FARMACEUTSKA HEMIJA VEBE UVOD Lekovita supstanca je hemijski jedinstvena supstanca koja u nauno utvrenim dozama moe da slui

i za leenje ili za odbranu od bolesti. Lekovita supstanca poseduje odreene fiziko-hemijske osobine potrebnu istou odreeni sadraj aktivne materije Lek (farmakon gr., medikamenta lat.) je hemijska supstanca male molekulske mase koja reaguje sa velikim molekulima u organizmu pri emu nastaje bioloki efekat. Lekovi su iste supstance ili smee supstanci koje kada se primene u odgovarajuim koliinama i pod odreenim uslovima slue za spreavanje, uklanjanje, ublaivanje i isceljenje bolesti ili simptoma bolesti i tetnih pojava u ljudskom ili ivotinjskom organizmu. Lekovi u odnosu na poreklo organskog porekla znatno zastupljeniji u terapiji sintetski polusintetski dobijeni izolovanjem iz prirodnih sirovina neorganskog porekla manje zastupljeni prirodne mineralne supstance (ienje: kristalizacija, sublimacija, destilacija, hromatografija) dobijeni sintezom iz istih sirovina ili regeneracijom biotehnoloki lekovi razvojem tehnologije sve vie zastupljeni u terapiji Lekovi u odnosu na primenu lekovi za kauzalnu terapiju primarna terapija, npr. kod bakterijskih ili parazitarnih infekcija pomona terapija, npr. anestetici ergometrin i oxitocin u porodiljstvu lekovi za simptomatsku terapiju antihipertenzivi, antidijabeteci, antiepileptici, antiastmatici, antitusici ili analgetici preventivni (profilaktiki lekovi kontraceptivi kinin u profilaxi malarije... Klasifikacija lekova prema hemijskoj strukturi Sline strukturne osobine esto slino farmakoloko dejstvo -laktamski prsten kod svih penicilina ubijanje bakterija istim mehanizmom sulfonamidi sa antibakterijskim delovanjem imaju isti mehanizam, ali ima sulfonamida koji poseduju antidijabetsko delovanje steroidi imaju zajedniku steroidnu tetraciklinu strukturu ali razliito delovanje

~1~

 prema farmakolokom dejstvu Koristan je za lekare, brzo snalaenje u velikoj paleti lekova. Nije sasvim pogodan za farmeceute jer unutar iste farmakoloke grupe razliiti lekovi deluju razliitim mehanizmima, npr. aspirin i morfin deluju na razliita ciljana mesta i hemijski su nesrodni. analgetici lekovi protiv bolova anestetici lekovi za anesteziju antidijabeteci lekovi za sniavanje nivoa glukoze u krvi diuretici lekovi koji poveavaju diurezu (izluivanje urina) prema delovanju na odreeni biohemijski proces prema delovanju na ciljani molekul Najkorisnija klasifikacija jer omoguava racionalizaciju ukljuenih struktura: npr. antiholinesteraze, lekovi koji inhibiraju delovanje enzima acetilholina imaju isti mehanizam delovanja. U ovoj klasifikaciji lekva mogue je odreditiopte strukturne osobine i uporeivati ih. Otkrie i razvoj novog leka: otkrivanje vodeeg molekula preklinika ispitivanja mehanizam dejstva leka bioraspoloivost apsorpcija, distribucija, metabolizam, eliminacija experimenti sa ivotinjama (razliitim dozama testira se efikasnost i tetnost novog leka) optimizacija procesa sinteze od laboratorijske sinteze do proizvodnje velikih razmera farmakoloke studije (in vitro, ex vivo i in vivo) toxinost i bezbednost leka (karcinogenost, mutagenost, teratogenost...) razvoj doziranog oblika testovi stabilnosti (rok trajanja i nain uvanja leka) klinika ispitivanja testiranja efikasnosti i bezbednosti lekova na ljudima faza 1: na zdravim volonterima, testiranje bezbednosti leka na ljude, farmakokinetika, interakcije lek-lek i lek-hrana) faza 2: na manjem broju pacijenata obolelih od odreene bolesti, farmakodinamika i bezbednost leka faza 3: tokom 3 godine 1000-2000 pacijenata , dokazuje se efikasnost leka na pacijente pre nego to lek registruje FDA faza 4: skupljanje podataka o korisnosti i sporednim efektima leka, dodatne klinike studije odobrenje Idealan lek? efikasan i bezbedan, hemijski i metaboliki stabilan visoka specifinost delovanja, bez sporednih efekata i toxinosti odreene fiziko-hemijske osobine: rastvorljivost da bi mogao da se apsorbuje bez taloenja u GIT-u, lipofilnost da bi mogao da proe kroz bioloke membrane prijatnog mirisa i ukusa, tako da moe da se aplikuje na odgovarajui nain, npr. oralno

~2~

Metode otkrivanja novog leka sluajna otkria (penicilin, aspirin) screening metode (prontozil) testiranja velikog broja molekula hemijske modifikacije molekula (sinteza analoga, cimetidin ranitidin) racionalno dizajniranje leka (kaptopril...)

FARMAKOPEJA Farmakopeja je najvii slubeni akt kojim se odreuju propisi za izradu lekova, potvrdu identiteta, ispitivanja kvaliteta lekova i njihovo doziranje i uvanje. Propisi savremenih farmakopeja, ICH smernice (International Conference on Harmonisation Guidelines), koje u sebi sadre principe GLP, GMP, GCP, helskinke deklaracije SZO, Direktive Evropske Unije, i drugi propisi imaju za cilj da omogue dobijanje, razvoj, proizvodnju i distribuciju bezbednih i efikasnih lekova, to podrazumeva praenje, ispitivanje i kontrolu kvaliteta leka kroz sve faze njegovog razvoja: od sinteze, preklinikih i klinikih ispitivanja do distribucije i ire primene leka u klinikoj praxi. GLP = Good Laboratory Practice GMP = Good Manufacturing Practice GCP = Good Clinical Practice WHO = World Health Organisation Svi faktori koji utiu na kvalitet konanog leka obuhvaeni su farmakopejom. To su: kvalitet polaznih lekovitih supstanci i pomonih lekovitih supstanci za izradu lekova opte procedure i tehnoloki procesi u toku proizvodnje lekova kvalitet materijala za izradu primarne i sekundarne ambalae uslovi uvanja Farmaceutski preparat odnosno farmaceutska sirovina mora da odgovara svim zahtevima ispitivanja koje propisuje farmakopeja u toku celog roka trajanja (upotrebe). O naznaenom roku trajanja bilo kog preparata odluuje ovlaena ustanova na osnovu ogleda koji se pre svega odnose na stabilnost farmaceutskog preparata. U naoj zemlji danas se zvanino koristi prilagoen prevod III Evropske Farmakopeje (Ph.Eur. III) pod nazivom Jugoslovenska Farmakopeja 2000 (Ph.Jug. V). Farmakopeja se sastoji iz dva dela: Knjiga 1 opte napomene metode analize o aparature o fizike i fiziko-hemijske metode o identifikacija o limit testovi o metode kvantitativne analize o bioloki testovi, bioloka odreivanja o metode u farmakognoziji o farmaceutsko-tehnoloki postupci ispitivanja materijali za izradu ambalae i kontejneri reagensi

~3~

 opta poglavlja o metode sterilizacije i mikrobioloka istoa o statistika analiza lekoviti preparati Knjiga 2 i 3 oficinalne monografije i materije medike

MONOGRAFIJE Uputstva i zahtevi dati u monografijama obavezno moraju biti ispunjeni osim ako nije drugaije naglaeno. Opta poglavlja su takoe obavezna kada se na njih poziva odreena monografija ukoliko se u textu jasno ne navode kao informacija ili sugestije. Farmaceutski preparat je farmakopejskog kvaliteta jedino u sluaju kada ispunjava sve zahteve navedene u odgovarajuoj monografiji. Opisna ispitivanja i odreivanja se smatraju oficinalnim metodama na kojima se zasnivaju standardi farmakopeje. Oficinalne monografije farmaceutskih supstanci su uraene po jedinstvenom principu, tj. sadre skoro identian raspored podnaslova koji ne moraju svi biti sadrani u svakoj monografiji. Podnaslovi monografije 1. Naslov monografije je na srpskom jeziku, a podnaslov na latinskom. Umesto prvog naziva koji je na srpskom jeziku koristi se latinski naziv u poglavlju Droge, a kod nekih monografija i sinonim. 2. Definicija sadri sve relevantne podatke koji se odnose na odgovarajuu farmaceutsku supstancu, preparat odnosnopredmet oficinalne monografije. Obavezno navodi pun hemijski naziv farmaceutske supstance. 3. Izrada sadri podatke koji se odnose na pojedine aspekte proizvodnog procesa koji nisu sveobuhvatni ve pretstavljaju sastavni deo instrukcija proizvoau. Farmaceutske supstance se proizvode po principima GMP. 4. Osobine koje se navode su organoleptike, zavise od velikog broja faktora i ne treba ih striktno shvatiti. Ne pretstavljaju zahtev farmakopeje. Od organoleptikih osobina zastupljenih u ranijim farmakopejama Ph.Jug. V ne navodi ukus i miris. Rastvorljivost navedena u poglavlju data je opisnim terminima: opisni termin vrlo lako rastvorljiv lako vrastvorlji umereno rastvorljiv slabo raastvorljiv teko rastvorljiv vrlo teko rastvorljiv gotovo nerastvorljiv priblina zapremina rastvaraa [ml] po 1g rastvorka <1 1 10 10 30 30 100 100 1000 1000 10000 >10000

Termin delimino rastvorljiv se koristi da se opie smea u kojoj se samo jedna od komponenata rastvara. Termin moe da se mea se koristi da se opiu tenosti koje se u svim zapreminskim odnosima meaju u navedenim rastvaraima. 5. Identifikacija ima za cilj da sa odreenim stepenom sigurnosti moe da se potvrdi da uzorak odgovara deklarisanom opisu u definiciji. U odreenim monografijama identifikacija je podeljena na prvu i drugu identifikaciju.

