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1 ANO 1 SEMESTRE
BIOLOGIA CELULAR
Jorge Paulos
2006/2007
1. Do Procarionte ao Eucarionte
A identidade celular foi conseguida a partir do momento em que a primeira clula ganha uma membrana plasmtica, com funes de proteco e regulao da entrada e sada de substncias da clula. Isto fez com que o meio intracelular fosse diferente do meio externo, do ponto de vista fisico-qumico. Porm, o grande avano adaptativo sofrido pelas clulas foi a formao de vesculas, compartimentos e retculos originados da membrana primordial. Com isto, nasce a clula eucaritica, com o seu sistema de endomemranas. Este sistema possibilitou: Maior crescimento celular; Maior especializao, diviso de tarefas entre componentes celulares e eficincia metablica; Maior proteco do material hereditrio; Maior diversidade de rotas metablicas; Facilidade no contacto e na aglomerao intermolecular.
As clulas procariticas so muito diferentes das eucariticas. A sua principal caracterstica , ento, a ausncia de membrana celular, individualizando assim, o ncleo. Para alm disso, no tm alguns organelos, o que lhes confere um tamanho bastante reduzido. O DNA que possuem encontra-se na forma de um anel no-associado a protenas. Eubactrias verdadeiras bactrias Arqueobactrias clulas primitivas, geralmente anaerbias, que vivem nos ambientes mais inspitos.
As clulas eucariticas so mais complexas que as procariticas. Possuem membrana nuclear individualizada e vrios tipos de organelos. A maioria dos animais e plantas a que estamos habituados esto dotados deste tipo de clulas. Fungos Protozorios 2
Captulo 1 - A evoluo da clula |
Procariontes Organismos Medida Metabolismo Organelas Bactrias, Cianobactrias 10 m Anaerbio, Aerbio Ausentes
Eucariontes Protistas, Fungos, Plantas, Animais 10 - 100 nm Aerbio Ncleo, Complexo de Golgi, Mitocndria, Retculo Endoplasmtico, etc.
RNA sintetizado no ncleo; Ambos sintetizados no mesmo local Protenas sintetizadas no citoplasma Tipo 70S No tem citosqueleto: correntes citoplasmticas, exocitose e endocitose ausentes Principalmente unicelular Tipo 80S Tem citosqueleto: correntes citoplasmticas, exocitose e endocitose presentes Principalmente multicelular
Necessitam de uma fonte de C e de Requerem uma grande quantidade N de compostos e alguns ies
2. Do RNA ao DNA
No processo de evoluo celular, atravessaram-se as seguintes fases: RNA capaz de dirigir a sua auto-replicao; RNA capaz de intervir na sntese de protenas (ribossomas); Aparecimento da membrana celular; Aparecimento do DNA como molcula mais estvel do que o RNA, e com capacidade para dirigir a sua prpria replicao (replicao semi-conservativa).
O DNA mais estvel do que o RNA porque: Tem um a desoxi bose em vez de um a ri rri bose.A ri bose tem um grupo O H no carbono 2que pode sofrer hidrlise; O DNA constitudo por 2 cadeias anti-paralelas, sendo mais difcil ocorrerem mutaes; O DNA possui a base timina, em vez do uracilo. Este ltimo mais instvel pois pode sofrer metilao; O DNA possui um mecanismo de auto-reparao de erros. Assim, o RNA foi progressivamente substitudo pelo DNA, que ganhou uma importncia vital para os organismos vivos.
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Genes Ortlogos genes considerados homlogos que apresentam a mesma funo em organismos diferentes mas provenientes do mesmo organismo progenitor (genes alterados dentro de linhagens especficas, aps diferenciao). Genes Parlogos genes considerados homlogos, presentes num mesmo organismo , que no apresentam a mesma funo. Assim, estes genes so duplicados dentro de uma mesma linhagem, no importando se tm a mesma funo ou no. 4
Captulo 1 - A evoluo da clula |
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Genes Homlogos so genes que apesar de pertencerem a diferentes organismos, so estruturalmente semelhantes e cumprem funes idnticas.
Necrose todo o contedo intracelular expulso para o exterior, sendo associada a vrios tipos de clulas simultaneamente. A necrose abrange alteraes regressivas reversveis que, em algum ponto e por algum estmulo descohecido, passam a ser irreversveis. Instalada a irreversibilidade e a necrose propriamente dita, inicia-se um processo de desintegrao celular (autlise).
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Apoptose tambm designada por morte celular programada um tipo de auto-destruio celular que requer energia e sntese proteica para a sua execuo. Est relacionada com a homeostase na regulao fisiolgica do tamanho dos tecidos, exercendo um papel oposto ao da mitose. Portanto consiste numa morte desejvel e necessria que participa na formao dos rgos. Autofagia neste processo, a clula elimina organelos envelhecidos atravs da formao de autofagossomas. O objectivo deste processo converter os componentes da clula em alimento para prolongar a sobrevivncia do organismo. Morte autofgica induzida em algumas clulas, considerada uma morte celular programada e associada a clulas isoladas.
5. Organizao molecular
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1. Aminocidos
Um aminocido qualquer molcula que contm simultaneamente grupos funcionais amina e cido carboxlico.
Um aminocido constitudo por: Carbono Grupo amina Grupo carboxilo tomo de hidrognio Cadeia lateral radical que influencia: O ponto isoelctrico do aminocido; O prprio aminocido (porque varia de aminocido para aminocido); O tipo de aminocido formado quanto polaridade, porque existem aminocidos apolares, polares neutros ou polares com carga.
Os aminocidos apresentam um determinado estado de ionizao que se encontra dependente do pH do meio. Assim, podem existir na forma ionizada io dipolar ou zwiterio que para um determinado valor de pH, tantas cargas positivas como negativas. Este valor designado por ponto isoelctrico. Quando o pH do meio bsico (pH do meio superior ao ponto isoelctrico), o aminocido comporta-se como um cido, ficando carregado negativamente, por perda de protes. Quando o pH do meio cido (pH do meio inferior ao ponto isoelctrico), o aminocido comporta-se como uma base, ficando carregado positivamente, por ganho de protes.
Aminocidos essenciais so aqueles que no existem no nosso organismo, tendo portanto que ser obtidos atravs da alimentao. So todos da forma L, excepto os que so da forma D (alguns antibiticos e nas paredes das bactrias).
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2. Hidratos de carbono
Os hidratos de carbono (ou glcidos) so substncias sintetizadas pelos organismos vivos. Tm funo energtica e estrutural pois participam da arquitectura corporal dos seres vivos. Para alm disso, tambm tm funo anticoagulante, lubrificante e participam na sinalizao celular. A frmula geral da estrutura dos hidratos de carbono (CH2O)n, sendo que cada um deles possui na sua estrutura: Grupo aldedo (CHO) aldose Grupo cetona (C = O) cetose Os hidratos de carbono podem dividir-se em: monossacardeos, oligossacardeos e polissacardeos. Os monossacardeos ou acares simples constituem as molculas dos carboidratos, as quais so relativamente pequenas, insolveis em gua e no hidrolisveis. Em geral, obedecem frmula bsica dos hidratos de carbono. Os oligossacardeos ou acares pequenos so constitdos por duas a dez molculas de monossacardeos, como os dissacardeos que tm duas. (Ex.: maltose, lactose e sacarose.) Os polissacardeos ou acares mltiplos so formados pela unio de mais de dez molculas monossacardeas, constituindo, assim, um polmero de monossacardeos, geralmente de hexoses. Ao contrrio dos anteriores, so insolveis em gua, no alterando assim o equilbio osmtico das clulas e prestando-se muito bem s funes de armazenamento e reserva nutritiva. (Ex.: celulose, amido e glicognio.)
3. Lpidos
Os lpidos (ou lpideos) so biomolculas insolveis em gua, e solveis em solventes orgnicos, como o lcool, benzina, ter ou clorofrmio. A maioria dos lpidos so molculas anfipticas, isto , possuem uma cabea que polar ou hidroflica, e uma cauda constituda por uma parte apolar ou hidrofbica, isto , que repele a gua. Assim, de todos os lpidos enunciados acima, apenas os triglicerdeos no so molculas anfipticas.
3.1.
cidos Gordos
Os cidos gordos so cidos monocarboxlicos de cadeia normal hidrocarbonatada e que possuem um grupo carboxlico (COOH) que permite a ligao a outras molculas. So armazenados no citosol sob a forma de gotculas de gordura, os triglicerdeos. Ao longo de uma cadeia hidrocarbonatada de um cido gordo, existe sempre uma ligao dupla que lhe confere uma quebra extremamente importante para as membranas biolgicas. 8
Captulo 2 Componentes qumicos celulares e Macromolculas |
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3.2.
Os triglicerdeos so lpidos formados pela ligao de trs molculas de cidos gordos com uma de glicerol, atravs de ligaes ster. Normalmente, os cidos gordos que participam na estrutura de um triglicerdeo so diferentes entre si. Quando necessrio, os cidos gordos so libertados das molculas de triglicerdeos e quebrados em unidades com dois tomos de carbono.
3.3.
Fosfoglicerdeos / Fosfolpidos
Os fosfoglicerdeos so lpidos constitudos por uma molcula de glicerol, duas cadeias de cidos gordos (uma saturada e uma insaturada), um grupo fosfato e uma molcula polar ligada a ele (serina, etanolamina, colina ou inositol). Assim, a sua designao depende da molcula polar presente (Ex.: serina fosfatidilserina). As suas principais funes so no processo de sinalizao celular e na constituio das membranas biolgicas Cada membrana constituda por uma dupla camada fosfolipdica organizada de modo a que as cabeas hidroflicas fiquem viradas para o lado exterior da membrana e as caudas hidrofbicas para o interior. Esta organizao permite tornar a membrana selectiva pois s atravessam a membrana por difuso simples as substncias lipossolveis.
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3.4.
Esfingolpidos
Os esfingolpidos provm da esfingosina que um aminolcool, e cujo grupo amina se pode ligar a um cido gordo formando a ceramida. Existem dois tipos de esfingolpidos: Esfingofosfolpidos so as ceramidas que contm fosfato. Um exemplo a esfingomielina que o componente principal da mielina das clulas nervosas. So constitudos por: Fosfocolina ou Fosfoetanolamina Ceramida Glicolpidos so as ceramidas que contm acares. Podem ser de dois tipos: Cerebrosdeos constitudos por ceramida e 1 a 4 molculas de acar Gangliosdeos constitudos por ceramida e n molculas de acar (contm, para alm de outras molculas, o cido N-acetilneuramnico). Nos animais, os glicolpidos so derivados da ceramida, enquanto que nas plantas so derivados do glicerol. Assim, nas membranas das clulas animais: Camada interna fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina Camada externa fosfatidilcolina e esfingomielina Nota: A fosfatidilserina uma molcula negativa, sendo importante porque dificulta ou facilita a passagem de determinado tipo de molculas.
3.5.
Antignios O Glicose + Galactose + N-Acetilgalactoseamina + Galactose + ... Antignios A Antignio O + N-Acetilgalactoseamina Antignios B Antignio O + Galactose
4. Nucletidos
Os nucletidos so compostos ricos em energia que auxiliam os processos metablicos na maioria das clulas. So constitudos por: Uma base azotada (purina / pirimidina) Uma pentose (ribose / desoxirribose) Um ou vrios grupos fosfato As principais funes dos nucletidos so: Transferncia de sinais qumicos (ex.: CoA) Constituio de cidos nucleicos 10
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Constituio de molculas que permitem efectuar o armazenamento de energia (ex.: ATP) Controlo das reaces intermoleculares (ex.: AMP cclico)
Bases azotadas
Purinas Adenina (A) e Guanina (G) Pirimidinas Uracilo (U), Timina (T) e Citosina (C)
Pentoses
-D-Ribose
-D-Desoxirribose
Nota: Nucletido base + pentose + fosfato Nuclesido base + pentose Base Adenina Guanina Citosina Timina Uracilo Nuclesido Adenosina (A) Guanosina (G) Citidina (C) Timidina (T) Uridina (U)
5. Protenas
As protenas so compostos orgnicos de estrutura complexa, sintetizadas pelos organismos vivos atravs da condensao de um grande nmero de molculas, atravs de ligaes peptdicas.
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Ligao peptdica
As ligaes estabelecidas entre aminocidos numa determinada protena denominam-se ligaes peptdicas e estabelecem-se entre o grupo carboxilo de um aminocido e o grupo amina do aminocido seguinte. Estas ligaes podem ser quebradas por enzimas ou atravs de tratamentos drsticos como a adio de cidos ou bases fortes a temperaturas elevadas, pelo facto de serem ligaes extremamente fortes. Tendo por base o mecanismo de ligao conclui-se que o primeiro aminocido da cadeia polipeptdica tem o grupo amina livre e o ltimo tem o grupo carboxlico livre.
Composio
Quanto sua composio molecular, as protenas podem ser classificadas em: Simples protenas constitudas unicamente por aminocidos Conjugadas protenas que apresentam a cadeia de aminocidos ligada a um radical diferente (grupo prosttico). Dependendo do grupo prosttico, as protenas podem ser classificadas em: Glicoprotenas glcido (ex.: mucina) Cromoprotenas pigmento (ex.: hemoglobina) Fosfoprotenas cido fosfrico (ex.: vitelina) Nucleoprotenas cido nucleico Lipoprotenas lpido
Forma
Quanto sua forma, as protenas podem ser classificadas em: Globulares presentes no sangue e solveis em gua, com estrutura compacta, o que permite o transporte de lpidos Fibrosas protenas estruturais, cuja forma se define segundo um eixo, sendo insolveis em gua (ex.: colagnio)
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Estrutura
Primria dada pela sequncia de aminocidos ao longo da cadeia polipeptdica. o nvel estrutural mais simples e mais importante, por ser dele que deriva todo o arranjo espacial da molcula. Esta estrutura especfica para cada protena, sendo determinada geneticamente. Como a sua constituio s definida pela sequncia de aminocidos, a orientao espacial da molcula no tem qualquer relevncia. Secundria dada pelo arranjo espacial de aminocidos prximos entre si na sequncia primria da protena. o ltimo nvel de organizao das protenas fibrosas, mais simples estruturalmente. Esta estrutura ocorre graas possibilidade de rotao das ligaes entre os carbonos dos aminocidos e os seus grupos amina e carboxilo. Existem dois tipos de estrutura secundria: define-se entre pequenas zonas da cadeia entre aminocidos adjacentes. estabelecimento de pontes de hidrognio entre diferentes cadeias peptdicas.
Terciria resulta do enrolamento da protena no espao, sendo mantida por pontes de hidrognio e pontes dissulfito. Basicamente, esta estrutura confere actividade biolgica protena. Enquanto a estrutura secundria determinada pelo relacionamento estrutural de curta distncia, a terciria caracterizada pelas interaces de longa distncia entre aminocidos. Os aminocidos apolares vo dispr-se essencialmente no interior da molcula, porque tm de existir grupos polares superfcie para permitirem a dissoluo em gua. A estrutura terciria , ento, determinada e estabilizada por determinados factores como: Interaces hidrofbicas tendnci dos am i a noci apol dos ares fugi da gua. rem Ligaes inicas foras de atraco entre aminocidos com radicais carregados com cargas opostas. Foras de van der Waals Pontes de hidrognio ligaes com tratamentos fracos que podem ser quebradas porque so covalentes. Ligaes dissulfito ligaes no covalentes que resultam da oxidao, permitindo que duas cistenas (aminocidos no carregados) possam reagir entre si. Quaternria existente nas molculas com vrias cadeias polipeptdicas. Depende da forma como as vrias cadeias se organizam entre si, sendo que as interaces so as mesmas da estrutura terciria.
Desnaturao de protenas
A desnaturao consiste na perda de actividade biolgica da protena devido quebra das ligaes no covalentes e das pontes dissulfureto, que asseguravam a manuteno da sua estrutura terciria e
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quaternria. No entanto, durante a desnaturao, a estrutura primria da protena no se altera, ou seja, a sequncia linear dos aminocidos mantm-se constante. Os agentes desnaturantes mais comuns so: Ureia agente desnaturante que corta as ligaes no covalentes (ligaes hidrofbicas). -mercaptoetanol agente redutor que corta as pontes dissulfito. Atravs de um ensaio enzimtico, foi concludo que a conformao de uma protena est na sequncia dos aminocidos, ou seja, se a estrutura primria no for mantida, a protena no volta a ter actividade. A dilise consiste na remoo dos agentes desnaturantes, permitindo que a protena volte a adquirir a sua conformao nativa, readquirindo a sua actividade biolgica (renaturao). No caso da protena ser constituda por apenas uma cadeia peptdica, a actividade biolgica restabelecida quando a sua estrutura terciria a correcta. Caso a protena seja constituda por mais do que uma cadeia peptdica, ela s volta a adquirir a sua actividade biolgica quando se apresenta na correcta estrutura quaternria. No ocorre renaturao caso os agentes desnaturantes utilizados tenham sido: Enzimas (proteases) Meios de pH muito cido ou muito bsico, quando associados a temperaturas da ordem dos 180C.
5.1.
Enzimas
So especficas Apresentam um local activo para ligao do substrato Podem ou no ter um local alostrico Podem sintetizadas sob a forma de zimognio Podem ter necessidade de coenzimas No se consomem nas reaces So a maior e mais especfica classe de protenas Local activo da enzima local de ligao da enzima ao substrato. Local alostrico local de ligao da molcula efectora que pode activar ou inibir a enzima. Coenzima enzima inicialmente inactiva (sintetizada no organismo), e que para se tornar activa tem que sofrer protelise. Zimognios so formas precursoras das enzimas (forma inactiva) que tambm tm que sofrer protelise para se tornarem activas. Constante de Michaelis (Km) valor de concentrao de substrato para o qual a velocidade da reaco atinge metade do valor mximo. Se Km for um valor baixo significa que a enzima muito especfica, e que se liga fortemente ao substrato. Se o valor de Km for elevado pode concluir-se que a enzima pouco especfica e que o substrato no se liga muito fortemente enzima.
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Quanto mais substrato se adicionar enzima, maior a velocidade de produo do produto da reaco. Quando a enzima entra em saturao, a velocidade de formao de produtos estabiliza.
5.2.
Anticorpos
Anticorpos policlonais populao total de imunoglobulinas presentes num soro animal. So anticorpos que so sintetizados num animal, mas que reconhecem diferentes partes da protena antignica (diferentes determinantes antignicos ou eptopos). Este tipo de anticorpos reconhecem sempre o antignio, mesmo que este esteja sob a forma desnaturada. Anticorpos monoclonais um tipo de imunoglobulinas sintetizadas por um nico clone (clula) e que especfica para um nico determinante. Eptopos so sequncias de aminocidos relacionadas com a estrutura primria. Eptopos conformacionais a protena quando est no seu estado nativo, vai adquirir uma determinada conformao (estrutura terciria). Estruturas moleculares derivadas de modificaes ps-traduo estas modificaes que podem vir a conferir um reconhecimento aos anticorpos e permitir a activao das protenas (ex.: glicoprotenas, adio de fosfatos, etc.) Imunognio qualquer substncia capaz de induzir uma resposta imunitria. Imunoglobulina protena complexa, constituda por vrios domnios (estrutura quaternria). Possui duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, ligadas por pontes dissulfureto.
6. cidos nucleicos
Os cidos nucleicos so cidos orgnicos complexos formados por uma longa cadeia de nucletidos, presente no ncleo e, por vezes, no citoplasma das clulas vivas. Os dois tipos, DNA e RNA, constituem a base da hereditariedade. Os nucletidos, medida que se vo organizando na cadeia de cido nucleico constituem o cdigo gentico.
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Nucleossomas e a fibra de 30 nm
A cromatina nos ncleos encontra-se organizada estruturalmente, e a um nvel bsico, em subunidades com a forma de esferas, com dimetro de 10 nm, designadas por nucleossomas. Estes so protenas carregadas positivamente, na medida em que o DNA tem grupos fosfato carregados negativamente. O estudo estrutural detalhado mostra que cada nucleossoma constitudo por um esqueleto central proteico, constitudo pelo octmero de histonas 2x (H2A, H2B, H3 e H4), em torno do qual o DNA se enrola duas vezes, sendo este duplo enrolamento estabilizado por uma outra quinta histona (H1). O comprimento do DNA corresponde a 146 pares de bases nucleotdicas. As histonas so protenas altamente conservadas, ricas em aminocidos carregados positivamente. Desta forma, significa que no sofreram quaisquer alteraes durante a evoluo.
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Os nucleossomas so o primeiro nvel de compactao do DNA. O nvel seguinte consiste na concentrao dos nucleossomas justapostos, com enrolamento helicoidal posterior, formando uma longa fibra de 30 nm. As histonas, com a sua forma alongada, interactuam contribuindo assim para a aproximao dos nucleossomas e para a sua justaposio. Com o prosseguimento do ciclo celular, a fibra de cromatina organiza-se em nveis, sucessivos de complexidade, ainda hoje pouco esclarecidos, at formar o corpo do cromossoma em metafase. Este constitudo, de acordo com a hiptese mais aceite actualmente, por uma nica fibra de cromatina, composta por uma longa molcula de DNA, que percorre cada cromatdeo de um extremo ao outro.
Cromossomas
Um cromossoma uma molcula de DNA associada a protenas histnicas e no histnicas. constitudo por dois cromatdeos ligados pelo centrmero que se caracteriza por ser uma zona altamente compacta. Para que um cromossoma seja funcional, tem de possuir: Origem de replicao local onde se inicia a replicao do DNA; Centrmero regio especializada e complexa dos cromossomas que apresenta poucos ou nenhuns genes. o ponto de unio dos cromatdeos irmos e contm uma estrutura (o cinetocoro) a que as fibras do fuso se ligam durante a mitose e a meiose, pelo que tem um papel importante no movimento dos cromossomas em direco aos plos;
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Telmero sequncias de DNA existentes nas zonas terminais dos cromossomas, que impedem um encurtamento de DNA pela aco de uma enzima especfica. O telmero pode ter o comprimento de algumas centenas de pares de bases e participa na estabilidade e na replicao do cromossoma. Um crom ossom a norm alpossuidoi tel eros. A enzi a que protege os tel eros desi s m m m gna-se telomerase, que j no est presente na maioria das clulas adultas. Nas clulas embrionrias, existe sempre a telomerase, na medida em que esto em constante desenvolvimento. O genoma humano contm 23 pares de cromossomas, logo existem 46 molculas de DNA.
Caritipo
O caritipo o conjunto dos cromossomas duma clula eucaritica, normalmente definido em termos do seu nmero, dimenses e morfologia (forma e estrutura). caracterstico de cada espcie como, por exemplo, o caritipo humano. Este constitudo por 22 pares de cromossomas homlogos (autossomas) e um par de cromossomas sexuais (heterossomas). Bandas G possuem baixo teor em GC (guanina + citosina) e so escuras devido colorao de Giemsa. Bandas R elevado teor em GC e apresentam cor mais clara. Correspondem a zonas com maior densidade de genes, especialmente genes que so expressos em todos os tipos de clulas.
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Politinizao h repetio da molcula de DNA mas no h separao. Existe o cromossoma polytene e por isso que se consegue observar ao MOC.
Cromatina
Nas clulas eucariticas, a parte no nucleolar do ncleo formada, na sua maior parte, por uma estrutura fibrosa, a que se d o nome de cromatina. Esta constituda por DNA associado a uma quantidade igual de protenas bsicas, as histonas, e protenas no histnicas. A cromatina no ncleo em interfase est topologicamente compartimentada em domnios estruturais correspondentes a cada cromossoma e territrios, como por exempo, os dos centrmeros e os dos telmeros. Existem dois tipos de cromatina: Eucromatina a cromatina activa e a zona geneticamente mais activa do genoma, estando nela situadas as regies do DNA com uma hipersensibilidade marcada DNAase. Esta cromatina situa-se no interior do nucleoplasma. Heterocromatina corresponde s regies menos activas e inactivas do genoma, tem uma estrutura condensada e mantm o seu grau de condensao durante todo o ciclo celular. Localiza-se ao longo do interior do invlucro nuclear e junto dos poros nucleares. Facultativa segmentos cromossmicos ou cromossomas inteiros que durante o perodo precoce do desenvolvimento embrionrio se inactivam e condensam, continuando neste estado em todos os tecidos ou em muitos deles ex.: um dos cromossomas X das clulas femininas. Constitutiva caracteriza-se por ser constitudo por sequncias que se encontram altamente repetidas e organizadas lado a lado (em tandem). Assim, encontra-se em posies idnticas nos cromossomas homlogos.
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Ribossomas
Constitudos por RNA associado a protenas; So constitudos por duas subunidades (uma maior e outra menor); Nos procariticos, os ribossomas so do tipo 70S, em que a subunidade maior uma 50S e a subunidade menor uma 30S. Nos eucariticos, os ribossomas so do tipo 80S, em que a subunidade maior uma 60S (que est associada a 49 protenas) e a subunidade menor uma 40S (que est associada a 33 protenas). A subunidade maior constituda por 3 fraces (5S, 5.8S e 28S) e a subunidade menor constituda por 1 fraco (18S).
Cdigo gentico
O cdigo gentico a informao para a construo das protenas, inscrita no material gentico. No tem vrgulas na sua escrita, ou seja, lido na totalidade, sem quaisquer interrupes. Apresenta as seguintes caractersticas:
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Degenerado existem vrias codes que codificam o mesmo aminocido; Universal lido da mesma maneira, desde as bactrias at aos mameros (com excepo das mitocndrias, nas quais h algumas variaes no modo de leitura); Possui 43 = 64 codes; Existem 3 codes stop ou de terminao, para os quais no h nenhum anti-codo complementar, sendo responsveis por sinalizar o fim do processo de traduo (UAG, UGA, UAA); Existe um codo de iniciao que codifica a metionina e que sinaliza o incio do processo de traduo (AUG).
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1. Centrifugao
Na centrifugao, o comportamento de uma partcula num campo de centrifugao, depende do seu peso e da resistncia que encontra ao mover-se no meio da suspenso. A taxa de sedimentao : Directamente proporcional ao tamanho da partcula; Directamente proporcional diferena entre a densidade da partcula e a densidade do meio; Nula quando a densidade da partcula iguala a do meio; Inversamente proporcional viscosidade. Directamente proporcional fora centrfuga.
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Centrifugao isopcnica
Nesta centrifugao, a separao efectuada apenas por densidade, sendo que a zona de maior densidade tem uma densidade maior que a partcula a separar.
2. Cromatografia
A cromatografia um mtodo de purificao de protenas. Neste mtodo, utilizada uma coluna cheia com uma matriz com caractersticas especficas de acordo com o tipo de cromatografia que se vai realizar. No cimo da coluna, coloca-se a amostra que equilibrada com um tampo. Este tampo vai atravessando a coluna e medida que isto acontece, a amostra vai descendo ao longo da mesma.
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2.1.
2.2.
Nesta cromatografia, as protenas so separadas de acordo com a sua carga. Utilizam-se colunas que so carregadas positiva ou negativamente, atraindo as protenas de carga negativa ou positiva, respectivamente. Quando uma coluna tem carga positiva, atraindo protenas com carga negativa, diz-se que ocorre uma troca aninica. Quando a coluna possui carga negativa, atraindo protenas carregadas positivamente, diz-se que ocorre uma troca catinica. As protenas de carga contrria matriz so atradas por ela, sendo retardadas relativamente a outras que no sejam atradas pela matriz, e que vo ser eludas em primeiro lugar. A eluio da protena vai ser efecutada por uma soluo tampo, cujo pH altere a carga da protena, de acordo como o seu ponto isoelctrico. Podemos dar o exemplo de uma troca aninica (protena carregada negativamente e coluna carregada positivamente). Se adicionarmos uma soluo com um pH muito baixo (abaixo do ponto isoelctrico da protena), a protena tem que funcionar como uma base, aceitando H+ e ficando carregada positivamente. Neste caso, a protena deixa de ter afinidade com a matriz e eluda.
