Agrobiotecnologa

Curso 2011

Clonacin y transgnesis animal

Lino Baraao

Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

Sumario
Clonacin

Clonacin en distintas especies

Animales transgnicos

Recombinacin homloga

Aplicaciones
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos

Referencias

Clonacin

Agrobiotecnologa
Animales transgnicos

La clonacin consiste en la produccin de individuos genticamente idnticos

En los animales, la clonacin se basa en el uso de la tcnica de transplante nuclear. Mediante esta tcnica, una clula donante . del individuo a clonar se transfiere a un . ovocito previamente enucleado.
clula donante ovocito embrin sinttico

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Animales transgnicos

Enucleacin

Electrofusin

TRANSPLANTE NUCLEAR

Clulas embrionarias (totipotenciales) Nuevo individuo

Clulas diferenciadas La diferenciacin es un proceso irreversible asociado a la prdida de La diferenciacin es un proceso irreversible asociado a la prdida de totipotencialidad. Slamente las clulas embrionarias tienen la totipotencialidad. Slamente las clulas embrionarias tienen la potencialidad de generar un organismo completo. De ah el estatus potencialidad de generar un organismo completo. De ah el estatus nico del embrin. nico del embrin.

Dolly fue clonada a partir de una clula de glndula mamaria, Dolly fue clonada a partir de una clula de glndula mamaria, demostrando que an las clulas somticas diferenciadas demostrando que an las clulas somticas diferenciadas pueden ser totipotenciales. pueden ser totipotenciales.

La diferenciacin celular sera la consecuencia de la unin reversible de factores de transcripcin tejidoespecficos que regulan la expresin de un grupo particular de genes.

Embrin

Clula somtica

Corolario: La potencialidad para dar un nuevo Corolario: La potencialidad para dar un nuevo individuo no es privativa del ncleo de las clulas individuo no es privativa del ncleo de las clulas embrionarias embrionarias

Reprogramacin: Los factores de transcripcin originalmente presentes en la clula donante se diluyen y son reemplazados por aquellos presentes en el oocito

 Cules son las aplicaciones de la clonacin animal?

Clonacin reproductiva de bovinos

Para la clonacin de bovinos suele partirse de clulas fetales como donantes del material gentico. Los ovocitos pueden provenir de animales sacrificados para consumo ya que slo aportan el ADN mitocondrial. El embrin obtenido en cultivo debe ser luego transferido a una hembra receptora para completar su desarrollo.

Clulas donantes
Clulas adultas Clulas fetales

- La vida media es de 20 divisiones celulares. - La tasa de divisiones de 0,8 divisiones por da. - Son muy sensibles a la inhibicin por contacto. - Se desarrollan en menor proporcin.

- La vida media es de 35 divisiones celulares. Ello permite su manipulacin gentica. - La tasa de divisiones de 1,3 divisiones por da. - Son muy sensibles a la inhibicin por contacto. - Se desarrollan en mayor proporcin.

cortar el tejido

explanto

Ovocito recipiente

24 hs

Expansin de las clulas del cmulus

OVOCITOS INMADUROS
Primer cuerpo polar

OVOCITOS MADUROS Los ovocitos obtenidos de ovarios de animales sacrificados para consumo deben ser madurados in vitro. La maduracin consiste en el avance de la divisin meitica hasta la metafase II. En este estado se observa la extrusin del primer cuerpo polar.

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Animales transgnicos

Transplante nuclear

Para implementar la tcnica de transplante nuclear se requiere disponer de micromanipuladores y de un microscopio con accesorios para visualizar fluorescencia.

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Animales transgnicos
Gentileza de Biosidus S.A.

Transplante nuclear
Gentileza de Biosidus S.A.

Ovocito en MII

Enucleacin

Clula donante

Transplante nuclear

Fusin celular

Gentileza de Biosidus S.A.

Activacin

Post-fusin

Post-activacin

Desarrollo embrionario y preez

Aplicaciones de la clonacin
La clonacin reproductiva tiene distintas aplicaciones en biotecnologa animal. - Clonado con fines agropecuarios - Clonado de animales de zoolgicos y mascotas - Clonado para introducir modificaciones genticas La clonacin teraputica se aplica en medicina humana.

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Animales transgnicos

Clonacin en distintas especies

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Animales transgnicos

Clonacin en ovinos
El primer mamfero clonado a partir de una clula somtica fue una oveja, la ahora mundialmente conocida Dolly.

Tomado de: http://www.roslin.ac.uk/imagelibrary/

Clonacin de bovinos
Uno de los primeros bovinos clonados fue Second chance

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Tomado de: Hill et al., Biol. Reprod., 2000.

