SUMRIO INTRODUO ......................................................................................... 3 2 MEIOS DE CULTURA .......................................................................... 8 3 ISOLAMENTO .................................................................................... 10 3.1 MTODOS CLSSICOS .............................................................. 11 3.1.

1 TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS ........................ 11 3.1.2 TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO .......... 12 3.1.3 TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO ......... 12 3.1.4 TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE ............. 14 3.1.5 TCNICAS EM CULTIVO LQUIDO ...................................... 15 3.1.6 ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO ............................ 16 3.2 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ESPECFICOS ............ 17 3.2.1 ISOLAMENTO DE FUNGOS ................................................. 17 3.2.2 ISOLAMENTO DE BACTRIAS ............................................ 18 3.2.3 ISOLAMENTO DE ALGAS .................................................... 19 3.2.4 ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS .................................. 19 4 NOVOS METODOS ............................................................................ 22 4.1 BASE DOS MTODOS ................................................................ 22 4.1.1 PCR (REAO EM CADEIA DA POLIMERASE) .................. 23 4.1.2 MARCADORES MOLECULARES ......................................... 26 4.2 MTODOS BASEADOS NA HIBRIDIZAO .............................. 26 4.2.1 SOUTHERN BLOT ................................................................ 27

4.2.2 NORTHERN BLOT ................................................................ 27 4.3 MICROARRANJO ........................................................................ 28 4.4 MTODOS BASEADOS EM MARCADORES DE DNA ............... 29 4.4.1 SSCP ..................................................................................... 29 4.4.2 DGGE/TGGE ......................................................................... 30 4.4.3 RFLP ..................................................................................... 31 4.4.4 VNTR ..................................................................................... 31 5 METAGENOMICA .............................................................................. 32 5.1 METAGENMICA X OUTRAS TCNICAS ................................. 33 5.2 A ESTRATGIA DA METAGENMICA ....................................... 35 5.3 VANTAGENS DESVANTAGENS ................................................. 36 REFERNCIAS ..................................................................................... 38 ANEXOS ................................................................................................ 41 ANEXO 1 - Isolation, identification and physiological study of Lactobacillus fermentum LPB for use as probiotic in chickens ..................... 41 ANEXO 2 - Isolation and serological identification of enteropathogenic Escherichia coli in pasteurized milk in Brazil................................................. 47 ANEXO 3 - Isolation, properties and kinetics of growth of a thermophilic Bacillus ..................................................................................... 53

INTRODUO

O crescimento acelerado da populao mundial acentua a preocupao em relao produo e demanda de alimentos, novos medicamentos, fontes alternativas de energia entre outras preocupaes com o bem estar das pessoas, isso sem esquecer-se da conservao do meio ambiente. Neste sentido, a Biotecnologia apresenta grande contribuio, j que permite o desenvolvimento de novas e modernas tcnicas sem agredir tanto o meio ambiente quanto as alternativas oriundas do petrleo, por exemplo. Nestas tcnicas, a utilizao de microorganismos constante e serve aos mais diversos fins, como na fixao de nitrognio, no controle biolgico de pragas, na degradao de resduos no meio ambiente, nas fermentaes, no desenvolvimento de novos medicamentos e tcnicas de diagnstico, entre outros. Assim, a explorao dos recursos naturais, realizada com a aplicao de tcnicas biotecnolgicas que utilizam microorganismos, permite a utilizao de reas consideradas inicialmente inaproveitveis ou o melhoramento de de tcnicas j conhecidas. Isto permite a reduo de custos, alm de contribuir para um menor consumo energtico e para a preservao ambiental. As vantagens apresentadas na aplicao de tcnicas biotecnolgicas que utilizam microorganismos propiciaram o reconhecimento da importncia das colees de culturas de microorganismos ou centros de cepas (que podem fornecer microrganismos de caractersticas j conhecidas), bem como o aumento da demanda desse material por parte de universidades, institutos de pesquisa e empresas.

Muitas vezes, porm, no se consegue o microrganismo ideal em um banco de culturas. Para se fazer uso dos microrganismos, ento, deve-se colet-los, isol-los, testar e medir a sua produo para ento utiliz-los em larga escala (se for o caso). Um grande exemplo do uso de microrganismo est na fermentao, j que ele constitui um dos quatro pilares de um processo fermentativo, ou seja, sua seleo de extrema importncia, pois ele ditar procedimentos e caractersticas que se seguiro at a obteno do produto final. Isolar um microrganismo consiste em obter culturas puras que envolvem somente o organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleo de uma colnia atravs da observao de certas caractersticas como a produo de determinado produto ou mesmo da prpria morfologia da colnia. Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o microrganismo de interesse est presente de forma homognea denominada cultura axnica. Um cultivo desse tipo d oportunidade de investigao de caractersticas fisiolgicas e genticas sem a interferncia de outros microrganismos. Entretanto, muitas vezes um organismo apresenta