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Focagem isoelctrica
A focagem isoelctrica permite separar as protenas segundo a sua carga, sendo til para determinar rigorosamente o ponto isoelctrico de uma dada protena. Como se analisa a carga, o meio de suporte pode ser a poliacrilamida ou a agarose. O gel usado possui anflitos que so molculas cujo ponto isoelctrico conhecido. Assim, neste mtodo, necessrio aplicar uma corrente elctrica para que os anflitos se desloquem e criem um gradiente de pH. Estes anflitos devem possuir um conjunto de caractersticas: Condutividade no ponto isoelctrico; Inertes com as protenas em estudo; Capacidade tampo para no alterar o pH do meio; Solveis no ponto isoelctrico; Interaco mnima com as protenas; Baixo peso molecular.
A protena vai deslocar-se ao longo da matriz, sendo atrada pelo plo de carga contrria sua. Num determinado momento, a protena atravessa a zona da matriz onde esto situados os anflitos, cujo pH igual ao seu ponto isoelctrico. Aqui, as cargas positivas da protena vo ser iguais s cargas negativas, ficando a protena neutra. Assim, ela vai deixar de ser atrada para um dos plos e fica esttica junto aos anflitos com o mesmo ponto isoelctrico. Nota: Como o ponto isoelctrico dos anflitos conhecido, ento vai ficar a conhecer-se esse mesmo atributo nas protenas.
4. Imunocitoqumica
A imunocitoqumica uma tcnica que permite localizar protenas num determinado local do interior da clula. Para isso, utilizam-se molculas especficas para as protenas os anticorpos que localizam antignios nas clulas. Por esta razo, este mtodo a base para a maioria dos processos que utilizam anticorpos no seu procedimento. A visualizao conseguida atravs de um processo de marcao do anticorpo feita com enzimas ou fluorocromos (substncias fluorescentes). Como no possvel marcar todos os anticorpos (porque existe um nmero muito elevado de protenas), inicialmente vo ser utilizados os anticorpos que no esto marcados.
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Os antignios primrios so produzidos directamente pelo organismo receptor do anticorpo e os antignios secundrios so originrios de um outro organismo. No entanto, estes so marcados, inseridos no interior do primeiro organismo e vo permitir o reconhecimento da regio constante dos anticorpos.
5. Citometria de fluxo
Este mtodo de estudo permite identificar clulas atravs de dois mecanismos: ou pela luz que as clulas difundem, ou pela fluorescncia emitida quando atravessam um feixe de raios laser. Aqui, a separao das clulas pode ser efectuada tendo em conta trs factores: Marcadores; Tamanho das clulas; Contedo de DNA.
6. Microscopia
Uma vez que as clulas tm dimenses muito pequenas, ou seja, tm uma dimenso inferior ao poder de resoluo da viso humana, torna-se obrigatria a utilizao de aparelhagem adequada para a sua observao: os microscpios. Consoante os microscpios, pode estudar-se: Processos in vitro clulas em cultura, ou seja, a morfologia de clulas isoladas ou de tecidos (identificar os determinados tipos de clulas que fazem parte do tecido); A localizao de determinadas substncias desejas; Processos in vivo seleccionar clulas vivas e injectar-lhes determinadas substncias no seu interior observando, por exemplo, um determinado momento do ciclo celular. No caso do estudo de clulas em tecidos ou do estudo da sua morfologia, recorre-se usualmente a microscpios pticos. Por outro lado, no caso de se estudarem as clulas isoladas ou mesmo um determinado organismo, procedem-se a ensaios in vitro e in vivo.
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A sua utilizao baseia-se na propriedade que certas substncias tm de absorver a luz a um determinado comprimento de onda e, posteriormente, emitir luz a um comprimento de onda superior. Este mecanismo depende do fluorocromo que est a ser utilizado, dentro do espectro vsivel, no entanto existe apenas um nmero reduzido de substncias com capacidades de fluorescncia: a clorofila, a riboflavina, a vitamina A ou a porfirina. A base da tcnica para observar as clulas neste tipo de microscpio exactamente a mesma que usada no microscpio de campo claro. Porm, enquanto no primeiro os anticorpos tm que estar marcados com fluorocromo para serem vistos no microscpio, no segundo, os anticorpos tm de estar marcados com uma dada enzima para ficarem corados. por isso que a tcnica de fluorescncia vai decaindo, ou seja, ao fim de algum tempo de permanncia do fluorocromo nas clulas, o seu efeito desaparece. Desvantagens: Durante a focagem, focam-se vrios planos simultaneamente, ou seja, verifica-se uma sobreposio de imagens fluorescentes das molculas, a profundidades da clula, o que exibe uma imagem com pouca definio. Durante a fixao, pode haver destruio da antegenicidade das protenas, o que vai dificultar a sua ligao aos anticorpos, portanto a fluorescncia emitida perde eficcia. difcil utiliz-lo para seces de clulas finas. O prprio meio em que as clulas esto pode emitir fluorescncia, obscurecendo o sinal emitido pel anti o corpo (f enm eno decl ant).
6.2.
Microscpio confocal
Tal como o microscpio anteriormente referido, este tambm emite fluorescncia durante o processo de observao. No entanto, difere do microscpio de fluorescncia nos seguintes aspectos: Permite visualizar as molculas num nico plano de focagem e forma uma imagem a nvel de computador (imagem tridimensional com mais pormenores) e bastante mais definida deconvoluo. Utiliza raios laser. Tanto a fluorescncia do declant como a sobreposio de planos desaparecem. Devido ao seu elevado custo, so usados nos laboratrios, os de fluorescncia e no confocal.
6.3.
Este microscpio bastante utilizado para clulas vivas, em culturas, ou para observar movimentos celulares. Baseia-se nas diferenas entre os ndices de refraco, entre o interior da clula e o exterior da clula e zonas das clulas. Assim sendo, as diferentes espessuras e os diferentes tipos de refraco iro converter-se em zonas claras e escuras. O que este microscpio tem de especial relativamente aos outros,no que diz respeito morfologia uma placa com um anel com orifcio e um anel escuro. Isto faz com que os raios que atravessam a 28
Captulo 3 Mtodos de estudo das clulas |
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preparao sofra refraco e difraco, atingindo a objectiva ao atravessar o objecto. Os raios de luz no sofrem quaisquer desvios e passam pelo anel escuro ao induzir um atraso fase da onda, permitindo assim observar as zonas claras e escuras com maior nitidez. A principal desvantagem deste microscpio o facto de apenas ser possvel observar clulas isoladas ou tecidos ou cortes extremamente finos.
6.4.
muito utilizado na microbiologia e serve para observar estruturas muito pequenas, como as bactrias. Com este microscpio observamos o fundo escuro e estruturas extremamente brilhantes. Quando se liga o microscpio ptimo, possver o fundo todo iluminado, o que no acontece com o microscpio de fundo escuro, na medida em que os raios partem da fonte luminosa, atravessam o condensador, mas nem todos atingem a objectiva. Apenas aqueles que atravessam tambm o objecto que iro atingir a objectiva, dando origem s estruturas brilhantes que constituem as clulas que se pretendem observar.
6.5.
Microscpios electrnicos
Estes microscpios servem, principalmente, para estudar todas as estruturas existentes no interior da clula. Em comparao com os restantes, estes utilizam um feixe de electres (em vez de fotes), existindo uma grande diferena de potencial entre o ctodo (filamento de tungstnio) e o nodo que vai permitir a obteno de uma boa definio da imagem observada. Quanto maior a voltagem, maior a definio da imagem e maior a resoluo do microscpio. O poder da resoluo aproxima-se dos 0.1 nm, sendo muito pequeno em valor, mais muito grande na visualizao das clulas. Esta diferena de potencial provoca uma acelerao dos electres, sendo que para evitar as interferncias deste excesso de acelerao, todo o sistema est inserido num tubo constitudo apenas pelo vazio, a fim de no haver absoro de electres. Possui lentes electromagnticas onde se colocam as amostras, no entanto a imagem visualizada num ecr.
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Modo de funcionamento: 1. Quando o filamento de tungstnio aquecido no vcuo, produz electres. 2. H uma grande diferena de potencial entre o nodo e o ctodo, que leva acelerao dos electres. 3. Os electres passam no condensador e atingem o objecto a observar os electres tm fraco poder de penetrao logo os cortes devem ser extremamente finos. 4. Muitos electres so dispersos pelos constituintes da estrutura celular e contribuem para a formao de uma imagem intermdia dada pela objectiva. Aps a passagem dos electres, as estruturas celulares ficam destrudas. 5. Esta imagem depois ampliada por outra bobina projectora que equivale ocular do microscpio ptico. 6. A focagem feita pela variao da corrente electrnica que passa atravs das lentes electromagnticas.
Tipos de microscpios electrnicos: Transmisso (difere do segundo devido diferena de potencial) Transmisso de alta voltagem Esquadrinhamento SEM Integrado STEM (transmisso + enquadrinhamento)
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ENERGIA
Movimentos celulares, incluindo contraces musculares, arrastamento de clulas e movimento de cromossomas durante a mitose
Calor
1. Gliclise
A gliclise a sequncia metablica de vrias reaces enzimticas, em que a glicose oxidada produzindo duas molculas de cido pirvicoe dois equivalentes reduzidos de NAD +, que ao introduziremse na cadeia respiratria, produziro duas molculas de ATP. Os organismos primitivos originaram-se num mundo cuja atmosfera carecia de O2 e, por isso, a gliclise considerada com sendo a via metablica mais primitiva, estando portanto presente em todas as formas de vida actuais. Este processo, nos seres eucariontes, ocorre no citosol.
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A gliclise divide-se em duas partes principais: Na primeira, a glicose fosforilada com o gasto energtico de uma molcula de ATP para originar a glicose-6-fosfato, que se isomeriza para formar frutose-6-fosfato. A partir desta molcula e com gasto de outra molcula de ATP, forma-se a frutose-1,6-bifosfato. Assim sendo, nesta fase, foram gastas duas molculas de ATP. Esta uma reaco irreversvel na qual intervm a glicose e o ATP, onde constam cinco reaces bioqumicas. A importncia dos intermedirios fosforilados : Grupos fosfato so ionizados a pH 7, dando uma carga negativa aos intermedirios que ento, no conseguem atravessar a membrana celular; Grupos fosfato so essenciais na conservao da energia metablica; A ligao dos grupos fosfato ao centro activo da enzima fornece a energia de ligao.
Na segunda parte, a frutose-1,6bifosfato divide-se em duas molculas: gliceraldedo-3-fosfato e dihidroxiacetona-fosfato, por meio da enzima aldolase. Esta ltima molcula vai transformar-se tambm em gliceraldedo-3-fosfato, duplicando a reaco a partir deste momento. O gliceraldedo-3-fosfato sofre cinco reaces bioqumicas at se converter em piruvato. O piruvato pode ser oxidado a acetil-CoA na presena de oxignio (na matriz mitocondrial) e o NADH formado vai ser oxidado atravs da oxidao mitocondrial.
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2. Fermentao
A fermentao um processo anaerbio de transformao de uma substncia noutra, produzida a partir de microrganismos, tais como bactrias e fungos, chamados nesses casos de fermentos. Existem vrios tipos de fermentao, entre os quais: Fermentao lctica em que o piruvato origina o cido lctico.
3. Ciclo de Krebs
O ciclo de Krebs corresponde a uma srie de reaces qumicas que ocorrem no metabolismo celular. exectuado nas mitocndrias dos eucariontes e no citoplasma dos procariontes. Trata-se de uma parte do metabolismo dos organismos aerbios (utilizando oxignio da respirao celular) mas tambm dos organismos anaerbicos (atravs da gliclise, por exemplo).
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Este ciclo inicia-se quando o piruvato que sintetizado na gliclise transformado em acetil-CoA por aco da enzima piruvato-desidrogenase. Este composto reage com o oxaloacetato que um produto do ciclo anterior, formando-se citrato. Este vai dar ori gem a um com posto de ci nco carbonos, o cetoglutarato com libertao de NADH e de CO2. Por sua vez, o -cetoglutarato vai dar origem a outros compostos de quatro carbonos com formao de GTP, FADH2, NADH e oxaloacetato.
4. Fosforilao oxidativa
O processo de fosforilao oxidativa refere-se fosforilao do ADP em ATP, utilizando para isso a energia libertada nas reaces de oxidao-reduo. As transferncias de electres constituem reaces desse tipo, que se processam com libertao de energia, que pode ser aproveitada biologicamente para a sntese de ATP. A energia do transporte de electres primariamente utilizada para bombear protes para o exterior da matriz mitocondrial. Como consequncia deste mecanismo, vai haver a formao de um gradiente de protes, ou seja, um conjunto de concentraes de protes diferentes dentro e fora da mitocndria. Como a membrana interna deste organelo impermevel a protes, eles s podem voltar matriz e desfazer o gradiente atravs de locais especficos da membrana interna. A carga fica mais positiva no espao intermembranar, devido maior concentrao de protes e o pH fica sucessivamente mais cido, o que conduz produo de ATP atravs da ATP sintase.
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5. Sntese de polmeros
Existem monmeros que contm a energia necessria sua prpria ligao cadeia em crescimento (Tail polymerization) ex.: cidos nucleicos e polissacardeos. Existem monmeros que transportam a energia necessria para que se ligue o monmero seguinte (Head polymerization) ex.: protenas e cidos gordos.
6. Ciclo do azoto
O ciclo do azoto pode ocorrer nos nucletidos ou nas protenas. No caso dos nucletidos, originado nas dietas e na biossntese, pois o azoto das bases azotadas proveniente da glutamina, da glicina (aminocidos tambm importantes para a sntese de outros compostos) e do cido asprtico. Por sua vez, as pentoses ribose e desoxirribose so provenientes da glicose. No que diz respeito s protenas, a origem semelhante dos nucletidos. Na biossntese de polmeros, podem existir reaces favorveis quando se produz energia necessria para a sntese de molculas ou reaces desfavorveis quando no ocorrem devido ausncia de energia. Relativamente regulao, controlada por mecanismos de feedback negativo e de modificaes enzimticas. Isto acontece pois as enzimas s so activas quando esto fosforiladas.
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Este conjunto de protenas e DNA, localizado na zona da origem de replicao, vai originar a constituio de uma dupla forquilha de replicao, que se estende em direces opostas para os dois lados da origem no caso mais comum da replicao bidireccional. De modo a iniciar a sntese de cada cadeia filha, e devido impossibilidade de esta ser efectuada pelas DNA polimerases, um novo complexo enzimtico denomiado primase ir sintetizar um fragmento de RNA, o fragmento iniciador ou RNA iniciador,a parti da extrem i r dade 5de cada um a das novas cadei a as sintetizar. Este fragmento iniciador tem como funo permitir a ligao cadeia nascente das enzimas que consti tuem o com pl da D N A polm erase,para que este cont exo i nue a s ntese da cadei fiha na di a l reco 5 para 3 . No entanto, devido ao antiparalelismo da cadeia de DNA parental, das duas cadeias filhas a sintetizar, s um a poder ser fei de m odo cont ta nuo na di reco 5 para 3 a parti da regi da cadei r o a principal imediatamente adjacente origem de replicao esta ser a cadeia avanada (cadeia contnua ou leading). A outra cadeia filha no poder ser sintetizada de forma contnua, pois estar condicionada pelo facto da D N A polm erase ter um a ni di i ca reco de s ntese (de 5 para 3 Assi , esta cadeia atrasada ). m (cadeia descontnua ou lagging) ir ser sintetizada na direco oposta ao avano da forquilha de replicao, atravs da sntese e posterior ligao de mltiplos segmentos de DNA, todos iniciados por um pequeno fragmento de RNA iniciador colocado pela primase os fragmentos de Okazaki. O processo de juno de dois fragmentos de Okazaki implica a remoo do RNA iniciador existente no fragm eto de O kazaki a parti da sua extrem i r dade 5 por um a enzi a do ti RN Ase com acti dade m po vi exonucl ca 5 . esi -3 Ao mesmo tempo, para preencher esse espao, so adicionados novos nucletidos na extremidade 3do fragm ento de D N A que l fi adj he ca acente,com a aj uda de um a das D N A polm erases que consti o i tue complexo de replicao. Os dois fragmentos de DNA so finalmente ligados um ao outro pela DNA ligase, que estabelece a lgao fosf ester fi entre o grupo 3 i odi nal -OH do ltimo nucletido do primeiro fragmento de Okazaki e o alfa-P da exterm i dade 5do fragm ento de O kazakiadj acente que acabou de ser si nteti zado. De modo a aliviar a tenso de torso das cadeias durante o seu desenrolar pela helicase, enzimas de tipo topoisomerases vo igualmente actuar neste processo. Estas enzimas associam-se com a dupla cadeia parental a montante de cada uma das helicases e removem a tenso provocada pela toro da
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cadeia dupla atravs de uma srie de cortes pontuais nas ligaes fosfodiester, reformadas de seguida pela mesma enzima, que vo ocorrer durante o desenrolamento efectuado pela helicase.
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Depurinao caso em que falta uma base na cadeia, criando-se portanto um local apurnico (caso a base em falta seja uma purina), ou um local apirimidnico (caso a base em falta seja uma pirimidina). Tem de haver quebra das ligaes fosfodiester entre nucletidos, preenchimento do espao vazio e novamente ligao dos nucletidos. Para este processo, so ento necessrias as seguintes enzimas: - Endonucleases - DNA polimerase - DNA ligase Desaminao caso em que um uracilo est no lugar de uma citosina; hipoxantina em vez de adenina ou xantina em vez de guanina. Neste processo intervm as seguintes enzimas: - DNA glicosidases (remove o uracilo) - Endonucleases - DNA polimerase - DNA ligase
2. Transcrio
A transcrio constitui o mecanismo universal da expresso dos genes, unidades de DNA que contm a informao necessria especificao da sntese de todas as formas funcionais de RNA de cada clula. Trata-se de um processo sequencial que se processa em 3 etapas: Iniciao consiste no reconhecimento do stio do DNA genmico que ir ser copiado em RNA, e condensao dos primei nucl dos consti ntes das extrem i ros eti tui dades 5 do RN A nascente. P Elongao consiste na polimerizao orientada dos nucletidos, reflectindo a sequncia do DNA molde, e obedece regra da complementaridade estrutural das respectivas bases. Terminao resulta da interrupo selectiva do processo de transcrio da cadeia molde do DNA, delimitada pelo ltimo nucletido de cada gene activo, que corresponde portanto extremidade 3 -OH da cadeia de RNA transcrito. Existem zonas do DNA que so reconhecidas pela RNA polimerase e por protenas, como sendo o local de incio da transcrio promotor. Este uma sequncia de nucletidos qual se ligam protenas que informam a RNA polimerase que pode iniciar a sntese da molcula de RNA. Contm zonas consenso como a TATA box que altamente conservada e que existe na maior parte dos genes, constituda por nucletidos de adenina e timina (TATAAT). Existe uma protena que reconhece o promotor a TBP. Esta vai ligar-se TATA box que se encontra 25 a 35 nucletidos acima do incio da cadeia e vo adicionar-se vrios factores de transcrio. A RNA polimerase II tem uma sequncia de aminocidos terminal carboxlico que se designa CTD sinal reconhecido por outras enzimas e que indica que a molcula sintetiza o mRNA. Depois da RNA polimerase II 40
Captulo 5 Mecanismos genticos |
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se ligar, necessrio que todos os factores de transcrio recebam a abertura da cadeia. Para isso necessrio o TFIIH, que actua como uma cinase, fosforilando as protenas neste caso o terminal CTD.
Tipos de RNA
rRNA antes de passar para o citoplasma, associa-se a protenas e forma as unidades do ribossoma. mRNA RNA mensageiro, capaz de reconhecer o cdigo proteico. tRNA ler a informao contida no mRNA. snRNA relacionado com o proesso de splicing; reconhece zonas de RNA estranhas e remove-as. snoRNA envolvido na degradao da molcula de rRNA sintetizado no nuclolo.
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3.1. Capping
N os eucari ontes, a extrem i dade 5 da m ol a , i edi cul m atam ente aps a sua s ntese, bl oqueada pel fi a xao ao nucl do 5 term i da m ol a, de um res eti nal cul duo guani em posi lco o i nverti a da metilguanosina. O capping ocorre ainda durante a fase de elongao das cadeias de RNA nascente. Esta estrutura, designada cap, formada por adio do resduo G proveniente do dador GTP, formando uma ligao de ti pouco com um ,5 tri po -5 fosfato com o nucl do tri esi fosfato term i da cadei transcri nal a ta. A presena desta estrutura 5 cap impede a degradao do mRNA e respectivos precursores intranucleares pelas fosfatases ou pelas exonucleases, ao mesmo tempo que estimula a traduo dos mRNA pelo aparelho de sntese proteica dos eucariotas, ao nvel do citoplasma. A estrutura cap no s protege os mRNA eucariotas da degradao pelas nucleases, como tambm intervm activamente na formao do complexo de iniciao da traduo.
Depois de as molculas de RNA nascente produzidas pela RNA polimerase II atingirem um comprimento de 25 a 30 nucletidos, a 7-m etiguanosi e os outros com ponentes do 5 cap que se l na encontram no m RN A eucari co, so adi onados sua extrem i ti ci dade 5 Este passo i ci do . ni al processamento de RNA catalisado por um complexo enzimtico associado ao CTD fosforilado.
3.2. Splicing
Com apenas algumas excepes, a maior parte dos genes que codificam para as protenas nos eucariotas superiores contm sequncias no codificantes, os intres, intercalados nas sequncias codificantes, os exes. O processo de eliminao dos intres durante a maturao dos mRNA designado splicing, e consiste na exciso-reparao das cadeias dos respectivos produtos primrios da transcrio. O conjunto dos precursores do mRNA nucleares, que incluem as formas que se encontrm nas diferentes fases de maturao, constituem o RNA heterogneo nuclear (hnRNA). Este no se encontra livre no nucleoplasma, mas sim associado a protenas, sob forma de partculas ribonucleoproteicas que, no citoplasma, contm os mRNA maduros, aptos a ser traduzidos pelos ribossomas.
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Em unidades pequenas de transcrio, o fenmeno de splicing segue, normalmente, a poladeniao da extrem i i l dade 3 enquanto que em m ai , ores uni dades de transcri o,contendo um grande nmero de exes, o splicing s se inicia quando a transcrio de todo o gene termina.
3.3.
Poliadenilao
Na maior parte dos eucariotas, d-se a adio de 200 a 300 resduos adenlics, que formam uma cadeia de pol A na extrem i i dade 3 da m ol a. Esta reaco catalsada pel pol A polm erase que, cul i a i i juntamente com a endonuclease, constitui um complxo que inclui ainda uma partcla ribonucleoproteica contendo um pequeno RNA nuclear de composio rica em uridina, o U1RNA.
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Uma poli-A polimerase (PAP) conecta-se a um complexo proteico antes de a clivagem ocorrer. Este facto para a conexo da PAP liga a clivagem e a poliadenilao, para que a extrem i dade 3lvre sej rapi i a dam ente poladeniada. i l
Seguidamente clivagem, a poliadenilao divide-se em duas fases: em primeiro lugar, d-se a adio de 12 resduos adenlicos de forma lenta e seguidamente ocorre a adio dos restantes 200-250. Esta ltima fase requer uma ligao de vrias cpias de PABPII (polyA-binding protein).
Esta protena tem a capacidade de ligar a cauda adenlia mais curta inicialmente adicionda pela PAP, estimulando a polimerizao de um novo conjunto de fragmentos adenlicos. Para alm disso, a PABPII tambm responsvel por sinalizar poli-A polimerase que pode finalizar a polimerizao quando a cauda poli-A atinge um comprimento de cerca de 250 nucletidos, ainda que o mecanismo para controlar esse tamanho ainda no seja conhecido.
4. Sntese do rRNA
As molculas de rRNA vo ser sintetizadas no nuclolo com excepo do gene que d origem fraco 5S, que existe no nucleoplasma. Existem vrias fraces de rRNA que no se associam s protenas, e que vo dar origem s duas subunidades dos ribossomas. A fraco 45S sintetizada pela enzima RNA polimerase I e a fraco 5S pela RNA polimerase III. A fraco 45S vai ser degradada por outras pores de RNA no codificadas designadas snoRNA (small nucleolar RNA), originando outras tres fraces de rRNA (5.85S, 18S, 28S). A fraco 18S associa-se a protenas, e d origem subunidade menor do ribossoma, enquanto que as fraces 5.85S e 28S do origem subunidade maior do ribossoma. O componente fibrilar so as zonas do nuclolo que contm os RN A transcri e a com ponente s tos granular composta pelas zonas que contm os RNAs associados a protenas. A lmina nuclear constituda por filamentos intermedirios que fazem parte do citosqueleto e que so altamente
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organizados, existindo cromatina associada parte interna da membrana nuclear (heterocromatina protena em forma condensada, sem genes activos).
5. Traduo
Formao do aminoacil tRNA
Esta fase o primeiro passo da sntese proteica e s ocorre na presena da aminoacil tRNA sintetase, sendo que cada aminocido tem a sua. Os aminocidos de grandes dimenses penetram nas bolsas enquanto que os mais pequenos so inicialmente activados pelas AMP (adenina monofosfato). A cada codo do mRNA correspnde um anticodo dum tRNA que transporta um aminocido. As molculas de tRNA podem servir de transportadores de aminocidos, estabelecendo uma ligao covalente entre o grupo hi droxio da ri l bose lgada adeni no extrem i i na dade 3e o grupo carboxio do am i l noci a do ser transportado. A reaco catalisada pelas enzimas sintetase de aminoacil-tRNA utiliza ATP e permite a esterificao dos grupos O H em posi 3ou 2 A reaco ocorre em duas etapas:pri ei a form ao dum am i o . m ro noacil adenilato com libertao de pirofosfato e depois a reaco com o tRNA para a formao do aminoaciltRNA:
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O aminocido activado devido ligao do AMP ao seu grupo carboxlico formando-se um aminocido adenilado. Este AMP proveniente da hidrlise do ATP j referido. O aminocido adenilado transferido para uma molcula de tRNA havendo uma ligao do grupo carboxi do am i lco noci e do grupo hi do droxio do acar 3 do tRN A, sendo que com l esta ligao ster, fica formado o aminoacil tRNA.
1 - Iniciao
A traduo inicia-se quando h um aminoacil tRNA que se liga ao local P da subunidade pequena do ribossoma, em vez de se ligar ao local A. Assim, com esta ligao, este aminoacil tRNA tem um codo complementar de iniciao AUG. A ligao do aminoacil tRNA ao local P, bem como a ligao da subunidade pequena ao mRNA, deve-se participao de factores proteicos ou factores de iniciao (eIF, eIF1, eIF2 e eIF3). O eIF2 vai, ento, ligar-se molcula de tRNA, fazendo com que esta molcula se possa ligar ao local P do ribossoma. No entanto, esta molcula pode sofrer alteraes e deixa de se poder ligar ao tRNA, sendo necessrios novos mecanismos de regulao. O eIF2 na forma inactiva tem ligado a si GDP e na forma activa, troca para GTP. Para isso, necessrio que o eIF2 sofra fosforilao atravs de cinases.