~4~

 Prva identifikacija je: IR spektroskopija (uvek) temperatura topljenja (vrlo esto) UV spektrofotometrija pH rastvora optika rotacija.... Druga identifikacija je: bojene i talone reakcije temperatura topljenja TLC UV spektrofotometrija... 6. Ispitivanje stepena istoe 7. Odreivanje 8. uvanje 9. Oznaavanje 10. Upozorenje 11. Neistoe 12. Kritine fizike osobine 13. Referentne supstance, preparati i spektri

FIZIKO HEMIJSKE OSOBINE SUPSTANCI 1. RASTVORLJIVOST SUPSTANCE Rastvori su homogene smee supstanci koje imaju isti sastav u svakom delu svoje zapremine. Uobiajeno je da se jedna komponenta rastvora naziva rastvara, a druga rastvorak ili rastvorna supstanca. Rastvaranje supstanci (vrstih, tenih ili gasovitih) u tenim rastvaraima predstavlja dispergovanje jona ili molekula meu molekule rastvaraa, to podrazumeva da moraju biti savladane meujonske ili meumolekulske privlane sile izmeu jona ili molekula supstance, kao i privlane sile izmeu molekula rastvaraa. Uzajamnim delovanjem jona ili molekula rastvorne supstance sa molekulima rastvaraa dobija se odreena energija, i ukoliko je ona dovoljna, supstanca e se rastvoriti. Razlika izmeu potrebne energije i energije koja se pri rastvaranju dobija odreuje rastvorljivost jedinjenja. Rastvorljivost supstance zavisi i od karakteristika vrstog stanja (kristalni oblik, veliina kristala...). Rastvarai mogu biti polarni i nepolarni, a supstance koje se rastvaraju elektroliti (jonska i polarna kovalentna jedinjenja) i neelektroliti. Elektroliti pri rastvaranju disosuju na jone, dok se molekuli neelektrolita pri rastvaranju samo meusobno razdvajaju, ali ne disosuju. Elektroliti se dobro rastvaraju u polarnim rastvaraima, a neelektroliti u nepolarnim rastvaraima (slino se u slinom rastvara), mada i ovo pravilo ima izuzetaka. Polarni rastvarai molekuli polarnih rastvaraa imaju pozitivan i negativan pol i grade tzv. dipol. U ove rastvarae spadaju voda, alkohol, teni amonijak... Najznaajniji i najpolarniji rastvara je voda zbog svoje visoke polarnosti, sposobnosti graenja vodonine veze i donorskih osobina, kao i zbog mogunosti graenja koordinacionih veza sa nizom metalnih jona. Rastvorljivost organskih jedinjenja u vodi se poveava sa poveanjem broja polarnih grupa (-OH, -COOH, NH2...) u molekulu, a opada sa porastom sadraja ugljenika.

~5~

Nepolarni rastvarai centri pozitivnog i negativnog naboja se podudaraju, npr. benzen, n-pentan, n-hexan, ugljendisulfid... S obzirom da nepolarni rastvara ne utie na velike elektrostatike sile izmeu jona u kristalnoj reetki, jonska jedinjenja se u takvim rastvaraima ne rastvaraju.

2. pH VREDNOST Disocijacija vode pH vrednost je definisana kao log[H+], gde je [H+] koncentracija vodonikovih jona u rastvoru. U istoj void je ta koncentracija odreena ravnoteom: H2O OH- + H+ Konstanta ravnotee moe da se prikae jednainom: Kw = [H+][OH-] / [H2O] Kw = [H+][OH-] Experimentalno je utvreno das u koncentracije hidronijum i hidroxidnih jona jednake u destilovanoj vodi I da na 25oC iznose: [H3O+] = [OH-] = 10-7 mol/dm3 pH = -log[H3O+] mol/dm3 Iz ega sledi da je sredina neutralna, a pH=7. Vodeni rastvor u kojem je pH<7 reagovae kiselo, a kada je pH>7 bazno. Analogno izraavanju pH, koncentracija hidroxidnih jona se izraava jednainom: pOH = -log[OH-] mol/dm3 pH + pOH = pKw = 14

Kiseline i baze Prema protolitikoj teoriji kiseline su supstance koje otputaju protone (donori protona), a baze su supstance koje primaju protone (akceptori protona). Koja e se od prisutnih supstanci ponaati kao kiselina, a koja kao baza zavisi od afiniteta prema proton. Supstanca sa veim afinitetom (nukleofilna) ponaae se kao baza, a ona sa manjim afinitetom, koja otputa proton, kao kiselina. Stoga, klasifikacija jedinjenja nije jednoznana, tj. u zavisnosti od sredine supstanca se moe ponaati i kao kiselina i kao baza. Jake kiseline i baze su potpuno disosovane. Slabe kiseline su u vodenom rastvoru u ravnotei sa nedisosovanim oblikom: HA H+ + AKa = [H+][A-]/[HA] pKa = -logKa Bazna konstanta je obrnuto proporcionalna kiselinskoj konstanati Ka konjugovane kiseline: Kb = Kw/Ka pKb = pKw - pKa pKa vrednost molekula Veina supstanci koje se koriste u medicini su slabe kiseline i baze. Vano je zapamtiti da pKa ne daje nikakve informacije da li je supstanca kisela ili bazna. To je negativan logaritam od konstante disocijacije za razliku od pH vrednosti koja direktno govori o koncentraciji H+ jona. Jedino razumevanje hemijske strukture i uticaja funkcionalnih grupa moe pomoi u korektnom predvianju kisele ili bazne bazne prirode nekog molekula. Jonizacija leka Jonizacija leka je veoma vana sa stanovita apsorpcije i distribucije u razliita tkiva tela. Kada je slabo kiseo ili bazan, lek e jonizovati u manjoj ili veoj koliini u zavisnosti od vrednosti njegove pK i pH telesne tenosti u kojoj se rastvara. pH u telu iroko varira, ali najznaijniji bioloki rastvor je krv koja ima pH vrednost 7,4. Iz prethodnih jednaina: HA H+ + AA- - jonizovana frakcija leka Ka = [H+][A-]/[HA] pKa = pH log([A]/[HA]) pH = pKa + log ([A]/[HA])

~6~

Nakon izvoenja sledi za slabo kiseo lek: slabo bazan lek:

jonizovano % = 100 / [1 + antilog (pKa pH)] jonizovano % = 100 / [1 + antilog (pH pKa)]

3. TEMPERATURA TOPLJENJA Tt Temperatura topljenja supst nce je ona temperatura na kojoj su vrsta supstanca i njen rastop u ravnotei. Predstavlja fiziku konstantnu karakteristiku za svaku supstancu. Odreivanje Tt predstavlja jednostavnu metodu za utvrivanje identiteta supstanci, kao i za proveru stepena istoe. iste supstance imaju uzan interval Tt. Oneienja, ak i u neznatnim koliinama, dovode do proirivanja intervala topljenja i snienja Tt, ak i u sluaju primesa sa viom takom topljenja. Izmeu Tt i molekulske strukture supstance postoji veza, npr. kod stereoizomernih oblika se trans izomer obino topi na vioj temperaturi od cis oblika. Tt se poviava sa stepenom asocijacije molekula, npr. estri kod kojih nema vodoninih veza sa tope na mnogo nioj temperaturi od odgovarajuih karboxilnih kiselina. Mnoge organske supstance se ne tope ve se raspadaju (supstanca se najee oboji i razvije se gas). Temperatura raspadanja nije tano definisana i zavisi od brzine zagrevanja. Neke supstance nemaju karakteristinu preobraajnu taku i ugljeniu pri jaem zagrevanju. Ph.Jug. V propisuje odreivanje Tt na tri naina: metodom kapilare metodom otvorene kapilare metodom trenutnog topljenja 4. POLARIMETRIJA Stereohemija neke supstance odreuje njen prostorni raspored, tj. geometriju. Farmakoloka aktivnost leka u velikoj meri zavisi od njegove stereohemije, tj. njegovog specifinog polaaja u prostoru. Optiki izomeri supstance mogu imati veoma razliite farmakoloke efekte. Postoje tri tipa izomerije: geometrijska izomerija cis (Z) i trans (E) oblici optika izomerija diastereoizomerija Optika izomerija je veoma rasprostranjena kod farmaceutskih proizvoda. Optiki aktivne ili hiralne supstance su one koje poseduju hiralni centar. Hiralni molekul sadri ugljenikov atom za koji su vezana 4 razliita supstituenta. Takav C atom se zove asimetrini atom ili stereocentar. Molekuli sa jednim asimetrinim atomom su uvek hiralni. Da bi molekul bio hiralan ne sme imati ravan simetrije. Adrenalin enantiomeri R i S imaju identine fizike i hemijske osobine, obru ravan polarizovane svetlosti u suprotnom smeru, (-) enantiomer ima jai bioloki efekat kao kardiostimulator. Enantiomeri su parovi molekula koji se odnose kao predmet i njegov lik u ogledalu i ne mogu se poklopiti jedan sa drugim. Veina fizikih osobina enantiomera je identina, ali ukoliko se planarno polarizovana svetlost propusti kroz uzorak, enantiomere je mogue razlikovati na osnovurotacije ravni polarizovane svetlosti. Enantiomeri rotiraju planarno polarizovanu svetlost za istu vrednost ali u suprotnim smerovima. Enantiomer koji rotira ravn svetlosti u smeru kazaljke na satu je desnogiri, a jedinjenje se obeleava (+) enantiomer, dok je enantiomer koji rotira u suprotnom smeru levogiri i