determinada atividade ou produo de determinado metablito justamente devido s interaes com o meio em que est inserido. Isolado, esse microrganismo pode apresentar a caracterstica investigada em menor proporo ou mesmo no apresent-la. O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o microrganismo desejado, podendo variar desde solo at guas, ar, lodo, alimentos ou rgos. Caractersticas que um determinado organismo possui

para se desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores seletivos no processo de isolamento. O solo contm uma grande variedade de microrganismos (apenas 1g de solo apresenta de 1 a 10 milhes de espcies de microrganismos), incluindo bactrias, fungos, protozorios, algas e vrus. Apesar desta diversidade, os microrganismos cultivveis predominantes entre a microflora do solo so fungos e bactrias heterotrficas do domnio Bacteria. preciso, contudo, levar em considerao que a flora microbiana presente numa amostra de solo depende de vrias caractersticas do solo particular em estudo (por exemplo, umidade, pH, temperatura, contedo em oxignio gasoso e composio em material orgnico e inorgnico); e que, alguns destes parmetros ambientais podem variar, por exemplo, ao longo do ano ou em funo do tipo de utilizao que dada ao solo (por exemplo, tipo de cultura agrcola, pastoreio, etc.). Estima-se que somente 1 a 9% de microrganismos presentes no solo so capazes de formar colnias em meios de cultura laboratoriais, como o caso dos meios TSA ou PDA. Os outros 91 a 99% da flora bacteriana do solo correspondem principalmente a clulas no cultivveis. O isolamento, assim como todo o processo que ir se desenvolver futuramente, deve ser o mais econmico possvel, levando-se em considerao a produtividade que ser obtida pelo microrganismo e os gastos necessrios para isolamento e manuteno do microrganismo em questo. Fatores importantes na escolha de um microrganismo so: suas caractersticas nutricionais, pois se almeja obter microrganismos que utilizem substratos baratos; a temperatura tima, visando o menor gasto com aquecimento ou; a

compatibilidade com o fermentador utilizado e com o processo de cultivo desejado; e a estabilidade gentica. Pode ser mais barato comprar uma cultura do que isol-la da natureza, mas tambm pode ser que se encontre um organismo muito melhor depois de uma procura extensa no meio ambiente. Entretanto, geralmente necessrio utilizar uma cepa dos bancos como uma referncia para comparao com novos microrganismos descobertos atravs do isolamento da natureza. Em qualquer laboratrio de pesquisa ou de produo que envolva o uso de microrganismos, todas as operaes tcnicas devem ser realizadas em ambientes controlados quanto sua esterilidade. A no-observncia deste requisito pode dar origem a contaminaes por bactrias e fungos, que determinam o descarte do produto, impedindo o cumprimento dos

compromissos de produo assumidos e alterando a relao de custo prevista. Medidas de precauo devem ser tomadas para evitar a contaminao do ambiente onde so processados produtos da complexidade dos

imunobiolgicos. Especial ateno deve ser dispensada ao treinamento do pessoal tcnico que trabalha nessas reas, quanto higiene pessoal e utilizao correta de vestimentas prprias para atividades em reas controladas, por constituir-se no principal veiculador de partculas viveis, sejam esporos fngicos ou bactrias. Tambm importante que a amostra seja identificada com o maior nmero de detalhes (data da coleta, parmetros do ambiente como pH, temperatura, presso, salinidade, entre outros).

A tabela 1 mostra o nmero de espcies de seres vivos atualmente conhecidas e a estimativa das espcies existentes no mundo. Mais adiante sero abordadas novas tecnologias baseadas na biologia molecular que realmente contribuem na descoberta desses novos microrganismos, auxiliando na explorao de toda a diversidade disponvel no planeta.

TABELA 1 - Nmero de espcies de seres vivos atualmente conhecidas e estimativa de espcies existentes no mundo

FONTE: AZEVEDO, 1998.

2 MEIOS DE CULTURA

Os microrganismos tal como outros organismos vivos necessitam de obter os nutrientes apropriados do seu meio ambiente. Para realizar o isolamento de um microrganismo corretamente, portanto, imprescindvel o uso de meio de cultivo adequado, levando em conta pH, aerao, presso osmtica, entre outros fatores. O meio de cultura um material nutriente preparado em laboratrio, lembrando sempre da correta assepsia, cuja utilizao importante tanto para o crescimento quanto para transporte e armazenamento de microrganismos. Nos meios slidos (os que contem gar) o crescimento pra por exausto de nutrientes, devendo realizar-se a transferncia de colnias para novo meio. No entanto estes meios permitem a individualizao das colnias. Os meios lquidos (sem gar) permitem melhor difuso de metablitos, mas no o isolamento de colnias. Os meios de cultivo podem ser: Meios sintticos (quimicamente definidos): so aqueles em que a composio qumica exata conhecida. So utilizados normalmente em trabalhos experimentais em laboratrios ou para o crescimento de seres autotrficos. Meios complexos: so aqueles que apresentam algum componente com composio varivel. Nesse caso esto includos extratos de leveduras, de carne, de plantas ou produtos da digesto protica como peptonas. O meio na forma lquida chamado de caldo nutriente; na forma slida, gar nutriente. 8

A tabela 2 mostra alguns tipos de meio de cultivo existentes e em que ocasies eles devem ser utilizados.

