LA POLIFENOLOXIDASA

La Polifenoloxidasa (PPO) conocida tambin como Tirosinasa, Fenolasa, Catecol oxidasa, o-difenoloxidasa, monofenol oxidasa cresolasa 2, clasificada por la Comision de Enzimas (EC) con el numero 1.10.3.1 2., dentro de la clase de las oxidoreductasas, es una meteloenzima que acta sobre compuestos fenlicos, causando su oxidacin y polimerizacin con el consecuente desarrollo de un color caf como se demuestra en la figura 1 3, durante el procesamiento y senescencia de frutas y vegetales, lo cual produce un deterioro en las caractersticas organolpticas de los alimentos, disminuyendo su valor proteico y reduciendo la aceptabilidad del consumidor por el producto.2,4

FIGURA 1: Accin de la PPO sobre los compuestos Fenlicos.

Fuente: AL- ZUBAIDY, M.M.I. & KHALIL, R.A. (2006).

AL- ZUBAIDY, M.M.I. & KHALIL, R.A. 2006. Kinetic and prediction studies of ascorbic acid degradation in normal and concentrate local lemon juice during storage. Food Chemistry, 101: 254-259. 2 Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67. 3 Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med Res Rev. 1988 Oct-Dec; 8 (4): 525-556. 4 RAMIRZ, E.C. & WHITAKER,J.R. 2003. Polyphenol Oxidase: p. 509-523. En: J. R. Whitaker, A.G. J. Voragen & D.W.S. Wong (eds.). Handbook of Food Enzymology. Marcel Dekker Inc., New York.

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La Polifenoloxidasa est compuesta por aminocidos catalticos y aminocidos de unin, donde su principal caracterstica es su ciclo activo, donde existe presencia de atomos de cobre (metaloenzima), unidos a histidinas; alrededor de los tomos de cobre se sitan aminocidos hidrofobicos, con anillos aromticos que integran el grupo de aminocidos de unin, importantes para la unin de los sustratos al ciclo activo de la enzima para su prxima catlisis 1,3 su actividad mxima se logra pH comprendidos entre 6 y 7 a una temperatura de 30C 2,3.

FIGURA 2: HISTIDINA
Fuente: http://es.123rf.com/photo_12771524_aminoacido-esencial-laestructura-molecular-de-histidina.html

SITIO ACTIVO Los sitios activos muestran una estructura piramidal trigonal coordinadas por esferas formadas por los tres ligandos de histidina y la molcula del solvente como puente. El tomo de azufre de la cistena 92 no se liga al centro del cobre pero esta unido covalentemente al tomo de histidina 109; alrededor de ellos aminocidos hidrofobicos, unidos mediante puentes inicos, los cuales permiten la unin de los sustratos. Ver figura 2.3

Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67. 2 KLABUNDE, T., EICKEN, C., SACCHETTINI, J.C. & KREBS, B. 1998. Cristal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nature Structural Biology, 5(12): 1084-1090. 3 NEVIN-RIDLEY 2009. Enzyme Structures Database. Londres. Disponible en: http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/databases/enzymes/ (consultada en abril 11 de 2009).

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FIGURA 3: Geometra de los centros activos de la PPO.

Fuente: Klabunde et al. (1998)

MECANISMO DE REACCIN El mecanismo de reaccin de la PPO, como su clasificacin lo indica Oxidoreductasa, es una enzima que acta sobre los compuestos fenlicos y polifenolicos oxidndolos en presencia de oxigeno molecular; donde su catlisis se desarrolla en dos etapas: oxidacin de un monofenol a o-difenol y la subsiguiente oxidacin del o-difenol a o-quinona, actividad de cresolasa y catecolasa respectivamente 1,4,5. Los sustratos ms comunes para estas enzimas son compuestos insaturados como monofenoles, o-difenoles, flavonoides, taninos, dihidroxifenilalanina, acido glico, y otras hidroquinonas, acido cloragenico y tirosina. Las dos ltimas siendo de mayor importancia en alimentos; las fenolasas pueden presentar dos tipos de actividad enzimtica, fenolhidrolasas o polifenoloxidasas tambin conocidas como catecolosas, las cuales actan por medio de reaccione de adicin en las que una molcula de oxigeno es introducida a la molcula insaturada de sustrato que al polimerizarse produce compuestos pigmentados oscuros. Siguiendo un mecanismo ordenado, la enzima liga primero al oxigeno y despus al monofenol.

Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67. 2 Miller, D. D. (2002). Qumica de Alimentos Manual de Laboratorio. Departamento de Ciencia de los Alimentos. Cornell University. Ithaca, Nueva York. 3 NEVIN-RIDLEY 2009. Enzyme Structures Database. Londres. Disponible en: http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/databases/enzymes/ (consultada en abril 11 de 2009). 4 AL- ZUBAIDY, M.M.I. & KHALIL, R.A. 2006. Kinetic and prediction studies of ascorbic acid degradation innormal and concentrate local lemon juice during storage. Food Chemistry, 101: 254-259. 5 KLABUNDE, T., EICKEN, C., SACCHETTINI, J.C. & KREBS, B. 1998. Cristal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nature Structural Biology, 5(12): 1084-1090.

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Se produce un cambio de valencia de los iones de los 2 tomos de cobre que posee en su ciclo cataltico de Cu1+ a Cu2+ formndose un complejo que tiene un enlace O O bien polarizado donde se produce la hidroxilacion a o-difenilo. La oxidacin del o-difenol a o-quinona finaliza el ciclo 1,2. Figura 3.5

FIGURA 4: Mecanismo cintico propuesto para la oxidacin de odifenol (catecol [A]) y un monofenol ( fenol [B]).
Fuente: Ramrez et al. (2003)

La primera reaccin requiere de fenoles, de oxigeno y cobre mientras que la segunda no interviene la enzima y es funcin de la temperatura y el pH, donde la o-quinonas formadas interaccionan con hidroxiquinonas u otras para formar polmeros 2,3.

Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67. 2 KLABUNDE, T., EICKEN, C., SACCHETTINI, J.C. & KREBS, B. 1998. Cristal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nature Structural Biology, 5(12): 1084-1090. 3 Quinde Z, Ullrich SE, Baik BK. Genotypic variation in color and discoloration potential of barley-based food products. Cereal Chemistry. 2004; 81(6):752-758. 5 RAMIRZ, E.C. & WHITAKER,J.R. 2003. Polyphenol Oxidase: p. 509-523. En: J. R. Whitaker, A.G. J. Voragen & D.W.S. Wong (eds.). Handbook of Food Enzymology. Marcel Dekker Inc., New York.

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FIGURA 5: Reaccin generalizada de la PPO en plantas.

Fuente: Gacche et al. (2003).

EXTRACCIN DE LA PPO Se puede observar diversas metodologas para la extraccin y purificacin de PPO de frutas y vegetales. En el proceso de extraccin se indican metodologas con variaciones importantes en el pH, la concentracin y la composicin del buffer de extraccin, y en los procesos de precipitacin proteica emplendose principalmente sulfato de amonio , y en algunas ocasiones acetona 1,6. Los mtodos convencionales para la purificacin de esta enzima emplean separaciones cromatografas usando dietilaminoetil (DEAE) y celulosa o sefarosa, fenil u octil sefarosa, sephadex G25 - G100 ,como matrices. Sin embargo, son costosos y esto dificulta su escalado, por eso uno de los mtodos ms empleados es el Sistema Bifsicos Acuosos como mtodo de extraccin y purificacin de enzimas como la Polifenoloxidasa 1,2. SISTEMAS BIFASICOS ACUOSOS (SEBAS) Los sistemas bifsicos acuosos o SEBAS, es una tcnica empleada tanto para extraer enzimas, de una matriz vegetal o animal o como mtodo de purificacin parcial. Un sistema bifsicos acuoso se forma cuando un polmero como el polietilenglicol (PEG) se mezcla con otro como el dextran, o sales en concentraciones particulares. Por lo tanto, el coeficiente de particin de la protena en un SEBAS depende no solo de sus propiedades de superficie tales como la carga o la hidrofobicidad sino tambin de las propiedades fisicoqumicas de las dos fases formadas, las cuales pueden ser manipuladas ajustando factores como el peso molecular del polmero y las concentraciones de las sales a utilizar, fuerza inica o pH, como se aprecia en la figura 5 7.
1

Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67. 2 Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med Res Rev. 1988 Oct-Dec; 8 (4): 525-556.

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FIGURA 6: Proceso de extraccin y purificacin de la PPO utilizando el SEBAS

Fuente: Sojo et al.(1998)

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CONCLUSIN

La Polifenoloxidasa es una metaloenzima perteneciente a la familia de las oxidoreductasas, y por lo tanto es una de las causantes del pardeamiento de los alimentos mediante reacciones de oxidacin, para lo cual su inhibicin se puede realizar mediante elevaciones de temperatura, ya que la PPO solo es estable en temperaturas entre 30-45 C, mayor a 55 ya la PPO se inactiva; tambin con variaciones del pH ya que esta enzima tiene como pH mximo un valor de 6; y con ello, poder prolongar la vida del alimento y conservar sus caractersticas organolpticas del alimento, como son color aroma y sabor.