~7~

oznaava se kao (-) enantiomer. Zbog ove interakcije sa svetlou enantiomeri se nazivaju i optiki izomeri, a pojava je optika aktivnodt. Smea jednakih odnosa enantiomera je optiki neaktivna i zove se racemska smea ili racemat. Ispitivanje optiki aktivnih jedinjenja Optiki aktivne supstance imaju osobinu da obru ravan polarizovane svetlosti za odreen ugao. Specifina rotacija optiki aktivnog molekula je fizika konstanta karakteristina za taj molekul, kao to su i Tk, Tt, n, ... Optika rotacija se odreuje polarimetrom koji mora obezbediti oitavanje sa tanou do 0,01o . Skala se obino badari korienjem sertifikacionih kvarcnih ploa, a njema linearnost se proverava standardnim rastvorom saharoze. Izmerena optika rotacija uzorka (u stepenima) zavisi od strukture optiki aktivnog jedinjenja, koncentracije, vrste rastvaraa, duine polarimetarske cevi, talasne duine svetlosti i temperature. Ugao optike rotacije tenosti je ugao rotacije , izraen u stepenima [o], za koji tenost obrne ravan polarizacije polarizovanog svetlosnog zraka D-linije natrijumovog spektra ( = 589,3 nm), pri njegovom prolasku kroz sloj debljine od 1dm, na 20oC. Postupak pripreme je propisan u monografiji. Specifina optika rotacija []20D ratvorene supstance je ugao rotacije , izraen u stepenima [o], za koji rastvor koji sadri 1 g/ml date supstance, obre ravan polarizovane svetlosti talasne duine D-linije natrijumovog spekra izmeren na 20oC, izraunatog za sloj debljine 1 dm. Specifina optika rotcija vrstih supstanci se uvek izraava u odnosu na dati rastvara i koncentraciju. za tenosti: []20D = l20 za vrste supstance: []20D = 1000 / lc ugao rotacije u stepenima na 200,5oC l duina polarimetrijske cevi u dm 20 gustina na 20oC u g/cm3 (za potrebe farmakopeje gustina se zamenjuje relativnom gustinom) c koncentracija supstance u g/l U odreenim sliuajevima, navedenim u monografiji, ugao se moe izmeriti i na drugim temperaturama, osim na 20oC, kao i na drugim talasnim duinama. 5. INDEX REFRAKCIJE Index refrakcije (nt ) nekog medijuma u odnosu na vazduh jednak je odnosu sinusa ugla upadnog zraka svetlosti i sinusa ugla prelomljenog zraka u datom medijumu. Predstavlja fiziku konstantu, karakteristinu za pojedine farmaceutske supstance. Postoje apsolutni i relativni index refrakcije. Apsolutni index refrakcije (n) predstavlja odnos brzine prostiranja svetlosnog zraka u vakuumu (c) i medijumu (v). Relativni index refrakcije (n1,2) predstavlja odnos brzine prostiranja svetlosnog zraka u medijumu 1 (najee vazduhu) i medijumu 2. n = c/v n1,2 = sin / sin upadni ugao svetlosnog zraka u odnosu na normalu na graninu povrinu prelomni ugao svetlosnog zraka u odnosu na normalu na graninu povrinu Ukoliko nije drugaije propisano, index refrakcije se meri na 200,5oC, proputanjem D-linije Na spektra ( = 589,3 nm), a oznaava se sa n20D. Priprema Abbe-ovog refraktometra Odvrnuti zavrtanj koji spaja prizme i podii gornju prizmu. Vatom natopljenom etanolom obrisati obe prizme. Saekati da se prizme osue isparavanjem etanola. Pasterovom pipetom naneti analiziranu tenost na celu povrinu prizme, ne dodirujui prizmu da se ne bi otetila. Gornju prizmu spustitina donju i prvrstiti zavrtnjem.

~8~

 Merenje indexa refrakcije Gornjim zavrtnjem na desnoj strani aparata izotriti granicu tamno-svetlo u gornjem delu vidnog polja. Donjim zavrtnjem podesiti granicu to je mogue preciznije na presek konanica (dveju unakrsnih crnih linija). Index refrakcije se oitava u donjem delu vidnog polja sa tanou do 10-4. Napomena: Postupak pripreme aparata i merenja ponoviti za svaki ispitivani rastvor

HROMATOGRAFIJA UVOD Hromatografija je separaciona analitika metoda koja obuhvata veliki broj tehnika. Za otkrie ove analitike metode zaduen je botaniar Cvet koji je 1903. razdvojio biljne pigmente lia i ovaj proces nazvao hromatografija. Cvet je pretpostavio da boja zelenog lia nije jednostavna materija, te je pokuao da je razdvoji na jednostavne komponente na osnovu razlike u adsorpciji na stubu CaCO3 u staklenoj cevi. Naknadnim proputanjem istog rastvaraa kroz kolonu, dobijeni prstenovi su se meusobno razdvajali da bi se smea razdvojila u niz utih i zelenih zona. Otud i potie naziv ove metode: shroma boja i grafeien pisati. Hromatografija se danas koristi za razdvajanje, identifikaciju, preiavanje i izdvajanje komponenti iz smee. PRINCIP HROMATOGRAFIJE Hromatografija se zasniva na migraciji analita kroz stacionarnu fazu (najee silikagel), pod uticajem mobilne faze (smea organskih rastvaraa) koju pokreu kapilarne sile. Preena razdaljina analita je odreena njegovim relativnim afinitetom prema mobilnoj tj. stacionarnoj fazi. Uzorak nanet na jedan kraj stacionarne faze se kontinualno ispira sveom mobilnom fazom. U zavisnosti od vrste i stepena interakcija komponenata uzoraka sa mobilnom fazom, dolazi do njihovog razliitog zadravanja na stacionarnoj fazi. Prema fiziko-hemijskim procesima koji se odigravaju na dodirnoj povrini dveju faza, hromatografija se moe podeliti na: adsorpciou hromatografiju razdvajanje se vri naosnovu razliite adsorpcione sposobnosti komponenata deobnu (podeonu) hromatografiju razdvajanje se vri na osnovu razliite raspodele komponenata izmeu stacionarne i mobilne faze (2 tene faze) hromatografiju pomou jonskih izmenjivaa gel-hromatografiju stacionarnu fazu ini porozni polimer ije su pore dostupne samo odreenim molekulima (efekat sita) Na razdvajanje komponenata iz smee najee utiu kombinovani procesi adsorpcione i podeone hromatografije.

HROMATOGRAFSKE METODE Razvitak hromatografije je doveo do formiranja razliitih tehnika. Danas su poznate sledee hromatografske tehnike: hromatografija na stubu (jonoizmenjivaka hromatografija) hromatografija na papiru hromatografija na tankom sloju (TLC Thin Layer Chromatogrphy) gasna hromatografija (GC) visokoefikasna tena hromatografija (HPLC High Performance Liquid Chromatography) Kapilarna elektroforeza (CE)

~9~

HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU Hromatografija na tankom sloju je separaciona tehnika, u kojoj se stacionarna faza koju ini pogodni materijal, nanosi u ujednaenom tankom sloju i fixira na podlogu (ploa ili folija) od stakla, metala ili plastike. Razdvajanje se vri migracijom rastvorene supstance u rastvarau ili pogodnoj smei rastvaraa (mobilna faza) kroz tanak sloj. Metoda tankoslojne hromatografije se veoma esto koristi za kvalitativnu i kvantitativnu analizu aktivnih supstanci, ispitivanje stabilnosti, stepena istoe, kao i u preparativne svrhe. Prednosti ove tehnike, kao to su jednostavnost izvoenja, brzina razdvajanja i mogunost ispitivanja vie uzoraka istovremeno, ine je vrlo ekonominom i jednom od esto korienih metoda u analitikim laboratorijama. Meutim, osetljivost i rezolucija ove metode su manje u odnosu na druge hromatografske metode. Takoe je nepogodna za lako isparljiva jedinjenja, a i ljudski faktor u velikoj meri utie na uspenost. Za razdvajanje supstanci na tankom sloju od znaaja su: jonske sile po svojoj prirodi su elektrostatike i dolaze do izraaja na kiselim ili alkalnim adsorbensima i na adsorbensima impregniranim solima. koordinativne sile nastaju izmeu visokoaktivnih tankih slojeva koji sadre atome Al, Si, Ca, Mg, Fe i pojedinih funkcionalnih grupa jedinjenja koja se razdvajaju. sposobnost graenja komplexa imaju adsorbensi koji na povrini estica sadre atome sa nepopunjenom elektronskom strukturom (Al2O3, FeO, Mg(OH)2, CaSO4) i jedinjenja koja su po strukturi ili aminoalkoholi, hidroxialdehidi i oxikiseline asocijacija dipola ove sile dolaze do izraaja izmeu adsorbensa impregniranog polarnim rastvaraem i jedinjenja sa dipolnim momentom (alkoholi, ketoni, halogenovana jedinjenja) vodonine sile intermolekulske vodonine veze izmeu jedinjenja sa aktivnim vodonikom i funkcionalnih grupa sa slobodnim elektronskim parom su veoma znaajne za hromatograafiju natankom sloju. Prema sposobnosti graenja vodonine veze sva jedinjenja se mogu podeliti na: donore vodonika akceptore vodonika donore i akceptore vodonika u zavisnosti od uslova (alkoholi, fenoli, imidi...) jedinjenja koja grade intermolekulske vodonine veze jedinjenja bez sposobnosti graenja vodonine veze disperzione sile (Van der Waals-ove sile) znaajne su za razdvajanje u najslabije su po svom intenzitetu. Ovoj grupi pripadaju 3 vrste nejonskih, meumolekulskih, slabih sila koje se razlikuju po tipu interakcije: dipol dipol dipol indukovani dipol indukovani dipol indukovani dipol

~ 10 ~

Kod TLC metode, kao i kod svake druge hromatografske metode, prisutne su 3 komponente: stacionarna faza, ispitivani uzorak i mobilna faza. Polarnost stacionarne faze odreuje vrstu TLC. Ako je mobilna faza manje poalrna od stacionarne faze to je TLC sistem normalnih faza i obeleava se sa NP-TLC. Ako je mobilna faza polarnija od stacionarne faze, onda je to hromatografski sistem reversnih faza i obeleava se kao RP-TLC.