TABELA 2 Meios de cultura Tipo Quimicamente definido Complexo Redutor Finalidade Crescimento de quimioautotrficos e autotrficos e anlises microbiolgicas. Crescimento da maioria dos organismos quimioheterotrficos. Crescimento de anaerbios obrigatrios.

Impedir o crescimento de microrganismos no desejados; favorecer o crescimento do organismo de interesse (meios com telurito de potssio para isolamento de Corynebacterium Seletivo diphtheriae, gar Salmonella-Shigella (SS) e gar MacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella) Diferenciar colnias do organismo de interesse dos outros microrganismos (meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno diferencial para coliformes, gar MacConkey para a Diferencial diferenciao de enterobactrias, gar sangue, agar BairdParker para isolamento e diferenciao de cocos Gram positivos) Semelhante ao seletivo, mas com a caracterstica importante de aumentar o nmero de bactrias de interesse tornando-a Enriquecimento detectvel (Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas, Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens.)
Fonte: Adaptado de TORTORA et al., 2006.

Alm desses, existem meios com funes menos conhecidas, como os meios de triagem (para avaliar determinadas atividades metablicas permite caracterizao e identificao presuntiva de muitos microrganismos), os meios de identificao (para a realizao de provas bioqumicas e verificao de funes fisiolgicas de organismos), os meios de dosagem (determinaes de vitaminas, antibiticos e aminocidos), entre outros.

Alm do que j foi citado existem, ainda, tcnicas de sucesso que combinam a utilizao de diferentes meios para aumentar o numero de isolados ou direcionar o isolamento para uma dada linhagem, por exemplo.

3 ISOLAMENTO

O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o microrganismo desejado. Caractersticas que um determinado organismo possui para se desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores seletivos no processo de isolamento. Depois de recolhida a amostra, a cultura pode necessitar ou no de um pr-tratamento ou enriquecimento do meio sinttico onde a cultura ser feita. O pr-tratamento uma etapa que facilita o isolamento do microrganismo e poder ou no ser seguido de um enriquecimento. Ele aplicado em amostras que no podem ser utilizadas de imediato. O enriquecimento geralmente aplicado em amostras onde se sabe que o nmero de microrganismos de interesse pequeno em comparao com o nmero dos outros que l se encontram. Nesse caso, as condies de cultivo geralmente favorecem o crescimento e multiplicao do microrganismo de interesse. Apenas depois dessa(s) etapa(s) o isolamento, chamado de indireto, poder ser seguido, fazendo-se a caracterizao do microrganismo. Caso no haja necessidade de nenhum dos dois tratamentos, a caracterizao do microrganismo poder ser realizada. Se for necessrio um 10

pr-tratamento, este poder ou no ser seguido de um enriquecimento. Apenas depois dessa etapa o isolamento, dito indireto, poder ser feito seguido da caracterizao do microrganismo.

3.1 MTODOS CLSSICOS

3.1.1 TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS Esse mtodo tambm chamado de esgotamento de ala. Atravs de uma ala de platina, de um fio de platina ou at mesmo um swab, coleta-se uma pequena parcela da colnia crescida no meio e espalha-se sobre uma placa de Petri com gar fazendo movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. importante que a cada mudana de direo no estriamento, uma parte da amostra anterior seja arrastada para o esgotamento, para garantir que a cultura continue no procedimento e que se produza o efeito de diluio. Numa nova seleo, devem ser escolhidas as culturas mais diludas, que tm maior chance de estarem mais isoladas. A figura 1 ilustra a direo das estrias na placa, bem como o efeito de diluio esperado, onde em algumas regies observam-se colnias isoladas.

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FIGURA 1 Semeadura por estrias

FONTE: TORTORA, et al, 2006

3.1.2 TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO Essa tcnica (ilustrada pela figura 2) consiste em despejar um pequeno volume da soluo de microrganismos ( em geral contendo de 30-300 clulas) no centro de uma placa de Petri com gar j solidificado com o auxlio de uma pipeta estril. Em seguida, utiliza-se de uma ala de Drigalski j flambada (de modo a manter a esterilidade) para espalhar aquele volume depositado por toda a superfcie do gar. As colnias crescem espalhadas por toda a superfcie do Agar, por isso essa uma tcnica muito utilizada para purificao de colnias.