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REFERENCIA DE DATOS

AL- ZUBAIDY, M.M.I. & KHALIL, R.A. 2006. Kinetic and prediction studies of ascorbic acid degradation in normal and concentrate local lemon juice during storage. Food Chemistry, 101: 254-259. Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67. KLABUNDE, T., EICKEN, C., SACCHETTINI, J.C. & KREBS, B. 1998. Cristal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nature Structural Biology, 5(12): 1084-1090. Miller, D. D. (2002). Qumica de Alimentos Manual de Laboratorio. o Departamento de Ciencia de los Alimentos. Cornell University. Ithaca, Nueva York. Nelson D, Cox M. Lehninger: Principles of Biochemistry. Worth Publishers, New York. 2000. NEVIN-RIDLEY 2009. Enzyme Structures Database. Londres. Disponible en: http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/databases/enzymes/ (consultada en abril 11 de 2009). Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med Res Rev. 1988 Oct-Dec; 8 (4): 525-556. Quinde Z, Ullrich SE, Baik BK. Genotypic variation in color and discoloration potential of barley-based food products. Cereal Chemistry. 2004; 81(6):752758. RAMIRZ, E.C. & WHITAKER,J.R. 2003. Polyphenol Oxidase: p. 509-523. En: J. R. Whitaker, A.G. J. Voragen & D.W.S. Wong (eds.). Handbook of Food Enzymology. Marcel Dekker Inc., New York. SOJO, M. M., NUNEZ-DELICADO, E., GARCIA-CARMONA, F. & ANCHEZFERRER, A. 1998. Partial purification of a polyphenol oxidase using Triton X114 and PEG 8000 for removal of polyphenols. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46: 4924-4930.

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ANEXOS

ANEXO N 1

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 ANEXO N2

TIROSINASA
Introduccin
El pardeamiento enzimtico es una reaccin de oxidacin en la que interviene como substrato el oxgeno molecular, catalizada por un tipo de enzimas que se puede encontrar en prcticamente todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre. En el hombre es la responsable de la formacin de pigmentos del pelo y de la piel. En los cefalpodos produce el pigmento de la tinta, y en los artrpodos participa en el endurecimiento de las cutculas del caparazn, al formar quinonas que reaccionan con las protenas, insolubilizndolas. En los vegetales no se conoce con precisin cul es su papel fisiolgico. El enzima responsable del pardeamiento enzimtico recibe el nombre de Polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este ltimo caso especialmente cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato. Tambin se ha utilizado el trmino cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. Se descubri primero en los championes, en los que el efecto de pardeamiento tras un dao mecnico, como el corte, es muy evidente.

Championes cortados, mantenidos a temperatura ambiente y fotografiada a distintos tiempos.

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En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimtico puede ser un problema muy serio en frutas, championes, patatas y otros vegetales, y tambin en algunos crustceos, e incluso en la industria del vino, al producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, o incluso los hacen inaceptables para el consumidor. Estas prdidas son muy importantes en el caso de las frutas tropicales y de los camarones, productos trascendentales para la economa de muchos pases poco desarrollados. A pesar del nombre genrico de pardeamiento (browning en ingls), los colores formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo del alimento y de las condiciones del proceso. En algn caso, como en las pasas, otras frutas secas, la sidra, el t o el cacao, el pardeamiento enzimtico contribuye al desarrollo de los colores caractersticos de estos productos, aunque como se ha indicado, en otros muchos constituye un problema grave. Adems de la alteracin del color, los productos formados pueden reaccionar con las protenas, insolubilizndolas. Por otra parte, puede producirse tambin una prdida nutricional, ya que aunque la Polifenoloxidasa no oxida directamente al cido ascrbico, esta vitamina puede destruirse al reaccionar con intermedios de la reaccin.

Estructura de las polifenoloxidasas

La Polifenoloxidasa, EC 1.14.18.1 tiene dos actividades enzimticas, una hidroxilando monofenoles (cresolasa) y otra oxidando difenoles a quinonas (catecolasa). Dependiendo de la fuente, la actividad cresolasa es mayor o menor, incluso inexistente en algunos casos. En cambio, todas las enzimas tienen actividad catecolasa. La caracterstica estructural ms importante de estas enzimas es la presencia en su centro activo de dos tomos de cobre, unidos cada uno de ellos a tres histidinas, que se han conservado a lo largo de la evolucin en todas las enzimas de este tipo, desde las bacterias al hombre. En su entorno se sitan una serie de aminocidos hidrofbicos, con anillos aromticos, que tambin son importantes en su actividad, para la unin de los sustratos. Estructura de la difenoloxidasa de la batata

