ve analizi yaplacak rnein bilinen kimyasal ve fiziksel zelliklerine gre seilmelidir. Seilecek kolonun HPLC uygulamasnda kullanlacak ak hz ve dolaysyla oluacak basnca dayankl

olmasna dikkat edilmelidir. Birok analitik kolonun i ap 2-5 mm aralnda deimektedir. Kolon i ap arttka ak hz ve i doldurma hacmi artmakta ama oluacak piklerin znrl dolaysyla duyarllk azalmaktadr. Kolonlarn boylar (uzunluu) ok eitli olup genellikle 30-300 mm aralnda deimektedir. Kolon uzunluu arttka rnek bileenlerinin ayrm daha iyi olmakta fakat analiz sresi uzad iin daha fazla mobil faz harcanmaktadr. Kolon boyutlarnn tanmlanmasna uluslararas standartlar getirilmitir. Buna gre nce mm cinsinden uzunluk ve ap yazlmakta, bunu firma ad, sabit faz tr, AO trnden poroz yzey ap ve mm cinsinden partikl bykl izlemektedir. rnein, 250/4,6 Nucleosil C18 100 5 yazldnda, kolonun 250 mm uzunluk ve 4,6 mm i apa sahip olduu anlalmaktadr. Kolonun firmas (markas) Nuclesoil olup, sabit faz tr normal fazda kullanlan bir tr olan C18 dir. Poroz yzey ap 100 AO olup, dolgu materyaline ait partikl bykl 5 mdir. Dedektr HPLC donanmnda 4 temel bileenden birisi olan dedektrler, rnek bileenlerini tayin ederken ltkleri fiziksel zelliklere gre, 8 eittir: A) ULTRAVOLE / GRNR BLGE DEDEKTR (Ultraviolet / Visible dedector UV/VIS): Absorbans llr. Lambert-Beer yasas geerlidir. Spektrum taramas yapmak, farkl dalga boyunda almak veya dalga boyunu zamana kar programlamak mmkndr. B) FOTODYOT ARRAY DEDEKTR (Photodiode array dedector-DAD): UV/VIS dedektrden fark, 512 elementden oluan bir yzeyde, her elementin ayr bir dalga buyundaki absorbans e zamanl olarak lebilmesidir. Bu sayede 3 boyutlu kromatogramlar almak ve istenilen her pikin ok hzl spektrum taramasn grebilmek olasdr. Ayrca istenilen dalga boyu aralnda

allabilmesi bu dedektrn salad bir dier nemli avantajdr. Kullanlan k kayna dteryum veya tungsten lambadr. C) FLORESANS DEDEKTR (Fluorescence dedector-FLD): Organik maddelerin yaklak %15I fluoresans oluturma yeteneine sahiptir. Oluan fluoresans llmektedir. Kullanlan k kayna ksenon lamba olup, duyarll UV/VIS dedektre gre yaklak 103 kat fazladr. D) LETKENLK DEDEKTR (Conductivity dedector-CDD): letkenlik llr. Daha ok anyon ve katyon analizlerinde kullanlr. Scaklk kontrol ok nemlidir bu sebeple kolon frn ierisinde allmaldr. Kullanlan mobil fazn iletkenlii ne denli dk olursa oluan grlt de o denli dk olur. E) REFRAKTF NDEKS DEDEKTR (Refreactive index dedector-RID): Krlma indisi llr. Scaklktan etkilenir. rnek bileenlerinin bulunduu ortamda younluk artacandan gelen k krlarak hcreyi terkeder. In llen krlma oranndan (krlma indisi) kantitatif tayin yaplr. F) ELEKTROKMYASAL DEDEKTR (Electrochemical dedector-ECD): Elektroaktif maddeler analizlenebilir. Yani bileenler , belirli potansiyel deerlerinde ykseltgenebilir veya indirgenebilir olmaldr. llen fiziksel zellik tayin srasnda oluan elektrik akmdr. G) KTLE DEDEKTR (Mass dedector-MS): rnek bileenlerine ait ok zgn kromatogramlar elde edilir, dolaysyla zellikle kalitatif tayinlerde tehis amal kullanmlarda ok nemli bir dedektrdr. H) EVAPORATF IIK DAITICI DEDEKTR (Evaporative ligth scattering dedector-EL)

HPLC Sistem Trleri A) Isocratic sistem (tek pompa, tek solvent, solvent karm olabilir, ayrm yetersizdir) B) Dk basnl gradient sistem (tek pompa, max 4 farkl mobil faz, karma pompadan nce) C) Yksek basnl gradient sistem (2 yada 3 pompa, 2 yada 3 farkl mobil faz, karma pompadan sonra) HPLCde Ayrma Teknikleri A) Normal faz (Normal phase-NP) (ilk gelitirilen teknik, kolon polar, mobil faz apolardr, kullanlan kolonlar silica gel, cyano, amino, diol veya nitro kolonlardr) B) Ters faz (Reverse phase-RP) (en sk kullanlan teknik, kolon apolar, mobil faz polardr, kullanlan kolonlar C18, C8, C4, phenyl, TMS, Cyanodur) C) Ters faz iyon ifti (Reverse phase ion pairing-IP) D) yon deiim (Ion exchange-IC) E) Size exclusion SEC (GPC/GFC) F) Kiral ayrm (Chiral separation)