3.1.3 TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO O mtodo de semeadura por derramamento, ou tambm conhecido por pour plate muito utilizado para bactrias e fungos, principalmente para contagem de micro-organismos cultivveis na amostra. A amostra original diluda de forma a se otimizar a separao de colnias. Um pequeno volume da melhor diluio (que deve ser previamente testada) ento derramado em uma 12

placa de Petri sem gar. Em seguida, derrama-se gar fundido na temperatura de 45C e mistura-se os dois com uma agitao leve da placa, deixa-se o meio solidificar e incuba-se essa placa. As colnias se desenvolvero tanto acima quanto abaixo da superfcie (colnias internas). Deve-se tomar cuidado com microrganismos sensveis ao calor, pois eles certamente podem ser danificados pelo gar fundido e podem ficar impossibilitados de formar colnias. A figura 2 ilustra um comparativo entre o mtodo do espalhamento e o pour plate.

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FIGURA 2 Comparativo entre a tcnica de semeadura por espalhamento e o pour plate

FONTE: Black, 2002.

3.1.4 TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE Utilizando uma agulha de platina e semeia-se o material contido nela picando um gar slido contido num tubo. Com isso haver o crescimento de microrganismos em anaerbios no fundo e aerbios perto da superfcie do gar. Alm disso, possvel observar caractersticas de mobilidade de microrganismos. A figura 3 ilustra o processo.

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FIGURA 3 Tcnica de semeadura em profundidade

Fonte: Adaptado de DROVAL, LIMA e HABU, 2001

3.1.5 TCNICAS EM CULTIVO LQUIDO Geralmente os meios lquidos proporcionam um grande aumento de determinada populao microbiana. Tambm utilizado quando o

microrganismo inibido pelo meio slido ou no capaz de formar colnia, um exemplo disso so algumas bactrias que no crescem em meio solido devido a sua baixa atividade de gua. Para cultivos lquidos, utiliza-se a tcnica das diluies sucessivas. Toma-se 1g ou 1ml da amostra e dilui-se em 9ml de, geralmente, uma soluo salina 0,85%. Dessa diluio, toma-se novamente 1ml, que diludo novamente em 9ml de soluo, obtendo a diluio correspondente a 10-2, e assim sucessivamente, como mostra a figura 4. Espera-se que em certo momento se obtenha culturas provenientes de somente uma nica clula. dessa forma que feita o isolamento e a contagem de clulas de Escherichia coli em guas ou alimentos, por exemplo, ou para algas, visto que seu habitat natural , em geral, aqutico. Toma-se para isolamento, em geral, as trs ltimas diluies. A tcnica pode ainda ser utilizada como prvia para isolamento em cultivo slido.

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FIGURA 4 Diluies sucessivas

FONTE: Adaptado de PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

3.1.6 ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO Mtodos de isolamento dependendo da capacidade de desenvolvimento de um microrganismo em determinado meio, sendo que para isso ele dever produzir um nmero muito maior de clulas do que em relao aos outros. Cultivo em meio de enriquecimento geralmente feito em Erlenmeyers. No entanto, o crescimento de um determinado organismo oriundo de uma amostra variada na forma de batelada pode resultar numa mudana das condies do meio, e, portanto, ocorre uma variao nas presses seletivas. Isso pode ser reajustado inoculando uma parcela desse meio de

enriquecimento em um novo meio idntico ao inicial. Aps um bom desenvolvimento do microrganismo desejado, semeia-se uma alquota em meio slido.

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A prevalncia do microrganismo desejado com relao aos outros depender da taxa mxima de crescimento dele com relao aos outros organismos capazes de tambm crescer no meio. Portanto, aquele capaz de crescer mais rapidamente com os substratos disponveis ter um nmero maior de clulas. Em um cultivo contnuo, a taxa de crescimento depende da taxa de diluio e da concentrao do substrato limitante. Essa tcnica bastante utilizada na seleo de microrganismos para a produo de biomassa, mas tambm j foi usada para o isolamento de bactrias produtoras de enzimas

3.2 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ESPECFICOS

3.2.1 ISOLAMENTO DE FUNGOS Expor placas de Petri, contendo gar Sabouraud dextrose durante 15 minutos em diferentes locais. Cultivar temperatura ambiente. Aps 4 dias realizar a contagem de colnias crescidas e iniciar a identificao das mesmas. ISOLAMENTO DE FUNGOS DE LQUIDOS Para o isolamento de fungos que utilizam a gua como via de disperso, utiliza-se tcnicas de diluio comuns e semeadura em agar Sabouraud.Para o isolamento de fungos aquticos, as tcnicas so especficas. Semeia-se 1 ml da amostra do lquido em agar Sabouraud. Espalhar com ala de platina e cultivar temperatura ambiente. Aps 4 dias realiza-se a contagem de colnias crescidas e inicia-se a identificao das mesmas. Em 17