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As duas subunidades do ribossoma esto separadas no citosol. A pequena est ligada ao eIF3 e a grande est ligada ao eIF6, sendo que quando se encontram neste forma, perdem a capacidade de se unir e impedem o decorrer da traduo. Por sua vez, o eIF2 que permanece ligado ao GTP, pode associar-se ao aminoacil tRNA e para se conseguir ligar ao local P do ribossoma, tem de estar aqui associada a subunidade menor, ligando-se ao eIF1A, e formando um complexo de pr-iniciao (tem esta designao porque ainda no comeou a sntese). Depois de a molcula ter o eIF4, o complexo de iniciao liga-se, iniciando a sntese da molcula de RNA. No entanto, se o tRNA est ligado a outras moleculas, caso haja um novo aminoacil tRNA no vai ter capacidade de se ligar. Quando se forma o complexo de iniciao, liga-se m ol a de RN A na extrem i cul dade 5 e segue at encontrar o codo AUG. Quando o encontra, d-se o estabelecimento de pontes de hidrognio entre o codo e o anticodo presente a nvel do RNA. Quando h pontes de hidrognio, a subunidade maior pode ento ligar-se, mas inicialmente o GTP hidrolisa-se e o eIF2 deixa de ter capacidade de ligao e todos os factores ligados at ao momento, desligam-se tambm. A partir deste momento, a subunidade maior do ribossoma j tem a capacidade de se associar menor. No entanto, como tem ligado a si o eIF6, impede esta conexo, necessitando de um novo factor activo com uma molcula de GTP que permita a ligao do eIF6 subunidade menor, o IF5. Assim que a ligao ocorre, os factores eIF5 e eIF libertam-se, juntamente com a GTP, permitindo que finalmente se inicie a sntese do peptdeo.
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2 - Elongao
Factores de Elongao permitem que a leitura codo-anticodo seja correcta. Esta fase requer factores de elongao que se ligam a uma molcula de ATP e ao aminoacil tRNA, sendo que no caso dos eucariotas, este factor o EF1, que para ser activo tem de ter uma molcula de GTP. Em primeiro lugar, ocorre o emparelhamento entre o anticodo do tRNA e o respectivo codo do mRNA no local A, atravs de pontes de hidrognio, bem como a hidrlise do GTP (em GDP + Pi). Esta hidrlise revela-se fundamental para que a leitura seja correcta existindo, enquanto isso, um tempo de espera. Durante esse tempo de espera, verifica-se se o aminoacil tRNA o correcto ou no: Se for incorrecto, o nmero de ligaes que se subemtem entre o codo e o anticodo so menores e quando ocorre a hidrlise do GTP, liberta-se o factor EF1 e o aminoacil tRNA porque a ligao fraca. Se for correcto, h separao do complexo (GDP + EF1) do local A, sendo libertados e o aminoacil tRNA mantmse estvel neste local. A ligao peptdica existente entre o aminocido do local A e do local P sintetizada e catalizada pela enzima peptidiltransferase. Para que o local A fique livre, actua um segundo factor de elongao, o EF2. Este factor permite a translocao das molculas de tRNA para outros locais do ribossoma e liga-se nas proximidades do local A, fazendo com que o ribossoma se desloque trs nucletidos. Assim, ocorre a transferncia do peptidil tRNA do local A para o local P, e de seguida para o local E, acompanhada da sada do tRNA que se encontrava no local P para o citosol. Quando ocorre este processo, o ribossoma altera a sua configurao e as suas ligaes iniciais so modificadas.
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3 - Terminao
Factores de Terminao/Libertao quando um codo stop encontrado, fazem com que o polipeptdeo seja libertado e as clulas ribossmicas se dissociem. Quando no mRNA surgem codes de terminao codes stop (UAA, UAG, UGA) para os quais no h nenhum anticodo do tRNA correspondente, o crescimento da cadeia peridica termina. Estes codes vo ento ser reconhecidos por factores de terminao/libertao, existentes no citosol, ligando-se directamente a eles. Esta ligao altera a actividade da enzima peptidiltransferase, levando adio de uma molcula de H2O, em vez de um grupo amina de um aminocido ao peptidil tRNA que se encontra no local P (perda no prprio RNA). Como consequncia desta adio, h libertao da cadeia peptdica para o citosol e separao das duas subunidades dos ribossomas bem como do mRNA.
Polissomas / Poliribossomas - no caso de as protenas serem sintetizadas no citosol, os poliribossomas sintetizam as vrias molculas de protenas, em que cada um dos ribossomas d origem a uma molcula proteica.
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Nos seres procariticos, como no possuem o fragmento CAP, o que lhes indica onde se inicia a transcrio uma sequnci de nucl dos j a eti unto extrem i dade 5 N a m ol a de m RN A transcri . cul ta, acontece que a molcula tem vrias sequncias codificadas, podendo dar origem a vrias protenas, logo o mRNA procaritico policistrnico.
8. Chaperes Moleculares
Enquanto a cadeia polipeptdica se encontra em crescimento, no pode enrolar para no adquirir configurao diferente do normal. Para que isto seja possvel, ocorre a ligao de um conjunto de protenas cadeia em crescimento - os chaperes moleculares impedindo: Que esta adquira uma m conformao; A precipitao das cadeias polipeptdicas (agregao de protenas).
Existem dois tipos de chaperes moleculares, o HSP70 e o HSP60, e foram descobertos quando as clulas estavam sujeitas a aquecimento, verificando-se que havia protenas em excesso. Quando a protena est 100% sintetizada, os chaperes libertam-se e vai dar-se o estabelecimento de ligaes favorecendo a conformao normal da protena.
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9. Ubiquitinao
A ubiquitinao um processo de degradao de protenas que permite remover os chaperes moleculares. Normalmente, as ubiquitinas existem em toda as clulas, havendo enzimas que permitem que elas se liguem protena que vai ser degradada, formando depois uma cadeia de ubiquitinas ligada protena. As ubiquitinas ligam-se protena e sinalizam ao proteossoma (que reconhece a protena com a cadeia de ubiquitinas) que existe uma molcula que tem de sofrer degradao. Esta molcula envia o sinal e , mais tarde, reconhecida pelo nucleossoma.
Genes com zonas codificveis e zonas no codificveis. Os genes so transcritos para uma molcula que vai sofrer processamento e de seguida passa para o citosol. O primeiro codo a ser transcrito indicado pela m etiguanosi que exi na extrem i l na ste dade 5 sendo o , primeiro AUG que est mais prximo desta extremidade que vai indicar qual o codo a ser traduzido. O primeiro aminocido a metionina. O processo de transcrio e de traduo do-se em diferentes locais e a diferentes tempos. O gene vai ser transcrito, processado e traduzido, dando origem a um nico tipo de protenas RNA
Todos os genes so codificveis (contm exes). Os genes so transcritos no citoplasma (e no no ncleo) e a molcula no vai sofrer processamento. O primeiro codo a ser transcrito indicado por uma sequncia de seis nucletidos (logo indica que nesse local que se vai iniciar tambm o processo de traduo).
O primeiro aminocido : n-formil-metionin (derivado). O processo de transcrio d-se no mesmo local que o processo de traduo. D-se vrias vezes o incio do processo de traduo, dando origem a vrios tipos de protenas RNA | Captulo 5 Mecanismos genticos
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monocistrnico.
policistrnico.
Captulo 6 Biomembranas
As membranas biolgicas so, sob o ponto de vista estrutural, bicamadas de lpidos anfipticos onde se intercalam, aqui e alm, molculas proteicas. So estruturas termodinamicamente estveis, cuja manuteno no requer hidrlise de ATP. As membranas biolgicas permitem a separao do contedo celular do espao extracelular, j que a natureza hidrofbica do interior da camada lipdica impede a passagem de gua. A troca metablica de molculas solveis em gua entre a clula e o espao extracelular est condicionada pela formao de canais transmembranares resultantes da associao dinmica de protenas que se encontram intercaladas na bicamada fosfolipdica. Nas clulas procariticas, as membranas biolgicas participam apenas na definio do limite da clula. Nas clulas eucariticas, as membranas exercem tambm funo de invlucro, tanto do ncleo como de organelos intracelulares. Assim, nestas clulas, as membranas biolgicas tm um papel fundamental, na organizao da topografia do seu meio interno, separando-o em vrios compartimentos, sendo dois principais: o nuclear e o citoplasmtico. As membranas subdividem ainda o citoplasma em dois espaos: um que contnuo, designado por matriz citoplasmtica ou citosol, que fica entre a membrana plasmtica e as membranas do ncleo e dos organelos citoplasmticos, e outro espao, que descontnuo, de topografia exoplasmtica, constitudo pelo somatrio dos espaos contidos nos organelos ou vesculas que so limitadas por membrana.
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Assimetria expressa-se pela diferente composio molecular observada nas duas metades da membrana: os fosfolpidos e as protenas no se encontram distribudos de forma equivalente nos dois folhetos da membrana, estando os glicolpidos presentes apenas no folheto exoplasmtico da bicamada fosfolpidica.
2. Os lpidos da membrana
Mobilidade - O movimento lateral dos lpidos faz-se dentro de cada um dos folhetos da bicamada, sendo raras as permutas destas molculas entre os dois folhetos (flip-flop) devido barreira hidrofbica que os separa, o que requer aco enzimtica e consumo de energia. A fluidez da bicamada depende da natureza qumica dos seus lpidos. Assim, um incremento de molculas de colesterol diminui a fluidez da bicamada fosfolipdica, devido interaco destas molculas com as regies polares dos fosfolpidos. De igual modo, a maior concentrao de fosfolpidos saturados encontrada no folheto externo da membrana torna este folheto menos fluido do que o folheto interno. Assimetria A desigual composio qumica dos fosfolpidos nos dois folhetos da bicamada implica a natureza assimtrica da membrana. Os dois folhetos fosfolipdicos apresentam diferenas tambm de carga elctrica, sendo o folheto citoplasmtico o de maior carga negativa. As protenas citoslicas ligam-se a determinados grupos polares das molculas lipdicas, atravs de cinases, e os grupos polares das molculas lipdicas sofrem modificao atravs da fosfolipase C (fosfatidilinositol). No entanto, a assimetria no regra universal para todas as molculas da membrana, j que as molculas de colesterol se encontram na maioria das clulas dos mamferos, em nmero semelhante nos dois folhetos da membrana.
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2.1. Fosfolpidos
Os fosfolpidos so as molculas lpidicas que se encontram em maior abundncia nas membranas biolgicas. Como molculas anfipticas que so, os fosfolpidos so constitudos por duas extremidades que reagem diferentemente presena de gua: uma hidrofbica ou polar e outra hidroflica ou apolar, sendo esta ltima constituda por duas caudas de cidos gordos. Em presena de gua, os fosfolpidos anfipticos orientam-se de modo a evitarem o contacto das suas extremidades hidrofbicas com molculas de gua. Por esta razo se organizam espontaneamente em pequenas formaes esfricas as micelas ou, talcomo observado, nas membranas biolgicas, em bicamadas, com as extremidades hidrofbicas dos fosfolpidos orientadas face a face, e para o interior da membrana. Cria-se assim um espao interior bicamada fosfolipdica, que hidrofbico e se furta ao contacto com a gua. Da composio fosfolipdica das membranas das clulas eucariticas destacam-se, em termos quantitativos, quatro molculas: fosfatidilcolina, esfingomielina, fosfatidilserian e fosfatidiletanolamina. O nico destes fosfolpidos que apresenta carga negativa a fosfatidilserina, os outros trs fosfolpidos no apresentam carga a pH fisiolgico. No entanto, os fosfolpidos que se encontramem pequena concentrao na membrana plasmtica podem ter uma grande relevncia na fisiologia da clula. o caso dos fosfolpidos de inositol, que so elementos cruciais em mecanismos de transmisso de sinal para o interior da clula.
2.2.
Colesterol
Nas membranas da maioria das culas eucariticas, o colesterol , a seguir aos fosfolpidos, a molcula lipdica que se apresenta em maior abundncia. Em particular nas membranas de 54
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clulas que esto sujeitas a alteraes marcadas da sua forma, a presena de molculas de colesterol essencial para que no ocorram roturas na bicamada fosfolipdica. As molculas de colesterol tm tambm maior facilidade de saltarem entre os dois folhetos da membrana (movimento de flip-flop) do que os fosfolipdos. A sua presena refora a impermeabilidade da bicamada gua, diminui a fluidez da membrana e tambm a temperatura a que se regista a transio de fase. As membranas de clulas procariticas so totalmente desprovidas de molculas de colesterol.
2.3.
Glicolpidos
Os glicolpidos encontram-se apenas no folheto exoplasmtico da membrana exterior das cluals eucariticas. Ao contrrio dos fosfolpidos e do colesterol, os glicolpidos no tm a mnima capacidade de fazer o movimento de flip-flop entre os dois folhetos da membrana. Assim, estas molculas podem actuar como receptores especficos de molculas presentes fora da clula, podendo tambm ligar-se a componentes da matriz extracelular.
2.4.
Rafts lipdicos
A membrana biolgica no toda ela de carcter homogneo, existindo determinadas zonas onde se encontra uma maior concentrao de algum tipo de molculas, que exercem a sua funo especfica. Com isto, descobriu-se que existem microdomnios ao longo das membranas, onde ocorrem alguns procesos relacionados com a membrana. Uma destas estruturas constituda pelos raf ts lp cos que so zonas mais espessas, i di especializadas da membrana, ricas em esfingolpidos, colesterol e protenas. Parecem estar envolvidos em mecanismos de adeso celular, sendo que as cadeias hidrocarbonadas dos esfingolpidos de uma monocamada interagem com os esfingolpidos da outra monocamada comunicando, assim, entre si.
3. As protenas da membrana
A massa de uma protena da membrana de tamanho mdio 40 a 60 vezes superior massa de um fosfolpido. Na maioria das membranas celulares, as protenas contribuem para cerca de metade da sua m assa total o que perm i concl r que as prote m em branares esto com o que di vi , te ui nas ssol das num m ar de pequenas molculas lipdicas que, em nmero, lhes so dezenas de vezes superiores. Boa parte das protenas membranares, particularmente as que se expressam em espaos exoplasmticos, contm resduos sacardeos e so, portanto, glicoprotenas. O processo de glicosilao das protenas (e dos glicolpidos) da membrana faz-se durante o seu trfego intracelular e termina quando estas molculas passam pelo complexo de Golgi. Tal como as molculas lipdicas da membrana, as protenas esto sujeitas a movimentos de rotao e de deslocamento lateral e, tal como acontece com os
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glicolpidos, no lhes permitido movimento de flip-flop entre os dois folhetos da bicamada. Assim, os movimentos de lateralidade das protenas na membrana podem ser medidos com exactido, aps conjugao de ligando fluorescente protena.
Protenas integrais (1, 2, 3, 4) atravessam o plano hidrofbico da membrana e so observadas nas faces de fractura. 1 e 2 Protenas transmembranares 3 Protena ligada a um cido gordo (sintetizada no citosol) 4 Ligada ao glicosilfosfatidilinositol (sintetizada no retculo endoplasmtico) Protenas perifricas (5, 6) no tm a capacidade de se integrar na membrana e so observadas nas superfcies de membranas intactas. Por atravessarem a bicamada fosfolipdica, as protenas integrais contm, necessairamente, segmentos hidrofbicos na sua molcula e, por isso, so de purificao mais difcil do que as protenas perifricas. O seu isolamento requer ruptura da bicamada fosfolipdica, o que pode ser obtido tratando preparaes de membrana com detergentes (Triton ou SDS), os quais, devido sua natureza anfiptica, se ligam s regies hidrofbicas das protenas integrais, separando as extremidades no polares dos fosfolpidos circundantes e formando micelas na gua. A purificao das protenas perifricas mais fcil: basta tratar as preparaes da membrana com solues de salinidade elevada, no sendo, portanto, requerida disrupo prvia da bicamada fosfolipdica. NOTA: Ora dentro das protenas transmembranares consoante a funo dessas protenas das membranas, elas podem obter ou apresentar estruturas de elementos diferentes. As protenas transmembranares, portanto aquelas que atravessam totalmente a membrana podem ser protenas transportadoras: 56
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Ou transportam molculas de um lado para o outro da membrana, apresentando uma estrutura em hlice que atravessa a camada lipdica; Ou esto envolvidas no transporte atravs da formao de canais, apresentando uma estrutura em camadas ex.: porinas (aparecem na membrana externa das mitocndrias e bactrias, permitindo a passagem de molculas sem alterao da sua conformao, no envolvendo dispndio de energia).
3.2.
A membrana que apresenta um estudo mais avanado a dos eritrcitos, na medida em que: Existem em grande quantidade (permitindo obter membranas puras que so depois dissolvidas pelo SDS); So anucleados; No tm organelos; Os eritrcitos maduros no tm ncleo, no tem capacidade de sintetizar, mas apresentam mecanismos e enzimas que conseguem remover os produtos que so txicos para a clula. A forma anterior dos eritrcitos a dos reticlcitos, onde se consegue observar RNA.
Inicialmente, os eritrcitos so conduzidos plasmlise atravs da insero numa soluo hipotnica, obtendo-se membranas puras que sero sujeitas a electroforese em gel de poliacrilamida (onde as protenas so separadas quanto sua massa). Os tipos de protenas encontrados so os seguintes: Espectrina Protena mais abundante nos eritrcitos humanos; Possui cadeias e hlice (protena fibrosa) que depois se unem em determinados pontos, formando uma rede de filamentos proteicos que constituem o citosqueleto (responsvel pela forma das clulas); Formada por dmeros que se unem atravs da actina e da topomiosina formando tetrmeros; Confere uma forma bicncava aos eritrcitos A sua ligao com a banda 3 feita por aco da anquirina, permitindo a conexo membrana. Banda 3 Protena transmembranar que atravessa vrias vezes a membrana; Protena glicosilada, mais negativa que a glicoforina; Protena transportadora, responsvel pela deslocao do CO2 nos pulmes. um canal inico que permite o transporte de CO2 sob a forma de HCO3- que tem carga negativa. Por isso, este trocado pelo io Cl- carregado negativamente, para que a clula no fique electricamente neutra. Surge associada anquirina.
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Glicoforina No tem funo cientificamente definida; Protena que atravessa uma nica vez a membrana; Protena altamente glicosilada; Apresenta um peso molecular semelhante ao da Banda 3. Banda 4.1 Liga a glicoforina actina; Responsvel pela ligao membrana. Actina Responsvel pela ligao membrana. Anquirina Liga a espectrina membrana, ligando-se banda 3.
3.3.
1) Recolha de uma clula de animal e de uma clula humana, e marcao de ambas com fluorocromos, com o objecto de obter uma boa visualizao ao microscpio. 2) Fuso das duas clulas num meio de substncias que permitem esta reaco a clula que resulta da fuso designa-se por heterocrio. 3) Marcao da membrana proteica do animal com fluorocromos verdes e da membrana proteica do ser humano com fluorocromos vermelhos, sendo que se encontram de lados opostos do heterocrio. 4) Incubao do heterocrio a 37C durante 40 minutos, fazendo com que as protenas das duas clulas sejam misturadas e sejam encontrados fluorocromos dos dois tipos espalhados por toda a membrana.
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3.4.
A mobilidade das protenas no permitida ao longo de toda a membrana nas culas epiteliais e nos espermatozides. No caso das clulas epiteliais, acontece que existem, na zona apical, junes celulares designadas por tight junctions que fazem com que as protenas de parte apical no se movimentam para a parte basal e vice-versa, pois so clulas polarizadas. Assim sendo, a funo das membranas nesta zona tem de ser diferente das membranas da outra parte, sendo consideradas protenas especficas.
4. Os acares da membrana
Os acares que podem ser encontrados na membrana so: Glicolpidos associados a lpidos Glicoprotenas associados a protenas Proteoglicanos existem no espao intracelular e so constitudos por uma parte de acar com caractersticas especiais e por outra parte proteica. As protenas e os lpidos podem sofrer glicosilao s em dois locais da clula: no retculo endoplasmtico ou no complexo de Golgi. Da que s as protenas que vo ser sintetizadas no retculo que podem sofrer glicosilao, porque de seguida vo para o complexo de Golgi onde podem: Sofrer multiplicao da cadeia oligossacardica, que foi adicionada s clulas no retculo; Sofrer outra glicosilao. Ora as protenas que esto associadas ou sintetizadas no retculo vo ser transportadas para o complexo de Golgi atravs de vesculas e deste vo ser transportadas para a membrana ou para o exterior da clula, por vesculas. A vescula funde-se com a membrana e o seu contedo passa para o exterior. Para alm disto, os acares da membrana encontram-se no lado no citoslico da membrana, constituindo o glicoclice. Na sua maior parte, estes acares so importantes no reconhecimento celular, como por exemplo quando os leuccitos atravessam os vasos sanguneos porque existem clulas que expressam determinados acares que vo ser reconhecidos por protenas na outra clula e vo permitir que as clulas comuniquem e atravessem a parede do capilar.
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Transporte passivo as molculas passam a favor do gradiente de concentrao atravs de determinadas protenas (transportadoras ou canais), num processo espontneo e sem qualquer gasto de energia. Transporte activo as molculas so transportadas contra o seu gradiente de concentrao. Difuso simples as molculas passam a favor do gradiente de concentrao e como so lipdicas ou polares no carregadas, de pequenas dimenses, conseguem atravessar determinadas membranas. No entanto, ocorre mais lentamente que o transporte passivo.
5.1.
Bombas energticas de ATP protenas que transportam a molcula contra o gradiente, com gasto de energia (transporte activo) GTPases. Protenas canais conforme o canal est aberto ou fechado, necessita de um estmulo para permitir a passagem das molculas, so de dois tipos:
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Pricas esto sempre abertas e o movimento a favor do gradiente de concentrao (permitem a passagem do potssio para dentro e para fora da clula). Canais inicos esto abertos ou fechados consoante as necessidades da clula, necessitando estas de estmulos para abrir (ocorrem alteraes da voltagem, ligao a um ligando e stress mecnico). Protenas transportadoras ligam-se ao soluto a transportar, alteram a conformao e deixam-nas passar, atravs de vrios processos. A molcula transportada a favor do gradiente fornece energia para o transporte daquela que transportada contra. Uniporte transporte de solutos de um lado para o outro da membrana de forma simples, a favor do gradiente de concentrao e num mecanismo de difuso facilitada. Simporte transporte de molculas contra o gradiente de concentrao num mecanismo de transporte activo, em que a molcula a transportar e o io so transportados no mesmo sentido, sendo um transportado a favor do gradiente e o outro contra (soluto). Antiporte transporte de molculas tambm contra o gradiente de concentrao, em que a molcula e o io so transportados para lados opostos da clula, sendo um a favor do gradiente e o outro contra.
Transporte passivo
Este transporte, baseado na difuso facilitada, responsvel pela passagem da glicose das clulas epiteliais para o sangue. O transporte da glicose ocorre a favor do gradiente de concentrao e atravs de transportadores da membrana, designados GLUT. Quando a glicose se liga ao transportador, a configurao deste vai alterar-se e a glicose vai ser exposta do outro lado da membrana, no havendo quaisquer gastos de energia.
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Transporte activo
Este transporte, no se d conjuntamente com a hidrlise de ATP. responsvel pela passagem da glicose do lmen intestinal at s clulas epiteliais contra o gradiente de concentrao. A energia proveniente provm do cotransporte de Na+, que se encontra muito concentrado na zona extracelular e ao entrar na clula a favor do gradiente gera energia suficiente para transportar a glicose tambm para o interior da clula, mas contra o gradiente. O transportador apresenta dois locais de ligao: um para o Na+ e outro para a glicose. Este transporte activo est dependente do transporte activo primrio (bomba de Na+ e K+), que mantm uma concentrao de Na+ baixa na zona intracelular e alta na zona extracelular, propcia para que ocorra o transporte. Caso no existem ies Na+ no exterior da clula, no vai haver o transporte de glicose contra o gradiente de concentrao.
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K+ num fluxo contnuo. Para alm disso, a clula recorre ao K+ para neutralizar as cargas negativas das molculas orgnicas. O Na+ sai juntamente com molculas de gua para compensar a hipertonia causada pelos solutos orgnicos que tendem a reter a gua no interior da clula.
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5.5. Transporte de molculas atravs da dupla membrana das bactrias (ATPases tipo ABC)
Na membrana externa existem protenas canais que permitem a passagem das molculas a favor do seu gradiente de concentrao para o espao intermembranar. Aqui, as protenas periplsmicas reconhecem as molculas de soluto, alteram a sua prpria conformao e ligam-se s protenas transportadoras situadas na membrana interna. Como se tratam de ATPases do tipo ABC, o transpore tem de ser feito contra o gradiente de concentrao, havendo gasto de energia. Assim, a molcula vai atravessar a membrana interna e passar para o interior da clula. Depois de a protena transportadora libertar o soluto, separa tambm a protena periplsmica da sua constituio, que fica livre para receber uma nova molcula proveniente do exterior. Nos seres eucariotas, as clulas com este tipo de bombas, quando ligadas a determinados medicamentos, tm a capacidade de permitir a resistncia a drogas devido ao transporte, do interior para o exterior, das molculas de medicamentos recebidas.
Tipo V transporte de ies H+ para o interior dos endossomas (vesculas celulares que tm a capacidade de ao sofrerem maturao se transformarem em lisossomas importantes para a digesto celular e em enzimas que vo permitir a degradao de todo o tipo de molculas em pH = 5). Caso ocorra uma mutao nestas bombas, no h transporte de H+ para os lisossomas, no se atinge um pH = 5 e as enzimas no efectuam a degradao das molculas que l chegam. Tipo ABC transporte de ies e molculas pequenas, existindo essencialmente em bactrias e algumas clulas de mamferos. 64
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No citosol as protenas podem sofrer alteraes ps-traduo: Fosforilao Glicosilao adio da N-acetilglucosamina a um resduo da serina Ligao de coenzimas a algumas enzimas Ligao a cidos gordos e incorporao na membrana (protenas integrais)
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2. Ncleo
O ncleo delimitado do citoplasma por um sistema membranar denominado invlucro nuclear, constitudo por uma dupla membrana com poros nucleares. No lado interno deste invlucro, situa-se a lmina nuclear, constituda por filamentos intermedirios altamente organizados, que confere forma ao ncleo e serve de ancoragem cromatina. Na mitose ocorre a despolimerizao dos filamentos, sempre depois da fosforilao das lminas. No ncleo, encontra-se o patrimnio gentico da clula, sob a forma de molculas de DNA que quando associado a histonas, forma a cromatina, que se espalha pelo interior do ncleo. Para alm da cromatina, identifica-se uma outra estrutura, o nuclolo, que representa o local de biossntese de ribossomas. Os poros nucleares so revestidos por protenas (nucleoporinas) que reconhecem peptdeos sinal (ricos em arginina e lisina) ou signal patches das protenas a transportar.
No transporte de molculas entre o ncleo e o citosol (e vice-versa) intervm as seguintes protenas e sinais: NLS nuclear localization signal peptdeo sinal que indica que a protena vai para o ncleo NES nuclear export signal peptdeo sinal que indica que a protena vai para o citosol Ran-GDP existente no citosol / Ran-GTP existente no ncleo Ran-GAP GTPase activating protein permite a hidrlise do GTP no citosol GEF permite a passagem do GDP a GTP no ncleo I porti e importam molculas para o ncleo, reconhecendo o NLS m nas Exportinas reconhecem as protenas que vo para o citosol, atravs do NES.
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2.1.
A protena que vai ser transportada para o citosol tem consigo um sinal de exportao nuclear o NES -. Este sinal vai ser reconhecido pela exportina existente no ncleo e que necessita de estar associada Ran-GTP para formar um complexo com a protena desejada. Assim que o complexo fica formado, reconhecido pelas nucleoporinas (NPC) presentes no envelope nuclear e passa para o citosol. Aqui, para a protena ficar livre no local desejado, tem de sofrer separao dos restantes componentes do complexo. Desta forma, o GTP hidrolisado a GDP atravs da Ran-GAP e ocorre a separao dos trs componentes: Ran-GDP, exportina e protena. A protena permanece no citosol, a exportina passa novamente para o ncleo depois de ser reconhecida pelas nucleoporinas para uma nova passagem, e a Ran-GDP tambm passa novamente para o ncleo para que seja substituda em GTP atravs do GEF, na medida em que o Ran s fica activo ligado a GTP e no a GDP.
