Biotecnologa Ambiental Obtencin de liposomas Por M en C. Javier Araiza Arvilla.

RESUMEN Los liposomas al ser estructural y funcionalmente semejantes a las membranas celulares, han sido ampliamente usados en la industria farmacutica como acarreadores de frmacos de liberacin prolongada; y ms recientemente se ha tratado de implementar el uso de stos en la remediacin ambiental. En el presente ensayo se obtuvieron liposomas a partir de lecitina de soya, encontrndose una gran variabilidad de tamaos entre las vesculas de cada una de las repeticiones realizadas y entre los observados inmediatamente despus de la metodologa y los almacenados 5 das despus del procedimiento. En dichos liposomas se puede insertar enzima lacasa para la degradacin de colorantes textiles en aguas contaminadas por la industria de ese rubro. INTRODUCCION Los liposomas fueron descubiertos en 1961 por Alec D. Bangham mientras estudiaba un tipo de biomolculas (los fosfolpidos) y su relacin con la coagulacin sangunea. Desde entonces, se han convertido en herramientas verstiles en Biologa, Bioqumica y Medicina. Bangham descubri que los fosfolipidos en agua forman de manera inmediata esferas cuyas paredes se encuentran organizadas en bicapas debido a que cada molcula tiene un terminal hidrosoluble en tanto el otro es hidrofbico, es decir se trata de molculas anfiflicas (Lanio, et al. 2010). Para comprender las propiedades de las membranas biolgicas se han estudiado ampliamente sistemas de membrana artificial. Existen diversas tcnicas que utilizan fosfolpidos sintticos y lpidos extrados de membranas naturales para preparar liposomas. Segn el procedimiento pueden prepararse vesculas unilamelares o multilamelares (vesculas dentro de vesculas) de diversos tamaos. Tanto el entorno externo como el interno del liposoma, puede ser manipulado lo que permite llevar a cabo estudios sobre una serie de propiedades de estas membranas sintticas entre ellas su capacidad de excluir molculas, su interaccin con las sustancias as como la estabilidad en diversas condiciones. Con los liposomas es ms fcil evaluar los diversos parmetros de los sistemas de membrana lo que permite estudiar las diferentes actividades libres de posibles interferencias provocadas por reacciones presentes en las membranas celulares (Devlin, 2004). Los liposomas han sido estudiados por casi dos dcadas con el objetivo de incrementar la especificidad de accin de los frmacos hacia dianas especficas para facilitar la biodisponibilidad de los frmacos a travs de membranas biolgicas o para proteger al frmaco contra la inactivacin de la enzima (Garg, et al. 2010).

La mayora de los resultados han indican que los liposomas utilizados como vehculo del frmaco ofrecen la posibilidad de una administracin selectiva y controlada as como una biodisponibilidad mejorada. Sin embrago su utilidad se ve opacada por una vida propia corta limitada capacidad de carga de frmaco y por la dificultad de esterilizacin de las preparaciones de los frmacos (Garg, et al. 2010). El uso de los liposomas como acarreadores de frmacos se ha dirigido a reducir los efectos txicos colaterales de las drogas en rganos sensibles, tales como corazn y riones, y a lograr una direccionalizacin a tejidos especficos tales como los tumorales. Por otra parte, la inclusin de lpidos catinicos en la composicin liposomal ha potenciado su capacidad para mediar la transfeccin en la terapia gnica. La racionalidad que existe en el empleo de los liposomas en inmunizaciones y en el diseo de vacunas se basa en su capacidad para liberar la molcula antignica en clulas especficas del sistema inmunolgico y estimular una respuesta inmune (Lanio, et al. 2010). OBJETIVO Conocer el mecanismo de obtencin de liposomas y explorar la posibilidad de su utilizacin con enzimas para tratar agua contaminada proveniente de la industria textil. MATERIAL Y MTODOS Los liposomas como acarreadores de enzimas han sido obtenidos por Len et al. (2009), intentando en el presente trabajo la obtencin de liposomas portadores de enzima lacasa. Para lograr esto, se realiz por triplicado la preparacin de la solucin, en la cual; se utiliz como componente de la base de la matriz lipdica, L- - fosfatidilcolina de cpsulas de lecitina de soya, y colesterol (CH); rehidratando manualmente con cloroformo, se elimin la fase orgnica por rotaevaporacin (Rotavapor Yamato, Water Bath BM 400) a 65C y se sec a temperatura ambiente durante 24 horas. Se obtuvo un film delgado de fosfolpidos que se hidrat con buffer fosfato pH 7 a 40C para obtener una suspensin de liposomas. Se llev a cabo la reduccin de tamao por medio de ultrasonido (sonicador VWR Modelo 150T) durante 20 minutos, en tanto la distribucin de tamao se determin mediante la observacin de la solucin lipdica al microscopio ptico (Leika); y despus se contrast con la observacin de la mezcla lipdica teida con Sudn III y observada en las mismas condiciones. RESULTADOS Sin teir La observacin se llev a cabo a 400 aumentos totales, encontrando aproximadamente 200 vesculas lipdicas por campo. Muestra 1.

Figura. . Liposomas de la muestra 1 observados al microscopio ptico. Existe una variabilidad en el tamao de las vesculas lipdicas.

Muestra 2.