STACIONARNA FAZA Stacionarnu fazu u TLC predstavljaju razni adsorbensi (nosai), koji su naneti u obliku tankog sloja na ploe (staklene ili plastine), ili na folije (Al ili plastine). Veina laboratorija danas koristi gotove ploe na koje je ve naneen sloj adsorbensa. Debljina sloja adsorbensa varira od 0,1 do 0,3 mm. Adsorbensima se esto dodaju vezivna sredstva, npr. gips, skrob ili soli poliakrilnih kiselina u koliini od 0,1 do 10 % (w/w) ime se poveava vrstina sloja i obezbeuje bolje vezivanje za plouDodatak malih koliina UV-andikatora omoguava vizuelno otkrivanje jedinjenja na hromatogramu. Strukturu adsorbensa sainjavaju mikroestice uglavnom sferinog ili nekog drugog, modifikovanog oblika. Osnovne fizike karakteristike koje definiu sloj su specifina povrina adsorbensa (m2/g) i zapremina pora adsorbensa.Specifina povrina adsorbensa je funkcija veliine estica ako su dimenzije estica manje, sloj adsorbensa je homogeniji, putovanje mobilne faze je sporije i postie se bolje razdvajanje komponenata. Najei neorganski adsorbensi koji se koriste u tankoslojnoj hromatografiji su: silikagel je hemijski delimino dehidratisana silicijumova kiselina (SiO2*H2O) i izuzetno je polaran adsorbens. Polarnost silikagela se objanjava prisustvom hidroxilnih grupa (silanolnih), koje se nalaze na njegovoj povrini. Postoji vie vrsta silikagela: H bez vezivnnog sredstva HF245 sadri oko 1,5 % fluorescentnog indikatora koji ima optimalni intenzitet na 245 nm G sadri 13 % kalcijumsulfata hemihidrata GF245 sadri 13 % kalcijumsulfata hemihidrata i oko 1,5 % fluorescentnog indikatora DS sadri 5 % gipsa aluminijum-oxid je drugi najee primenjivani adsorbens. Joni kiseonika i aluminijuma na povrini obrazuju jako elektrostatiko polje koje je odgovorno za mehanizam adsorpcije. U poreenju sa silikagelom, aluminijum-oxid je manje polaran i razdvajanje smee due traje. Moe se koristiti za razdvajanje alkaloida, steroida i eera. keiselguhr dobija se od prirodne dijatomejske zemlje. Po hemijskoj strukturi predstavlja oneien silicijum-dioxid (90%) jer sadri Al, Fe i druge metalne oxide. Manje je aktivan od silikagela. prirodna ili mikrokristalna celuloza esto se koristi kao adsorbens za razdvajanje vrlo polarnih jedinjenja (ugljeni hidrati, karboxilne kiseline, aminokiseline, fosfati...). Celulozu ine polisaharidi opte formule (C6H10O5)n u obliku duih (prirodna) ili kraih vlakana (mikrokristalna). Razdvajanje komponenata se postie na osnovu njihovog razliitog particionog mehanizma.

~ 11 ~

RAZDVAJANJE IZOMERA Metoda tankoslojne hromatografije moe se koristiti i za razdvajanje enantiomera, ali je osnovni nedostatak ove metode mali broj raspoloivih hiralnih stacionarnih faza. Enantioseparacija se moe postii impregniranjem sloja silikagela nekim hiralnim agensima (npr. (+)-vinska kis. ili (+)-askorbinska kis.), dodavanjem hiralnih aditiva mobilnoj fazi ili korienjem gotovih reversno-faznih ploa koje su mpregnirane bakar-acetatom ili nekim hiralnim selektorom (prolin).

HPTLC Savremeni tehnoloki postupci dobijanja tankih slojeva doveli su do razvoja visoko efikasne tankoslojne hromatografije (High Performance Thin Layer Chromatography) koja u odnosu na konvencionalnu TLC ima niz prednosti: smanjuje prenik polazne mrlje smanjena je zapremina uzorka koji se nanosi poveana je efikasnost i osetljivost metode

MOBILNA FAZA Mobilnu fazu ini smea dva, tri ili vie rastvaraa pomeanih u razliitim zapreminskim odnosima. Mobilna faza se pomou kapilarnih sila ascedentno kree preko stacionarne faze na ogranienom prostoru od starta do fronta. Mobilna faza ne sme da reaguje sa supstancama koje se razdvajaju to manje da je toxina viekomponentna mobilna faza mora biti homogena rastvarai moraju biti isti, lako isparljivi i to jeftiniji Rastua polarnost (eluotropni niz) hexan < heptan < ciklohexan < ugljenohorid < benzen < hloroform < etar < < etilacetat < piridin < aceton < etanol < metanol < voda Hemijske i fizike osobine supstanci koje se razdvajaju diktiraju izbor mobilne i stacionarne faze. Pre svega, treba razmatrati polarnost i rastvorljivost supstanci, zatim mogunost graenja vodoninih veza sa adsorbensom, pKa vrednost... Na izbor mobilne faze utiu i hemijske osobine. Ako se kao mobilna faza koristi smea rastvaraa razliite polarnosti, polarniji rastvara se vezuje za adsorbens, imregnira ga i na hromatogramu se javlja tzv. drugi front, esto teko uoljiv. Ova polava se naziva demixija (autohromatografisanje rastvaraa), a moe se izbei posavljanje trake filter papira niz zid kade za hromatografiju da bi se obezbedilo ravnomerno zasienje kada parama rastvaraa.

TEHNIKE RAZDVAJANJA Linearno kada se uzorak nanosi du jedne ivice ploe (kao mrlja ili traka) a mobilna faza putuje od te ivice ka suprotnoj. Kruno cirkulaciono ako je poloaj ispitivanog uzorka u cenru ploe a mobilna faza putuje od centra ka periferiji ploe. Anticirkularno uzorak se nanosi na periferiji spoljnog kruga i razvija prema centru ploe. U kontinualnom razvijanju mobilna faza putuje kroz sloj sve dok ne postigne jednu, unapred odreenu poziciju na ploi. Tehnika viestrukog razdvajanja se koristi za razdvajanje smee irokog opsega polarnosti koju nije mogue razdvojiti

~ 12 ~

korienjem jedne mobilne faze. U jednodimenzionalnom viestukom razvijanju, hromatogram se razvija do odreenog rastojanja, ploa se izvadi iz kade za hromatografiju, mobilna faza otpari i proces razvijanja se ponovi. U svakom ponovljenom procesu razvijanja moe se promeniti duina razvijanja hromatograma, vreme razvijanja hromatograma, sastav mobilne faze, a proces se moe ponavljati sve dok se ne postigne zadovoljavajua razdvajanje. U dvodimenzionalnoj hromatografiji uzorak se nanosi na jedan kraj ploe, hromatogram razvija du jedne ivice, ploa se nakon otparavanja mobilne faze vrati u kadu pod uglom od 90o u odnosu na smer prvog razdvajanja.

DETEKCIJA ZONA NA HROMATOGRAMU Sve metode za detekciju hromatograma mogu se podeliti na: optike metode sastoje se u posmatranju hromatograma na obinoj (vidljivoj) svetlosti ili pod Uvsvetlosti. Obojena jedinjenja (biljni pigmenti su vidljivi na hromatogramu i na obinoj svetlosti. Jedinjenja koja apsorbuju svetlost u UV oblasti uoavaju se kao tamne mrlje na 254 nm, pod UV-lampom. Jedinjenja koja imaju nativnu fluorescenciju razdvajaju se na adsorbensima bez fluorescentnog indikatora i otkrivaju se pod UV-lampom na 366 nm. Optike metode detekcije zona koriste se u kvantitativnoj analizi. hemijske metode izvode se na reagensima koji sa supstancama daju bojene ili talone reakcije. Ovakav nain otkrivanja poloaja mrlja na hromatogramu dovodi do hemijskih promena ili degradacije jedinjenja te se ne mogu koristiti u preparativnoj hromatografiji (npr. detekcija mrlja kofeina parama joda ili barbitona prskanjem sa HgNO3) bioloke metode podrazumevaju da jedinjenja poseduju specifine fizioloke ili mikrobioloke efekte (saponini i antibiotici) Izazivanje hromatograma detekcija Izazivanje hromatograma pomou rastvora hromogenih reagenasa ili sumporne kiseline se izvodi (obavezno u digestoru) nanoenjem ovih rastvora pomou rasprivaa (staklena prskalica). Izazivanje boje nakon prskanja hromatograma se najee postie zagrevanjem isprskane ploe na temperaturi koja zavisi od vrste primenjenog reagensa.