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3. Transporte mitocondrial
As protenas das membranas mitocondriais que esto envolvidas no transporte de protenas so: Tom translocadores da membrana externa Tim translocadores da membrana interna Oxa translocadores da membrana interna que permitem a insero na membrana interna das protenas sintetizadas no citosol ou na mitocndria.
3.1.
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prosseguir o seu percurso. Para que a protena chegue matriz mitocondrial, tem de atravessar a membrana interna da mitocndria, onde existem os translocadores internos Tim , sendo que assim que inicia o processo de passagem pelo espao intermembranar, os chaperes desligam-se da protena. Assim que a protena chega matriz, novos chaperes voltam a ligar-se por mais uma hidrlise de ATP em ADP + Pi. Desta forma, s quando toda a protena se encontra na matriz mitocondrial que o peptdeo sinal retirado por peptidases e os chaperes desligam-se, libertando a protena e permitindo que ela adquira a sua conformao normal e a funo biolgica respectiva.
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Aqui, o segundo peptdeo sinal reconhecido e a protena fica presa membrana interna devido ausncia de peptidases que reconheam a sequncia do peptdeo sinal a ser cortada. 2) A protena apresenta um peptdeo sinal que conduz a protena para a matriz e um outro que se relaciona com os translocadores Oxa. A protena segue todo o processo (3.1.), sendo que na matriz o primeiro peptdeo sinal retirado normalmente e o segundo vai ser reconhecido pelo Oxa1. Assim, a protena adere membrana interna onde fica presa, e com os dois terminais virados para a matriz. 3) A protena no apresenta peptdeo sinal no terminal amina, mas apresenta vrios peptdeos sinais ao longo da cadeia peptdica. Assim, ao longo do processo (3.1.), a protena no consegue passar atravs do canal Tim, ficando presa membrana interna, e enrolando-se tantas vezes quantos peptdeos sinais tiver na sua constituio. Neste caso, os dois terminais ficam virados para o espao intermembranar.
4. Peroxissomas
Os peroxissomas so organelos citoplasmticos limitados por uma membrana. Do seu contedo destacam-se enzimas oxidativas, como a urato oxidase. As reaces de oxidao catalizadas por estas enzimas produzem perxido de hidrognio (H2O2), que utilizado pela catalase (outra enzima abundante no peroxissoma) para oxidar um conjunto de outros substratos, tais como fenis, cido frmico, formaldedo e lcool. Outra importante funo dos peroxissomas consiste na beta-oxidao dos cidos gordos em acetil-CoA. Possivelmente, o peroxissoma representa o vestgio de um organelo primitivo, responsvel por metabolizar o oxignio antes do aparecimento das mitocndrias. Tal como as protenas mitocondriais, as protenas
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destinadas ao peroxissoma so sintetizadas por ribossomas do citosol e depois dirigidas para peroxissomas pr-existentes mediante a presena de sinais especficos. Nas plantas, os peroxissomas podem existir nas folhas onde intervm na fotorespirao ou nas sementes germinativas, onde transformam cidos gordos em cido succnico que, mais tarde, transformado em acares (glioxissomas).
4.1.
Nos peroxissomas, as protenas, ao contrrio do caso das mitocndrias, encontram-se na sua conformao activa e vo atravessar a membrana com estas caractersticas. Apresentam um nico peptdeo sinal no terminal carboxlico que vai ser reconhecido pelas Pex5, que so protenas citoslicas. Os receptores da membrana reconhecem o Pex5 e permitem a passagem da protena para o interior do peroxissoma onde a protena e o Pex5 se dissociam.
5. Retculo Endoplasmtico
O retculo endoplasmtico constitudo por um labirinto intracelular de cisternas, delimitadas por membranas. Parte destas cisternas esto revestidas por ribossomas e denominam-se retculo endoplasmtico rugoso. Outra parte no se associa a ribossomas e denomina-se retculo endoplasmtico liso. O retculo endoplasmtico rugoso responsvel pela sntese de todas as protenas secretadas para o exterior da clula, bem como de todas as protenas transmembranares e das enzimas lisossmicas. Na realidade, a sntese destas protenas inicia-se em ribossomas localizados no citosol. No entanto, estas protenas distinguem-se das restantes por possurem um sinal que consiste numa sequncia especfica de aminocidos. O retculo endoplasmtico liso escasso na maioria das clulas. No entanto, este compartimento encontra-se particularmente desenvolvido em certos tipos especializados de clulas. o caso das clulas do
| Captulo 7 Organizao interna das clulas
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fgado, clulas musculares e clulas produtoras de hormonas esterides. O retculo liso tambm o local de acumulao de enzimas responsveis pela sntese de hormonas esterides a partir do colesterol e, por isso, encontra-se muito desenvolvido nas clulas produtoras deste tipo de hormonas. Finalmente, o retculo liso contm protenas de transporte e sequestro de clcio, e por isso muito abundante nas clulas musculares. Microssomas vesculas resultantes da homogeneizao das clulas. Os microssomas lisos resultam do retculo liso, do complexo de Golgi, da membrana, etc.. Depois da centrifugao, os microssomas rugosos separam-se facilmente dos lisos porque a sua densidade bastante superior. Atravs do estudo destas vesculas, pode concluir-se sobre a forma como as protenas so sintetizadas no retculo endoplasmtico.
5.1.
Assim que o peptdeo sinal do retculo endoplasmtico chega ao ribossoma, ligado a uma protena que o reconhece (o SRP). O SRP entrega o ribossoma com a protena nascente ao receptor da SRP que se situa na membrana do retculo endoplasmtico. Esta interaco reforada pela ligao de uma molcula de GTP tanto ao SRP como ao seu receptor. A transferncia da protena nascente at ao transportador canal da membrana do retculo endoplasmtico est relacionada com a abertura desta molcula e com a insero do peptdeo sinal e do segmento adjacente protena em crescimento. O SRP e o seu receptor dissociam-se da protena canal, o GTP hidrolisa-se e seguidamente renemse todas as condies necessrias para a insero de uma outra cadeia polipeptdica. medida que a cadeia cresce, passa atravs da protena canal para o lmen do retculo endoplasmtico, onde o peptdeo sinal cortado por uma peptidase e rapidamente degradada. A cadeia peptdica continua a elongar-se medida que o mRNA transcrito em direco extrem i dade 3 Com o o ri . bossom a se encontra anexado protena canal, a cadeia em crescimento expulsa atravs dela para o lmen do retculo endoplasmtico.
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Por fim, quando a transcrio est completa, o ribossoma libertado e o que resta da cadeia peptdica passa tambm para o lmen do retculo, fechando a protena canal e conferindo a conformao nativa protena sintetizada. Nota: Algumas protenas secretoras entram no lmen do retculo endoplasmtico depois da transcrio estar completa. Nestes casos, o transporte tambm condicionado por um complexo proteico adicional, da famlia dos chaperes, designado BiP. Este complexo embebido na membrana junto protena canal, onde reconhecido pelo lmen do retculo endoplasmtico. Tal como os outros chaperes, o BiP possui um domnio peptdico e um domnio de ATPase. Assim que o terminal amina da protena chega ao lmen do retculo endoplasmtico, a peptidase corta o peptdeo sinal. A interaco do BiP-ATP com a restante poro lumnica da protena provoca a hidrlise do ATP, produzindo uma alterao conformacional no BiP. De seguida, o BiP-ADP obtido permanece ligado cadeia proteica, induzindo uma sequncia de hidrlises de ATP que permite a ligao de vrias complexos BiP-ADP molcula, at que toda ela esteja no lmen do retculo. Quando isto acontece, as molculas de BiP trocam espontaneamente o ADP por ATP, levando libertao do polipeptdeo que vai adquirir a sua conformao nativa.
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passagem fica impedida e a sntese da protena continua. No final, o terminal amina indica que o destino o retculo e que passava para o lmen. No entanto, a sntese continua at que o outro peptdeo sinal se localize na membrana, onde vai ficar alojado e onde faz com que o terminal amina fique virado para o lado citoslico e o terminal carboxlico para o lmen.
Existem quatro tipos de protenas transmembranares: Tipo 1 apresentam um peptdeo sinal do terminal amina e esto ligadas membrana com o seu terminal amina virado para o lmen e com o terminal carboxlico virado para o citosol. Tipo 2 no possuem peptdeos sinais no terminal e esto orientadas ao contrrio das anteriores: com o terminal amina para o citosol e o terminal carboxlico para o lmen. Tipo 3 apresentam a mesma orientao das tipo 1, mas no apresentam peptdeo sinal no terminal. Estas diferenas na topologia reflectem os diferentes mecanismos utilizados pela clula para estabelecer a orientao da membrana dos segmentos transmembranares. Tipo 4 contm mltiplos peptdeos sinais ao longo da cadeia proteica e nenhum no terminal, fazendo com que a protena apresente tantas hlices transmembranares quantos peptdeos sinais tiver. As protenas tipo 4 aqui representadas correspondem s protenas com receptores tipo G que a orientam com o terminal amina para o lmen e com o terminal carboxlico para o citosol. No entanto, existem protenas tipo 4 que podem ter um nmero diferente de hlices e adquirir vrias orientaes para os terminais.
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Depois de o dolicolfosfato com os 7 resduos de acar sofrer flip-flop, passa para o lmen do retculo, onde as 4 manoses restantes so adicionadas uma a uma, juntamente com 3 molculas de glicose. Nas reaces seguintes, o acar a ser adicionado inicialmente transferido de um UDP para um transportador de dolicolfosfato situado no lado citoslico. O transportador sofre ento flip-flop para a face do lmen e o acar transferido para o oligossacardeo crescente. Por fim, o transportador volta a sofrer flip-flop e volta novamente para o lado citoslico.
O precursor completo no processo anterior transferido do transportador dolicol para um susceptvel resduo de aspargina que se encontra numa protena nascente, assim que a aspargina passa para o lado do lmen do retculo endoplasmtico.
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e formando uma molcula de RNA no citosol. Esta molcula activa de mRNA vai ser traduzida para originar uma protena que vai actuar como factor de transcrio. Estes factores vo ligar-se a um determinado gene e induz a sua activao, provocando uma sntese de uma molcula de mRNA e sendo transportado para o ncleo atravs do reconhecimento por importinas. Por fim, codificam-se os chaperes do retculo endoplasmtico que ao serem produzidos no retculo endoplasmtico, ajudam as protenas a adquirir a sua conformao.
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O m i sturador no espec co para grupos cabea de fosf i deo em parti ar e,portanto,equii fi oglcer cul lbra os diferentes fosfoglicerdeos entre as duas monocamadas.
Transporte de fosfoglicerdeos
Vesculas transportar para o complexo de Golgi, lisossomas e membrana plasmtica Protenas da membrana existem protenas no citosol que reconhecem os fosfolpidos, ligam-se a elas e transportam-nos para a membrana do organelo desejado. No caso da mitocndria, a fosfatidiletanolamina, no vai ser transferida. A fosfatidilserina sofre descarboxilao na membrana da mitocndria e transforma-se em fosfatidiletanolamina, para depois ser integrada na membrana. Contacto entre membranas quando as membranas podem contactar directamente entre si, transportam as molculas atravs dos pontos de contacto.
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5.8. Ubiquitinao
Quando as protenas so consideradas anormais, ou ficam no lmen ou passam para o complexo de Golgi, no conseguindo completar o transporte para o seu destino. Quando isto acontece, devido ao facto de as protenas provocarem destabilizao da clula, tm uma conformao imprpria e so reconhecidas por chaperes, fazendo com que as protenas passem para o citosol atravs do translocador que as reconheceu quando entraram para o lmen do retculo. Este translocador uma protena transmembranar que reconhece a protena como protena que deve ir para o lmen do retculo e permitindo-lhe a passagem para o citosol. Posteriormente, ocorre a remoo da cadeia oligossacardica atravs da glicanase, num processo designado ubiquitinao. Neste processo, as ubiquitinas que esto no citosol reconhecem a protena num determinado aminocido que tem compatibilidade com a ubiquitina. A protena que tem a cadeia de ubiquitinas vai ser reconhecida por um proteossoma que tem a capacidade de destruir as protenas e de controlar a qualidade da clula. O processo de ubiquitinao ocorre no citosol, mas tambm pode dar-se no ncleo. Quando isto acontece, protenas que so transportadas para o ncleo podem estar a adquirir uma conformao errada. Assim, tanto podem sofrer uma desfosforilao ou uma fosforilao como podem ser sintetizadas em determinadas alturas por diferentes processos, sendo no final eliminadas.
6. Complexo de Golgi
O complexo de Golgi localiza-se, geralmente, perto do ncleo e constitudo por uma srie de cisternas empilhadas, rodeadas por inmeras vesculas. Em cada pilha de cisternas distingue-se uma face cis (ou face de entrada), mais prxima do ncleo, uma face trans (ou face de sada), mais afastada do ncleo e uma face mdia situada entre as duas anteriores. Junto face cis, as vesculas representam um sistema de vaivm entre o Golgi e o retculo endoplasmtico rugoso: das cisternas do retculo destacam-se, continuamente, vesculas que se fundem com as cisternas do complexo de Golgi, transportando as protenas destinadas via de secreo; em sentido inverso, destacam-se vesculas das cisternas do Golgi que retornam ao retculo transportando protenas que no entram na via de secreo. Da face trans destacam-se vesculas destinadas ou via de secreo ou aos lisossomas. Ao atravessar o complexo de Golgi, as protenas sofrem uma srie de modificaes que incluem a remoo de alguns acares (geralmente resduos de manose), a adio de outros (por exemplo, N-acetilglucosamina, 80
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galactose e cido silico). O complexo de Golgi , portanto, o local da clula onde se produzem as glicoprotenas e os proteoglicanos.
No complexo de Golgi existe, ainda, o TGN (Trans Golgi Network) que parte as vesculas para as diferentes partes da clula (membrana, lisossomas, exterior da clula, etc.)
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O processo de sntese complexo, uma vez que os glucdios so adicionados um a um, inicialmente na superfcie citoslica do retculo e mais tarde na sua prpria luz onde se concluir a sntese do sacardeo. Este depois transferido para os resduos asparagina dum polipptido em formao, por intermdio da oligossacardeo transferase. No retculo endoplsmico, imediatamente aps a actuao desta enzima, as 3 glicoses (que actuam como sinal de finalizao ou maturao do oligossacardeo) e 1 manose so removidas. Do retculo endoplsmico, esta glicoprotena passa ao complexo de Golgi por meio de vesculas (COP II) e aqui processada, pela interveno dum conjunto de reaces coordenadas, que consistem na remoo de cinco das 8 manoses restantes, na adio de 3 N-acetilglucosaminas, 3 galactoses, 3 resduos de cido Nacetilneuramnico (cido silico) e uma fucose, uma reaco de cada vez, em relao a cada cadeia do oligossacardeo.
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Para haver fuso da membrana da vescula, h necessidade da interveno de uma GTPase, a dinamina, que actua formando e terminando a vescula. A clatrina apenas necessria para a formao da vescula, sendo dissociada no final do processo, com a ajuda de chaperes, hidrlise do ATP e, provavelmente, pela controlo da concentrao de clcio. Assim sendo, s no final da dissociao que a vescula reconhecida pelos lisossomas e se funde com as suas membranas.
Formao das vesculas COP I e COP II Para que haja formao de vesculas, necessrio que haja a interveno de protenas que se inserem na membrana, sendo elas as GTPases: para a COP I a ARF e para a COP II a Sar1. Estas protenas existem no citosol na forma inactiva e ligadas ao GDP. Tm incorporadas molculas lipdicas e enquanto permanecerem inactivas, as molculas lipdicas ficam protegidas do meio aquoso (citosol). Quando a GTPase se torna activa, necessita da protena GEF (que permite a transformao de GDP em GTP). Assim, o GEF faz esta transformao, sendo que o GTP ao reagir com a GTPase vai permitir que o cido gordo altere a sua conformao, ficando inserido na membrana. Esta molcula lipdica vai ser reconhecida pelo revestimento (COP I ou COP II) e este vai ligar-se GTPase.
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Para ocorrer a dissociao do revestimento, o GTP tem de ser hidrolisado. Com isto, altera-se a conformao e o cido gordo vi ser recolhido na molcula, havendo um local de ligao para o entre o revestimento e a protena.
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Interveno da Rab e do respectivo efector O Rab uma GTPase que est inactiva no citosol porque est ligada a um GDP e outras molculas que impedem a activao. Quando fica activa devido presena de GTP (RabGTP) j se pode ligar a uma vescula do organismo dador que tem v-SNAREs. Esta vescula aproxima-se da membrana-alvo apropriada, onde existem efectores Rab e t-SNAREs. Assim, os efectores reconhecem o RabGTP e os t-SNAREs reconhecem os vSNAREs, formando-se um complexo com cada. De seguida, ocorre a fuso das membranas e a libertao do complexo SNARE para uma nova fuso vesicular.
Interveno do NSF e das SNAPs Depois de ocorrer a fuso das duas membranas, ocorre imediatamente a dissociao das protenas SNARE que constituem o seu complexo. Para isto ocorrer, intervm a NSF juntamente com uma protena SNAP que se liga ao complexo. A NSF catalisa a hidrlise do ATP em ADP + Pi conduzindo dissociao das duas protenas para uma nova fuso membranar.
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mitocndrias, os lisossomas e um sortido de vesculas para o retculo endoplasmtico ou para a periferia da clula. Por sua vez, o transporte retrgrado depende das dinenas transporta mitocndrias, elementos do retculo endoplasmtico e endossomas tardios para o centro da clula.
Secreo regulada necessita de um estmulo do exterior, podendo ser um neurotransmissor ou uma hormona, que se liga a um receptor da membrana e faz com que as molculas existentes sejam secretadas da clula.
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7. Lisossomas
O s lsossom as so sacos i i ntracel ares delm i ul i tados por um a m em brana e chei de enzi as os m hidrolticas, capazes de digerir todas as macromolculas da clula. Conhecem-se cerca de 40 tipos de enzimas lisossmicas, que incluem proteases, nucleases, glicosidases, lipases, fosfolipases, fosfatases e sulfatases. Todas estas enzimas tm uma particularidade: so preferencialmente activas em meio cido e, para acidificar o seu meio interno, os lisossomas possuem na membrana uma bomba de protes. Deste modo, a clula est dupl ente protegi contra um ataque por parte das enzi as am da m lisossmicas. Por um lado, a membrana impede o acesso das enzimas ao citoplasma. Por outro, no caso de eventual fuga, as enzimas no so activas ao pH neutro do citoplasma. Os lisossomas tm bombas de hidrognio tipo V que permitem bombear H+ do citosol para os lisossomas e o consequente abaixamento do pH. Na clula, os lisossomas desempenham fundamentalmente trs funes: Digerem macromolculas provenientes do exterior pela via da endocitose, fornecendo nutrientes para o metabolismo da clula. Desempenham um papel fundamental na destruio de componentes celulares obsoletos autofagia. Participam na degradao de microrganismos ou partculas nocivas clula atravs do mecanismo de fagocitose.
7.1.
Existem trs tipos de vesculas: Endossomas perifricos no possuem enzimas hidrolticas e s so transformados pelos endossomas tardios. Endossomas tardios recebem as enzimas hidrolticas do complexo de Golgi. Lisossomas Os endossomas perifricos transformam-se em lisossomas atravs de um destes dois processos: As vesculas sofrem maturao e portanto vo-se transformando progressivamente em lisossomas. Existem trs vesculas que comunicam entre si e transportam as molculas entre si por um sistema de vesculas que vo transportando o contedo do endossoma para o endossoma tardio e depois para o lisossoma.
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Endocitose / Pinocitose Na pinocitose ocorre a formao de vesculas revestidas por clatrina nos coated pits. Uma partcula de LDL (low-density lipoprotein) uma esfera com aproximadamente 25 nm de dimetro, apresenta um fosfolpido externo que contm uma nica molcula de uma protena designada apoB-100. A maior parte das clulas produz receptores para a superfcie da clula, que se ligam especificamente protena apoB-100 e englobam a LDL atravs da endocitose mediada por esses receptores. Depois da endocitose, as partculas de LDL so transportadas para os lisossomas atravs de um percurso endoctico e depois so degradadas por hidrolases lisossmicas. Os receptores de LDL, que se dissociam dos seus ligandos no endossoma tardio, vo ser reciclados para a membrana celular. Tendo por base que o endossoma tardio tem pH = 5.0 no seu interior, vai ento fundir-se com o lisossoma e as protenas e lpidos da partcula livre de LDL so distribudas para as suas partes constituintes, por enzimas no lisossoma , formando uma vescula que contm cidos gordos, aminocidos e colesterol. Por fim, o material no digerido nos lisossomas eliminado por exocitose e formam-se cavolas em que no h formao de vesculas revestidas, mas sim a formao de cavolas em rafts lipdicos atravs da caveolina.
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Nota: Nos receptores dos coated-pits, podem surgir dois casos distintos : (A) O receptor de LDL est localizado na membrana plasmtica apresenta um local de ligao para o LDL e um terminal na parte inferior que permite o emparelhamento com o coated-pit revestido por clatrina. Depois de ocorrer esta ligao, os LDL vo ligar-se aos receptores que se encontram no coated-pit. (B) O receptor de LDL diferente do anterior porque no apresenta o terminal de ligao para o coated-pit revestido por clatrina. Assim, as partculas de LDL ligam-se aos receptores que permanecem nos locais originais da membrana e o coated-pit fica vazio.
Fagocitose A fagocitose uma forma especial da endocitose onde partculas de grandes dimenses, como microrganismos, so ingeridos atravs de grandes vesculas fagocticas, os fagossomas. Existem dois tipos de clulas que realizam a fagocitose: os macrfagos e os neutrfilos. Estes dois tipos de clulas desenvolvemse a partir de uma mesma clula precursora e defendem o nosso organismo contra infeces provocadas pela ingesto de microrganismos. Para alm disso, os macrfagos tambm so importantes no processo de eliminao de clulas velhas ou danificadas. Enquanto que as vesculas endocticas envolvidas no processo de pinocitose so pequenas e uniformes, os fagossomas apresentam dimetros determinados pelo tamanho da partcula ingerida. Os fagossomas fundem-se com lisossomas e o material ingerido degradado. De seguida, substncias indigestveis permanecem nos lisossomas, formando corpos residuais.
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Para serem fagocitadas, as partculas tm de ligar-se inicialmente superfcie do fagcito. Estes tm uma grande variedade de receptores na sua superfcie, que esto funcionalmente ligados maquinaria fagoctica da clula. Ao contrrio da pinocitose, a fagocitose um processo com iniciadores que requer os receptores activados a transmitir sinais para o interior da clula para iniciar a resposta. Os melhores iniciadores so anticorpos que se ligam superfcie dos microrganismos infecciosos para formar um revestimento onde a cauda de cada anticorpo (regio Fc) se encontra virada para o exterior. O revestimento por anticorpos reconhecido por receptores especficos (receptores Fc) na superfcie dos macrfagos e dos neutrfilos. A ligao destes anticorpos aos receptores induz, ento, a emisso de pseudpodes pela clula fagoctica, que englobam a partcula e se fundem para formar o fagossoma.
Autofagia A autofagia consiste na digesto intracelular de organelos e estruturas da prpria clula. Deste modo, podem ser eliminados organelos que deixaram de ser necessrios actividade celular. Este processo relativamente selectivo, sendo includos nos vacolos de autofagia, principalmente, os organelos que deixaram de ser funcionais. Contudo, em certos casos, a autofagia pode ser muito mais generalizada.
8. Mitocndrias
8.1. Composio das mitocndrias
Mitocndrias so organelos celulares presentes na maioria das clulas eucariticas e responsveis, em condies aerbias, pela obteno da maior parte da energia necessria s clulas que as possuem. Tm aspecto morfolgico muito varivel, podendo ocorrer, contrariamente ao que o seu nome indica, sob diversas formas, como redonda, oval e em bastonete ou filamento, e apresentando variaes no seu tamanho, nmero e distribuio, no s segundo os diferentes tipos de clulas como tambm durante o ciclo de vida de uma mesma clula. Uma clula humana contm, em mdia, cerca de 3000 a 5000 destes organelos citoplasmticos.
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As mitocndrias contm duas membranas muito diferentes, que definem dois compartimentos: o espao intermembranar e a matriz mitocondrial. Membrana externa contm protenas canais que permitem a passagem das substncias entre o citosol e o espao intermembranar. Tem tambm enzimas envolvidas na sntese de lpidos que s existem ao nvel da mitocndria. Membrana interna forma invaginaes designadas por cristas mitocondriais, cujo nmero varia com o tipo de clula, ou seja, podem ter mais ou menos cristas consoante o nvel de energia que a clula consome. Contm cardiolipinas (duplo fosfolpido) que muito importante pois reduz a permeabilizao da membrana a ies. Assim sendo, a membrana interna contm todas as protenas que intervm na transferncia de electres, onde se d a fosforilao oxidativa, ou seja, todas as protenas que so transportadoras de electres. Estas protenas so constitudas por vrias cadeias polipeptdicas e formam grandes complexos enzimticos. Por fim, esta membrana contm a ATP sintetase (que uma ATPase) que permite a sntese de ATP e que constituda por vrias cadeia polipeptdicas que tambm tm a capacidade de hidrolisar o ATP. Espao intermembranar espao delimitado pelas duas membranas, apresentando composio semelhante do citosol. Matriz mitocondrial local onde ocorre grande parte dos processos energticos da mitocndria. Apesar de tambm ser um dos compartimentos da mitocndria, apresenta composio diferente do espao intermembranar. Para alm disso, um local muito especializado e contm uma substncia fundamental onde coexistem DNA e ribossomas.
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Ciclo de Krebs No ciclo de Krebs, a acetil-CoA posteriormente metabolizada numa srie de reaces sequenciais, catalisadas por enzimas, conhecidas como o ciclo do cido ctrico ou ciclo de Krebs. Daqui resultam 3 molculas de NADH, 1 de FADH2, 1 de GTP e 2 de CO2. Alm destas, formam-se ainda mais duas molculas que so muito importantes no metabolismo dos aminocidos. So elas o oxaloacetato e o alfasetoglutarato que actuam como compostos intermedirios, da sntese dos aminocidos, para alm de fazerem parte do prprio ciclo.
Fosforilao oxidativa O NAD+ capta electres e transforma-se em NADH e capta protes e portanto tem a capaciade de se transformar em NADH. O mesmo acontece com o FAD. Ao haver a transferncia de electres ao longo da membrana, eles tornam-se cada vez menos energticos. Existe tambm uma enzima na membrana interna, a ATP sintetase, que permite que os
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protes existentes em grande quantidade no espao intermembranar, consigam passar a favor do seu gradiente para a matriz mitocondrial e quando isso acontece, o ADP transforma-se em ATP. Para alm disso, tambm hidrolisa ATP consoante as condies da mitocndria, como as concentraes de ATP e o gradiente electroqumico de protes.
Gradiente electroqumico de protes Se os protes existentes na matriz passam para o espao intermembranar, cria-se um pH cido neste local. Para alm disso, ocorre um aumento e consequente excesso de cargas positivas no espao intermembranar, cuja diferena com as negativas, facilita o transporte de molculas para dentro e para fora da matriz. O gradiente electroqumico gera um gradiente de pH atravs da membrana, e um potencial de membrana atravs da membrana interna da mitocndria. A dissipao deste gradiente (transporte de protes do espao intermembranar para a matriz mitocondrial) utilizado por um complexo enzimtico da membrana interna (a ATP sintetase) para formar ATP. No entanto, o gradiente electroqumico de protes no utilizado apenas para a sntese de ATP. Conforme as necessidades especficas da clula, a energia armazenada usada para outras funes importantes, como o transporte de molculas e ies para a mitocndria. Por exemplo, ela utilizada no trasnpotre de ADP, fosfato, piruvato e clcio (importante regulador da actividade enzimtica).