alguns casos necessrio proceder diluio da gua e semear pela tcnica de pour plate. ISOLAMENTO Vanbreuseghen) Esta tcnica permite-nos conhecer a biologia dos dermatfitos, seus ciclos evolutivos e sua ocorrncia em determinada regio. Os dermatfitos tm a capacidade de crescer em queratina e, devido a este fato, utilizamos plos e outro material que a contenha como isca para "pescar o dermatfito. Colocar uma quantidade de terra em placa de Petri estril. Espalhar os plos sobre a superfcie da terra. Umedecer com gua estril. Fechar e identificar a placa. Deixar temperatura ambiente, observando-a DE DERMATFITOS DO SOLO (Mtodo de

periodicamente. Aps crescimento de miclio branco penugento ao redor dos plos, examin-los entre lmina e lamnula com uma gota de lactofenol azul algodo. ISOLAMENTO DE FUNGOS DE SUBSTRATOS ALIMENTARES Faz-se uma suspenso do substrato em gua destilada estril (g/ml), uma diluio seriada e semeia-se pela tcnica pour plate em agar batata acidificado. O material ser diludo adequadamente e a semeadura ser realizada na superfcie do gar.

3.2.2 ISOLAMENTO DE BACTRIAS Bactrias existem em grande variedade na natureza, e cada tipo necessita de um meio de isolamento diferente. Algumas necessitam gar 18

suplementado com extratos na concentrao de 10 a 50% do volume total, outras necessitam de infuses feitas do material da onde foram coletadas (solo, lama, folhas, pedras, troncos, detritos). Podem ser usados tambm alguns meios seletivos como gar sangue, verde bile brilhante, MRS, ou McConkey

3.2.3 ISOLAMENTO DE ALGAS Para isolar eficientemente algas, necessrio simular em parte o ambiente onde a amostra foi coletada, como pH, temperatura, salinidade, luminosidade. Mtodos de diluio so bastante indicados nesse caso, uma vez que algas e microalgas so normalmente encontradas em meio lquido. A filtragem de amostras e posterior inoculao do filtro em novo meio estril tambm um mtodo utilizado.

3.2.4 ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS Actinomicetos so bactrias filamentosas que fazem parte da maioria dos substratos naturais. No difcil isolar actinomicetos de amostras que tambm contm fungos devido s suas propriedades fisiolgicas distintas. O uso de antibiticos e antifngicos tambm auxilia no isolamento, como mostra a tabela 3.

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Tabela 3 - Antibiticos usados e microrganismos alvo que so inibidos

Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.

Os actinomicetos geralmente crescem lentamente, e demoram de 4 a 20 dias para formarem colnias definidas quando incubadas temperatura de 6580C . O crescimento desses microrganismos tambm favorecido quando h no meio de cultivo algum dos componentes listados na tabela 4:

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Tabela 4 - Substncias que estimulam o desenvolvimento de actinomicetos em geral e actinomicetos produtores de antibiticos

Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.

Pela tabela 5 percebe-se que a quantidade de actinomicetos obtidos variando a fonte de carbono e nitrognio e o tipo de meio utilizado.

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Tabela 5 - Comparao de meio AGS com meio de chitin e efeito das fontes de carbono e nitrognio no meio*

Fonte: EL-NAKEEB and LECHEVALIER, 1963.

4 NOVOS METODOS

4.1 BASE DOS MTODOS Para a realizao dos mtodos novos de isolamento existem duas ferramentas principais, a PCR e os marcadores moleculares. Ambos sero explicados a seguir.

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4.1.1 PCR (REAO EM CADEIA DA POLIMERASE) A reao em cadeia da polimerase (em ingls, Polymerase Chain Reaction - PCR) um mtodo utilizado para amplificao(criao de mltiplas cpias) rpida de segmentos-alvo especficos de DNA ou cDNA sem o uso de um organismo vivo, a cpia ocorre in vitro. Os produtos de uma PCR sao chamados amplicons. Para a execuo da tcnica da PCR preciso que se tenha conhecimento prvio da sequncia do cido nuclico que se deseja amplificar, dita sequncia alvo. A partir disto, desenham-se dois iniciadores (primers) para dar partida ao processo de sntese em um local especfico.Um primer serve para sintetizar a sequncia alvo no sentido 3- 5e outro para o sentido inverso isto , 5-3. O primer uma pequena sequncia de nucleotdeos que hibridiza no incio da sequncia alvo que se quer amplificar e da qual ele complementar. Ao reconhecer o primer, a polimerase sintetiza uma cpia complementar, obedecendo informao contida na sequncia de DNA que ser replicada (sintetizada). A PCR precisa ainda de deoxinucleosdeos trifosfatados (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) que so quatro componente qumicos diferentes que atuam como se fossem tijolos na construo da molcula de DNA. O primeiro passo para a realizao de um PCR a coleta da amostra biolgica. O segundo passo consiste em extrair o DNA a partir do material coletado. Esta extrao segue um critrio de metodologia bsico, que varia dependendo da amostra utilizada.