RETENCIONE VREDNOSTI Poloaj mrlja supstanci na hromatogramu se karakterie Rf vrednou (ratio of fronts). Rf vrednost je odnos duine puta koji je prela supstanca i duine puta koji je prela mobilna faza na adsorbensu. U sluaju linearnog razvijanja hromatograma, Rf vrednost je definisana izrazom AC / AB = Rf AC rastojanje od startne linije do centra mrlje AB rastojanje koje pree rastvara od startne linije do njegovog fronta esto se Rf rednost izraava koa hRf vrednost (Rf * 100) Rf je neimenovan broj koji ima vrednost od 0 do 1. Kada je Rf = 1 uzorak putuje sve do fronta mobilne faze. Iako se Rf vrednost esto koristi za identifikaciju supstanci, postoje izvesne potekoe u tanom odreivanju ove vrednosti, pre svega zbog nemogunosti da se tano odredi poloaj fronta mobilne faze. Osim toga, kretanje supstance na adsorbensu odvija se samo dok je ploa u mobilnoj fazi, pa je Rf vrednost srazmerna vremenu razvijanja hromatograma. Ukoliko je vreme zadravanja supstance u mobilnoj fazi due, migracija zona e biti vea, a prema tome i Rf vrednost.

~ 13 ~

Jedinjenja se mogu identifikovati poreenjem experimentalne vrednosti sa tabelarnom Rf vrednosti. Pouzdaniji nain odreivanja Rf vrednosti je odreivanje relativne Rf vrednosti (rRf): rRf = preeni put ispitivane supstance / preeni put standarda Rf vrednost na datom adsorbensu i na datoj mobilnoj fazi zavisi od naina rada, kvaliteta i aktivnosti adsorbensa, debljine sloja, koliine nanetog uzorka, poloaja starta i duine putovanja mobilne faze. Da bi Rf vrednost bila konstantna, potrebno je standardizovati uslove odreivanja i odravati temperaturu u intervalu 20 25oC.

IZVOENJE TLC Primena tankog sloja nosaa Tanak sloj nosaa (npr. silikagel) najee se nanosi na staklene ploe dimenzija 5*10; 10*20; 20*20 cm, kao i na ploice manjih dimenzija (2,5*7,5 cm). Staklene ploe se prvo peru etkom pod mlazom vode, ostave u hromosumpornoj kiselini (3-4h), a zatim se dobro isperu vodom, destilovanom vodom i osue. Ako se ne koriste odmah, moraju se zatititi od praine i drugih zagaivaa, naroito organskih jedinjenja. Najee se uvaju u exikatoru. Priprema tankog sloja silikagela Nanoenje tankog sloja silikagela na staklene ploice dimenzija 2,5*7,5 cm se izvodi na sledei nain: silikage (8 g) se prenese u erlenmajer sa lifovanim zatvaraem od 100 ml, doda se destilovana voda (20 ml) i sadraj erlenmajera se kratkotrajno intenzivno promea. Dobijena suspenzija sa nanese na 16 ploica postavljenih na jednu plou dimenzija 20*20 cm, na koju je prethodno naneen tanak sloj vode. Nakon suenja sloja silikagela na vazduhu i aktiviranja (105oC, 15 min), ploice se uvaju u exikatoru do momenta upotrebe. Silikagel za tankoslojnu hromatografiju (30 g) se prenese u erlenmajer od 250 ml sa bruenim zatvaraem, doda se destilovana voda (60 ml) i sadraj erlenmajer intenzivno izmea (30 sec). Dobijena suspenzija se nanese na pet ploa dimenzija 20*20 cm (debljina sloja 0,25 mm). Nakon suenja na vazduhu na sobnoj temperaturi tokom 2 h, ploe se aktiviraju zagrevanjem u sunici na temperaturi od 120oC tokom 30 min. Pripremljene ploe sa slojem silikagela se uvaju u exikatoru do momenta upotrebe. Nanoenje uzorka Uzorci (supstsnca ili smea supstanci) odreene koncentracije u pogodnom raastvarau se nanose pomou mikropipete, prica ili staklene kapilare u vidu take (prenika 2-3 mm). Nanoenje se vri na ratojanju od 2,5 cm od donje ivice ploe, du zamiljene startne linije i 2,5 cm od bonih ivica na meusobnom rastojanju ne manjem od 1 cm. Razvijanje hromatograma Za razvijanje hromatograma se koriste staklene kade-komore razliitih dimenzija i konstrukcija, u zavisnosti od dimenzija ploa i primenjenog metoda hromatografije. U staklenu sipa se pokretna faza (50 -100 ml) koja se obavezno priprema u menzuri sa lifom ako je viekomponentna. Uz ire unutranje zidove komore stavi se filter papir (18*18 cm) natopljen pokretnom fazom. Razvijanje hromatograma se izvodi u zatvorenoj hromatografskoj kadi, zasienoj parama mobilne faze, postavljanjem ploe u vertikalan poloaj i to paljivim uranjanjem donje ivice vodei rauna da se mrlje ili trake nalaze iznad povrine mobilne faze. Mobilna faza putuje kaapilarnim silama kroz sloj adsorbensa pri emu se komponente uzorka razdvajaju u zavisnosti od fiziko-hemijskih osobina i interakcija sa slojem stacionarne faze. Kada pokretna faza, nakon odreenog vremena pree odreen put (oko 15 cm za plou dimenzija 20*20 cm), skine se poklopac sa kade, izvadi ploa i ostavi da se osui na vazduhu. Nakon uparavanja mobilne faze, dobijene mrlje se detektuju na odreeni nain.

~ 14 ~

Preparativna hromatografija Preparativna hromatografija se koristi za izolovanje i preiavanje jedinjenja iz smee. Izvodi se na tankim slojevima vee debljine od uobiajenih (0,26 mm) i za detekciju se koriste metode koje ne izazivaju hemijsku promenu (npr. UV detekcija ili prskanje vodom). Nakon razvijanja hromatograma i detekcije, zone koje odgovaraju jedinjenjima koja se izoluju se oznae i eluiraju sa silikagela pogodnim rastvaraem. Nakon filtriranja (ili centrifugiranja) rastvara se otpari a dobijeni kristali analiziraju. Kvantitativna analiza se moe izvesti primenom odgovarajue instrumentalne metode.

ADSORPCIONA HROMATOGRAFIJA U KOLONI TEORIJSKE OSNOVE ADSORPCIONE HROMATOGRAFIJE Da bismo potpunije shvatili proces razdvajanja supstanci pomou adsorpcione hromatografije moramo se upoznati sa Langmuir-ovom jednainom koja nam pokazuje kako se na odreenoj temperaturi poveava adsorpija neke supstance iz rastvora s poveanjem njene koncentracije. Ako deo ukupne povrine adsorbensa koji je pokriven adsorbovanom supstancom obeleimo sa (stepen pokrivenosti), onda moemo pisati da je: = a / a tj. stepen pokrivenosti povrine adsorbensa jednak je koliniku izmeu adsorbovane supstance (a) i maximalne koliine supstance koja se u datim uslovima moe adsorbovati (a). U koloni za hromatografiju se paralelno odvijaju dva suprotna procesa adsorpcija i desorpcija supstance sa odgovarajueg adsorbensa. Brzina adsorpcije u koloni se moe prikazati jednainom: v1 = k1 Cr (1 ) gde je Cr koncentracija supstance u rastvoru Jednaina za brzinu desorpcije glasi: v 2 = k2 Po uspostavljanju adsorpcione ravnotee brzine oba procesa moraju biti jednake:

U sluaju kada je Cr < (k2/ k1) moemo Cr u imeniocu zanemariti, pa nalazimo da je adsorbovana koliina supstance (a) proporcionalna koncentraciji supstance u rastvoru (Cr):

Grafiki predstavljena zavisnost a = f (Cr) je prava koja polazi iz koordinatnog poetka. To je tzv. idealna adsorpciona izoterma.

~ 15 ~

U sluaju kada je Cr > k2 / k1, vrednost kolinika k2/k1 se u imeniocu jednaine moe zanemariti pa dobijamo da je a = a. Ova jednaina je horizontalni deo na tzv. ravnoj adsorpcionoj izotermi. Analiza Langmuir-ove jednaine, prema tome pokazuje da je pri malim vrednostima Cr adsorpcija upravo proporcionalna koncentraciji supstance u rastvoru, a pri velikim vrednostima za Cr adsorpcija ima konstantnu vrednost koja odgovara zasienju povrine adsorbensa. Idealan sluaj odvajanja faza A i B pomou adsorpcione hromatografije imamo kada: komponente imaju linearne adsorpcione izoterme momentalno se uspostavlja adsorpciona ravnotea u okviru tene faze ne dolazi do difuzije Prema nainu izvoenja analize razlikujemo sledee hromatografske metode: frontalna analiza metoda istiskivanja metoda eluiranja

TEHNIKA ADSORPCIONE HROMATOGRAFIJE Razdvajanje pomou adsorpcione hromatografske metode se zasniva na dinamikoj raspodeli supstance izmeu dve faze koje se ne meaju, od kojih je jedna faza pokretna (mobilna) a druga nepokretna (stacionarna). Jedinjenja sa veim afinitetom se zadravaju na adsorbensu, i obrnuto. Prednost ove tehnike odvajanja jeste u tome to ne zahteva komplikovanu opremu i ureaje, veoma je efikasna, relativno brza, na zahteva ve liku experimentalnu vetinu i najekoniminija je metoda za preparativna odvajanja. Pored obine hromatografije u koloni koja se izvodi obinim ceenjem, poznate su i modifikacije ove metode pri kojima se prolaz eluenta kroz kolonu ubrzava povienjem pritiska iznad eluenta (Flash Chromatography) ili snienjem pritiska u recipientu (Dry Flash Chromatography).