Clonacin en la Argentina
(De cmo una sucesin de fracasos puede conducir al xito)

Clonacin de bovinos

Pampa fue la primera ternera nacida por clonacin a partir de fibroblastos fetales en Argentina

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Gentileza de Biosidus S.A.

Cerdos clonados obtenidos por transferencia nuclear de clulas somticas de un animal adulto

El clonado de cerdos requiri modificar la tcnica habitual de transplante nuclear.

Tomado de: Poleiaeva et al., Nature, 2000.

Clonacin de mascotas

A pesar de que su dueo invirti ms de 3 millones de dlares en ello, Missy muri en 2002 sin haber sido clonada.

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http://www.missyplicity.com

Clonacin de mascotas

Clon de Little Gizmo

Clon de Rainbow

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http://www.savingsandclone.com/clients/our_latest_clones.html

Clonacin de primates

Neti y Ditto

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Tomado de: Meng et al., Biol. Reprod.,1997.

Clonacin de humanos?

La clonacin reproductiva carece de justificacin mdica. Su aplicacin masiva es totalmente improbable en las condiciones actuales

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Animales transgnicos

Clonacin teraputica
La denominada clonacin teraputica permite generar tejidos de reemplazo a partir de clulas del paciente.

Autotransplante

Tejido normal (ej. fibroblastos)

Transplante nuclear

Factores de crecimiento Matriz extracelular

Embrin (?) sinttico Clulas precursoras del Ovocito (donado) Clulas embrionarias (pluri o totipotenciales) tejido daado

Animales transgnicos

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Animales transgnicos

Animales transgnicos

Un animal transgnico es aquel que tiene una porcin de ADN forneo en su genoma.
- Los primeros animales transgnicos producidos fueron . ratones, obtenidos mediante microinyeccin de cigotas

Macho frtil
X

Hembra superovulada

Colecta de embriones

Inyeccin con ADN forneo Promotor

Implantacin de los embriones en hembras seudopreadas

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Extraccin del ADN y deteccin de la presencia del transgen

Cras

Elementos requeridos en una construccin gentica

Promotor original del gen a expresar exones

ADN genmico
intrones

ARN mensajero

ADN copia

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Gen recombinante
Promotor regulable o tejido especfico intrn

La tcnica de microinyeccin de cigotas resulta muy poco eficiente en bovinos

Microinyeccin de cigotas bovinos

Eficiencia en la produccin de animales Eficiencia en la produccin de animales Transgnicos por microinyeccin Transgnicos por microinyeccin
Cigotas microinyectadas Sobreviven la microinyeccin
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2.800 2.500 250 50 1

Embriones transferidos a receptoras Preeces Terneros transgnicos

Clonacin y transgnesis

La introduccin de genes por transfeccin y posterior seleccin de clulas totipotenciales permite producir animales transgnicos con muy alta eficiencia.

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Gentileza de Biosidus S.A.

70

60

50

hGH g / day

40

30

20

10

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Day of milking after lactogenesis

Res non verba

25 profesionales, 2 empresas, 3 instituciones

High level expression of bioactive recombinant human growth hormone in the milk of a cloned transgenic cow (J. Biotechnology, 2006)
Daniel Salamone1,2, Lino Baraao3 Claudio Santos,1Jorge Artuso1, Carlos Werning1, Leonardo Bussmann6 Aida Prync1Cesar Carbonetto1, , Susana Dabsys1, , Carlos Munar5 Guillermo Berra4, Ignacio Berra, Roberto Salaberry1, Nahuel Fernndez1, Mariana Papouchado, Marcelo Foti1, Norberto Judewicz1, Ignacio Mujica5, , Luciana Muoz, Silvana Mannocci 1, Silvina Fenndez Alvarez1, Eliseo Gonzlez, Juan Zimmermann, Marcelo Criscuolo1, Carlos Melo1.

1. Biosidus S.A. 2. Facultad de Agronoma, Universidad de Buenos Aires 3. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires 4. Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria 5. Munar y Asociados 6. Instituto de Biologa y Medicina Experimental-CONICET

PAMPA August 6, 2002 PAMPA MANSA September 24, 2002

PAMPA MANSA II & III January 5, 2004

PAMPERO December 7, 2004

Recombinacin homloga

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Recombinacin homloga
contruccin conteniendo un gen de resistencia a antibitico flanqueado por secuencias homlogas al exn a eliminar secuencias homlogas
Neo

gen endgeno promotor exones

intrones

gen de resistencia a antibiotico

recombinacin
Neo

Neo

el alelo en el que se ha producido la recombinacin homologa no produce protena activa

Recombinacin homloga
La recombinacin homloga elimina un alelo por vez. Los animales resultantes son heterocigotas.
linea celular de partida

recombinacin homloga
Neo

se ha eliminado uno de los alelos del gen

transferencia nuclear

el animal resultante posee todava una copia activa del gen

Recombinacin homloga
Para obtener homocigotas (que no expresen la protena) es necesario el cruzamiento de machos y hembras genticamente modificados.