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O terceiro passo consiste em preparar a mistura de reao. A mistura de reao contm as substncias necessrias para fazer novas cpias de DNA no processo da PCR. Ento, dentro de um tubo so colocados: a soluo tampo (para manter a mistura de reao no pH e condies inicas ideais para a reao), os deoxinucleotdeos j mencionados, os primers, a Taq Polimerase e o DNA extrado da amostra. O quarto e ultimo passo consiste na reao em si que feita em uma mquina especial, chamada de termociclador, que aquece e resfria o tubo em vrios ciclos consecutivos para amplificar o DNA. A reao no termociclador ocorre em trs etapas que se repetem em ciclo:

Desnaturao do DNA alvo pelo calor (1 minuto a 94-96C), para separar as duas cadeias

Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples (temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequncia a amplificar)

Extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (1 minuto a 72C) O processo pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel

aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente (figura 5).

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FIGURA 5 Esquema da PCR.

FONTE: site e-escola, 2011.

A PCR encontra sua principal aplicao em situaes onde a quantidade de DNA disponvel reduzida. Em teoria, possvel amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicaes da PCR na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaos de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaos de plo ou at mesmo a minscula quantidade de DNA deixada em uma impresso digital) so amplificadas para serem analisadas pelo mtodo de fingerprinting. A PCR tambm rotineiramente utilizado em procedimentos cientficos de biologia molecular como amplificao para gerar mutagnese, deteco de mutaes ou preparao de fragmentos de DNA para clonagem (insero em plasmdeo, por exemplo) como tambm pode ser utilizado para identificao de patgenos que esto presentes em amostras como por a exemplo identificao de agentes como Cndida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vrus do

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papiloma humano e seus gentipos, HBV Vrus da Hepatite B, etc Alm disso, ela tambm utilizada na paleontologia para o sequenciamento gnico de animais prhistricos.

4.1.2 MARCADORES MOLECULARES Os marcadores moleculares constituem regies do genoma possveis de serem detectadas e cuja presena ou ausncia pode caracterizar um organismo cuja seqncia e funo, na maioria das vezes, so desconhecidas (Gostimsky et al., 1999).

4.2 MTODOS BASEADOS NA HIBRIDIZAO A hibridao in situ um mtodo que permite identificar o locus cromossmico onde se localiza uma determinada sequncia de DNA previamente clonada. Este mtodo tem como princpio a complementaridade das bases que reage a organizao de DNA. O DNA de um esfregao metafsico e o DNA de uma sonda so transformados em sequncias monocatenares atravs da desnaturao e posteriormente so postos em contacto em condies de hibridao. Assim a sonda vai hibridar com a sequncia cromossmica onde se localizam as bases complementares. Visto que a sonda previamente marcada (com um fluorocromo), o local de ligao torna-se visvel o que permite identificar especificamente o local do cromossoma onde se localiza o gene ou a sequncia no codificadora em causa. 26

A realizao desta tcnica pode ser feita usando uma nica sonda ou at mesmo vrias sondas, cada uma marcada com um fluorocromo diferente. Esta ltima tcnica chama-se FISH multiplex. Os padres de bandas de um cromossoma so diversos e depende da tcnica usada e do corante.

4.2.1 SOUTHERN BLOT O Southern blot uma tcnica que permite obter informao sobre a massa molecular e a quantidade relativa de uma determinada sequncia de DNA. A tcnica uma combinao de electroforese em gel do DNA (este frequentemente fragmentado por enzimas de restrio antes de fazer o Southern), transferncia deste para uma membrana e hibridizao com uma sonda marcada (radioactiva ou fluorescente). Aps a hibridizao, a membrana lavada para remover sonda no ligada a DNA e obtm-se uma imagem atravs de autoradiografia ou autofluorescncia. A imagem obtida d a localizao do DNA que liga a sonda, com a intensidade do sinal dando uma medida relativa da quantidade de DNA que hibridiza.

4.2.2 NORTHERN BLOT O Northern blot estuda o perfil de expresso de RNA mensageiro, onde, quando e quanto de determinado RNA mensageiro (correspondente expresso de um determinado gene) est presente numa dada amostra. uma das formas mais simples de determinar em que momento certos genes esto a ser expressos em sistemas vivos. Neste processo, o RNA separado numa 27

electroforese em gel, transferido para uma membrana e detectado de forma similar ao DNA no Southern blot.