Figura. 2. Muestra 2 observada al microscopio ptico; se notan varias capas de la preparacin, las vesculas ms claras son las del plano y las ms de difusas son de las capas inferiores de la preparacin.

Muestra 3.

Figura. 3. Liposomas de la muestra 3, observados al mismo aumento que las anteriores (40X), ntese que los de sta muestra presentan un mayor tamao y son ms abundantes que los de la muestra 1 y 2.

Teido. Asimismo, las muestras teidas fueron observadas a 400 aumentos totales. Encontrndose lo siguiente: Muestra 1.

Figura 4. Liposomas de la mezcla 1 con colorante (Sudn III) en su interior, el tamao se encuentra ms definido en cada una de las capas de la preparacin.

Muestra 2.

Figura. 5. Liposomas observados despus de teir con Sudan III la muestra 2.

Muestra 3.

Figura. 6. Vesculas liposomales de la tercera muestra teidas con Sudn III.

DISCUSION Los liposomas, son en esencia protoclulas o clulas sin organelos, pues estn formados al igual que las membranas celulares en mayor porcentaje por fosfolpidos, y dentro de ellos, la fosfatidilcolina al presentar caractersticas de gran biodegradabilidad, es uno de los mejores para sintetizar liposomas; por ello, la lecitina de soya fue elegida como la base lipdica para el desarrollo de las vesculas lipdicas en el presente trabajo. Los liposomas al ser estructuras micro o nanoscpicas consistentes de una o varias capas esferas concntricas de bicapas fosfolipidicas o lamelares que encierran compartimentos acuosos y poseer el carcter anfifilico de los lpidos que los componen; tienen atributos nicos que los convierten en vehculos adecuados de frmacos tanto hidroflicos como lipoflicos (Navarro et al., 2008). Adems de poder acarrear y conservar en ellos colorantes, enzimas y otras sustancias. Como es el caso de la enzima lacasa utilizada en el tratamiento de aguas contaminadas por colorantes textiles; o el colorante usado para contrastar las vesculas al microscopio. Para el anlisis cualitativo, los liposomas fueron observados a travs del microscopio ptico encontrndose una completa heterogeneidad en el tamao de stas; en lo relacionado a su forma, las

vesculas son esfricas y elipsoidales. Y un tamao ms o menos homogneo en cada una de las capas de la preparacin observada (Figura 1-6). Lo anterior debido a que la cantidad de colesterol aadido a las tres mezclas fue la misma; pues si hubiese cambiado, la medida hubiera incrementado; porque el porcentaje de colesterol en los liposomas, aumenta el dimetro de las vesculas, debido a la ubicacin de colesterol en la porcin interna de la capa fosfolipdica provocando una separacin entre las molculas de fosfolpido, aumentando por consiguiente el dimetro de la vescula (Beltrn et al., 1999). Adems, las vesculas teidas con Sudn III (Figuras 4- 6), fueron almacenadas por varios das; y muestran un mayor tamao; lo que puede deberse a que las vesculas se aproximan unas a otras fusionndose, y adems de formas esfricas tambin se observarn vesculas alargadas en las cuales es posible diferenciar los liposomas esfricos que se estn fusionando (Beltrn et al., 1999). CONCLUSION La heterogeneidad en el tamao de los liposomas obtenidos fue alta, de acuerdo al anlisis cualitativo, las vesculas de la muestra 3 presentaron el mayor volumen de las tres repeticiones; adems los liposomas de las mismas muestras mostraron un tamao ms grande en la observacin realizada despus de un tiempo definido y de ser teidas con colorante especfico para grasas (Sudn III). BIBLIOGRAFA Beltrn O. C. Escobar M. J. Jimnez F. Barbosa H. Martnez F. 1999. Caracterizacin de vesculas liposomales. Efecto de la composicin fosfolipdica sobre el tamao de la vescula. Rev. Colomb. Cienc. Qum. Farm. Vol. 38. Colombia. Pp. 117- 122. Devlin T. 2004. Bioqumica Aplicaciones Clnicas. Revert. USA. Pp. 504 Garg, Sheppard, Donnenfeld, Friedlaender. 2010. Tratamientos Antibitico y Antiinflamatorio en Oftalmologa. Panamericana. Argentina. Pp. 68 69. Lanio. M, Luzardo. M, Laborde. R, Snchez. O, Cruz-Leal. Y, Pazos. F, Tejuca. M,Valle. A, Alonso. M, Fernndez. L, Alvarez. C. 2009. Las vesculas liposomales: obtencin, propiedades y aplicaciones potenciales en la biomedicina. Revista Cubana de Fsica. Vol. 26, No. 1, Pp 23 30. Len- Joublanc E. Vzquez- Gutierrz B. Ramrez- Esquivel G. Martnez- Hernndez J. Ilin A. 2009. Enzimas micolticas encapsuladas en liposomas como agentes de biocontrol contra Fusarium oxysporum. Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera. Mxico. <http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/acapulco09/TRABAJOS/AREA_II/CII-58.pdf>. Navarro G. Cabral P. Malanga A. Savio E. 2008. Diseo de liposomas para el transporte de diclofecac sdico. Rev. Colomb. Cienc. Qum. Farm. Vol. 37. Colombia. Pp 212- 223.