O gradiente de pH serve para o transporte de piruvato para o interior da clula. No caso das clulas eucariticas, o io transportado era o Na+ e nos procariotas era o H+. Aqui nas eucariticas, o io que vai ser cotransportado o H+, logo o cotransporte simporte. O Pi vai ser transportado por simporte, transporte activo secundrio e a favor do seu gradiente de concentrao. Cadeia respiratria A cadeia respiratria permite que a grande quantidade de energia libertada pela reduo de oxignio a gua ocorra em vrias pequenas reaces de oxidao/reduo, de maneira a que possa ser armazenada em vez de se dissipar sob a forma de calor. Cinco complexos enzimticos de mltiplas unidades polipeptdicas (complexos I a V), juntamente com a ubiquinona (coenzima Q) e o citocromo c, constituem a cadeia respiratria ou cadeia de transporte de electres. A maior parte dessas estruturas so componentes intrnsecos da membrana interna mitocondrial.
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Ubiquinona (Coenzima Q) pequena molcula hidrofbica (membrana interna) Citocromo c presente no espao intermembranar NADH desidrogenase ou NADH reductase protenas com flavina, ferro e enxofre, que recebem os electres do NADH Succinato redutase protenas com ferro e enxofre Complexo bc1 ou citocromo c reductase citocromos e protenas com ferro e enxofre Citocromo c oxidase citocromos e protenas com cobre
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A mitocndria uma organela que contm DNA, que sofre replicao, sendo que esta no ocorre s na fase S do ciclo celular mas tambm no ncleo. Esta replicao pode fazer-se ao longo de todo o ciclo, sendo possvel que algumas molculas se repliquem mais que outras. No entanto, o factor mais importante que ocorra a duplicao do DNA mitocondrial.
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9. Citosqueleto
Depois de um perodo em que o protoplasma foi descrito como uma substncia homognea e transparente, comearam a surgir descries da presena, no seu seio, de elementos figurados sob a forma de grnulos, fibrilas e vacolos. Na sequncia da observao, em vrios tipos celulares, da presena de componentes fibrosos, surgiram duas teorias: a teoria fibrilar e a teoria reticular. Em qualquer delas est implcita a existncia de uma armao estrutural ou citosqueleto. Para a teoria fibrilar o protoplasma era formado por numerosas fibrilas entrecruzadas, no seio de uma substncia
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homognea. Segundo a teoria reticular, os filamentos constituam uma rede de elementos anastomosados. As vrias teorias sobre a natureza do protoplasma, surgidas na sequncia da aplicao das mais variadas tcnicas de colorao e de impregnao, foram entretanto sujeitas a intensa crtica pelos que consideravam que os agentes utilizados alteravam as estruturas, produzindo artefactos. Ncleo, organelos e outras formaes encontrar-se-iam includos no seio de uma substncia transparente ou translcida, mais ou menos viscosa, o hialoplasma ou substncia fundamental. Hoje sabemos que o citoplasma estruturado por um conjunto de estruturas filamentosas, de natureza proteica, formando uma rede dinmica, altamente complexa e interdependente denominada citosqueleto. As funes atribudas ao citosqueleto dependem no s das caractersticas dos seus elementos constituintes, mas tambm das propriedades de um grande nmero de protenas acessrias que com ele se associam, nomeadamente permitindo interaces entre os seus vrios elementos e destes com outras estrturas celulares. Nos ltimos anos, a possibilidade de envolvimento de componentes do citosqueleto, em funes menos bvias, como a transduo de sinais e o estabelecimento, manuteno e funo de domnios citoplasmticos, nomeadamente atravs do envolvimento na segregao intracelular de protenas e mRNA, tem aumentado ainda mais o interesse por este conjunto de estruturas. Morfolgica, bioqumica e funcionalmente distinguem-se trs grandes sistemas de estruturas filamentosas: os microtbulos, os filamentos de actina e os filamentos intermdios, que podem funcionar de modo integrado, embora apresentem padres de organizao, dinmica e funes especficas.
Constituio Os microfilamentos ou filamentos de actina so estruturas filamentosas de cerca de 5-7 nm de dimetro que se observam no citoplasma das clulas eucariticas sob a forma de feixes de filamentos paralelos ou de redes de filamentos anastomosados. So particularmente evidentes no citoplasma cortical, em estreita associao com a membrana e no eixo de prolongamentos celulares. So constitudos fundamentalmente pela polimerizao de uma protena globular denominada actina G, que uma das protenas mais abundantes nas clulas eucariotas, originando filamentos de actina F. A estrutura dos monmeros no conhecida, mas os dados existentes apontam para que tenham forma em halter. Admitia-se que os microfilamentos eram constitudos por duas cadeias de actina F enroladas helicoidalmente, mas a utilizao de tcnicas de reconstruo de imagem e de simulao por computador indicam, como modelo mais provvel, o de um filamento helicoidal formado por uma cadeia simples de monmeros. A organizao espacial dos microfilamentos muito varivel e complexa nas clulas no musculares. Nas regies submembranares do citoplasma, organizam-se em redes de malhas, mais ou menos apertadas, em pequenos feixes ou, como acontece nos fibroblastos e em clulas em cultura 102
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constituindo feixes longos e densos as fibras de stress. Os feixes de microfilamentos que se observam no eixo dos prolongamentos celulares tm aspecto varivel, caracterizando-se pelo nmero e regularidade de orientao dos seus elementos.
Os microfilamentos encontram-se em todo o citoplasma, embora se localizem, preferencialmente, na regio cortical das clulas, que a rea adjacente membrana plasmtica. Define-se, assim, uma rede cortical de microfilamentos, que em associao com a miosina parece exercer papis importantes na fagocitose, na citocinese (atravs do anel contrctil na zona de separao das duas clulas filhas) e na locomoo celular.
Protenas de polimerizao e seus efeitos neste processo Nos mecanismos de polimerizao e despolimerizao dos filamentos de actina, intervm vrias protenas que se encontram associadas aos filamentos, sendo responsveis basicamente pela estabilizao do filamento, pela regulao do seu comprimento e pela organizao espacial. As protenas associadas que participam na regulao dinmica de polimerizao dos microfilamentos actuam por vrios mecanismos: Sequestrao de monmeros de actina G, limitando a sua polimerizao (Profilina) Uma das protenas citoslicas que intervm na polimerizao dos microfilamentos a profilina que tem a capacidade de se ligar aos monmeros de ATP-actina, formando um complexo estvel. Na maior parte dos casos, a profilina pode moderar 20% da actina no-polimerizada nas clulas, sendo este um nvel relativamente baixo para que actue como protena efectiva. Inicialmente, a profilina promove o reconhecimento dos filamentos de actina como sendo um factor de troca de nucletidos. Assim, s interage com componentes da membrana que estejam envolvidos em sinalizao celular, o que sugere que ela seja particularmente importante no controlo do reconhecimento da actina na membrana plasmtica.
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Associao lateral a segmentos dos filamentos, impedindo a sua fragmentao Devido abundncia no citosol e habilidade de ligao ao complexo ATP-actina G (mas no actina F), a timosina considerada a principal protena relacionada com a actina existente nas clulas. A sua ligao ao ATP-actina G previne a sua polimerizao e, consequentemente, a timosina vai funcionar como um moderador nos monmeros de actina num equilbrio em que um aumento da concentrao citoslica da timosina ir provocar um aumento da concentrao das subunidades de actina e uma consequente diminuio da concentrao de actina F. Isto acontece na medida em que os filamentos de actina esto em equilbrio com os seus monmeros. Este efeito da timosina nos nveis de actina F foram experimentados laboratorialmente em clulas vivas.
Ligao a uma extremidade dos filamentos de actina F, impedindo o crescimento ou dissociao Por fim, o ltimo modo de actuao das protenas na polimerizao dos microfilamentos do citosqueleto est relacionado com a inibio da formao da actina F, sendo que este processo ocorre atravs da ADF (actin depolymerizing factor).
Modo de actuao Quando se encontra associado a uma molcula de ATP um determinado monmero e ocorre a polimerizao, d-se a hidrlise do ATP, formando-se um filamento de actina. A actina est associada miosina, importante no contraco muscular, no movimento celular e na forma da clula. No caso dos eritrcitos, a actina estava associada espectrina, tornando-se lgico que tenham aco na morfologia da clula e quando recebem um estmulo exterior sofrem alterao e com isto induzem a alterao da morfologia celular.
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A actina G associada molcula de ATP para se dar a polimerizaao e a despolimerizaao, e a molcula de ADP tem de passar a ATP. Os filamentos de actina e os microtbulos contm, para estarem estabilizados, outras molculas que podem associar-se ao filamento ou aos monmeros. As protenas associadas aos filamentos podem impedir que o filamento sofra despolimerizao, regular o seu comprimento e impedir que ocorra a substituio da molcula de ATP pela de ADP, ou pela organizao espacial dos filamentos.
Nucleao dos filamentos de actina Uma famlia de actin-related proteins (ARPs) exibindo 50% da sua sequncia como sendo similar actina, foi identificada em vrios organismos eucariticos. Um dos principais grupos de ARPs, um complexo de sete protenas, designado Arp 2/3, estimula a ligao da actina. Isoladamente dos extractos celulares na base da sua habilidade para ligar a profilina, o complexo Arp 2/3 liga-se a 70 da parte lateral do filamento de actina para originar um filamento-filho. A combinao dos filamentos-me e filho cria uma rede em que o complexo Arp 2/3 se encontra localizado nos pontos de ramificao. Assim, como resultado, os segmentos finais dos filamentos agora criados sofrem elongamento, e so capazes de criar uma fora para empurrar a membrana para a frente. importante referir que a ramificao estimulada pela famlia de protenas WASp, sob o controlo das GTPases. As protenas de ligao das actinas como a filamina estabilizam a rede de ramificao onde as protenas de rompimento de actina como a cofilina induzem a desconexo das estruturas previamente ramificadas.
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9.2. Microtbulos
Os microtbulos so estruturas tubulares com cerca de 25 nm de dimetro. Em corte transversal, tm perfil circular, podendo reconhecer-se uma zona central pouco densa com 15 nm de dimetro, limitada por uma parede com 5 nm de espessura. Em corte longitudinal, isolados ou em feixe, seguem trajectrias rectilneas ou ligeiramente curvas e tm aparncia rgida, l ogo o seu com pri ento vari m velpodendo ati r vri m . ngi os Foram inicialmente observados como componentes de estruturas celulares complexas, como o centrolo, corpsculos basais, fibras de fuso e axonemas de clios e flagelos. Os microtbulos citoplasmticos que se observam isolados, em feixes paralelos ou constituindo conjuntos muito ordenados so considerados como componentes do citosqueleto. O padro da sua distribuio celular e as suas modificaes em diferentes situaes so facilmente apreciadas pela tcnica de imunofluorescncia. Basicamente, os microtbulos so constitudos pela polimerizao de um heterod ero de tubulna e tubulna , originando uma parede m i i constituda por 13 protofilamentos alinhados longitudinalmente. As tubulnas e so prote i nas globulares, que nos vertebrados so codificadas por uma famlia de genes muito conservados durante a evoluo.
Orientao celular dos microtbulos Os microtbulos e os protofilamentos que os constituem so estruturas polarizadas cujas extremidades tm propriedades diferentes, exibindo polaridade estrutural e funcional. extremidade a que se associam preferencialmente novas subunidades d-se a designao de extremidade mais (+) oposta de extremidade menos (-). A primeira capaz de crescimento mais rpido que a segunda, tendendo esta at a perder subunidades caso no seja estabilizada. 106
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Na clula em interfase, os microtbulos esto organizados de modo polarizado, sendo que as extremidades (+) apontam para a periferia celular e as extremidades (-) partem de uma regio que as estabiliza. Esta regio, denominada centro organizador de microtbulos (MTOC) na maior parte das clulas animais em ciclo celular, corresponde ao centrossoma.
Formao de um microtbulo O primeiro passo no processo de formao de um microtbulo a nucleao, e requer a presena de tubulina, Mg2+ e GTP, a uma temperatura de 37 C. Esta fase relativamente lenta at que o microtbulo esteja a comear a formar-se. De seguida ocorre a segunda frase designada elongao, que ocorre de forma muito mais acelerada. Na nucleao, forma-se um heterod ero devi j m do uno de um a tubulna com um a tubulna . i i Depois, este complexo anexa-se a outros dmeros para formar olgomeros, que se elongam para formar os protofilamentos. Cada um dos dmeros transporta, normalmente, duas molculas de GTP que aparentam ter funes de lgao s m ol as de tubulna .Q uando esta lgao ocorre,o G TP hi i i cul i i drolsado a G D P e os olgomeros podem, por vezes, juntar-se a microtbulos j formados. No interior da clula, os microtbulos formam-se numa rea junto ao ncleo, o MTOC. Quando o GTP adicionado, tem a capacidade de quebrar o GDP, atravs da remoo de um grupo fosfato (P i). Consequentemente, o papel usual da hidrlise do GTP pode actuar de forma a promover o constante crescimento dos microtbulos medida que eles vo sendo necessrios na clula.
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Localizao dos microtbulos Os microtbulos localizam-se como componentes do fuso acromtico, dos centrolos, dos clios, dos flagelos e dos corpos basais. Assim sendo, as suas principais funes so: Movimentos dos cromosomas durante a mitose; Movimento das organelas; Transporte intracelular de materiais; Mobilidade intracelular; Secreo de molculas.
Centros organizadores microtubulares Centrossomas esto localizados num dos lados do invlucro nuclear. Embebido nos centrossomas, est um par de centrolos, constitudo por nove grupos de 3 microtbulos. A matriz pericentriolar constituda por protenas (tubulna ), parte do centrossom a responsvel pel nucl i a eao dos microtbulos. Devido ao fato de os microtbulos crescerem a partir do centrossoma, este , ento, considerado um dos centros organizadores dos microtbulos.
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Corpos basais os microtbulos do axomea inserem-se a nvel citoplasmtico no corpo basal ou cinetossoma. Este trata-se de um cilindro oco, cuja parede constituda por 9 tripletos de microtbulos. Aos tripletos esto associadas inmeras outras protenas que constituem a matriz do corpo basal e que asseguram, quer a sua fixao ao citosqueleto celular, quer a sua motilidade. O corpo basal possui vrias actividades enzimticas, tais como a fosforilase de nuclesidos purnicos e a ATPase Ca 2+-Mg2+ dependente, que se encontram envolvidas na transduco de sinais que regulam a motilidade celular. Clios e flagelos - os clios so projeces citoplasmticas mveis, contendo no seu interior um citosqueleto embebido por uma matriz proteica e rodeado por uma diferenciao da membrana celular. A funo dos clios destina-se a facilitar a locomoo celular, e a deslocar fluidos ou clulas na superfcie das clulas epiteliais. Os flagelos das clulas eucariticas possuem uma estrutura semelhante dos clios, encontrando-se nos protozorios flagelados, clulas vegetais. Contudo, so mais longos em geralmente, em menor nmero. Assim sendo, os clios tm movimento em chicote, enquanto que os movimentos flagelares so do tipo sinusoidal. A organizao ultrastutural do citosqueleto do clio ou do flagelo designa-se axonema.
Protenas associadas aos microtbulos O estudo da formao de microtbulos in vitro, a partir de tubulina purificada, levou identificao de um conjunto de protenas que co-polimerizam com a tubulina. Genericamente, estas protenas denominam-se protenas associadas aos microtbulos, por a eles se ligarem in vitro e in vivo. Estas protenas podem interferir com a ligao dos microtbulos a outras estruturas celulares, ou com a dinmica de polimerizao e despolimerizao, permitindo, deste modo, a modulao das suas funes. Foram isoladas e caracterizadas duas classes dessas protenas: as MAP (Microtubule Associated Proteins) e as tau (Low Molecular Weight Proteins). Adicionadas a solues purificadas de tubulina, as MAP: Baixam a concentrao crtica necessria formao dos microtbulos Favorecem o seu crescimento e diminuem a taxa da sua dissociao. Correspondem s projeces laterais (braos) que se observam na superfcie exterior dos microtbulos. Alm de controlarem a sua formao e estabilizao, participam nas ligaes cruzadas entre microtbulos vizinhos, com formao de feixes e na ligao de microtbulos a outras estruturas celulares. Funcionam como alvos dos sinais intracelulares (cAMP, Ca2+) que regulam a organizao estrutural e funcional dos microtbulos, sendo possvel que s diferentes espcies moleculares destas protenas correspondam localizaes e funes especficas. Em sentido lato, podemos tambm considerar, como protenas associadas aos microtbulos, as denominadas motores moleculares, que: So enzimas que associam a energia libettada pela hidrlise de nucletidos produo de movimento vectorial ao longo da rede celular de microtbulos, conferindo assim movimento intracelular a vesculas e organelos.
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Ligam-se por uma das extremidades ao microtbulo e pela outra estrutura que se movimenta. So dependentes dos microtbulos os movimentos, em ambos os sentidos, que se observam entre o corpo celular e aqueles prolongamentos. Existem, ento, dois tipos de protenas motoras associadas aos microtbulos: Dinenas possibilitam o movimento em direco extremidade (-); Cinesinas possibilitam o movimento em direco extremidade (+).
Efeito de drogas So conhecidas vrias drogas que interferem in vitro e in vivo no estado de polimerizao da tubulina. A mais conhecida a colchicina, que inibie in vitro a polimerizao da tubulina e provoca in vivo a dissociao dos microtbulos citoplasmticos. As molculas de colchicina ligam-se com grande afinidade aos dmeros de tubulina inibindo a sua polimerizao. Tambm a vinblastina se liga s molculas de tubulina impedindo a sua polimerizao e originando a formao de agregados paracristalinos desta protena. Em contraste com os anteriores, existe o taxol, que se associa a polmeros de tubulina, com uma aco estabilizadora. Assim, baixa a concentrao crtica de tubulina necessria polimerizao, que promove mesmo em condies desfavorveis (ausncia de MAP e GTP, baixas temperaturas). A utilizao experimental destas substncias tem sido muito proveitosa nos estudos sobre a formao e funes dos microtbulos.
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Estrutura A estrutura dos filamentos intermdios extremamente condensada. Cada protena tem um domnio globular nos terminais N e C, que rodeiam o domnio hlice-.O bl bsi de construo dos fiam entos oco co l intermdios um dmero paralelo, formado atravs da interaco da cadeia hlice- para f ar um orm conjunto de estruturas enroladas entre si. Os filamentos intermdios citoplasmticos ligam-se s unidades no-polares dos filamentos que, de seguida, se ligam a estruturas de maior comprimento. A orientao anti-paralela dos tetrmeros significa que ao controlo dos microtbulos e dos microfilamentos que apresentam uma extremidade positiva e uma negativa, os filamentos intermdios no tm qualquer polaridade. Geralmente, os microtbulos no existem nas plantas nem nos fungos, e a sua formao no envolve a hidrlise do ATP ou do GTP. Quanto aos filamentos intermdios da membrana plasmtica, algumas citoqueratinas interagem como desmossomas (adeso clula-clula) e hemidesmossomas (adeso clula-matriz) atravs de protenas adaptadoras.
Tipos de filamentos intermdios Existem cerca de 70 genes diferentes que codificam vrias protenas dos filamentos intermdios. No entanto, diferentes tipos de filamentos intermdios partilham caractersticas bsicas: todos so polmeros que geralmente medem entre 9 e 11 nm de dimetro quando se encontram completamente ligados. Os filamentos intermdios encontram-se subdivididos em cinco tipos, com base nas semelhanas nas sequncias dos aminocidos e na estrutura da protena. Tipos 1 e 2 Citoqueratinas cidicas e bsicas-neutras so as mais diversas dentro dos filamentos intermdios, estando as diferentes isoformas divididas em dois grupos: Citoqueratinas epiteliais Citoqueratinas tricocticas Tipo 3 constitudo por 4 protenas que podem formam protenas homo ou heteropolimricas: desmina, vimentina, protena acdica fibrilar e periferina. Tipo 4 consti do pel 3 prote dos neurofiam entos,a nesti e a -internexina. tu as nas l na Tipo 5 constitudo pelas lminas nucleares.
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2. Junes de ancoragem
Estas junes celulares ligam as clulas e o seu citosqueleto a clulas vizinhas ou matriz extracelular. So maioritariamente abundantes em tecidos que esto submetidos a um stress mecnico severo, como num msculo cardaco.
Nas junes de ancoragem intervm dois principais tipos de protenas: Protenas de aderncia intracelular formam um placa no lado citoplasmtico da membrana plasmtica e ligam-se a filamentos de actina ou a filamentos intermdios.
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Protenas de adeso transmembranares contm um domnio extracelular que se liga matriz extracelular ou a domnios extracelulares de protenas de adeso transmembranares da outra clula. A zona intracelular da protena liga-se a protenas de aderncia intracelular. Assim sendo, existem vrios subtipos das junes de ancoragem, sendo as principais as junes de aderncia, os desmossomas, os hemidesmossomas e as junes focais. Junes de aderncia As junes de aderncia so localizadas abaixo das junes ocludentes nos tecidos epiteliais. Rodeiam completamente as clulas, constituindo como que um cinto volta destas. As junes de aderncia so uma complexa estrutura formada pelas membranas das clulas adjacentes, em que as protenas integrais pertencem famlia das caderinas. As extremidades das caderinas de cada membrana interpenetram-se no espao intracelular, constituindo a poro aderente da estrutura. A outra extremidade das caderinas liga-se em cada uma das clulas adj acentes a prote do grupo das cateni e . nas nas Do ponto de vista molecular, estas junes subdividem-se em dois grupos: o primeiro composto pelas que contm vinculina e talina, e o segundo pelas que no contm a protena de 135 kDa, logo conclui-se que as protenas de aderncia se ligam aos filamentos de actina. Desmossomas Estas estruturas ocorrem nas membranas de duas clulas vizinhas, nomeadamente em epitlios. So constitudos por duas placas densas, situadas na poro citoplasmtica adjacente s membranas celulares das duas clulas vizinhas. Nos desmossomas, as protenas de aderncia ligam-se a filamentos intermdios.
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Hemidesmossomas So junes morfologicamente semelhantes a desmossomas, mas qumica e funcionamente diferentes. Ligam a superfcie basal das clulas epiteliais lmina basal subjacente. Os hemidesmossomas contm vrios polipeptdeos, como por exemplo as integrinas que atravessam a membrana celular e se projectam para a lmina basal. Junes focais So junes semelhantes aos hemidesmossomas, diferindo apneas nos filamentos de citosqueleto durante o processo de juno. Assim sendo, enquanto que nos hemidesmossomas ocorre nos filamentos intermdios, nas junes focais ocorre nos microfilamentos.
3. Junes comunicantes
As junes comunicantes so estruturas presentes em muitos tecidos e em quase todas as espcies animais. Ao microscpio electrnico, observam-se zonas onde as membranas de duas clulas adjacentes ficam separadas por um interstcio. As junes de cada uma das membranas so constitudas por molculas proteicas transmembranares que formam estruturas designadas por conexes, cada um formado por seis protenas idnticas, aderentes entre si. Estas protenas pertencem famlia das conexinas, as quais consistem, nas clulas humanas, pelo menos em 13 protenas diferentes. As conexes de duas clulas vizinhas formam um canal contnuo que conecta as duas clulas vizinhas. As junes comunicantes permitm a comunicao entre as clulas com passagem de pequenas molculas ou ies. So estruturas dinmicas que abrem ou fecham sob aco de modificaes celulares. O aumento de Ca2+ citoplasmtico, ou a diminuio de pH intracelular diminuem a permeabilidade das junes. As propriedades funcionais das junes comunicantes so fundamentais na contraco cardaca, nos movimentos peristlticos do intestino, na embriognese, e na diferenciao das clulas germinais. A passagem inica condiciona uma corrente elctrica, pelo que tambm so conhecidas por sinapses elctricas.
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4. Junes apertadas
As junes apertadas ou junes tight encontram-se frequentemente na poro apical lateral das clulas epiteliais de revestimento, sendo constitudas por bandas finas que rodeiam completamente as clulas e contactam com estruturas idnticas de clulas adjacentes. Vistas ao microscpio electrnico, aparecem como uma srie de ligaes entre os folhetos externos das membranas de clulas adjacentes, tornando o espao intercelular impermevel a molculas, sais e mesmo ies. A observao de microfotografias de tecidos tratados com substncias coloidais de peso molecular ele vado mostra o espao intracelular preenchido por este produto opaco aos electres, excepto ao nvel das junes ocludentes. As partculas intramembranares so de natureza proteica protenas integrais e esto presentes em cada uma das membranas das clulas adjacentes. Entre as mais importantes protenas destacam-se as claudinas (essenciais para a formao e funo das junes) e as ocludinas (que apresentam funo desconhecida). No entanto, j foram tambm identificadas outras protenas como a ZO-1 e a ZO-2, sendo que no ponto de contacto entre as protenas integrais de cada membrana adjacente, o espao intercelular nulo e um ponto completamente impermevel passagem de substncias do lmen para o espao intercelular.
5. Molculas de adeso
A adeso celular no ocorre exclusivamente atravs das junes celulares mas tambm a partir de molculas de adeso que existam nas membranas celulares. Todas as molculas de adeso so CAMs (cell adhesion molecules) existindo, ento, vrias classes de CAMs consoante a sua dependncia relativamente ao clcio.
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Consoante o tipo de molculas que existam nas duas membranas das clulas, ou entre a membrana da clula e a matriz extracelular, formam-se interaces homoflicas (caso as duas molcuas sejam iguais) ou heteroflicas (caso as duas molculas sejam diferentes). Existe ainda um terceiro caso possvel em que as duas molculas atravs uma outra atravs da aco de uma molcula ligante proveniente do meio extracelular.
5.1.
Selectinas
As selectinas constituem uma das famlias das CAMs que esto relacionadas com as interaces leuccitos-clulas vasculares. Um jogador-chave nestas interaces a selectina-P que se encontra na superfcie das clulas endoteliais. Todas as selectinas contm um domnio dependente do Ca2+, localizado na extremidade mais afastada da regio extracelular da molcula e reconhece oligossacardeos em glicoprotenas ou glicolpidos. Assim, as selectinas podem ser caracterizadas como sendo protenas transmembranares que ligam hidratos de carbono (lectinas) em clulas.
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So consideradas importantes nas interaces referidas leuccitos-clulas endoteliais dos vasos sanguneos (ligao fraca e reversvel), permitindo a migrao dos leuccitos para os tecidos. Tendo em conta esta caracterizao, conclui-se que as selectinas actuam conjuntamente com as integrinas e que existem trs principais tipos de selectinas: selectina-L (leuccitos), selectina-P (plaquetas) e selectina-E (clulas endoteliais activas).
Migrao dos leuccitos atravs dos vasos sanguneos (1) Na ausncia de qualquer inflamao ou infeco, os leuccitos e as clulas endoteliais das paredes dos vasos sanguneos encontram-se em estado de repouso. (2) Um conjunto de sinais inflamatrios libertado em reas susceptveis de leso e activa as clulas endoteliais que se encontravam em descanso, para que estas movam as selectinas para a superfcie celular. As selectinas agora expostas, medeiam a ligao dos leuccitos atravs da interaco de ligandos de hidratos de carbono com os leuccitos. A activao do endotlio tambm provoca a sntese do PAF (platelet-activating factor) e do ICAM-1, que se vo expressar na superfcie celular. O PAF e outros activadores normalmente secretados, induzem depois alteraes na f a dos l orm eucci tos, com o a L2, que se expressa atravs de linfcitos T. (3) A ligao subsequente que se verifica entre as integrinas activadas nos leuccitos e as CAMs no endotlio, resulta numa adeso firme (4) e movimento consequente (extravaso) para o tecido (5).