STACIONARNA FAZA Stacionarna faza ili adsorbens je vrsta porozna supstanca koja moe da adsorbuje rastvara i rastvorenu supstancu. Najee se kao stacionarna faza primenjuju: silikagel (SiO2), aluminijum-oxid (Al2O3), aktivni ugalj, celuloza... Za standardnu hromatografiju na koloni upotrebljavaju se adsorbensi ija je veliina estica od 0,08 do 0,2 mm, dok adsorbensi za tankoslojnu hromatografiju moraju biti finije spraene estice i ne mogu se upotrebiti za hromatografiju na koloni.

MOBILNA FAZA ELUENTNI RASTVOR Hromatografija u koloni na koju je nanet materijal za razdvajanje, razvija se tako to se rastvara proputa (filtrira) kroz vrstu stacionarnu fazu, bilo pod uticajem gravitacije ili pritiska. Ovaj proces se naziva eluiranje. Rastvarai za eluiranje razliite polarnosti imaju razliitu sposobnost da zamene adsorbovanu supstancu na aktivnom delu adsorbensa. Uopteno govorei, polarni rastvarai efikasnije zamenjuju supstancu na aktivnim centrima adsorbensa od nepolarnih, pa se eluiranjem polarnim rastvaraima supstanca bre kree niz kolonu. Ove osobine rastvaraa su meusobno uporeene pa su tako rastvarai poreani u eluotropni niz, koji je identian kao i kod tankoslojne hromatografije. (najbre) alkani > alkeni > aromatini ugljovodonici > etri > disupstituisani amidi > estri > ketoni > aldehidi > primarni amini > alkoholi > primarni amidi > karboxilne kiseline > sulfonske kiseline (najsporije eluiranje)

~ 16 ~

UREAJ ZA OBINU HROMATOGRAFIJU NA KOLONI Sastoji se od obine staklene cevi na ijem se jednom kraju nalazi slavina (najbolje je upotrebljavati kolone sa teflonskim slavinama jer se one ne podmazuju). Staklene slavine se obavezno moraju podmazivati i u tom sluaju, mast za podmazivanje se pri hromatografiji rastvara, pa posle uparavanja rastvaraa ispitivana supstanca moe biti zaprljana mau. Iznad slavine najbolje je postaviti poroznu sinterovanu ploicu ili se umesto toga na dno kolone stavi tampon vate. Pre poetka odvajanja na koloni potrebno je odrediti sistem rastvaraa za eluiranje, a to se postie odreivanjem najboljeg sistema rastvaraa pri odvajanju supstanci pomou hromatografije na tankom sloju. . Realno je oekivati da se odvajanje na koloni moe efikasno izvriti ako je razlika u Rf vrednostima izmeu dve komponente izmeu 0 i 0,3. Poto je adsorbens na koloni manje finoe nego ne ploi to se obino za odvajanje na koloni upotrebljava neto nepolarniji sistem rastvaraa. Tako npr. ako je najbolji sistem rastvaraa za tankoslojnu hromatografiju petrol-etar / etar 1:1, onda se za hromatografiju na koloni moe upotrebiti sistem petrol-etar / etar 3:2.

PUNJENJE KOLONE Kolone za hromatografiju obino se pune adsorbensom suspendovanim u najnepolarnijem rastvarau kojim se vri eluiranje. Ovaj postupak poznat je kao vlano punjenje jer se kolone mogu puniti i suvim adsorbensom. Odmeri se koliina adsorbensa koja je 25-50 puta vea od koliine suvog uzorka za odvajanje. Za sloenije smee, kao i za odvajanje uzoraka manjih od 100 mg upotrebljava se vei odnos adsorbensa prema uzorku. Veliina kolone se odabere tako da adsorbens ispuni oko 2/3 kolone. Duina kolone moe se proceniti iz sledeih formula: L duina kolone u cm d prenik kolone Tako npr. za 50 g silika-gela potrebna je kolona prenika 3 cm i duine 35-40 cm, dok je za istu koliinu aluminijum-oxida potrebna kolona prenika 2 cm i duine 25 cm. Za hromatografiju na stubu najbolje je upotrebiti kolonu sa odnosom duina/prenik od oko 15:1 do 10:1.

NANOENJE UZORKA I ELUIRANJE Osnovni cilj je da se ispitivana smea nanese na stub adsorbensa u to manjem sloju, to znai da uzorak treba rastvoriti u to manjoj zapremini rastvaraa. Za rastvaranje je najbolje upotrebiti rastvara za eluiranje ili najpolarniji rastvara u smei za eluiranje. Kolona se najbolje razvija tako to se rastvara za eluiranje lagano proputa kroz adsorbens. Maximalno dozvoljena brzina protoka ne sme biti vea od 1 kapi na 2 sekunde, a za sloenije smee brzina eluiranja mora biti manja. Frakcije se skupljaju u pravilnim intervalima pri emu sloenije smee zahtevaju manje frakcije. Sadraj frakcije se kontrolie pomou tankoslojne hromatografije ili UV- VIS-spektrofotometrijom, ali u intervalima, tako to se svaka peta frakcija analizira da bi se pratio tok hromatografije. Idealno je da se jednom zapoeta hromatografija u koloni zavri bez prekidanja, mada se proces moe zaustaviti na kratko vreme (npr. 1h). Ukoliko doe do stvaranja pukotina u adsorbensu i do difuzije traka sa rastvorenim supstancama, dolazi do ponitavanja prethodnog razdvajanja. Kada se hromatografijoma na tankom sloju ustanovi koje frakcije sadre jednu istu supstancu, onda se one spoje i rastvara se odvoji destilacijom pomou rotacionog uparivaa, pri emu se dobija preieni proizvod.

~ 17 ~

BRZA HROMATOGRAFIJA U KOLONI (Flash Column Chromatography) Kod fle hromatografije se primenjuje pritisak iznad eluenta to rezultuje poveanjem njegovog protoka. Ovom tehnikom se za samo 15 min moe postii dobro razdvajanja komponenti ije su razlike u Rf vrednostima 0,1.

ODREIVANJE FARMAKOLOKI AKTIVNIH SUPSTANCI VOLUMETRIJSKOM ANALIZOM ODREIVANJE SADRAJA KOFEINA TITRACIJOM U NEVODENOJ SREDINI Metoda kiselo-bazne titrcije u nevodenoj sredini se iroko primenjuje u analitici jer omoguava dovoljno precizno odreivanje ne samo jakih kiselina i baza, nego i slabih kiselina i baza i njihovih soli.Ova metoda omoguava odreivanje supstanci koje su veoma slabo rastvorne u vodi. Titracija alkaloida moe da se ostvari u kiselim nevodenim rastvaraima (glacijalna siretna kiselina, mravlja kiselina, smea sa anhidridom siretne kiseline, benzolom, hloroformom) u prisustvu indikatora (kristal violet, tropeolin-00, metiloran, sudan) i potenciometrijski. Kao titraciono sredstvo koristi se rastvor perhlorne kiseline u glacijalnoj siretnoj kiselini. Rastvaranje alkaloida u nevodenom rastvarau moe se prikazati sledeom jednainom:

alkaloid rastvara kiselina baza

Titraciono sredstvo reaguje sa rastvaraem po sledeoj jednaini: kiselina Reakcija neutralizacije: baza baza kiselina

Sumarno:

Kofein sa teofilinom i teobrominom spada u grupu purinskih alkaloida. U osnovi sadre purinski skelet koji nastaje kondenzacijom pirimidinskog i imidazolovog prstena. R1 R2 R3 metilxantin -H -H -H kofein -CH3 -CH3 -CH3 teofilin -CH3 -CH3 -H teobromin -H -CH3 -CH3

~ 18 ~

Purinski alkaloidi imaju iroku primenu u medicini u nizu preparata koji se koriste kao analgetici, vazodilatatori i diuretici. Kofein stimulie CNS, prouzrokuje vazokonstrikciju i povienje arterijskog pritiska, ubrazava srani rad, pojaava krvotok u bubrezima i istovrremeno spreava tubularnu resorpciju Na i na taj nain deluje diuretiki. Kofein zajedno sa ergotaminom se koristi u analgetikim i antipiretikim meavinama. Postupak rada Odmeri se oko 0,1 g uzorka (tano izmerena masa) i ratvori uz zagrevanje na vodenom kupatilu u 10 ml anhidrida siretne kiseline. Nakon hlaenja doda se 5 ml benzola i 1 kap 1 % rastvora kristal-violeta u glacijalnoj siretnoj kiselini. Zatim se rastvor titrie rastvorom perhlorne kiseline (0,1 mol/dm3) u glacijalnoj siretnoj kiselini do prelaza boje rastvora u plavozelenu. Sadraj kofeina se rauna prema izrazu: X = 100 * V * 0,01942 / m X sadraj kofeina (%) V utroak 0,1M rastvora perhlorne kiseline m masa uzorka (g) 0,01942 g masa bezvodnog kofeina koja odgovara 1 ml perhlorne kis. (prema farmakopeji) napomena: posue koje se koristi mora biti isto i suvo HClO4 je 2o standardni rastvor. U farmakopeji nai propis o pripremi i standardizaciji 0,1M HClO4 Dokazna reakcija za kofein je murexidna reakcija. Oxidativnim degradacijom molekula stvara se purpurna kiselina koja sa NH4OH gradi amonijum so purpune kiseline (murexid) karakteristiene ljubiaste boje. Izvoenje: U nekoliko mg ispitivane supstance, na sahatnom staklu, doda se 2-3 kapi koncentrovanog H2O2 i nekoliko kapi razblaene HCl. Uparava se na vodenom kupatilu sve dok se ne dobije ukastocrveni ostatak. Kada se doda 2-3 kapi razblaenog amonijaka ostatak promeni boju u ljubiastocrvenu.