4.3 MICROARRANJO Microarranjo, uma tcnica experimental da Biologia Molecular que busca medir os nveis de expresso de transcritos em larga escala, ou seja, medindo muitos (em alguns casos todos os) transcritos simultaneamente. Um DNA microarray, ou DNA-chip, consiste num arranjo pr-definido de molculas de DNA (fragmentos de DNA genmico, cDNAs ou

oligonucleotdeos) quimicamente ligadas uma superfcie slida, usualmente lminas de microscpio revestidas com compostos que conferem carga positiva. Os microarrays tambm podem ser preparados em membranas de nylon positivamente carregadas. Os microarrays so utilizados na deteco e quantificao de cidos nucleicos (RNAm na forma de cDNA ou DNA genmico) provenientes de amostras biolgicas, as quais so postas para hibridar com o DNA fixado no array (hibridao por complementariedade de bases). A deteco possvel pois as amostras so "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5) quando utiliza-se microarrays em vidro ou com o istopo 33-P quando os arrays so preparados em membranas de nylon. Para ambos os casos se faz necessrio a gerao de uma imagem de hibridao, que obtida por meio de leitores (scanners) a laser (para os fluorocromos) ou leitores de fsforo (para o istopo 33-P). O uso mais freqente dos microarrays na determinao da expresso gnica (perfil do 28

transcriptoma). A alta performance desta tcnica que pode-se determinar a expresso diferencial de milhares de genes num nico experimento, mas o seu alto custo faz com que ela nao seja, pelo menos ainda, uma tecnica muito utilizada.

4.4 MTODOS BASEADOS EM MARCADORES DE DNA A seguir sero descritos alguns mtodos que utilizam marcadores de DNA como base.

4.4.1 SSCP A SSCP, ou tcnica do polimorfismo de conformao da fita simples do DNA, baseia-se no potencial de formao de estruturas secundrias da fita simples do DNA que era obtido inicialmente, por meio de desnaturao do produto de amplificao antes do incio da eletroforese. Este mtodo utiliza um iniciador contendo o terminal 5 marcado (fosforilado) e durante o PCR, esse iniciador incorporado uma das fitas do DNA, que ao ser submetido a um tratamento como uma exonuclease que reconhece o iniciador fosforilado, a fita marcada digerida preferencialmente. A migrao da fita simples em um gel de poliacrilamida dependente da conformao que ela assume de acordo com sua seqncia de bases durante a eletroforese. Os produtos de amplificao de interesse para a anlise da comunidade microbiana podem ser posteriormente clonados e sequenciados.

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4.4.2 DGGE/TGGE As tcnicas baseadas na eletroforese com gis desnaturantes, como o DGGE (eletroforese em gel com gradiente desnaturante) e TGGE (eletroforese em gel com gradiente de temperatura) esto sendo amplamente utilizadas nos estudos de ecologia microbiana. So tcnicas utilizadas para separar fragmentos de DNA de mesmo tamanho mas com seqncia de nucleotdeos diferentes. Primeiro feita a amplificao do DNA atravs de PCR, onde um dos iniciadores apresenta uma regio rica em G+C (grampo G-C, para impedir a total desnaturao da dupla fita do DNA durante a eletroforese). Os fragmentos obtidos por PCR, de mesmo tamanho, so ento separados de acordo com a sua composio nucleotdica, atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo gradiente desnaturante (uria e formamida) que rompe as pontes de hidrognio entre os nucleotdeos, no caso da DGGE. A seqncia de nucleotdeos determina o momento em que o DNA, inicialmente em fita dupla, passar a adquirir uma estrutura de fita simples, onde as duas fitas simples se mantm ligadas pelo grampo. Nesta condio, a velocidade de migrao no gel extremamente reduzida, ocorrendo a separao de outros fragmentos que apresentam composio nucleotdica diferente. Para a TGGE, ao invs do gradiente qumico desnaturante, utilizada uma cuba especial que promove um gradiente de temperatura.

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4.4.3 RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) uma tcnica em que os organismos podem ser diferenciados pela anlise de padres derivados da clivagem do seu DNA. Se dois organismos diferirem na distncia entre os stios de clivagem de uma endonuclease de restrio, o comprimento dos fragmentos produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima de restrio. Para a deteco de RFLPs, pode ser usada a metodologia de Shouthern Blottin. Aps restrio enzimtica os fragmentos de DNA genmico so sujeitos a electroforese em gel e posteriormente transferidos para um suporte slido de nitrocelulose atravs do arrastamento por capilaridade. Aps hibridizao com sondas radioativas este processo possibilita a identificao, entre milhares de fragmentos de restrio obtidos, de sequncias bem determinadas.

4.4.4 VNTR O VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) uma metodologia que se baseia na existncia de uma sequncia repetitiva especfica ativa em diferentes indivduos de uma populao. Uma repetio em srie (tandem repeat) uma sequncia curta do DNA que repetido na forma de head-to-tail num locus cromossmico especfico. As repeties em srie esto presentes ao longo de todo o genoma humano; sendo que algumas sequncias so encontradas em somente um local (denominado VNTRs) e o nmero de unidades repetidas varia entre

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indivduos. Um VNTR nos seres humanos, por exemplo, uma sequncia de 17 pb do DNA repetida entre 70 e 450 vezes no genoma.

