Processo de fermentao por cultura submersa.

Em 1930, esse processo foi descrito usando Aspergillus niger japonicus (provavelmente A. japonicus Saito), borbulhando brandamente uma corrente de ar em um meio de cultura de 15 cm de profundidade, obtendo dessa forma o crescimento do miclio submerso e detectando a presena de cido ctrico no meio, mas em quantidades inferiores produo observada na fermentao de superfcie. Em 1933, foram descritos os experimentos com um meio sendo agitado; em 1938, aplicou-se tambm para a fermentao submersa a idia de deficincia de fosfato (nenhum dos dois reconheceu, no entanto, a influncia da presena de traos de ons metlicos no rendimento da fermentao). Em 1944, foi obtida uma patente para a fermentao de cultura submersa por crescimento de A. niger em um meio rico em fosfato, com posterior transferncia para outro meio sem fosfato, ou pelo mtodo de crescimento do miclio em um meio no qual inicialmente no havia sido fornecida a quantidade adequada de fosfato. Supunha-se que o crescimento do miclio poderia remover todo o fosfato do meio, deixando-o livre dessa substncia. Em 1953, descobriu-se que a adio de metanol nos meios de cultura resultava no aumento da produo de cido ctrico. Todavia, no se obteve um processo comercialmente vivel. Estudos conduzidos pelos laboratrios Miles no conseguiram demonstrar qualquer relao entre a quantidade de fosfato assimilvel no meio de cultura e o rendimento do processo. Em 1947 e 1948, pesquisas demonstraram que quando ons de mangans ou de ferro estavam presentes em concentraes suficientes, pouco ou nenhum cido ctrico era produzido no meio. Contudo, o A. niger crescia muito melhor quando esses ons eram fornecidos em quantidades menores. A remoo dos ons metlicos indesejveis do meio por troca inica foi demonstrada em 1949, e o uso do on cobre como um antagonista do ferro foi descoberto em 1957, tornando possvel o uso comercial do processo. As vantagens do processo de fermentao submersa sobre o de superfcie em termos de custos de investimento e operao induziram pesquisadores a procurar desenvolv-lo para a obteno de cido ctrico. O meio de cultura no processo de fermentao submerso esterilizado por meio rpido, ou ultra rpido, por passagem de vapor com fluxo turbulento atravs de tubos de trocadores de calor com camisas de vapor, e imediatamente resfriado at aproximadamente 30C em outro trocador de calor. O inculo habitualmente usado so esporos de uma cepa adequada de A. niger crescida em meio nutriente slido. A composio do meio de cultura (alm da fonte de carboidratos) a seguinte: a concentrao desses ons adicionados ao meio para neutralizar os ons de cobre e os ons de ferro varia de 0,1 a 50,0mg/l, dependendo da quantidade de ferro presente no meio. Caso o meio contenha uma quantidade de ferro muito baixa, deve-se suprir essa deficincia, at que se atinja uma faixa de 0,1 a 0,2mg/l. O pH deve ser ajustado antes da inoculao com on amnio para aproximadamente 4,0. Durante a fermentao, o pH muda rapidamente para a faixa de 1,5 a 2,0. Pouco cido ctrico formado

antes do pH atingir esse nvel. A aerao da cultura submersa deve ser contnua na taxa de 0,5 a 1,15 v/v de soluo por minuto e no pode ser interrompida, pois mesmo um breve lapso no suprimento de ar pode cessar o processo por vrios dias e a agitao mecnica no necessria. Agentes antiespumantes (livres de ferro, cobalto ou nquel) devem ser adicionados para evitar perdas devidas ao excesso de espuma. Os fermentadores de ao comum tm de ser adequadamente revestidos, para evitar a contaminao com ons metlicos. Podem ser usadas tambm como fontes de carboidratos, para a produo de cido ctrico, solues concentradas de xarope de cana-de-acar (com 30% a 35% de acar invertido, uma mistura de glicose e frutose, ambos os acares na mesma proporo), de glicose ou de sacarose, (tratadas com ferrocianeto para a remoo ou complexao do ferro presente no substrato). O processo de fermentao empregado descontnuo, uma vez que tcnicas de fermentao contnua no so adequadas para a produo de cido ctrico por serem muito dispendiosas e, provavelmente, economicamente inviveis. Para a separao do produto desejado, o meio filtrado dever ser submetido outra filtrao caso esteja turvo, devido presena de resduos de antiespumante, de miclio ou de oxalato. O citrato precipitado da soluo por adio de suspenso de hidrxido de clcio (que dever ter um baixo teor de magnsio para no haver formao de citrato de magnsio, que solvel em gua). Em seguida, o citrato de clcio filtrado e a massa transferida para um tanque, onde ser tratada com cido sulfrico para precipitar o sulfato de clcio. O sobrenadante contendo o cido ctrico purificado por tratamento com carvo ativado e desmineralizado por sucessivas passagens atravs de colunas com resina de troca inica; a soluo purificada ento cristalizada por evaporao, sendo os cristais removidos por centrifugao. Pode ser necessria uma recristalizao para atender os padres USP (United States Pharmacopoeia).