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5.2. Caderinas
As caderinas so molculas-chave na adeso clula-clula e na sinalizao celular e desempenham um papel extremamente importante durante a diferenciao e manuteno da integridade dos tecidos. As caderinas E- (epitelial), P- (placenta e epiderme) e N- (nervos e msculos) so as caderinas clssicas, sendo as mais frequentemente expressas, particularmente durante o incio da diferenciao. Folhas de clulas epiteliais polarizadas contm, normalmente, caderina-E em quantidades abundantes, ao longo das suas superfcies laterais. No entanto, ainda que a caderina-E esteja concentrada nas junes de aderncia, ela tambm est presente ao londo das superfcies laterais onde se pensa que ela se liga s membranas celulares adjacentes. Por sua vez, as caderinas no-clssicas so as caderinas dos desmossomas. Os domnios citoslicos das caderinas no-clssicas interagem com a placoglobina (que si iar em estrutura a -catenina) e com placofilinas. Estas protenas m l adaptadoras que formam pequenas placas citoplasmticas so caractersticas dos desmossomas que interagem com os filamentos intermdios. Consequentemente, pode concluir-se que os desmossomas e as junes de aderncia esto ligados a fibras de citosqueleto diferentes. Na membrana plasmtica, as caderinas associam-se entre si e formam dmeros ou olgomeros, ou seja, existem ligaes homoflicas.
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5.4. Integrinas
As integrinas compreendem protenas integrais heterodimricas que funcionam como receptores de adeso, mediando vrias interaces clula-matriz. Nos vertebrados, so conhecidas pelo menos 24 heterod eros de i m ntegri nas, com postos por 18 ti de subuni pos dades e 8 ti de subuni pos dades . Assi , um a cadei si pl pode interagir com qualquer uma m a m es das cadei , form ando i as ntegri nas que lgam di i ferentes lgandos. Este i fenmeno de diversidade combinatria permite um nmero relativamente baixo de componentes para servir um grande nmero de diferentes funes. Para alm disso, as integrinas ligam-se s lamininas, fibronectina da matriz extracelular e aos filamentos de actina no lado citoslico, com excepo dos hemidesmossomas que se ligam aos filamentos intermdios. As integrinas so ainda responsveis pela activao de vias de sinalizao intracelular e por processos de sobrevivncia celular (clulas endoteliais, musculares e epiteliais).
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1. Glicosaminoglicanos (GAG)
Os glicosaminoglicanos so polissacardeos complexos, geralmente de cadeia linear e elevado peso molecular, existentes na matriz extracelular e superfcie das clulas, nomeadamente entrando na constituio das lminas basais e do glicoclice. Podem ainda ocorrer intracelularmente e, em situaes patolgicas, ser a acumulados. So polmeros resultantes da repetio de um dissacardeo formado por uma N-acetilhexosamina (Nacetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina) e um cido urnico segundo padres que, por serem caractersticos, permitem subdividir os GAG em vrias populaes distintas. O cido hialurnico talvez o nico GAG que, nos sistemas biolgicos, no se encontra associado a protenas por ligaes covalentes. Todos os outros apresentam-se, geralmente, ligados a um componente prtico, associao esta que origina macromolculas designadas proteoglicanos, descritos seguidamente.
2. Proteoglicanos
Os proteoglicanos so um subconjunto das glicoprotenas que contm cadeias polissacardicas covalentemente ligadas os glicosaminoglicanos. Tal como outras glicoprotenas, os proteoglicanos so sintetizados no retculo endoplasmtico, e apresentam, tambm, cerca de 80% a 90% da molcula constituda por acares e apenas uma pequena parte de protenas, o que confere uma cadeia no ramificada e com uma constituio especfica (por ser constituda por dissacardeos especficos).
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A sua cadeia polissacardica liga-se a um resduo de serina e constituda por xilose, duas molculas de galactose e cido glucurnico, a que se seguem sequncias repetidas de unidades dissacardicas. Os proteoglicanos so secretados pelas clulas que existem no tecido os fibroblastos. As principais funes dos proteoglicanos so: Regular o trfico de molculas com base no seu tamanho e carga; Controlar a sinalizao celular; Regular a actividade das molculas secretadas. Tendo em conta a sua constituio, os proteoglicanos podem estar ligados s membranas atravs da sua parte proteica ou ligados ao glicosilfosfatidilinositol (GPI). Exemplos: agrecano (cartilagem), perlicano, decorina e sindecano (membranas).
3. Colagnio
O colagnio uma protena extracelular fibrosa que desempenha inequvocas funes estruturais, e nas quais uma parte aprecivel das suas molculas tem uma conformao em tripla hlice, que lhe confere uma rigidez considervel. A formao da tripla hlice est relacionada com a estrutura primria e modificaes ps-traduo que ocorrem nas trs cadeias polipeptdicas de cada molcula de glicognio as cadei . A estrutura primria as destas cadeias maioritariamente formada por uma sequncia de trs resduos de aminocidos Glicina, X, Y. Nas regies X e Y, designadas por domnios colagnicos, os aminocidos colocados so frequentemente a prolina e a hidroxiprolina, respectivamente. Reconhecem-se, actualmente, cerca de 20 tipos de colagnio, distintos tanto na constituio das suas cadei com o na sua capaci as dade de polm eri i zao, na sua l i ocalzao e nas suas funes espec cas. fi Admite-se que os colagnios mais abundantes so dos tipos I, II e III, sendo que os V e XI tambm entram na composio de fibrilas cilndricas que apresentam uma periodicidade transversal as fibrilas nativas. A excepo o colagnio tipo IV que um dos principais constituintes das lminas basais, sendo que da sua polimerizao no resultam fibrilas, mas sim uma malha molecular que interage com outros constituintes das lminas basais.
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Sntese do colagnio Os colagnios so habitualmente secretados sob a forma de precursores, os procolagnios, sendo estes posteriormente clivados extracelularmente para dar origem s molculas de colagnio propriamente ditas, tambm designadas por tropocolagnios. As molculas de colagnio tm a capacidade de polimerizar espontaneamente e de forma muito ordenada, originando as fibras de colagnio. Os vrios passos da biossntese podem ser descritos da seguinte forma: 1 - As cadei de procol as agni so si o nteti zadas nos ri bossom as associ ados m em brana do ret o cul endoplasmtico e os oligossacardeos de asparagina so adicionados ao terminal C do propptido. 2 - Os propptidos associam-se para formar trmeros e esto covalentemente ligados atravs de pontes dissulfito, sendo que os resduos no tripleto Gly-X-Y esto covalentemente modificados. 3 - As modificaes facilitam a formao da tripla hlice e a sua estabilizao, assim como a ligao de uma protena chaperona (Hsp47) que estabiliza as hlices ou previne a agregao prematura dos trmeros. 4 e 5 Os procolagnios formados so transportados para e atravs do complexo de Golgi, onde ocorre a associao lateral a pequenos feixes. As cadeias so ento secretadas (6), os terminais N e C dos propptidos so removidos (7) e os trmeros renem-se em fibrilas e so covalentemente ligados (8).
4. Fibronectinas
Vrios tipos de clulas sintetizam a fibronectina, uma protena abundante na matriz extracelular em todos os vertebrados. As fibronectinas so essenciais para a migrao e diferenciao de vrios tipos de clulas na embriognese. Estas protenas so tambm importantes no anexo das clulas matriz extracelular atravs 124
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da ligao a outros componentes da matriz, particularmente s fibrilas de colagnio, proteoglicanos de sulfato de heparano ou at os receptores de adeso como as integrinas. Fisicamente, as fibronectinas so dmeros de dois polipptidos semelhantes ligados ao terminal C, atravs de duas pontes dissulfito, que podem existir sob vrias isoformas: forma solvel ou de fibrilas insolveis (neste caso necessitam de outras protenas).
5. Lmina basal
Nos animais, o epitlio e outros grupos organizados de clulas esto rodeados pela lmina basal, uma espcie de folha de componentes da matriz extracelular. A lmina basal encontra-se diferentemente estruturada, consoante os tecidos. Assim, a lmina basal desempenha as seguintes funes: Papis bastante importantes na regenerao, depois de os tecidos serem danificados; Importante no desenvolvimento embrionrio, ao auxiliar os embries de 4 e 8 clulas a aderirem, formando as esferas embrionrias; Determina a polaridade celular; Influencia o metabolismo celular. A maior parte dos componentes da lmina basal so sintetizados por clulas que nela permanecem. Assim, existem quatro principais componentes que constituem a lmina basal: Colagnio tipo IV Laminina Perlicano Glicoprotenas
Degradao da lmina basal Os processos de degradao da lmina basal iniciam-se extracelularmente com a disrrupo parcial das fibrilas de colagnio por um conjunto de colagenases da grande famlia das metaloproteases da matriz (MMP) dependentes do clcio e do zinco, sendo completado intracelularmente aps fagocitose dos resduos inicialmente obtidos.
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A laminina tem receptores presentes junto ao colagnio tipo IV que vo ser reconhecidos por molculas presentes na lmina basal. Devido presena da colagenase que mantm a estrutura da lmina basal atravs da facilitao da migrao, a lmina basal digerida progressivamente depois da fagocitose dos resduos. Com este mecanismo, criam-se fendas ao longo da lmina basal, permitindo a migrao das molculas e a consequente degradao total da lmina a partir do lado intracelular.
6. Laminina
A laminina a principal protena da matriz na lmina basal, sendo uma protena heterotrimrica, com elevado peso molecular. Existem vrias isoformas de laminina, contendo cadeias polipeptdicas ligeiramente diferentes. Al guns dom os gl ni obul ares no term i C da subuni nal dade da l i na m edei am ni am as m ol as cul 2+ dependentes de Ca e a ligao de hidratos de carbono especficos a molculas especficas da superfcie celular como o sindecano e o distroglicano. Os domnios globulares encontram-se numa grande variedade de protenas e podem mediar a ligao a esterides, protenas e at hidratos de carbono. Quanto s funes, intervm na: Regulao da passagem de nutrientes; Organizao de tecidos; Selectividade do movimento das clulas.
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1. Sinais extracelulares
A maneira especfica pela qual a clula reage ao seu ambiente varivel. Ela varia de acordo com o conjunto de protenas receptoras que a clula possui, o que determina o subgrupo particular de sinais ao qual ela pode responder, o que, por sua vez, varia de acordo com a maquinaria intracelular, por meio da qual a clula integra e interpreta os sinais que recebe. Cada tipo celular exibe um conjunto de receptores que o torna capaz de responder a um conjunto de molculas sinalizadoras produzidas por outras clulas. Estas molculas regulam o comportamento celular, trabalhando de forma coordenada. Como est exibido na figura, uma clula necessita de mltiplos sinais para sobreviver (setas azuis) e sinais adicionais para se dividir (seta vermelha) ou diferenciar (setas verdes). Se a clula for privada dos sinais de sobrevivncia apropriados, ela sofre uma forma de suicdio conhecido por morte celular programada, ou apoptose.
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Activao da sinalizao intracelular Depois de passar o receptor, vo existir no interior da clula, protenas que vo desencadear uma srie de reaces. As protenas so as cinases que induzem a fosforilao de outras molculas, as fosfatases que desfosforilaram, e protenas G que tm a capacidade de ligar o GTP ou o GDP e so molculas que so activas em GTP ou inactivas em GDP. Para alm destas protenas, existem tambm mensageiros que actuam a vrios nveis: nvel de protenas de factores de transcrio, nvel de protenas que intervm no metabolismo ou podem alterar as protenas que fazem parte do citosqueleto. Quando se ligam a estas molculas, alteram a transcrio gentica, activando ou reprimindo a expresso de um determinado gene, permitindo a sntese ou no de uma determinada protena. Ao ligar-se ao citosqueleto, alteram tambm a forma dessa mesma clula. A resposta da clula a um sinal extracelular est dependente dos receptores que ela tem. Por outro lado, a via de transduo de sinal, porque existem vrias, e quando a molcula se liga ao receptor pode induzir a activao de vrias vias e portanto conforme a via activada, existe uma resposta diferente. Consoante a via de activao, os processos intracelulares afectados tambm vo ser diferentes, logo uma molcula extracelular ao ligar-se ao receptor duma cula, nao vai sempre induzir as mesmas respostas do que quando se liga a outra clula resposta diferente consoante o tipo de clula.
2. Formas de sinalizao
Sinalizao dependente de contacto muitas molculas sinalizadoras permanecem ligadas superfcie das clulas e influenciam somente clulas que estabelecem contacto. Esta sinalizao importante, especialmente durante o desenvolvimento e na resposta imunitria.
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Sinalizao parcrina as molculas sinalizadoras so secretadas e podem ser levadas para longe, actuando em alvos relativamente distantes, ou podem agir como mediadores locais afectando apenas as clulas que esto muito prximas da clula sinalizadora. Para que os sinais parcrinos possam ser recebidos s pelas clulas-alvo adequadas, as molculas secretadas devem ter sua difuso restrita; por isso elas so, com frequncia, captadas rapidamente pelas clulas-alvo das vizinhanas, destrudas por enzimas extracelulares ou imobilizadas pela matriz extracelular.
Sinalizao sinptica nos organismos multicelulares bastante complexos, os grupos de clulas especializadas evoluram com a funo especfica de estabelecer comunicao entre partes distantes do corpo. As mais sofisticadas so as clulas nervosas (neurnios), que estendem longos prolongamentos (axnios) que lhes permitem entrar em contacto com clulas-alvo distantes. Quando activado por sinais do meio ou de outras clulas, o neurnio envia impulsos elctricos (potenciais de aco) ao longo do seu axnio; quando um impulso desse tipo chega extremidade do axnio, promove a secreo pelos terminais nervosos a localizados, de um sinal qumico chamado neurotransmissor. Esses sinais so secretados em junes celulares especializadas, chamadas sinapses qumicas, desenhadas de forma a assegurar que o neurotransmissor seja liberado especificamente na clula-alvo ps-sinptica. Sinalizao endcrina - uma clula sintetiza uma determinada substncia que tem de passar a corrente sangunea e s depois que vai actuar em clulas-alvo que esto muito distantes. Se umas molculas so sintetizadas e passam a corrente, vai haver diminuio das substncias, provocando uma resposta demorada, porque se sintetiza uma molcula numa parte, para s mais tarde vir a actuar.
Sinalizao autcrina as clulas podem enviar sinais para outras clulas do mesmo tipo, assim como para elas mesmas. Nesta sinalizao, uma clula secreta molculas sinalizadoras que se ligam aos seus receptores na prpria clula. Durante o desenvolvimento, por exemplo, quando uma clula decide seguir uma determinada rota de diferenciao, ela comea a secretar sinais autcrinos, o que refora a sua
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deciso anterior. A sinalizao autcrina mais efectiva quando realizada, simultaneamente, por clulas vizinhas do mesmo tipo, e parece ser usada para encorajar grupos de clulas idnticas a tomar os mesmos caminhos ao longo do desenvolvimento. Assim, a sinalizao autcrina o possvel mecanismo responsvel pel efei com uni o to dade observado nos estgi precoces do desenvol m ento, durante o qual um grupo os vi de clulas idnticas responde a um sinal indutor de diferenciao, enquanto uma clula isolada do mesmo tipo no responde. Sinalizao das junes comunicantes as junes comunicantes nas clulas de um embrio em desenvolvimento so feitas e desfeitas em padres especficos e interessantes, sugerindo, fortemente, que elas desempenham um papel importante nos processos de sinalizao que ocorrem entre essas clulas. Da mesma forma que na sinalizao autcrina, a comunicao por junes comunicantes auxilia na coordenao do comportamento de clulas similares adjacentes. Contudo, ainda no se sabe quais as pequenas molculas importantes que actuam como transportadoras de sinais deste tipo, bem como no se conhecem as funes especficas da comunicao, atravs dessas junes, no desenvolvimento animal. Assim, em suma, as clulas conectadas por junes comunicantes compartilham pequenas molculas, inclusive pequenas molculas sinalizadoras intracelulares, podendo assim, responder a sinais extracelulares de maneira coordenada.
3. Tipos de receptores
Na maioria dos casos, as molculas sinalizadoras so hidroflicas e os receptores so protenas transmembranares na superfcie da clula-alvo. Ao ligarem-se a uma molcula sinalizadora extracelular, esses receptores so activados e geram uma cascata de sinais intracelulares, que alteram o comportamento da clula.
Em outros casos, os receptores so intracelulares, e a molcula sinalizadora tem que penetrar na clula-alvo para activ-los, sendo que isso requer que ela seja suficientemente pequena e hidrofbica para que se possa difundir atravs da membrana plasmtica.
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Superfamlia dos receptores nucleares Estes receptores existem na clula sob a forma inactiva associados a outras molculas que vo impedir que os receptores funcionem. Quando os receptores esto no citosol, tornam-se activos aps a ligao da molcula de sinalizao extracelular que se liga ao receptor, o inibidor desliga-se. Assim, o receptor pode passar ao ncleo, ligar-se ao DNA e induzir a expresso ou represso de um determinado gene. No caso de existirem receptores nuclares, tornam-se activos quando existem no ncleo ligados ao DNA e quando a molcula de sinalizao extracelular se liga ao receptor, induzindo tambm a expresso ou represso do gene. As molculas capazes de induzir este tipo de resposta so molculas que se ligam quer aos receptores citoslicos quer aos nucleares, e so sempre hidrofbicas. So as hormonas esterides (cortisol, ou hormonas sexuais), vitamina D, hormonas da tiride (provm de um aminocido que a tirosina) e os retinides. No caso das tirides e dos retinides ligam-se a receptores nuclares que j esto associados a DNA, logo automaticamente vo induzir a alterao de um determinado gene.
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Receptores associados protena G actuam indirectamente na regulao da actividade de uma protena-alvo ligada membrana plasmtica, que pode ser tanto uma enzima como um canal inico. A interaco entre o receptor e a protena-alvo mediada por uma terceira protena, chamada protena trimrica ligante de GTP (Protena G). A activao da protena-alvo altera a conformao de um ou de mais mediadores intracelulares (se a protena-alvo for um canal inico). Os mediadores intracelulares afectados, por sua vez, alteram o comportamento de outras protenas de sinalizao na clula. Todos os receptores de ligao protena G pertencem grande famlia das protenas homlogas transmembranares de sete passos.
Receptores associados a enzimas quando activados, funcionam directamente como enzimas, ou esto associados directamente a enzimas activadas por eles. So formados por protenas transmembranares unipasso, cujo stio de interaco com o ligante est do lado de fora da clula e cujo stio cataltico, ou de ligao enzima, do lado de dentro. Esses receptores apresentam uma estrututra heterognea em comparao com as outras duas classes. A grande maioria, contudo, representada por cinases ou associada com cinases e, quanto activada, induz a fosforilao de grupos especficos de protenas nas clulas-alvo.
5. Sinalizao intracelular
Os sinais recebidos por receptores associados protena G ou associados a enzimas, na superfcie de uma clula, so transmitidos para o seu interior por uma combinao de molculas de sinalizao intracelular. A cadeia de eventos de sinalizao intracelular resultante altera protenas-alvo que sero responsveis pela modificao do comportamento da clula. As protenas de sinalizao intracelular so as protenas de sinalizao intracelular. Muitas delas transmitem o sinal para dentro da clula activando a protena sinalizadora seguinte na cadeia ou gerando 132
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pequenos mediadores intracelulares. Essas protenas podem ser classificadas de acordo com a sua funo particular, embora muitas se possam inserir em mais de uma das seguintes categorias: Protenas transmissoras simplesmente passam a mensagem para o prximo componente da cadeia de sinalizao. Protenas mensageiras carregam o sinal de uma parte da clula para outra, por exemplo, do citosol para o ncleo. Protenas adaptadoras conectam protenas sinalizadoras. Protenas amplificadoras geralmente, so enzimas ou canais inicos, intensificam o sinal recebido por meio da produo de grande quantidade de mediadores intracelulares pequenas ou pela activao de um grande nmero de protenas sinalizadoras a jusante. Uma cadeia de transmisso com mltiplas etapas de amplificao , frequentemente, conhecida como cascata de sinalizao. Protenas transdutoras alteram a forma do sinal. A enzima que produz AMPc um exemplo, ao converter e amplificar o sinal, actuando tanto como transdutora como amplificadora. Protenas de bifurcao propagam o sinal de uma rota de sinalizao para outra. Protenas integradoras recebem sinais de duas ou mais rotas sinalizadoras e inegram-nos antes de transmiti-los mais frente. Protenas reguladoras de genes latentes so activadas na superfcie celular por receptores activos e migram para o ncleo, onde estimulam a transcrio gnica. Outros tipos de protenas intracelulares tambm desempenham papis importantes na sinalizao intracelular, como est mostrado, a azul, na figura. As protenas moduladoras modificam a actividade de protenas sinalizadoras intracelulares, regulando a intensidade ao longo de uma determinada rota de sinalizao. As protenas de ancoramento mantm determinadas protenas sinalizadoras numa localizao precisa da clula atravs da sua fixao membrana ou ao citosqueleto. Por fim as protenas de suporte so protenas adaptadoras e/ou de ancoramento que unem protenas sinalizadoras mltiplas em um complexo funcional e, comummente, as mantm em uma localizao especfica.
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Protenas de sinalizao intracelular Geralmente, so protenas ou mensageiros secundrios. As protenas so as cinases,as fosfatases ou as proteinas G. Protenas G so GTPases, estando activas quando ligadas a GTP e inactivas quando ligadas a GDP. Para se tornarem activas ou inactivas, necessria a interveno de outras protenas como o GEF que transforma o GDP em GTP e o Gap que tem a capacidade de hidrolisar o GTP a GDP. Estas protenas G so activas aps ligao ao receptor da membrana. Em primeiro lugar, estas protenas so diferentes porque so trimricas, tendo trs unidades: , e .Q uando se d a lgao da m ol a extracel ar ao receptor, i cul ul este vai induzir a activao da protena G, atravs da interveno do GEF, para que haja a passagem de GDP a G TP.Com i a ni subuni sto, ca dade lgada ao G D P passa a ser a .Assi ,esta vai-se ligar ao receptor e vai i m haver a transfernci de G D P a G TP na subuni a dade , havendo al terao da conf ao, e havendo orm dissociao das restantes subunidades. Cinases e fosfatases as cinases vo fosforilar determinados aminocidos como a timosina, a serina ou a treonina, existindo vrios tipos. O receptor pode apresentar actividade cinsica ou fosfatsica, induzindo a fosforilao ou desfosforilao da molcula. O receptor pode interagir com cinases citoslicas ou membranares e a actividade cataltica da cinase pode ser regulada pelas prprias cinases, provocando a alterao do nvel de segundos mensageiros. Segundos Mensageiros clcio, AMP cclico, 1-2,diacilglicerol, inositol-trifosfato. O clcio, por exemplo, existe em baixas concentraes no citosol, sendo que estas baixas concentraes so mantidas atravs de bombas de clcio na membrana plasmtica, na membrana mitocondrial ou na membrana do retculo endoplasmtico. Activao das protenas G No estado no-estimulado, o receptor e a protena G esto inactivos. Embora estejam mostrados na imagem como entidades separadas na membrana plasmtica, em alguns casos, pelo menos, esto associados num complexo pr-formado. A ligao de um sinal extracelular ao receptor altera a conformao deste que, por sua vez, altera a conformao da protena G associada a ele. A alterao da subuni dade da prote G perm i a troca do seu G D P por na te GTP. Isso provoca a sua dissociao em dois componentes activos um a subuni dade e um com pl exo , podendo, ambos, regular a actividade de protenas-alvo na membrana plasmtica. O receptor permanece activo enquanto o sinal externo estiver ligado a ele, podendo, por isso, catalisar a activao de muitas molculas de protena G.
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1.1.
Na fase G1, existem dois pontos de controlo. O primeiro o ponto de restrio ou start, em que as clulas caso tenham os nutrientes necessrios, podem continuar, seno ficam interrompidas na fase G0. Depois de passar o ponto de restrio para a fase S, a clula tem de apresentar tamanho suficiente e um ambiente favorvel para se dar a sntese de todas as molculas de DNA, para que mais tarde j na fase S ocorra a replicao do DNA e a passagem da clula para a fase G2. Para passar fase M, a molcula de DNA tem de estar completamente replicada (maquinaria de replicao do DNA) e para alm disso, tm de existir condies ambientais favorveis (protenas e factores de crescimento) e a clula tem de ter crescido o suficiente para ocorrer a sntese de protenas. Caso todos estes requisitos sejam completos, a clula pode passar mitose.
1.2.
Ciclinas variam ao longo do ciclo celular, tendo um ciclo de vida e sendo sintetizadas e degradadas. Existem vrios tipos: G1/S necessrias para a preparao da replicao do DNA S necessrias para o incio da replicao do DNA (no intervm directamente, mas permitem que o processo ocorra)
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M promovem a mitose, sendo importantes para a reorganizao do citosqueleto quando a forma da clula alterada, do Complexo de Golgi e do retculo endoplasmtico. Permitem que a clula mantenha a sua constituio, de forma a que na clula possa originar a diviso nuclear. G1 promovem a passagem da clula atravs do ponto de restrio G1. CDKs fosforilam, sendo cinases e dependentes das ciclinas. Existem sempre na mesma concentrao ao longo do ciclo, mas sendo dependentes das ciclinas, tanto esto activas como inactivas. Levam a oscilaes cclicas na fosforilao de protenas que iniciam ou regulam a replicao de DNA, mitose e citocinese. CKIs inibidores das CDKs, fazendo com que elas no tenham actividade quando ficam ligados.
Regulao das CDKs Activao a ligao da ciclina independente provoca uma activao parcial das CDKs, mas a activao completa requer a interveno do CAK para ocorrer a fosforilao do complexo final. Em clulas animais, o CAK (CDKactivating kinase) fosforila a subunidade do CDK depois da ligao da ciclina, num determinado local especfico. Com isto, o complexo CDK-ciclina forma-se atravs de um grupo fosfato activo que se localiza na subunidade, conferindo completa activao CDK.
Inactivao em clulas proliferativas activas, a maior parte da actividade das CDKs suprimida durante a fase G1, resultando numa transio estvel durante a qual o crescimento celular e outros factores de regulao celular podem comandar a entrada num novo ciclo. Na inibio das CDKs intervem um grupo de protenas, as CKIs (CDK-inhibitor proteins) que se ligam a elas e inactivam o complexo CDKciclina, sendo que esta inibio pode ocorrer de duas formas distintas: utilizando os CKIs, em que as ciclinas ao estarem associadas CDK e tm a fosforilao de um aminocido necessrio, a protena activa pode sofrer inactivao se se ligar a uma CKI. Em determinadas situaes necessrio degradar os CKIs por ubiquitinao. No outro caso de inibio, a protena que est activa tem uma fosforilao, atravs de uma cinase sofre outra fosforilao e, consequentemente, torna-se inactiva.
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A CDK1 liga-se a M-ciclina, mas mesmo assim continua inactiva, tendo necessidade de sofrer fosforilaes, para s depois sofrer uma desfosforilao e passar a activa. Por aco da CAK, sofre uma fosforilao e atravs da enzima Wee1 que uma cinase, o complexo sofre outra fosforilao o complexo sofre 2 fosforilaes por aco de 2 enzimas diferentes. Para se tornar activa, necessita de sofrer uma desfosforilao, por aco de uma fosfatase q a Cdc25. A Cdc25 uma fosfatase que existe na celula sob a forma inactiva, e quando a clula necesssita, existe uma cinase (polo cinase) que vai permitir que a Cdc25 sofra uma fosforilao. Ao sofrer fosforilao, a Cdc25 torna-se activa, actua como fosfatase e o complexo (M-CDK) torna-se activo. No entanto, o complexo activo tem um efeito de sobre a Cdc25 inactiva, pois tem a capacidade de induzir a sua fosforilao e, por outro lado, o complexo ainda tem a capacidade de inibir a Wee1.
