CAPITULO 1

INTRODUCCION 1.1 Generalidades. El cultivo de clulas con el objeto de obtener productos tiles es una actividad que ha realizado el hombre prcticamente durante toda su historia. El conocimiento cientfico ha permitido ampliar esos beneficios a la humanidad dando lugar a la biotecnologa. Hoy la biotecnologa puede ser definida como la integracin de las ciencias naturales y la ingeniera con el fin de lograr el uso de clulas, organismos, partes de ellos mismos y anlogos moleculares para la obtencin de productos y servicios. Las operaciones que comprenden los procesos biotecnolgicos a escala comercial se han dividido tradicionalmente en operaciones previas (procesos upstream) y operaciones posteriores o bioseparaciones (procesos downstream). Los procesos de bioseparacin involucran la recuperacin y purificacin de productos provenientes del biorreactor y comprenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo para la obtencin del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas. La dificultad para recuperar y purificar un producto biotecnolgico depende, en gran medida, tanto de la naturaleza del mismo como del grado de pureza deseado; de cualquier forma, se requiere de varias etapas de procesamiento. Estas etapas de procesamiento, debido a la fragilidad de los productos y a que normalmente stos se encuentran en soluciones acuosas diluidas, estn constituidas por procesos y operaciones de separacin no convencionales de la ingeniera qumica que pueden representar ms del 60% de los costos fijos. En general, la estrategia para la obtencin del producto contempla cuatro pasos, a saber: 1) separacin de productos insolubles, 2) aislamiento, 3) purificacin o eliminacin de contaminantes qumicos y 4) acabado o preparacin final del producto (Belter y col., 1988). Una operacin, comprendida en el proceso de bioseparacin, ampliamente utilizada para el aislamiento de productos biolgicos es la adsorcin en resinas sintticas (Tejeda y col., 1995). En el mercado pueden encontrarse una gran variedad de resinas sintticas entre las
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que destacan las resinas derivadas del estireno-divinilbenceno que son utilizadas para aislar una gran cantidad de sustancias. El cido giberlico (GA3) es una hormona vegetal de gran importancia en la agricultura ya que proporciona una gran variedad de beneficios como la elongacin de tallos y el aumento en el tamao de algunos frutos. En la actualidad, el GA3 es producido mediante fermentacin microbiana y con el objeto de recuperarlo del medio acuoso, donde es inestable, se han utilizado resinas sintticas de adsorcin en lecho fijo para su aislamiento y posterior purificacin. 1.2 Planteamiento del problema. Una vez terminado el proceso de fermentacin, la etapa siguiente es la extraccin y purificacin del GA3; por ello se hace necesario plantear un esquema para la recuperacin de este cido no slo para su aplicacin en plantas sino para estudios posteriores del mismo proceso de recuperacin. La recuperacin (aislamiento) de GA3 de caldos de cultivo se realiza mediante un proceso de adsorcin en columna. Sin embargo, poco se conoce del proceso de adsorcin como son las curvas de rompimiento o las isotermas de adsorcin. Tampoco se dispone de un modelo que permita predecir el comportamiento dinmico del proceso de adsorcin de GA3 en columna. 1.3 Justificacin. La importancia del estudio de las giberelinas se basa en las diferentes investigaciones que demuestran la accin que estas hormonas ejercen en todas las fases de desarrollo y crecimiento de las plantas, desde la germinacin de la semilla hasta la senescencia. El GA3 es importado a nuestro pas, desde China principalmente, y por esto es relativamente costoso lo que limita la disponibilidad y uso de esta sustancia.