Neo

X
Neo

Neo Neo

Neo Neo

Homocigota

Recombinacin homloga
Cupido y Diana, primeros corderos producidos por la tcnica de gene targeting

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Tomado de: McCreath et al., Nature, 2000.

Estrategias alternativas para la supresin de una protena

Silenciamiento por RNAi

Protena a suprimir Traduccin

X
Recombinacin homloga
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ARNm

Transcripcin

ADN

Silenciamiento gnico

La introduccin de secuencias cortas (22pb) de ARNs homlogos de doble cadena desencadena un proceso que degrada al ARNm blanco y conduce a la supresin de la protena respectiva

Degradacin del ARNm ARN doble cadena

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Transcripcin

ADN

Caractersticas de los mtodos usados para suprimir protenas

Recombinacin homloga
- Afecta al ADN (suprime el gen) - Requiere dos generaciones para obtener el fenotipo deseado - La supresin es total - Protenas candidatas: PrP, lactoglobulina

Silenciamiento por ARNi

- Afecta al ARN (suprime al mensajero) - El fenotipo deseado se obtiene en la primera generacin - Pueden obtenerse niveles intermedios - Protenas candidatas: lactoglobulina, protenas de la leche, miostatina

Aplicaciones

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Aplicaciones

-- Incremento en la velocidad de crecimiento y/o masa muscular en cerdos y peces Incremento en la velocidad de crecimiento y/o masa muscular en cerdos y peces -- Introduccin de genes de resistencia a enfermedades Introduccin de genes de resistencia a enfermedades -- Produccin protenas humanas que bloquean la accin del complemento en cerdos Produccin protenas humanas que bloquean la accin del complemento en cerdos (ejemplo, CD59) (ejemplo, CD59) -- Transplantes temporaros de corazn o hgado hasta la obtener donantes compatibles Transplantes temporaros de corazn o hgado hasta la obtener donantes compatibles -- Peces que expresan proteinas fluorescentes Peces que expresan proteinas fluorescentes -- Produccin de protenas recombinantes humanas en leche y suero Produccin de protenas recombinantes humanas en leche y suero -- Efectos de sobreexpresin de genes Efectos de sobreexpresin de genes -- Eliminacin de genes (knock out) Eliminacin de genes (knock out)

Produccin de alimentos: Produccin de alimentos:

Produccin de rganos para xenotransplante: Produccin de rganos para xenotransplante:

Fines ornamentales: Fines ornamentales:

Produccin de frmacos (molecular pharming) Produccin de frmacos (molecular pharming) Modelos animales para patologas humanas Modelos animales para patologas humanas

Transgnesis en bovinos. Produccin de alimentos

Cambios cualitativos en la produccin de leche: Cambios cualitativos en la produccin de leche:

- Produccin de lactoferrina en leche bovina - Produccin de lactoferrina en leche bovina - Produccin de leches humanizadas - Produccin de leches humanizadas - Modificacin de las casenas para la produccin de - Modificacin de las casenas para la produccin de .. quesos especiales quesos especiales

Cambios cualitativos en la produccin de carne: Cambios cualitativos en la produccin de carne:

- Produccin de carne bovina libre de riesgo - Produccin de carne bovina libre de riesgo de BSE de BSE - Modificaciones cualitativas - Modificaciones cualitativas

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Transgnesis en bovinos. Produccin de alimentos

Bovinos genticamente modificados para mejorar la produccin lctea

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Transgnesis en peces. Produccin de alimentos

La introduccin de copias extra del gen de hormona de crecimiento aumenta notablemente la velocidad de desarrollo de truchas y salmones.
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Tomado de: Devlin et al., Nature, 2001.

www.aquabounty.com

Transgnesis en peces. Fines ornamentales

Expresin de protenas fluorescentes en peces cebra

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http://www.glofish.com/photos.asp

Transgnesis en peces. Modelos experimentales

El uso de promotores especficos permite detectar patrones de expresin durante el desarrollo

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Tomado de: Wittbrodt et al., Nat. Rev. Genet., 2002.

Transgnesis en insectos: transformacin de gusanos de seda

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Tomado de: Tomita et al., Nat. Biotechnol., 2003.