LAKTAMSKI ANTIBIOTICI (PENICILINI) Antibiotici su jedinjenja koja najee nastaju u mikroorganizmima (ree u niim ili viim biljkama) i koja su u stanju da inhibiraju ili spree rast drugih mikroorganizama. Dinamian razvoj u oblasti antibiotika otpoeo je 30-ih godina prolog veka, nakon pronalaska praktino netoxinog penicilina. Antibiotici pripadaju razliitim klasama materija i deluju po razliitim mehanizmima. Za neke antibiotike je utvreno postojanje sinergetskog delovanja. Antibiotici se u prvom redu koriste u tretmanu bakterijskih infekcija, pri emu kod dovoljnog sadraja u krvi mogu delovati baktericidno. Neki od antibiotika se koriste zbog njihovog antimikotikog, kancerostatikog ili virustatikog delovanja. Mehanizam dejstva antimikrobnih lekova: inhibicija sinteze elijskog zida inhibicija funkcije citoplazmatske membrane inhibicija sinteze nukleinske kiseline inhibicija sinteze proteina inhibicija metabolikih puteva

~ 19 ~

Podela antibakterijskih lekova: baktericidni penicilini cefalosporini monobaktami karbapenemi vankomicin aminoglikozidi hinoloni metronidazol

bakteriostatski eritromicin kindamicin tetraciklini sulfonamidi hloramfenikol

Prirodni penicilini penicilin G ili benzilpenicilin i penicilin V ili fenoximetilpenicilin Penicilini rezistentni na penicilinaze nafcilin, oxacilin, kloxacilin, meticilin; razvijeni u cilju prevazilaenja aktivnosti penicilinaza kod Staphylococcus aureus koja inaktivie prirodne peniciline.

LAKTAMSKI ANTIBIOTICI U ovu grupu spadaju penicilini i cefalosporini (monobaktami i karbapenemi). Oni se vezuju za penicilin-vezane proteine (PVP), pojedini PVP imaju transpeptidaznu aktivnost, time onemoguuju ukrteno povezivanje gradivnih jedinica peptidoglikana. Benzil-penicilin je bio prvi antibiotik koji je u veem obimu primenjen u terapiji. Sem benzilpenicilina, drug prirodni penicilini (koji se u Americi oznaavaju kao X, K, F a u Britaniji sa III, IV i I) nemaju veeg znaaja. Benzilpenicilin se u terapiji uglavnom koristi u obliku Na i K soli. Slobodna kiselina je higroskopna i nestabilna. Svi penicilini imaju kao osnovni skelet dva kondenzovana heterociklina sistema: petolani tiazolidinski i na njega prislonjen etvorolani -laktamski prsten. Oni se meusobno razlikuju samo po acil ostatku vezanom za amino grupu. Osnovna struktura penicilina (u kojoj je acil ostatak zamenjen sa H atomom) zove se 6-APK odn. 6-aminopenicilanska kiselina. Prednosti benzilpenicilina su u njegovoj baktericidnoj aktivnosti i extremno maloj toxinosti, koja omoguava njegovu primenu u vrlo velikim dozama. Nedostaci su mu mala hemijska stabilnost (naroito prema kiselinama) usled koje se mora uvati pod posebnim uslovima i ne moe se upotrebljavati peroralno, zatim brza eliminacija, ogranien spektar delovanja (samo prema G+ mikroorganizmima i G- kokalnim oblicima bakterija), relativno iroko razvijena rezistencija i pojave alergije. Benzilpenicilin je u rastvorima najstabilniji na pH = 6,5 7,5, ali se i na ovim vrednostima pH i na sobnoj temperaturi postepeno raspada. Bitno bre se raspada u kiseloj i alkalnoj sredini. Alkalne soli benzilpenicilina se uvaju u ampulama u suvom stanju i na hladnom. Hemijska nestabilnost, jednim delom pojave rezistentnosti, sklonost ka nastajanju alergija ali i samo delovanje posledica su reaktivnosti -laktamskog prstena. Ako se on razgradi dobijaju se jedinjenja koja nemaju nikakvog delovanja. U baznoj sredini inaktivacija penicilina poinje nukleofilnim napadom jona hidroxida na karbonilnu grupu laktamskog prstena. Zatim sledi hidrolitika razgradnja prstena uz nastajanje peniciloinske kiseline. Proirenje spektra primene penicilina ostvareno je razvojem jedinjenja koja su promenjena na acilnom delu. Na ovaj nain su dobijeni ariloximetil- i alkil- odn.ariltiometil- penicilini (npr. fenoximetilpenicilin i almecilin). Vei znaaj zbog veih irina varijacija s obzirom na proizvodnju penicilina imaju parcijalne sinteze kojima se pod blagim uslovima acilovanja dobija 6-APK.

~ 20 ~

R CH2 O CH2 HO CH2

naziv hemijski benzilpenicilin fenoximetilpenicilin p-hidroxibenzilpenicilin n-heptilpenicilin n-pentilpenicilin 2-pentenilpenicilin trivijalni penicilin G penicilin V penicilin X penicilin K dihiropenicilin F penicilin F

CH3 (CH2)5 CH2 CH3 (CH2)4 CH3 CH2 CH = CH CH2

UV / VIS SPEKTROSKOPIJA Apsorpcione spektroskopske metode imaju veliki znaaj u kvalitativnoj i kvantitativnoj analizi farmakodinamskih aktivnih supstanci. U rutinskim analizama lekova najee se primenjuju UV, VIS i IR spektroskopske metode, koje se zasnivaju na interakciji aktivne supstance i elektromagnetskog zraenja odreene talasne duine. Neki atomi ili molekuli imaju sposobnost da apsorbuju energiju elektromagnetnih zraka, to dovodi do promene energetskog nivoa nekog molekula, odnosno do prelaska iz osnovnog u excitovano energetsko stanje, kao i do smanjenja intenziteta svetlosti koja prolazi kroz rastvor neke supstance. Hromofore su grupe koje su odgovorne za apsorpciju elektromagnetnog zraenja talasnih duina od 200 do 380 nm. Auxohromne grupe apsorbuju UV zrake u spektralnoj oblasti od 190 do 200 nm, a obojene supstance apsorbuju zrake u vidljivom delu spektra koji obuhvata obalst talasnih duina od 380 do 900 nm. Konvencionalno je sainjen elektromagnetni spektar koji obuhvata vie spektralnih oblasti u zavisnosti od talasne duine i energije zraenja: zraci 0,1 nm X zraci 0,1-1 nm vakuum UV 1-190 nm bliska UV 190-380 nm vidljiva (VIS) 380-900 nm bliska IR 900-2500 nm IR osnovna 2,5-26 m daleka IR 25-400 m mikrotalasi radiotalasi 400 m 25 cm > 25 cm

Sa porastom talasne duine opada energija elektromagnetnog zraenja. Deo elektromagnetnog spektra koji obuhvata UV i VIS spektralne oblasti naziva se elektronski spektar, jer energija UV i VIS zraenja izaziva pobuivanje elektrona (, ili n-nevezanih elektrona) koji iz vieg prelaze u nii energetski nivo unutar molekula. Elektroni jednostruke kovalentne veze su -elektroni i oni apsorbuju elektromagnetne zrake u vakuumskoj UV spektralnoj oblasti. Nevezani elektroni su elektroni koji ulaze u sastav slobodnih elektronskih parova na kiseoniku, azotu, sumporu ili halogenima. Oni imaju niu energiju excitiranja od -elektrona i apsorbuju elektromagnetne zrake u bliskoj UV spektralnoj oblasti. -elektroni su elektroni dvostrukih i trostrukih veza i oni apsorbuju elektromagnetne zrake u UV i VIS spektralnoj oblasti. Energija IR zraenja je dovoljna da izazove vibracije veza i funkcionalnih grupa u molekulu, pa se spektri u delu elektromagnetnog zraenja od 900 nm do 25 m nazivaju vibracioni spektri. IR spektroskopske metode imaju najznaajniju ulogu ukvalitativnoj analizi aktivnih supstanci. Grafiki prikaz zavisnosti apsorpcije svetlosti od talasne duine svetlosti koja prolazi kroz analizirani rastvor naziva se elektronski ili apsorpcioni spektar. Apsorpcioni spektar daje informaciju o poloaju i broju maximuma apsorpcije, kao i o

~ 21 ~

intenzitetu apsorpcije. Poloaj i broj maximuma apsorpcije zavisi od vrste i broja hromofora. Na poloaj maximuma apsorpcije u elktromagnetnom spektru nekog molekula ima uticaj vrsta rastvaraa i pH vrednost. UV i VIS spektrofotometrijske metode mogu da budu direktne ili indirektne. Kod UV direktnih metoda meri se apsorbancija rastvora aktivne supstance. Kod VIS direktnih metoda se isto meri apsorbancija obojenih rastvora ili extrakata. Indirektne UV i VIS metode se primenjuju posle hemijske modifikacije molekula aktivne supstance. Najee se izvodi hemijska reakcija izmeu aktivne supstance i nekog reaktiva koji sadri UV hromofornu grupu i u daljem postupku se meri apsorbancija nagraenih jedinjenja u UV spektralnoj oblasti. Indirektne kolorimetrijske metode zasnivaju se na merenju apsorbancija hemijski modifikovane aktivne supstance, koja predstavlja obojeno jedinjenje. UV spektar je karakteristian za dato jedinjenje u datom rastvarau. Poreenjem nepoznatog jedinjenja sa standardnim spektrom mogue je izvriti identifikaciju. U tu svrhu postoje kolekcije UV spektara. UV spektri su po koliini informacija koje sadre siromaniji od IR spektara, te se vie koriste za dobijanje dopunskih informacija, kada ve postoji dosta informacija o jedinjenju, a ne kao metode potpune identifikacije jedinjenja. UV spektrofotometrija se moe primeniti kada je potrebno odluiti izmeu nekoliko moguih struktura, u sluaju razlikovanja cis/trans izomera, prouavanja ravnotee u ratvorima i sl.