5 METAGENOMICA

Denominada tambm de Genmica Ambiental, Ecogenmica ou Genmica de Comunidades; o termo "metagenmica" foi usado pela primeira vez por Jo Handelsman (University of Wisconsin) em 1998. Metagenoma o nome dado ao genoma coletivo da microbiota total encontrada em um determinado hbitat. Enquanto a metagenmica, em si, a anlise genmica da comunidade de microrganismos de um determinado ambiente por tcnicas independentes de cultivo. Essa abordagem consiste na extrao de DNA diretamente do ambiente e construo de uma biblioteca metagenmica com este genoma misto. Essa estratgia permite o acesso a genes de bactrias incultivveis. Atravs de tcnicas de cultivo puro, como as apresentadas anteriormente, os microrganismos podem ser estudados individualmente. Entretanto essa abordagem limita a avaliao taxonmica, filogentica e a estimativa da diversidade microbiana da biosfera, pois apenas cerca de 1% dos microrganismos so cultivveis em laboratrio pelas tcnicas clssicas de cultivo.

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5.1 METAGENMICA X OUTRAS TCNICAS Tantos os mtodos clssicos quanto a metagenmica partem da coleta da amostra do ambiente. Mas, enquanto a metodologia clssica primeiro cultiva o microorganismo para obter uma cultura pura para depois isolar o DNA, a metagenmica inicia diretamente com esse isolamento. Isso faz com que, a principio, ela esteja apta a isolar 100% da fonte gentica em um ambiente. A figura 6 apresenta em fluxograma das estratgias para deteco, monitoramento e caracterizao da diversidade em amostras ambientais, considerando tanto as tcnicas clssicas quanto as novas.

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FIGURA 6 Estratgias para monitoramento e caracterizao da diversidade em amostras ambientais.

FONTE: PALMIERI, D. A.

Comparando a figura anterior com a figura 7, que mostra as estratgias da metagenmica, percebe-se a simplicidade de sua essncia. claro, sem esquecer a complexidade de cada etapa.

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FIGURA 7 Etapas da metagenmica.

FONTE: SESHADRI, R, 2007

5.2 A ESTRATGIA DA METAGENMICA A metagenmica se d basicamente por trs etapas: 1. Clonagem: consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas. O sistema de clonagem molecular se d a partir da estruturao de um DNA recombinante, que se replicam quando colocado em uma clula

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bacteriana. Na bactria, alm do DNA, existe tambm o plasmdeo, que uma molcula de DNA circular encontrada em bactrias que podem ser utilizadas para levar DNA de um organismo para outro de uma espcie diferente. O plasmdeo retirado da bactria e cortado pela enzima de restrio. Depois, um fragmento do plasmdeo, se une ao outro fragmento de DNA de um organismo diferente, que fica sujeito a outra ao de tal enzima de restrio, a enzima DNA-ligase est comprometida neste processo. Ao final deste processo, resulta-se um plasmdeo com o nome de vetor, que inserido na clula bacteriana para se replicar. 2. Seqenciamento: usado para obter informaes importantes sobre a identificao gentica, variaes e funes gnicas. Feito em equipamentos especiais para isso. Esses equipamentos vem sendo cada vez mais modernizados como o caso do Genome Sequencer FLX System de 2010, que oferece mais de um milho de leituras por corrida e leituras de 400 pares de bases, adequado para seqenciamento de genomas completos,

caracterizao metagenmica de sistemas complexos e mais. 3. Bioinformtica: aps o seqenciamento preciso ter uma ferramenta para analisar as sequncias obtidas, a bioinformtica apresenta softwares que auxiliam nessas analises, principalmente com a existncia das bibliotecas genmicas.

5.3 VANTAGENS DESVANTAGENS O maior problema da tcnica o fato de se ter que lidar com um numero desconhecido de organismos. Nas outras tcnicas o pesquisador tem que se 36

preocupar apenas com um organismo, isso facilita para que ele possa manter o controle de seu experimento. A tabela 6 mostra uma comparao entre as vantagens e desvantagens da metagenmica.

TABELA 6 Vantagens e desvantagens da metagenmica.

FONTE: Daniel, 2005

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REFERNCIAS

Cultura

de

Microrganismos

<http://www.uma.pt/gcosta/docs/

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ANEXOS ANEXO 1 - Isolation, identification and physiological study of Lactobacillus fermentum LPB for use as probiotic in chickens

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ANEXO

Isolation

and

serological

identification

of

enteropathogenic Escherichia coli in pasteurized milk in Brazil

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ANEXO 3 - Isolation, properties and kinetics of growth of a thermophilic Bacillus

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