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ANEXO N 3
ESTRES POR FRIO Y ACTIVIDAD DE LA POLIFENOLOXIDASA EN MANGO (Mangifera indica cv. MANILA).
Vela Gutirrez Gilber, Len G. Dinora M. , Garca Galindo Hugo S.1 y De la Cruz Medina Javier . Unidad de Investigacin y Desarrollo en Alimentos (ITV). Fax 01(29) 341478 y 69 Ext. 201. Email: gvelag@mailbanamex.com
Palabras claves: Polifenoloxidasa, dao por fro, pardeamiento. Introduccin: El almacenamiento a bajas temperaturas de ciertos frutos ha probado ser muy efectivo para disminuir los procesos de maduracin. Uno de los inconvenientes del almacenamiento refrigerado es el dao por fro (DF) que causa la liberacin de metabolitos comoaminoacidos,azcares,minerales, terpinoles y compuestos fenlicos del interior de las clulas, as como la degradacin de la estructura celular. Se ha encontrado que el obscurecimiento interno que puede ser causado por el rompimiento de la membrana permite a las enzimas y sustratos mezclarse dentro de la clula (Brown, 1986). Los disturbios provocados por el DF traen como consecuencia una reduccin en la calidad general y la inaceptabilidad del producto en el mercado. Uno de los sntomas ms importantes es el pardeamiento enzimtico debido a la actividad de la Polifenoloxidasa (PPO). Compuestos terpinlicos y otros voltiles presentes en la savia y cscara de mango al entrar en contacto con la enzima producen compuestos de Melanoidinas. Tomando en cuenta lo anterior se propuso como objetivo del presente trabajo determinar los cambios en la actividad de la Polifenoloxidasa que ocurren durante la maduracin del mango (Mangifera indica cv Manila) y su estrs por refrigeracin. Metodologa: Se utilizaron mangos de la variedad Manila en estado preclimatrico, los cualesfueronlavados,desinfectados, seleccionados y clasificados para su nalisis. Se almacenaron tres lotes de mangos a 6, 12 y un testigo a 25C, durante 30, 28 y 14 das respectivamente. Con humedad relativa (HR) del 805%. Se evalu propiedades fisicoqumicas (pH, % de ac. ctrico, % de slidos solubles, prdida de peso, firmeza del tejido y pardeamiento) de cada lote a cada 4 das; al mismo tiempo, se retiraron 6 mangos de los lotes refrigerados y fueron llevados a maduracin para su anlisis posterior. Se determin la actividad de la PPO del extracto obtenido tanto de la cscara como de la pulpa de mango. El extracto previamente centrifugado a 15000 rpm durante 15 minutos, a 4C, se hizo reaccionar con 4metilcatecol (sustrato) durante 10 minutos, inhibiendo la reaccin inmediatamente con una solucin de cido tricloroactico (TCA) al 10%. Se determin el cambio en densidad ptica por espectrofotometra a 400 nm. Se cuantific protena por el mtodo de Bradford para cada extracto analizado. Resultados y discusin: Los parmetros fisicoqumicos como pH, Brix, % de slidos solubles, % de cido ctrico y firmeza mostraron mayor incremento en el testigo, siendo de menor proporcin para 12C y 6C. Por el contrario, la prdida de peso fu menor en los mangos almacenados a temperaturas de refrigeracin que en el testigo. La actividad de la PPO que se present en el mesocarpio fu mnima y se consider como nula para las tres temperaturas. La actividad de la PPO en la cscara de los mangos refrigerados fu mayor y se observ una diferencia significativa respecto al testigo. Se observ un incremento en la actividad de la PPO en la cscara de los mangos almacenados a 6 C al da 16, siendo similar este comportamiento a la temperatura de 12C y en el mis mo da, pero con una actividad menor. Despus de 16 das de almacenamiento los mangos fueron llevados a maduracin (25C) dnde se observ una disminucin de la actividad de la enzima, resultados smilares fueron reportados por Sanchez de Medina et al., 1987. Conclusiones: La actividad enzimtica de la PPO fu significativamente menor en los mangos almacenados a 25C (testigo). La mayor actividad enzimtica se present en a 6C donde el DF es ms svero; a 12C la actividad es menor dnde se observo un menor DF.

Bibliografa: Brown, B.I.(1986). Temperature management and chilling injury of tropical and subtropical fruit. Acta Hort 175: 339-342. Sanchez de Medina L. et al., (1987). Changes in polyfenoloxidasa, peroxidasa, catalasa and acid phosphatasa activities for cherimoya fruit (Annona cherimolia) during ripening in controlled temperature and relative humiduty. Revista-de-Agroqumica-y-Tecnologade Alimentos; 26(4): 529-538.

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