Os CKIs so moleculas com capacidade de inibir CDKs, mas em determinadas alturas precisam de ser degradados. A protena SCF tem a capacidade de induzir a fosforilao dos CKIs e, com isto, permitir que as molculas sejam reconhecidas como molculas a degradar. Assim, o sinal a fosforilaao, e vai haver a ligao de vrias molculas de ubiquitina. A protena sofre fosforilao e, portanto permite, atravs de vrias enzimas, a ligao da ubiquitina, sendo degradada por um complexo enzimtico, o proteossoma. Existe ainda um complexo, o APC, que tem de se tornar activo para que as clulas em metafase passem para a anafase. Se o complexo no for activo, a clula fica parada em metafase, no havendo possibilidade de avanar na mitose. O APC inactivo liga-se a uma Cdc e com isto vai tornar-se activo, funcionando como uma enzima que permite a ligao da ubiquitina as molculas que devem ser degradadas. Desta forma, o APC activo vai funcionar como uma ubiquitina-ligase e para alm dele, tambm intervm outras enzimas neste processo. Por fim, o APC activo vai permitir a ligao da ubiquitina s ciclinas, formando um sinal que indica a degradao da molcula por ubiquitinao.
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2. Interfase
A vida de uma clula comea, no momento em que a diviso celular que a originou acaba e o momento em que ela mesma se divide ou morre, ou seja, toda a actividade celular cessa. A interfase corresponde ao perodo entre o final de uma diviso celular e o incio da segunda. Geralmente, a clula encontra-se nesta fase a maior parte da sua vida (cerca de 90%) e durante esta fase, o DNA no visvel ao microscpio ptico. A interfase constituda por trs fases: G1, S e G2. No entanto, existe um estado estacionrio ou fase G0, onde a clula pode permanecer durante meses ou anos, quando tm carncia de nutrientes, inibidores da sntese proteica ou uma populao supersaturada de clulas junto a si.
2.1.
Fase G1
A fase G1 um perodo da interfase que se localiza antes da fase S. Para vrias clulas, esta fase inclui o maior perodo de crescimento e diferenciao celular durante o seu perodo de vida. Durante esta fase, muitos dos organelos celulares so sintetizados, fazendo com que a clula precise de enzimas e de protenas estruturais, que tambm vo contribuir para uma grande sntese proteica. No final desta fase, ocorre a separao dos centrolos e para a clula completar a fase G1 tem de passar o ponto de restrio antes do incio da fase S.
2.2. Fase S
A fase S, ou fase de sntese, um perodo do ciclo celular durante a interfase, entre as fases G1 e G2. Depois da fase G1, a clula entra na fase S onde ocorre a sntese e a replicao do DNA. No incio da fase S, cada cromossoma constitudo por uma molcula de DNA de dupla hlice, ou seja, por um cromatdeo. Por sua vez, no final da fase, cada cromossoma vai apresentar duas molculas de DNA com dupla hlice e, portanto, dois cromatdeos-irmos. Para alm disso, o centrossoma tambm duplicado, e estes dois eventos apesar de independentes, requerem vrios factores comuns para se processarem. O resultado final a presena de material gentico duplicado na clula, que eventualmente ser dividido em duas partes. Por fim, nesta fase, h a sntese 140
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de histonas. Os danos do DNA podem, frequentemente, ocorrer nesta fase, sendo que a sua reparao iniciada imediatamente depois da replicao. O centrossoma actua como centro organizador de microtbulos, sendo formado por material amorfo e um par de centrolos. O aster um conjunto radial de microtbulos, que saem de um plo do fuso mittico ou do centrossoma. Ciclo centrossmico
O ciclo centrossmico inclui a separao do par de centrolos na fase G1 e a duplicao do centrossoma na fase S, visto este ser necessrio para a formao dos plos do fuso. Na mitose, cada par de centrolos faz parte de um centro organizar microtubular que inicia a formao dos microtbulos formando um aster. Para esta duplicao do centrossoma, intervm ainda a CDK G1/S.
2.3. Fase G2
A fase G2 a terceira e final subfase da interfase do ciclo celular. Segue a completao da sntese do DNA e a replicao dos cromossomas da fase S, e ocorre durante um perodo de tempo bem determinado que compreende cerca de 4 a 5 horas. Nesta fase da interfase, o ncleo fica bem definido, recoberto pelo envelope nuclear e contm pelo menos um nuclolo. Ainda que os cromossomas tenham sido replicados, elas ainda no podem ser distinguidos individualmente pois ainda se assemelham a pequenos agrupamentos de cromatina condensada. Esta fase prepara a clula para a mitose (fase M) depois de verificar a replicao do DNA, a presena de mutaes no DNA e de activar o MPF.
3. Mitose
A mitose um fenmeno celular que ocorre em diversos tipos de clulas, nas quais, por um complicado processo de diviso nuclear e citoplasmtica, uma clula origina duas clulas filhas. Estas so geneticamente iguais clula-me que lhe deu origem, mantendo-se inaltervel o nmero de cromossomas especficos (2n 2n). um processo de diviso celular em que a perpetuao do genoma celular se mantm inaltervel ao longo das diferentes geraes ps-mitticas. Durante a mitose, ocorre, como mais adiante est pormenorizado, um conjunto complexo de fenmenos biolgicos que se desenvolvem sucessivamente ao longo do processo. Enquanto que uns
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ocorrem simultaneamente, outros ocorrem interligados e dependentes de ocorrncias anteriores onde actuam mltiplos factores reguladores do processo. A quantidade de clulas que, nomesmo tecido, se encontram simultaneamente em mitose calculada sob a forma percentual e chama-se ndice mittico. O ndice mittico apresenta uma percentagem muito elevada nos pices vegetativos da raiz e do caule das plantas, bem como no testculo e no ovrio dos animais, locais onde se produzem, por mitoses, respectivamente, as vrias geraes de espermatognias e oognias. O centrmero o ponto de unio dos cromatdeos-irmos e contm uma sequncia de DNA especfica necessria para a separao dos cromtideos-irmos. Por sua vez, o cinetocoro uma estrutura proteica adjacente ao centrmero onde se ligam os microtbulos cinetocorianos.
3.1.
Ao longo do ciclo celular, necessrio desaparecer o invlucro nuclear, e isso vai ocorrer atravs do MPF que tem a capacidade de fosforilar as protenas constituintes da lmina nuclear constituda por filamentos intermdios altamente organizados, que tm composio varivel. A lmina nuclear, ao sofrer fosforilao, sofre desorganizao e h alterao da membrana do invlucro nuclear e consequente desintegrao da mesma. No incio da profase, as lminas sofrem fosforilao e desintegrao e s depois na telofase que a protena sofre desfosforilao, permitindo que haja novamente a formao do invlucro nuclear.
Na profase tambm comea a formao do fuso acromtico, constitudo por vrios tipos de microtbulos:
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Aster que partem dos centros organizadores microtubulares Cinetocorianos ligam-se ao cinetocoro Polares ligam-se a um microtbulo polar, sendo importante para o movimento dos cromossomas.
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A fosforilao destas protenas induz a condensao dos cromossomas, porque h protenas envolvidas na condensao, como a condensina (activada pelo MPF), a desagregao do invlucro nuclear por aco da fosforilao das lminas, a desagregao do citosqueleto, do retculo endoplasmtico e do complexo de Golgi devido fosforilao das protenas microtubulares e dos filamentos intermdios.
3.4. Profase
O incio da profase torna-se visvel com o aumento de volume nuclear e aparecimento de cromatina organizada sob a forma de longos e finos filamentos cromossomas depois de se condensar atravs das condensinas. Os cromssomas profsicos so dicromatdicos, isto , cada cromossoma constitudo por duas molculas de DNA rigorosamente iguais. O nuclelo ou nuclolos iniciam a sua dissipao e, gradualmente, vo desaparecendo no nucleoplasma. Com isto, os microtbulos citoplasmticos tambm se dissociam progressivamente, e o centrossoma separa-se para os plos do fuso. 144
Captulo 11 Ciclo celular |
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3.5. Prometafase
Incio da desorganizao e dissipao do invlucro nuclear, dando lugar ao aparecimento de fragmentos dessen invlucro, estruturas morfologicamente semelhantes a cisternas do retculo endoplasmtico, devido fosforilao da lmina nuclear por aco das M-CDKs. Os cromossomas prometafsicos continuam o seu encurtamento e espessamento, encontrando-se sem posio preferencial no nucleoplasma. Os cinetocoros dos cromossomas tornam-se visveis em cada um dos lados do centrmero e, ao mesmo tempo, aparecem os microtbulos orientados para os plos do futuro fuso acromtico. Cada cromossoma inicia o processo de orientao e deslocamento para o plano equatorial do fuso, por meio dos diferentes tipos de microtbulos que, entretanto, se tornaram mais evidentes. Os centrossomas j se encontram em plos opostos da clula a partir dos quais crescem microtbulos que eventualmente estabeleceram uma ligao estvel com os cinetocoros. Os cromossomas continuam a compactar e os braos dos cromatdeos-irmos separam-se claramente. Quando os cromossomas j esto biorientados, iniciam a migrao em direco regio equatorial da clula.
3.6. Metafase
Os cromossomas metafsicos (de constituio dicromatdica) localizam-se no plano equatorial do fuso por meio dos seus centrmeros, de forma alinhada. Os cromatdeos tornam-se mais distintos por ligeiro afastamento dos seus braos, ficando apenas aderentes na regio do centrmero. Os cinetocoros e os microtbulos cinetocorianos tornam-se bem visveis e orientados longitudinalmente desde cada plo do fuso acromtico at os cinetocoros. a fase esttica da mitose. Ocorre a activao do APC ou ciclossoma, e as ciclinas so degradadas. O MPF inactivado.
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3.7. Anafase
Caracterizada pela ascenso polar de cada um dos cromossomas filhos (cromatdeos-irmos dos cromossomas metafsicos) resultante da separao dos cromossomas dicromatdicos metafsicos. Anafase A inicia a anafase, com a dissoluo da coeso centromrica, nico ponto que unia os cromatdeos de cada um dos cromossomas, sendo repuxado pelos microtbulos cinetocorianos, e faz com que os cromatdeos-irmos (que passam a constituir cromossomas monocromatdicos) se desloquem para os plos. Anafase B durante a sua deslocao, os cromossomas continuam com o cinetocoro interligado aos plos por meio dos microtbulos cinetocorianos. Os dois plos do fuso afastam-se um pouco mais um do outro por alongamento da clula devido deslocao dos microtbulos polares e, consequentemente, aumentando a distncia entre os cromossomas. Verifica-se um aumento da concentrao de clcio e uma desfosforilao das protenas.
Separao dos cromatdeos-irmos Recentes estudos genticos indicaram que o APC regula a separao dos cromatdeos-irmos no incio da anafase. As protenas de coeso SMC ligam-se a cada um dos cromatdeos-imros e outras subunidades coesivas como o Scc1 ligam depois as protenas SMC entre si, com o objectivo de efectuar a associao entre os dois cromatdeos-irmos. A actividade obtida atravs desta ligao depende da securina, que est presente em todos os eucariontes. Assim que os cinetocoros estiverem ligados aos microtbulos, o APC dirigido por um factor de especificidade Cdc20 que poliubiquitina a securina, conduzindo a clula para o incio da anafase. A securina poliubiquitinada rapidamente degradada por proteossomas, libertando de seguida a separase.
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Livre do seu inibidor, a separase cliva o Scc1, partindo a protena de ligao entre os cromatdeosirmos. Assim que esta ligao quebrada, os cromatdeos-irmos podem mover-se para os plos opostos e permitir o desenvolvimento da anafase.
3.8. Telofase
Reorganizao do invlucro nuclear, rodeando os cromossomas que gradualmente se despiralizam e se descondensam tornando-se menos visveis. Ocorre a nucleocinese, isto , a formao dos ncleos-filhos. O centrossoma de cada uma das futuras clulas-filhas fica localizado na regio citoplasmtica perinuclear junto ao invlucro nuclear recm-formado. A maior parte dos microtbulos do fuso despolimeriza durante o incio da telofase, e s se podem observar numa zona entre os dois ncleos telofsicos. Durante o perodo inicial da telofase, o citosqueleto das clulas-filhas, baseado nos filamentos intermdios, ser alterado, conduzindo uma alterao significativa da morfologia celular. Conjuntamente, comea a haver a redistribuio equitativa dos organelos celulares pelas clulas-filhas. Assim, o nuclolo reaparece e formam-se clulas diplides (DNA = 2n).
3.9. Citocinese
O citoplasma dividido atravs de um processo denominado de clivagem. Na maioria das clulas, a diviso segue-se rapidamente aps a segregao dos cromossomas durante a mitose. A diviso inicia-se durante a anafase B, continua durante a telofase, terminando antes das clulas entrarem novamente em interfase.
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Depende da formao de um anel contrctil, uma estrutura formada por filamentos de actina e miosina II. O anel de contraco, forma-se exactamente a meio da distncia existente entre os dois centrossomas do fuso mittico. formado por filamentos organizados paralelamente em relao ao plano de diviso e numa associao estreita com a face citoplasmtica da membrana celular. Junto aos filamentos de actina, esto os de miosina que, ao longo do processo de diviso, produzem uma fora que determina a contraco do anel durante a telofase. Forma-se o corpo mdio que contm a parte central dos microtbulos polares e um material denso do qual se conhecem alguns componentes, mas pouco se sabe sobre a sua funo.
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1. Apoptose
O falecimento das clulas por morte programada marcado por uma sequncia bem definida de alteraes morfolgicas, normalmente designado por apoptose. As clulas em morte, encolhem e condensam, para depois fragmentar, libertando pequenos corpos apoptticos, que geralmente so englobados por outras clulas. O ncleo condensa e o DNA fragmenta-se. De forma importante, os constituintes intracelulares no so libertados para o meio extracelular onde poderiam exercer efeitos de eliminao nas clulas vizinhas. Os genes envolvidos na morte celular controlada codificam protenas com trs funes diferentes: Killer importantes para a clula comear o processo apopttico; Destruction protenas que digerem o DNA numa clula em apoptose; Engulfment importantes para a fagocitose da clula em apoptose por outra clula. Na apoptose, ocorre ainda a degradao do citosqueleto, e a exposio da fosfatidilserina para o lado no citoslico da membrana citoplasmtica, envolvendo a activao em cascata de enzimas designadas por caspases. Desta forma, as clulas ficam isoladas, no havendo nem lise das suas membranas nem processo inflamatrio associado.
2. Vias Apoptticas
2.1. Via mitocondrial
A via mitocondrial envolve membros pr-apopttios da famlia Bcl-2 que incluem a Bax e a Bid, que normalmente se encontram fracamente associados membrana externa da mitocndria, prevalecendo maioritariamente no citosol. A interaco entre o Bax e o Bid leva oligomerizao dos elementos, seguida da insero na membrana externa da mitocndria. Estas molculas passam, ento, a constituir canais de sada de protenas intermembranares desde a mitocndria at ao citoplasma, incluindo o citocromo c e o factor indutor de apaoptose. O citocromo c, uma vez libertado, activa uma protena citoplasmtica (Apaf1), a qual recruta e activa a procaspase-9, constituindo um complexo proteico denominado de apoptossoma. A caspase-9, como caspase i ci ni adora i requerer e acti a caspase-3 executora,a qualdegradar prote i portantes r var nas m para a variabilidade celular e, tambm, outras caspases. 150
Captulo 12 Morte celular |
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As protenas Bcl-2 e Bcl-xL, membros anti-apoptticos da famlia Bcl-2 bloqueiam a morte celular por prevenirem a libertao das protenas inermembranares da mitocndria. No entanto, uma vez ultrapassada a fase de morte celular que envolve este organelo, as protenas anti-apoptticas deixam de ser qualquer efeito na inibio da apoptose. As protenas anti-apoptticas podem interactuar entre si, regulando reciprocamente as suas funes. Por outro l ado, a funo das caspases executoras tam bm pode ser m odul por um outro ti de ada po protenas, que se pode ligar caspase-9 e inibir a sua actividade de protease, bloqueando a este nvel o processo apopttico. Para todo este processo ocorrer, o Bax e o Bcl-2 tm de estar em equilbrio para que no final, atravs de autoclivagem, a caspase-9 se torne activa, induzindo uma cascata de reaces das caspases e a apoptose consequente.
As caspases so sintetizadas sob a forma de precursores inactivos as procaspases sendo protenas altamente conservadas. Existem dois tipos de caspases: Iniciadoras caspase-8 ou caspase-9 Executoras ou Efectoras caspase-7 ou caspase-3
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Captulo 13 Meiose
A meiose um processo de diviso celular atravs do qual uma clula v o seu nmero de cromossomas reduzido a metade. Por este processo so formados gmetas. Nos organismos de reproduo sexuada, a formao dos seus gmetas ocorre por meio desse tipo de diviso celular. Quando ocorre fecundao, pela fuso de dois desses gmetas, ressurge uma clula diplide, que passar por numerosas mitoses comuns at formar um novo indivduo, cujas clulas sero, tambm, diplides. A meiose permite a recombinao gnica, de tal forma que cada clula diplide capaz de formar quatro clulas haplides geneticamente diferentes entre si, explicando a grande variabilidade das espcies com reproduo sexuada. Os principais acontecimentos meiticos so: Duas divises de DNA replicado originam quatro clulas haplides; Nmero de cromossomas das clulas-filhas metade do nmero de cromossomas da clula-me; Formao do complexo sinaptonmico; Emparelhamento de cromossomas homlogos; Formao de quiasmas.
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Para alm disto, na meiose tambm acontece que: dado que os cromossomas homlogos em determinada fase da meiose esto unidos, pode haver o crossing-over, fenmeno em que partes de um gene de um cromossoma homlogo podem passar para o outro cromossoma homlogo, aumentando ainda mais a variabilidade gentica.
2. Fases da Meiose
A meiose constituda por duas divises distintas, sendo que em qualquer uma delas se podem considerar quatro fases: profase, metafase, anafase e telofase.
2.1.
Diviso I
Na diviso I da meiose, as clulas-filhas so haplides em relao ao nmero de cromossomas, mas contm uma quantidade diplide de DNA. a diviso mais complexa, sendo designada diviso de reduo. Os cromossomas emparelham e trocam material gentico (atravs de crossing-over) para, ento, darem origem s duas clulas-filhas. Profase I tem um evento nico atravs do emparelhamento dos cromossomas homlogos, atravs da sinapse. O cromossoma resultante uma ttrada, sendo composto por dois cromatdeos em cada cromossoma, facilitando a ocorrncia do crossing-over. Durante este mecanismo, os cromatdeos partem e podem ser re-anexados a um cromossoma homlogo difernente. Consequentemente, em vez de se produzirem dois tipos de cromossomas, so produzidos quatro, duplicando tambm a variabilidade dos gentipos dos gmetas formados. A ocorrncia do crossing-over indicada por uma estrutura especial, o quiasma, desde que os alelos recombinantes se alinhem com outros do mesmo tipo. No final da profase I, os cromossomas homlogos separam-se lentamente, devido ao facto de ainda estarem ligados pelo quiasmata. A profase I divide-se em cinco estados: Leptteno condensao dos cromossomas Zigteno incio do desenvolvimento do complexo sinaptonmico Paquteno surge aps a formao do complexo sinaptonmico Diplteno observao do quiasmata e sntese de molculas Diacinese dissociao do invlucro nuclear e dos nuclolos e condensao dos cromossomas
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Formao do complexo sinaptonmico O complexo sinaptonmico uma estrutura formada entre os cromossomas homlogos, permitindo o emparelhamento de regies exactamente correspondentes. Nos cromossomas homlogos, vai haver estabelecimento de ligaes atravs de um conjunto de protenas, que vo permitir a ligao entre as molculas de DNA dos dois cromossomas homlogos. Nesta rede proteica, existem determinadas protenas em alguns espaos, os ndulos de recombinao, que so os locais onde se d o crossing-over. Esta troca de genes, no pode ser feita em genes adjacentes, sendo necessrio espaamento. Os ndulos de recombinaao tambm sao constitudos por protenas, muito importantes para a recombinao gnica, como a Rad51. Os ndulos de recombinao aparecem ao longo do complexo, e sero tantos quantos os crossingovers que ocorrerem.
Metafase I as ttradas alinham-se ao longo do plano equatorial. As fibras deste plano ligam-se ao centrmero de cada par de cromossomas homlogos.
Anafase I as ttradas separam-se e deslocam-se para plos opostos das fibras do plano equatorial. Aqui, os centrmeros permanecem intactos.
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Captulo 13 Meiose |
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Telofase I muito semelhante telofase mittica, excepto no facto de aqui existir apenas um par de cromossomas replicados em cada clula.
2.2. Diviso II
A segunda diviso meitica, nas suas linhas gerais, segue os traos de uma diviso mittica ordinria.
Profase II os envelopes nucleares (caso se tenham formado na telofase I) dissolvem-se e as fibras do plano equatorial reconstituem-se.
Metafase II os planos movem os cromossomas para a rea equatorial e anexamnos em lados opostos dos centrmeros na regio do cinetocoro.
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Mitose
Ocorre em clulas somticas. Diviso nica. Um ciclo de replicao do DNA seguido por uma diviso de que resultam duas clulas somticas diplides geneticamente idnticas O nmero de cromossomas das clulas-filhas idntico ao da clula-me A clula que sofre mitose pode ser diplide ou haplide. Compreende apenas uma diviso No ocorre diferenciao do complexo sinaptonmico No h emparelhamento dos cromossomas homlogos. Cada cromossoma comporta-se independentemente Normalmente o crossing-over somtico rarssimo
Crossing-over ou sobrecruzamento entre cromossomas homlogos Formao de quiasmata Os produtos meiticos no podem empreender outra diviso meitica, embora possam em alguns organismos empreender divises meiticas Quatro produtos celulares haplides (gmetas ou esporos) produzidos por ciclo diferentes dos progenitores e entre si Centrmeros dividem-se longitudinalmente apenas na anafase II Formao de ttradas cromossmicas Profase I mais longa
No h formao de quiasmata Produtos mitticos geralmente so capazes de sofrer outras divises mitticas subsequentes
Dois produtos diplides (duas clulas-filhas) produzidas por ciclo e geneticamente iguais clula-me Centrmeros dividem-se longitudinalmente na anafase
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Sry, que vai fazer com que as clulas precursoras se transformem e diferenciem em clulas de Sertoli, que tm a capacidade de sintetizar hormonas que impedem a formao dos rgos sexuais femininos. Por outro lado, diferenciam as clulas precursoras em clulas de Leydig que vo produzir testosterona, induzindo a formao de clulas sexuais, os espermatozides.
5. Oognese
A oognese um processo que ocorre nos ovrios que conduz formao dos gmetas femininos. Contrariamente espermatognese que se inicia na puberdade, a oognese inicia-se durante o desenvolvimento embrionrio. A oognese acompanhada da maturao dos folculos ovricos; num processo que compreende quatro fases:
Multiplicao durante o desenvolvimento embrionrio, as clulas germinativas oognias multiplicam-se, por mitoses sucessivas.
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Crescimento as oognias aumentam de volume, devido sntese e acumulao de substncias de reserva, originando os ocitos I, que se rodeiam de clulas foliculares, originando os folculos primordiais. Os ocitos I iniciam a primeira diviso meitica, que se interrompe em profase I.
Repouso os folculos primordiais, contendo os ocitos I em profase I, permanecem inactivos desde o nascimento at puberdade. Nesta fase, a maior parte dos folculos primordiais degenera.
Maturao - a maturao do ocito I torna-se evidente quando o folculo atinge a fase de maturao. Quando isto acontece, o ocito I, que se encontrava em profase I, recomea a diviso da meiose, originando duas clulas haplides desiguais: uma maior, o ocito II e uma de menor tamanho, o 1 glbulo polar. A diferena nos seus tamanhos deve-se a uma citocinese desigual, isto , o citoplasma divide-se por gemiparidade. Ambas as clulas se destacam da parede do folculo, para a cavidade folicular. Aps a ruptura do folculo de Graaf, com a consequente libertao do seu contedo, ocorre a ovulao, isto , a libertao do ocito II para o pavilho da trompa.
6. Espermatognese
A espermatognese o processo de diferenciao das espermatognias em espermatozides que ocorre nos tubos seminferos dos testculos, de forma centrpeta (da periferia para o lmen) e compreende quatro fases sucessivas:
Multiplicao nesta fase, as espermatognias esto localizadas na periferia dos tubos seminferos. Desde a puberdade, estas clulas entram em proliferao constante dividindo-se por mitoses sucessivas. Crescimento as espermatognias aumentam de volume, devido sntese e acumulao de substncias de reserva, originando os espermatcitos I. Maturao cada espermatcito I (com carga gentica 2n) divide-se por meiose, originando duas clulas (com carga gentica n), mas com cromossomas duplicados, donde vo resultar dois espermatcitos II. Nestes, ocorre a meiose II formando-se 4 espermatdeos, estes j com carga gentica n. Nesta diviso meitica, h a separao de 23 158
Captulo 13 Meiose |
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cromatdeos-irmos. Diferenciao ocorre uma perda de grande parte do citoplasma, a reorganizao dos organelos citoplasmticos e a diferenciao de um flagelo, a partir dos centrolos. Assim, os espermatdeos sofrem um processo de transformao em espermatozides. Precursores dos espermatozides As clulas precursoras dos espermatozides no sofrem citocinese durante este processo de diviso. Como no h separao das clulas, ficam interligadas atravs de pontes citoplasmticas. Desta forma, s no final, quando j so espermatozides, que estas clulas se tornam individuais. Esta ligao por pontes citoplasmticas tem o nome de sincitium.
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Captulo 14 Cancro
O cancro compreende genericamente as doenas em que determinado grupo de clulas do organismo, se divide de forma descontrolada, invadindo os tecidos adjacentes e/ou distantes. causado por mutaes no ADN, que podem ser hereditrias mas, mais frequentemente, so adquiridas ao longo da vida. Existem vrios tipos de cancro: Carcinomas clulas epiteliais; Sarcomas tecido conjuntivo ou muscular; Leucemias clulas hematopoiticas. O cancro adquire geralmente a designao de tumor ou neoplasia quando se forma uma grande massa de clulas anormais, que pode ser benigna ou maligna.
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Captulo 14 Cancro |
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2. Carcinognese
O processo de carcinognese no mais que o processo de formao de um cancro, sendo que a mutagnese a produo de uma alterao na sequncia de DNA, originando um cancro.
2.1.
Agentes carcinognicos
Os agentes carcinognicos so agentes mutagnicos, ou seja, substncias que ao entrarem em contacto com o organismo, induzem a formao de um tumor. Podem ser: Qumicos substncias presentes no ambiente, sejam elas naturais ou sintetizadas pelo Homem, que se ligam ao DNA e causam mutaes ou inibem a actividade das enzimas relacionadas com a reparao do DNA. Podem ser directos ou indirectos, consoante a incidncia que tiverem no organismo. Radiaes as radiaes ionizantes e excitantes podem provocar tumores atravs de mutaes gnicas, activao de oncogenes e inactivao de anti-oncogenes. Podem provocar vrios tipos de mutaes cromossmicas, mas o poder mutagnico depende da clula-alvo, da idade do paciente e da resposta imunitria. Vrus substncias que tm a capacidade de introduzir DNA nas clulas e induzir mutaes.
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Em primeiro lugar, se existem clulas que proliferam muito, significa que so clulas que necessitam de uma grande quantidade de nutrientes. So geneticamente instveis porque esto continuamente a proliferar, e os mecanismos de reparao de DNA no so eficazes, no conseguindo reparar quaisquer mutaes. So evasivas, tendo capacidade de invadir tecidos, a lmina basal, etc.. Normalmente, metastizam, no morrem por apoptose, no sofrem diferenciao e fogem ao controlo dos sinais internos ou externos de proliferao.