Transgnesis en insectos: mosquitos

Se est intentando producir mosquitos resistentes al parsito de la malaria.

Tomado de: Catteruccia et al., Nature, 2000.

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Larvas de mosquitos transgnicos (izquierde y centro) que expresan el gen de la protena GFP. Panel de la izquierda: luz UV; panel de la derecha: luz blanca

Transgnesis en aves

La expresin de protenas en la clara de huevo tiene un enorme potencial. La transgnesis en aves se enfrenta todava con notables dificultades tcnicas derivadas de los problemas del aislamiento de ovocitos y cigotas y el posterior cultivo embrionario. Se ha logrado expresar enzimas en la clara del huevo y se obtuvieron quimeras que expresan genes marcadores. La heredabilidad de estos caracteres es baja.

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Transgnesis en cabras
La empresa Nexia (Canad) ha logrado producir cabras que expresan fibrona (protena de la tela de araa) en su leche.

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Tomado de: Keefer et al., Biol. Reprod., 2001.

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Transgnesis en cerdos

Se han transformado cerdos con el gen de la Green Fluorescent Protein mediante transfeccin de clulas somticas en cultivo y posterior clonado. Xenotransplante:
- La eliminacin de genes para la alfa 1-3 galactosil transferasa permitira obtener cerdos que no posean el residuo galactosa en su endotelio y, por lo tanto, sean menos proclives al rechazo agudo.

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Universidad de Missouri-Colombia Immerge BioTherapeutics Inc

ENVIROPIG University of Guelph

Aplicaciones Produccin de protenas recombinantes humanas en la leche animal

Capacidad de produccin de protenas Capacidad de produccin de protenas recombinantes en la leche en distintas especies recombinantes en la leche en distintas especies Litros/ao Cerdo Cabra Oveja Vaca 250 400 500 10.000 Protena 250 400 500 10.000

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Aplicaciones. Produccin de frmacos

Volumen del mercado mundial en protenas humanas: Volumen del mercado mundial en protenas humanas: - U$S 20.000 millones - U$S 20.000 millones Ejemplos: Ejemplos: - Antitrombina 3: U$S 200 millones - Antitrombina 3: U$S 200 millones - Albmina srica: U$S 1.500 millones - Albmina srica: U$S 1.500 millones

Requerimientos mundiales de protenas humanas y nmero de animales transgnicos necesarios para satisfacerlo
Factor VIII Alfa-1-antitripsina Factor IX 120 g 5.000 kg 2 kg 1000 kg 75 kg 2 vacas 10-25 ovejas 33.000 ovejas 42.000 cabras 13 ovejas 22 cerdos 300 vacas 8.300 cabras 600 cabras

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Albmina srica Activador tisular del plasmingeno

Aplicaciones Produccin de protenas recombinantes humanas en la leche animal

1 huevo de oro (1,3 kg) por da

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Vaca transgnica 2 g/L hTPA 10.000 U$S/g 30 L por da U$S 600.000/da

U$S 15.000/da

Aplicaciones
El uso de animales transgnicos como bioreactores permitira suplir la demanda de protenas recombinantes, en particular de aquellas que requieren produccin masiva. Demanda de capacidad productiva instalada (datos a nivel mundial)

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Aplicaciones
Produccin de protenas recombinantes en leche de animales transgnicos: Productividad de 1 animal transgnico: 1,5 kg de protena teraputica/ao = equivalente a 200.000 L de fermentacin o sea 1 animal transgnico = 4 fermentadores de 500 L
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Demanda anual de hormona de crecimiento (hGH):

- Mercado latinoamericano: produccin de 2 animales transgnicos - Mercado mundial: produccin de 40 animales transgnicos

ANDi

Referencias

1. Palma, G.A. Biotecnologa de la Reproduccin. Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA, Argentina), 2001. 2. Hwang, W.S., Ryu, Y.J., Park, J.H., Park, E.S., Lee, E.G., Koo, J.M., Jeon, H.Y., Lee, B.C., Kang, S.K., Kim, S.J., Ahn, C., Hwang, J.H., Park, K.Y., Cibelli, J.B., Moon, S.Y. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science, 303:1669-74, 2004. 3. Cristophides, G.K. Transgenic mosquitoes and malaria transmission. Cellular Microbiology, 7:325-333, 2005. 4. Wilmut, I. Cloning for Medicine. Scientific American, 279:58-63, 1998. 5. Sitios relacionados con clonacin animal: http://ag.arizona.edu/ANS/courses/cloning2/ http://www.infigen.com/ http://www.advancedcell.com/ http://www.emtran.com/ http://gslc.genetics.utah.edu/units/cloning/whyclone

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