PRIMENA UV I VIS SPEKTROSKOPIJE U KVANTITATIVNOJ ANALIZI Zasniva se na promeni intenziteta svetlosi koja ulazi u rastvor neke supstance (Io), i intenziteta svetlosti koja izlazi iz rastvora (I), koja zavisi od debljine sloja rastvora (l) i koncentracije rastvora (c). Ovaj odnos je definisan Lambert-Beer-ovim zakonom: I = Io 10-klc tj. log (Io/I) = klc = A gde je A apsorbancija rastvora neke supstance. U kvantitativnoj analizi neke supstance moe se koristiti i transmisija T, koja predstavlja koliinu proputene odn. transmitovane svetlosti odreene talasne duine, i ona je obrnuto srazmerna apsorpciji a moe se prikazati sledeom relacijom: A = log (1/T) T = I/Io Odreivanja pomou poredbene (standardne) supstance Pripremi serastvor supstrata, kako je to opisano u pojedinoj monografiji, i izmeri njegova apsorbancija (A1) na propisanoj talasnoj duini u kiveti pri debljini sloja od 1 cm, uz rastvara odn. slepu probu. Na isti nain i pod istim uslovima se pripremi rastvor poredbene (standardne) supstance tako da vrednost apsorbancije (Ao) bude priblina vrednosti apsorbancije (A1). Rezultat odreivanja se izraunava prema izrazu:

A1 apsorbancija rastvora koji se ispituje A0 apsorbancija rastvora poredbene supstance C1 koncentracija supstance u preparatu koji se ispituje (%, m/v) C0 koncentracija standardne supstance (%, m/v) a odmerena masa preparata (g)

~ 22 ~

Odreivanje metodom standarnog dodatka Izmeri se apsorbancija ispitivanog rastvora (A1) a zatim apsorbancija istog rastvora uz dodatak poznate koliine ispitivane supstance (A1+dod.). Koncentracija ispitivane supstance (C1) se izraunava na osnovu izraza:

A1+dod. apsorbancija ispitivanog rastvora uz dodatak poznate koliine supstance Cdod koncentracija dodatka (%, m/v) Odreivanje pomou specifinog koeficijenta apsorbancije Specifini koeficijent apsorbancije (A1%1cm) predstavlja apsorbanciju rastvora koji sadri 1 g supstance u 100 ml rastvora, pri debljini sloja od 1 cm. Na odreenoj talasnoj duini i uz odreene uslove, ova vrednost predstavlja fiziko-hemijsku konstantu za datu supstancu. A1%1cm = A/Cl A apsorbancija rastvora supstance C koncentracija supstance (g/100 ml) l debljina sloja u kiveti, 1 cm Pripremi se rastvor supstance odreene koncentracije i izmeri se apsorbancija rastvora (A) na propisanoj talasnoj duini u sloju od 1 cm, ako nije drugaije propisano. Prethodno se spektrofotometar, pomou rastvaraa (slepa proba) podesi na 0 i 100% propustljivosti. Koncentracija supstance mora biti takva da se vrednost odgovarajue apsorbancije nalazi izmeu 0,200 i 0,600. Na osnovu oitane vrednosti apsorbancije izraunava se specifini koeficijent apsorbancije. Sadraj ispitivanog uzorka u preparatu (X,%) se izraunava prema izrazu:

A apsorbancija rastvora preparata F ukupna zapremina rastvora (ml) u kojoj bi trebalo da bude m grama analiziranog preparata da bi se dobila korektna vrednost apsorbancije m masa preparata (g) Odreivanja pomou standarnog dijagrama Pripremi se serija (5-8) rastvora supstance rastuih koncentracija, izmeri njihova apsorbancija i konstruie dijagram zavisnosti apsorbancija od razliitih koncentracija (masa) supstance. Zatim se izmeri apsorbancija ispitivanog rastvora, na osnovu koje se interpolacijom sa ordinate na apscisu prvo dolazi do koncentracije (mase) ispitivane supstance, a zatim se izraunava sadraj supstance u preparatu. Standardni dijagram treba povremeno proveravati, a pri korienju drugog instrumenta ii drugog reagensa mora se konstruisati novi dijagram. A

c (ili m)

~ 23 ~

REFRAKTOMETRIJA Refraktometrija (odreivanje indexa prelamanja odn. refrakcije) je metoda koja ima iroku primenu u identifikaciji supstanci i u odreivanju njihove istoe. Uporeivanje izmerene vrednosti indexa refrakcije sa podatkom iz literature ili kompjuterskih baza podataka, omoguava potvrdu identiteta datog jedinjenja ili potvrdu njegove istoe. S obzirom da je index refrakcije bezdimenziona veliina ija brijana vrednost zavisi od talasne duine upadne svetlosti veoma je vano da indexi refrakcije koji se uporeuju budu odreeni na istoj talasnoj duini. Index refrakcije se uglavnom odreuje upotrebom natrijumove D-linije na 589,3 nm (refraktometri koji koriste belu svetlost su konstruisani tako da izmereni index refrakcije odgovara onom na 589,3 nm). Index refrakcije takoe zavisi i od temperature, tako da je najbolje odreivati na istoj temperaturi na kojoj je dobijena vrednost indexa refrakcije sa kojim ga elite uporediti. Najee je to temperatura od 20oC. Index refrakcije po pravilu raste ukoliko se smanjuje talasna duina upadne svetlosti, a opada sa porastom temperature. Za mnoge organske tenosti index refrakcije se smanjuje za priblino 0,000450,0001 za svako poveanje temperature od 1oC. Index refrakcije za vodu je najmanje zavisan od temperature. Ako se index refrakcije odreuje na temperaturama koje su razliite od onih u literraturi, potrebno je izvriti korekciju pre nego to se te dve vrednosti uporede. Korekcija se izraunava na sledei nain: n(t2) = n(t1) (t1-t2)*0,0045 Index refrakcije zavisi od prirode supstance, njenog hemijskog sastava, strukture, agregatnog stenja, istoe. Male koliina neistoe mogu da prouzrokuju znaajne promene u indexu refrakcije. Strukturni faktor koji utia na index refrakcije je polarnost jedinjenja, pa supstance koje sadre polarnije grupe imaju vei index refrakcije od supstanci sa manje polarnim grupama. U najveem broju sluajeva index refrakcije je u linearnoj (ili skoro linearnoj) zavisnost od procenta rastvorene vrste supstance u rastvoru. Pomou standardne kalibracione krive i izmerene vrednosti indexa refrakcije rastvore moe da se odredi procentna koncentracija rastvora sa dosta dobrom tanou.

UPUTSTVO ZA RAD SA ABBE-OVIM REFRAKTOMETROM Refraktometar je instrument koji slui za merenje indexa prelamanja (refrakcije) svetlosti. Apsolutni index refrakcije n predstavlja odnos brzine kojom se svetlost prostire kroz vakuum i neki drgi medijum, dok relativni index refrakcije predstavlja odnos brzine svetlosti kroz vazduh i neku drugu sredinu. Index refrakcije moe da se definie i kao odnos sinusa upadnog i prelomnog ugla zraka svetlosti koji prelazi iz jedne u drugu sredinu. Refraktometri najee mere ugao totalne reflexije. To je ugao za koji je upadni ugao tano 90o. Ako je prelomni ugao vei od graninog ugla zrak se totalno reflektuje. Index refrakcije se rauna iz graninog ugla prema jednaini: n = 1 / sin(granini) Index refrakcije je funkcija talasne duine i temperature, pa se radi sa utim svetlom natrijumove D linije na temperaturi 20oC, nD20. Abbe-ov refraktometar sadri dve kompenzacijske Amiijeve prizme meusobno zaokrenute tako da proputaju samo zrake ija talasna duina odgovara Na D liniji, pa se kao izvor svetlosti ne mora koristiti natrijumova lampa. Abbe-ovim refraktometrom moe se meriti index refrakcije u rasponu nD 1,3000-1,7000 sa tanou 0,0002, uz odravanje stalne temperature (0,2oC), to se postie spajanjem prizme sa ultratermostatom.

~ 24 ~

Uzorak se ravnomerno nanese na povrinu prizme i prizma se brzo zatvori. Levim vijkom se pomera granica refrakcije dok se ne ue u vidno polje i namesti tano na presek dve dijagonale (kosi krst), dok se desnim vijkom po potrebi izotrava. U sluaju slabog kontrasta izmeu svetlog i tamnog polja moe da se upotrebi ogledalo na dnu donje refrakcijske prizme. Ako granica izmeu tamnog i svetlog polja ne moe da se izotri, potrebno je dodati jo uzorka ili bolje oistiti povrine obe prizme. Abbe-ov refraktometar ima skalu za direktno oitavanje indexa refrakcije i za oitavanje vodenog rastvora saharoze u masenim udelima. Skala je vidljiva kada se posmatra kroz okular.

Marina Rajic

~ 25 ~