Quando h formao de um tumor, estas clulas proliferam muito e, como consequncia, no tm tempo para se diferenciarem. Por isso, vo invadindo as camadas de clulas que vo sendo eliminadas, e as clulas que deviam ser diferenciadas e/ou pouco diferenciadas, passam a ser todas pouco diferenciadas. Como consequncia, as clulas tm estrutura pouco especializada, e forma-se o tumor. O nuclolo proeminente porque se as clulas esto em proliferao, precisam de grande quantidadede de nutrientes e h necessidade de sntese de protenas e de rRNA. Para alm disso, a relao entre o ncleo e o citoplasma bastante elevada e a estrutura celular pouco especializada.
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3. Metstases
Uma metstase a formao de uma nova leso tumoral a partir da primeira mas sem continuidade das duas. Assim sendo, implica que as clulas neoplsicas se desprendam do tumor primrio e caminhem atravs do interstcio, ganhando uma via de disseminao para um local distante onde formam uma nova colnia neoplsica. Em cada um desses passos, as clulas malignas tm de superar os sistemas de controlo do organismo que mantm as clulas nos seus locais primitivos. Assim, as metstases s ocorrem em tumores malignos e quando surgem, o tumor quase sempre incurvel. Para metastizar, as clulas necessitam de: Perder a adeso s clulas vizinhas perda da expresso das molculas de adeso atravs das Ecaderinas; Penetrar em outros tecidos tm de ter integrinas que funcionam como receptores das lamininas, os quais permitem que a clula adira lmina; devem ter superfcie colagenase do tipo IV para degradar a lmina. Normalmente, as clulas cancergenas morrem mais facilmente que as clulas normais, devido irradiao ou exposio a drogas que interferem com o metabolismo do DNA. Para alm disso, as alteraes na replicao, recombinao e reparao do DNA tornam-nas progressivamente mais vulnerveis.
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1. Microscopia
Os microscpios podem utilizar como fonte luminosa um feixe de fotes ou de electres sendo designados respectivamente por microscpios fotnicos ou electrnicos. A qualidade de um microscpio avaliada pelo seu poder de resoluo, ou seja pela sua capacidade de formar imagens distintas de dois pontos ajdacentes, e no pelo seu poder de ampliao. O poder de resoluo do olho humano a uma distncia de cerca de 25 cm de cerca de 0.1 a 0.3 mm, enquanto que o do microscpio ptico de cerca de 0.2 m e o do microscpio electrnico da ordem de 1 . Poder de resoluo a funo do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numrica. Depende da largura do cone de iluminao, ou seja, depende do condensador e das lentes objectivas. da largura do ngulo de abertura n ndice de refraco do meio que separa a amostra da objectiva Abertura numrica a notao caracterstica da objectiva que relaciona o ngulo de abertura com o ndice de refraco do meio situado entre o objecto e a lente frontal da objectiva.
ngulo de abertura ngulo formado pelos raios luminosos que delimitam o cone de luz que atinge a lente frontal da objectiva. Varia com o ndice de refraco do meio existe entre o objecto e a objectiva. Quanto maior a abertura numrica, menor o limite de resoluo e, portanto, maior ser o poder de resoluo. Visibilidade - a capacidade de ver ou detectar um objecto. Os objectos que podem ser observados so: as peas naturalmente corados, as peas coradas artificialmente ou as peas com ndices de refraco diferentes dos do meio onde esto inseridos. ndice de visibilidade - a diferena entre os ndices de refraco do objecto e do meio. Poder de ampliao a capacidade de fornecer uma imagem ampliada do objecto.
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Principais diferenas entre o microscpio ptico e electrnico Microscpio ptico Lentes de vidro Feixe de fotes Poder de resoluo cerca de 200 nm Amplia cerca de 2.000x Clulas vivas ou mortas Microscpio electrnico Lentes electromagnticas Feixe de electres Poder de resoluo cerca de 0.1 nm Amplia cerca de 100.000x Clulas usualmente mortas
1.1.
Componentes do microscpio
Sistema mecnico P Brao Tubo Suporte do condensador Suporte do diafragma Suporte de porta-filtros Parafuso macromtrico Parafuso micromtrico Botes de controlo da sobreplatina Revlver Platina Pina de sobreplatina Sistema ptico Fonte luminosa faz variar a visibilidade e o contraste. O filtro de luz aumenta a visibilidade ou reduz o contraste e vice-versa, conforme a cor do filtro e do objecto. A qualidade da imagem pode ser aperfeioada pelo uso de filtros corados que tm influncia na composio espectral da luz no tubo do microscpio. Os filtros corados so filtros de absoro de certas radiaes, e variam conforme a sua cor e espessura. Condensador fornece objectiva um cone de luz uniforme, concentra os raios luminosos na preparao e aumenta o poder de resoluo Diafragma controla a abertura do cone de luz Objectivas fornecem uma imagem real, ampliada e invertida (imagem intermdia) Oculares fornecem uma imagem virtual, ampliada e direita. O comprimento das oculares varia na razo inversa da ampliao.
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1.2.
Posio do microscpio - em frente do observador. Posio da preparao microscpica - apoiada sobre a platina e imobilizada pela pina da sobreplatina mvel, com a lamela voltada para cima. Posio do observador - sentado de forma a manter uma posio confortvel para a observao ao microscpio. Deve observar pelas oculares com os olhos prximos das mesmas. A mo esquerda deve estar, do mesmo lado, sobre o parafuso macromtrico, e tendo a mo direita ocupada com os parafusos da sobreplatina mvel ou com o parafuso micromtrico, ou livre para escrever ou desenhar. Focagem do microscpio - colocar a preparao microscpica na platina e certificar-se de que a mesma est imobilizada pela mola da sobreplatina mvel e voltada para cima. Com a mo direita, mover o parafuso das grandes deslocaes, fazendo subir a platina e aproximar, da preparao, uma objectiva de pequena ampliao (4x). Certificar-se de que esta a objectiva que est no prolongamento do tubo. Em seguida dever: * observar pelas oculares * ajustar a posio do condensador * abrir o diafragma ris * focar, observando pela ocular direita, mantendo o olho esquerdo fechado * fechar o olho direito e observar pela ocular esquerda * focar com o anel graduado do porta-ocular esquerdo, sem mexer nos botes de comando de focagem * regular a distncia interpupilar * tendo a mo esquerda no boto de comando do parafuso micromtrico que se desloca, continuamente, num e noutro sentido, e tendo a mo direita nos parafusos de deslocao da sobreplatina mvel, pode-se explorar a preparao (fig. 2): * uma vez conseguida a focagem, a mo direita fica livre para escrever ou desenhar. Mudana de objectiva - rodar o revlver at colocar a objectiva seguinte em posio de observao, exactamente no prolongamento do tubo: * ouvir o estalido (centrar) * notar que as objectivas so para-focais : pode-se mudar de uma objectiva para a outra sem necessidade de mover o parafuso macromtrico, bastando, para focar, usar o parafuso micromtrico * ajustar a posio do diafragma do condensador, objectiva (uma objectiva de maior ampliao, necessita de maior abertura do diafragma). Utilizao da objectiva de imerso - depois de utilizar a objectiva a seco de maior ampliao, rodar o revlver, deixando-o numa posio que, em relao posio de observao, seja intermediria entre a objectiva de 40x e a objectiva de imerso: * colocar uma gota de leo de imerso (leo de cedro) sobre a lmina * rodar o revlver de modo a colocar a objectiva de imerso no prolongamento do tubo * observar pelas oculares * terminada a observao, descer a platina antes de retirar a preparao. 166
Captulo 15 Parte Laboratorial |
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Cuidados a ter * No tocar com os dedos na lente frontal * No tocar com os dedos na lente ocular * No deixar que a lente frontal das objectivas toque na lamela ou lmina das preparaes * No utilizar a objectiva de imerso, sem usar o leo de cedro * Limpar as lentes com um pano macio e um delicado movimento circular * No retirar as objectivas dos seus encaixes no revlver * No desmontar as objectivas nem as oculares * No forar os parafusos Recomendaes aps utilizao do microscpio * Descer a platina * Colocar a objectiva de menor ampliao * Limpar a objectiva de imerso, retirando o leo de cedro (assim como da lente frontal do condensador) com xilol, mas no deixar vestgios deste, porque descola as lentes.
2. Fixadores
Os fixadores so substncias ou agentes que induzem precipitao ou coagulao das protenas tornando-as insolveis. Estes utilizam-se em tcnicas citolgicas para: * inibir a actividade enzimtica da clula * impedir a actividade e a proliferao de bactrias * endurecer as clulas, para que elas resistam melhor s etapas seguintes das tcnicas citolgicas * aumentar a afinidade das estrnturas celulares para os corantes citolgicos, tornando-as assim mais facilmente corveis * manter quanto possvel a morfologia e estrutura das clulas
2.1.
Tipos de fixadores
Agentes Fsicos Calor - pode ser seco (chama, ex: bactrias) ou hmido (fervura). De um modo geral so profundamente a estrutura das clulas. mtodos grosseiros e violentos que alteram
Dissecao temperatura ambiente - em que h evaporao da gua das clulas e dos lquidos intersticiais Frio - que por si s no um agente fixador. O frio actua mais como um agente conservador, pois suspende ou evita temporariamente os processos autolticos, os quais se restabelecem, logo que a pea deixe de estar submetida ao frio.
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Agentes Qumicos Metanol, etanol, cido clordrico, cido picrico, cido sulfrico, cido tricloroactico, tetrxido de smio, cido actico, formaldedo etc.
Misturas de fixadores mais usadas em microscopia ptica: * Lquido de Bouin (c. picrico + formol + c. actico) * Lquido de Camoy (etanol + cloroformio + c. actico) * Lquido de Fleming (c. Actico + trixido de crmio + tetrxido de smio) * Lquido de Bouin-Allen (liq. De Bouin + c croinico + ureia) * Lquido de Dubosq-Brazil (sol. alcolica saturada de c. picrico + formol + c. actico) Quando uma pea colocada num fixador, a morte das clulas no ocorre instantneamente. O fixador penetra na pea por difuso, de tal modo que a maioria das clulas perifricas fixam-se melhor e mais rapidamente do que as centrais. A rapidez da fixao depende da barreira protica que se origina na periferia do tecido. Qualidades de um bom fixador * ter um bom poder de penetrao * ter poder de endurecimento * ser rpido para impedir a alterao da estrutura da pea
3. Coloraes e corantes
Os corantes podem dividir-se em:
Corantes naturais: hematoxilina (extrada de uma leguminosa pau de campeche), carmin (extrado da cochonilha, no pode ser usado em cortes de parafina), anil (extrado de uma leguminosa anileiro), orcena (extrada de certos lquenes, corante de fibras elsticas) Corantes artificiais: azul de metileno, azur I, azur II, azul de toluidina, vermelho neutro, etc.
-
Os corantes artificiais so compostos orgnicos da srie aromtica. Nem todas as substncias coradas, orgnicas ou no, podem ser considerados corantes. Se existirem determinados grupos atmicos, chamados cromforos, como o grupo ntrico (N02), nitroso (NO), azo (NN), que se combinem com molculas de hidrocarbonetos aromticos transformam-nas em cromogneos, ou seja, ern compostos capazes de gerar corantes.. Para que um cromogneo se transforme em corante necessita, por sua vez, de 168
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se ligar a auxocrmios, agrupamentos com funes cidas ou bsicas, que permitem a formao de sais.
Tipos de corantes artificiais: * cidos - eosina, fucsina cida, vermelho congo * bsicos - vermelho neutro, verde de metilo, azul de metileno * neutros - eosinato de azur de metileno.
Consoante a afinidade de determinadas estruturas das clulas ou tecidos para com um dado tipo de corantes as estruturas podem ser designadas por: * acidfilas - se coram com um corante cido (citoplasma) * basfilas - se coram com um corante bsico (cromatina)
Para as preparaes fixadas por processos qumicos, um constituinte celular basfilo pode passar a acidfilo, uma vez que a constituio fsico-qumica dos tecidos poder ser alterada. Tipos de colorao quanto ao mtodo de actuao do corante * Colorao simples ou progressiva - o corante deve deixar de actuar no momento em que a estrutura celular, que se pretende evidenciar, atinja a colorao desejada. * Colorao regressiva - h uma sobrecolorao recorrendo-se a um diferenciador (lcool a 90, lcool clordrico) que progressivamente vai descorando at se atingir a colorao desejada. Para este tipo de colorao os cortes tm de ser muito finos e de igual espessura, o soluto corante e o diferenciador devem ser diludos * Colorao com mordentes - a actuao do corante precedida de um banho com mordentes, substncias que actuam sobre as estruturas aumentando a sua afinidade para os corantes ou o mordente est contido na soluo de colorao. Um dos mordentes mais usados o sulfato de alumnio. A hematoxilina um exemplo de um corante que necessita de mordentes.
4. Tcnicas citolgicas
Podemos considerar trs tipos de preparaes para os microscpios pticos:
4.1.
um tipo de preparao utilizada a todo o momento, porque permite uma observao rpida e imediata. As clulas so colocadas entre lmina e lamela. Por vezes utilizam-se lminas escavadas que impedem a compresso dos microorganismos a observar.
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Os meios usados devem ter caractersticas (ex: pH e isotonicidade), tanto quanto possvel, idnticas ao meio onde vivem normalmente as clulas a observar. As preparaes a fresco permitem observar: (no permitem distinguir estruturas que apresentem o mesmo ndice de refraco do citoplasma) Movimentos de ciclose Cristais e cristalides Ncleo e nuclolo Vacolos Gros e secreo e gotculas lipdicas Nestas preparaes podem-se utilizar os chamados corantes vitais (corantes que se utilizam em concentraes muito diludas). Exemplos de corantes vitais - vermelho neutro, vermelho congo, azul de metileno, verde Janus (cora as mitocndrias). azul brilhante de cresilo, azur I, azur II. Muitos corantes coram certas estruturas com uma cor diferente da sua ou seja, so corantes reveladores de reaces qumicas e so designados por corantes metacromticos (ex: Vermelho neutro cor vermelho violcea - a pH cido fica vermelho cereja e a pH alcalino muda para amarelo/acastanhado ou alaranjado; o vermelho congo fica azul a pH cido). Limitaes do exame a fresco S se aplica a materiais suficientemente transparentes. A nutrio das clulas no suficiente e dentro de horas, as clulas comeam a mostrar sinais de degenerescncia e posteriormente morrem. As observaes tm assim uma durao muito limitada, sendo portanto preparaes efmeras que no se podem conservar. Observaes in vivo e in vitro A observao in vivo corresponde ao estudo das clulas no seu prprio meio. um mtodo muito utilizado para o estudo dos seres vivos de pequenas dimenses (protozorios e bactrias). A observao in vitro permite o estudo das clulas vivas. Estas so previamente retiradas do meio natural em que vivem e so colocadas em solues com composio qumica bem definida, de forma a que se processe sem qualquer alterao o metabolismo celular.
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Mtodos Fsicos Distenso - estender a pea ao longo de uma lmina sob a forma de uma fina camada (ex. esfregao sanguneo) Dilacerao - separao das vrias partes da pea separando-as com o auxlio de agulhas de dissecao (ex. preparaes de fibras musculares) Agitao - coloca-se a pea num tubo de ensaio e agita-se, separando as vrias partes da pea (ex. preparaes de fibras nervosas) Raspagem - consiste em recolher com o bisturi o produto a observar (ex. preparaes das clulas da mucosa lingual ou bucal) Compresso - presso da lamela sobre a lmina de modo a que a pea sofra distenso (ex. observao de parasitas) Centrifugaco ou ultracentrifugao - dissociao mecnica dos vrios componentes celulares (ex. preparaes de mitocndrias) Mtodos Qumicos enzimas, lcool a 30-40, hidrxido de sdio ou potssio, cido aztico ou sulfrico diludos, gua fervente, etc. A dissociao qumica pode ter diferentes designaes consoante os dissociadores usados: Digesto utilizao de enzimas Descalcificao utilizao de cidos aztico, frmico, tricloroactico etc., em solues aquosas de 1% a 5% durante 10 a 20h. Lavagem - esta fase depende do dissociador usado Colorao Desidratao - esta desidratao feita com uma srie ascendente de lcoois ou acetona. (Ex. alcol a 50, 75, 90, 100 e benzol ou xilol) Montagem - cobre-se a preparao com um meio de montagem (blsamo do Canad, glicerina, gelatina), que geralmente viscoso e endurece com o tempo, por fim coloca-se uma lamela de proteco Secagem - estufa a 50-60C Lutagem - proteger os bordos da lamela com betume da Coreia, verniz ou parafina derretida, impedindo assim a entrada de impurezas Etiquetagem - a etiqueta deve conter o nome da pea, fixador, corantes, data e n da preparao
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minutos em cada passo. Esta etapa necessria, dado que nos passos seguintes se utiliza a parafina, que formada por uma mistura de hidrocarbonetos e insolvel em gua. Impregnao - feita com uma mistura de benzol/parafina (1:1), a 56C, durante 1 hora, seguido de um banho de parafina, temperatura de 56 C, durante 1 hora. Incluso - a pea juntamente com a parafina so colocadas em moldes especiais, ficando a pea includa em parafina, aps a solidificao da mesma. Separa-se o bloco dos moldes e este pode permanecer assim at ser cortado. Corte - efectuado por meio de uma faca colocada num aparelho especial chamado micrtomo, no qual se regula a espessura do corte. Normalmente faz-se um corte de 4-8 tm de espessura, mas tudo depende da natureza do tecido e do estudo que se pretende realizar. Colagem e Secagem - o corte obtido colocado com gua albuminosa, a 37C,1 sobre uma lmina de vidro, indo depois para a estufa a 40 onde permanece 1 a 2 dias. Desparafinao - feita em xilol. Rehidratao - realizada na srie descendente de lcoois (de lcool absoluto at lcool a 50 e depois em gua). Colorao - geralmente efectuada por corantes aquosos. Se o corante alcolico, deve-se proceder rehidratao at ao grau alcolico correspondente soluo alcolica do corante. Geralmente utiliza-se uma associao de dois corantes aquosos. Primeiro colocam-se as lminas contendo os cortes (em tinas com ranhuras) em hematoxilina (de cor arroxeada) durante 10 a 15 minutos. Depois, lavam-se em gua corrente e coram-se nas mesmas condies com a eosina (de cor avermelhada) durante 2 a 5 minutos. Lavagem - em gua durante 30 minutos. Desidratao - feita numa srie ascendente de lcoois demorando cerca de 1 minuto em cada passagem. Montagem, Secagem, Lutagem e Etiquetagem
Microscopia Electrnica Colheita - consiste em retirar a pea histolgica, lav-la se necessrio e cort-la em pequenas pores (volume no deve ser maior que o tamanho da cabea de um alfinete, 0,5 a 1 mm3). Deve ser colocada rapidamente no fixador. Fixao - esta operao consiste, em geral, em dois tipos de fixao, que podem ser seguidos ou intercalados por uma lavagem em tampo durante 1 ou 2 horas. - Gluteraldedo de 1 a 4% (10 fixador), durante 2 horas a 4C. - Lavagem com soluo tampo durante 1 a 12 horas a 4C, se for caso disso. - Tetrxdo de smio de 1 a 2% (2 fixador ou pos-fixador), durante 2 horas. Desidratao - consiste em retirar a gua da pea citolgica numa srie ascendente de lcoois, com tempos variveis. Impregnao - consiste em introduzir as peas citolgicas numa mistura de &ido de propileno com epon ou araldite, cuja concentrao deve aumentar do seguinte modo:
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- 1 mistura de ox. prop. + epon (3:1) - 2 mistura de ox. prop. + epon (1 :1) - 30 mistura de ox. prop. + epon (1 :3) - 4 epon - 5 epon
Incluso - as peas histolgicas so retiradas do epon e colocadas em cpsulas de gelatina, devidamente numeradas, e nelas introduzido novo epon. O epon uma substncia viscosa que polimeriza a uma temperatura de 50-55C, pelo que endurece, decorridos 2-3 dias a 60C. Os blocos assim formados, ficam a constituir peas que podem ser utilizadas muito mais tarde. Corte - os cortes so feitos por meio de facas de vidro ou de diamante em aparelhos designados por ultramicrtomos. Inicialmente fazem-se cortes semi- finos de 1 m que perrnite um estudo preliminar da pea ao ME. Em seguida, fazem-se cortes ultra-finos de 600-700 de espessura. Os cortes assim obtidos so recolhidos em pequenas grelhas de cobre. Colorao - no uma designao correcta dado que os produtos usados com o corantes no coram as organelas, mas imprimem-lhe um determinado contraste e tm a designao de contrastantes. colorao dupla: acetato de uranilo (20 a 30 minutos) e o hidrxido de chumbo (10 a 15 minutos). Observao - depois de contrastados os cortes j podem ser observados ao microscpio electrnico e se necessrio fotografados.
5. Micrometria
A micrometria o captulo da microscopia que determina as dimenses de microorganismos ou peas de tamanho mnimo, fazendo a medio em micrmetros cuja unidade mtrica a micra (m ou ). Utilizam-se dois micrmetros (rguas graduadas): ocular e objectivo. Micrmetro objectivo uma rgua graduada, de 1 nm, dividida em cem partes iguais que se coloca na platina. Cada diviso do micrmetro igual a 10-2 m m = 10 m . Ocular micromtrica - um disco de vidro, que se coloca na ocular, tendo gravada uma escala dividida em cem partes iguais. Coeficiente micromtrico o valor, em micras, de cada diviso do micrmetro ocular para um determinado sistema ocular-objectivo.
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Determinao do coeficiente micromtrico para um determinado sistema ocularobjectiva Depois de iluminar o microscpio, coloca-se o micrmetro objectivo na platina e coloca-se o micrmetro ocular numa das oculares. A escala do micrmetro objectivo constitui o objecto a observar. A escala do micrmetro ocular e a imagem do micrrnetro objectivo encontram-se no mesmo plano de focagem. Rodando a ocular micromtrica, sobrepe-se, em posio paralela, as duas escalas, e faz-se coincidir, exactamente, o zero. Regista-se o nmero exacto de intervalos do micrmetro objectivo que correspondem a um nmero exacto de intervalos do micrmetro ocular.
Medio de um objecto - conhecido este valor, quando se pretende medir qualquer objecto usando aquele sistema ocular-objectivo, bastar substituir o micrmetro objectivo pela preparao que contm o objecto em causa. Contam-se as divises da ocular micromtrica, nas quais est compreendido o objecto, e multiplica-se o nmero de divises pelo valor do coeficiente micromtrico. Se o objecto ocupar 20 divises, multiplica-se este valor por 4 m e a medio real do objecto ser de 80 m. Cmara clara - um dispositivo que se adapta ao microscpio para desenhar. Sendo constituda por um sistema de dois espelhos planos ou dois prismas de reflexo total. Este dispositivo projecta no plano da imagem intermediria, uma imagem real e direita da folha de papel de desenho e da ponta do lpis. Um observador olhando atravs da ocular do microscpio v simultneamente a preparao microscpica e as imagens dos pontos de um plano exterior ao microscpio. Atravs da cmara clara pode-se determinar o valor real de um objecto desenhado com ampliao conhecida.
6. Sangue
O sangue uma massa lquida formada por duas fases: elementos figurados e plasma.
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Plasma fase lquida que contm em suspenso os elementos figurados e tambm protenas, sais inorgnicos, compostos orgnicos, tais como aminocidos, vitaminas, hormonas, hidratos de carbono e lpidos.
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Leuccitos - so corpsculos incolores que esto implicados nas defesas celulares e imunes do organismo. Tm uma forma esfrica quando em suspenso no sangue circulante, podendo assumir um aspecto amebiforme se encontram um substrato slido. Verifica-se muitas vezes que os leuccitos deixam os capilares e penetram no tecido conjuntivo. O nmero total de leuccitos no adulto de 7,5 3,5x109/1, sendo estes valores inferiores nascena. O aumento e a diminuio do nmero de leuccitos no sangue designa-se, respectivamente, por leucocitose e leucopenia. Neutrfilos - tm cerca de 12 de dimetro, so esfricos enquanto circulantes, condio em que parecem inactivos, deformando-se logo que encontram um substrato slido sobre o qual emitem pseudpodes, movimentando-se a uma velocidade de 19 a 36 m por minuto. Constituem a primeira linha de defesa contra a invaso de microorganismos e so fagcitos activos de partculas de pequenas dimenses. O ncleo pouco volumoso formado por 2 a 5 lbulos (geralmente 3), ligados entre si por finas pontes de cromatina. As formas com mais de 5 lbulos so designadas hipersegmentadas e representam clulas envelhecidas. Nos indivduos do sexo feminino aparece frequentemente um apndice, muito menor que o lbulo nuclear, com a forma de uma raquete, que designado por baqueta e que contm a crom ati sexual, constituda normalmente por um cromossoma X na heterocromtico. O ci asm a do neutrfio abundante e carregado de pequenas granul es neutrfias topl l a l (dado que apresentam o mesmo tipo de afinidade para todos os componentes do corante Romanovsky), cujas dimenses (0,3 a 0,8 ) se situam prximo do limite de resoluo do microscpio Basfilos - medem cerca de 12 de dimetro. Embora no sejam muito activos, so capazes de movimentao amibide e de fagocitose. O ncleo volumoso e de forma irregular tomando geralmente a forma de um S. O citoplasma carregado de grnulos basfilos, de cor roxa (esta cor deve-se s propriedades metacromticas da histamina, que um dos constituintes desta granulao) e de maiores dimenses que as dos outros granulcitos, as quais sobrepem o ncleo obscurecendo-o. Eosinfilos - tm um dimetro de cerca de 9 e so clulas dotadas de movimento amibide e capacidade de fagocitar. Esta fagocitose processa-se de um modo mais lento, mas mais selectiva. O ncleo geralmente bilobulado, podendo apresentar 3 lbulos. A principal caracterstica dos eosinfilos a presena de granulaes ovides que coram pela eosina (granulaes acidfilas, cr alaranjada) e que so maiores que as dos neutrfilos. A membrana do citoplasma recortada devido s granulaes. Linfcitos - so cl as esf cas,com di etro vari ul ri m velentre 6 a 8 ,que tm a desi gnao de pequenos linfcitos. Juntamente com estes, ocorre uma pequena percentagem de linfcitos mdios e grandes linfcitos. Embora morfologicamente semelhantes, os linfcitos constituem uma populao celular heterognea. Variam em tamanho, em densidade e em longevidade (alguns vivem poucos dias e outros podem viver at 10 anos). O linfcito pequeno, que predomina no sangue, tem o ncleo esfrico, oval ou reniforme, geralmente em posio excntrica. A cromatina dispe-se em grumos grosseiros ( mais compacta que a do moncito). O citoplasma muito escasso no pequeno linfcito, aumentando a relao citoplasma/ncleo do pequeno para o grande linfcito. Moncitos - tm um dimetro varivel entre 9 e 12 . Podem viver semanas ou meses. Tm como principal funo a fagocitose de vrus, fungos e protozorios. O ncleo ovide, em forma de 176
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rim, ferradura ou enovelado, sendo geralmente excntrico. A cromatina pouco densa, o ncleo dos moncitos mais claro do que o dos linfcitos. Tem o citoplasma bem definido e com granulao azurfila de dimenses inferiores ao poder de resoluo do microscpio, que lhe confere um tom purpura. Plaquetas - so corpsculos anucleados com a forma de disco, que medem cerca de 3 de dimetro e existem apenas nos mamferos. O seu valor no sangue humano est compreendido entre 150 e 400 x 109/L. A principal funo das plaquetas relaciona-se com a capacidade que tem o sangue de irnpedir a sua prpria sada quando os vasos sanguneos so lesados. Quando h ruptura de um vaso sanguneo, as plaquetas aglutinam-se, formando um tampo, que, dependendo do calibre do vaso, pode fechar imediatamente a leso. Alm disso, participam na formao da tromboplastina, factor essencial para a transformao do fibrinognio em fibrina, a qual forma o cogulo sanguneo.
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