1.4 Hiptesis de investigacin. La adsorcin en lecho fijo utilizando resinas sintticas derivadas del estireno-divilbenceno permitir extraer selectivamente el cido giberlico proveniente de caldos de medios de cultivo para su posterior purificacin. 1.5 Objetivo general. Mediante la experimentacin, extraer y purificar el cido giberlico a partir de caldos de cultivo por medio de un proceso de bioseparacin basado en el uso de resinas sintticas; adems de modelar el proceso de adsorcin de cido giberlico en estas resinas. 1.6 Objetivos particulares. Determinar isotermas de adsorcin de las resinas seleccionadas para este trabajo. Determinar el mejor eluente para cada resina. Seleccionar dos resinas para su posterior utilizacin en el proceso de adsorcin en columna con base en su capacidad de aislamiento de GA3. Modelamiento matemtico aproximado del proceso de adsorcin en columna. Plantear esquema de recuperacin y purificacin de GA3.

CAPITULO 2
ANTECEDENTES 2.1 cido giberlico. El cido giberlico (GA3) es una giberelina. Las giberelinas son un grupo importante de hormonas que se encuentran en plantas superiores y que regulan diferentes procesos de crecimiento. Las giberelinas estn presentes en pequeas cantidades en las plantas (0.001 a 1.0 mg de GA3 por kilogramo de peso fresco) y, qumicamente, son un grupo de diterpenoides que presentan un sistema de anillos tetracclicos (Figura 2.1) y pueden clasificarse en dos grupos: Giberelinas C20 Giberelinas C19

Debido a sus diferencias estructurales, las giberelinas cubren un rango amplio de polaridad y difieren tambin en sus solubilidades y coeficientes de particin.

Figura 2.1 Esqueleto estructural de las giberelinas. Las giberelinas C19 se caracterizan por tener una alta actividad biolgica. Dentro de este grupo se encuentra el GA3. El GA3 es un slido cristalino blanco, soluble en agua hasta 5 g/l y soluble en solventes orgnicos como el metanol y el acetato de etilo. Es estable estando seco e inestable en soluciones acuosas. El GA3 contiene un anillo de lactona que es
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lo que lo hace inestable, al abrirse este anillo se forma el cido giberelnico que no cuenta con actividad biolgica. La vida media del GA3 en soluciones acuosas es de 14 das a 20 C y presenta un pH entre 3 y 4 (Brkner y Blechschmidt, 1991). El GA3 es un cido monobsico y se reportan valores de pK en agua de 4.0 (Cross y col., 1961) y de 4.1 en solucin acuosa amortiguada (Durley y Pharis, 1972). La Figura 2.2 muestra la estructura del GA3.

Figura 2.2. Estructura del cido giberlico. Uno de los principales campos de aplicacin del GA3 es el malteado de la cebada en la produccin de cerveza. El tratamiento con GA3 reduce el tiempo de germinacin de la cebada de 10 a 3 das. El GA3 se utiliza tambin en las industrias del vino y de los ctricos. En estas industrias el GA3 aumenta tanto el tamao del fruto como el nmero de frutos sin semillas. 2.2 Produccin de cido giberlico. El GA3 se produce en la actualidad mediante fermentacin microbiana en cultivo sumergido. Se utilizan una gran variedad de fuentes de carbono y de nitrgeno para efectuar la fermentacin. Las fuentes de carbono que ms se utilizan son carbohidratos simples y aceites vegetales. Las fuentes de nitrgeno pueden ser de origen inorgnico, como el NH4Cl, o de origen orgnico, como el licor de maz.

2.3 Estado del arte de la extraccin y purificacin de giberelinas. Una vez que finaliza el proceso de produccin de GA3 es necesario remover el mismo del medio acuoso de cultivo que contiene biomasa, nutrientes no consumidos y otros metabolitos producidos por el hongo (e.g. giberelinas GA4 y GA7). El proceso de recuperacin del medio acuoso debe realizarse lo ms rpido posible ya que el GA3 es inestable en soluciones acuosas donde su vida media es de 14 das a 20 C, como se mencion anteriormente. El primer paso en la recuperacin del GA3 es la remocin del micelio del medio de cultivo mediante centrifugacin y filtracin. Una vez que se elimina el micelio se hace necesario aislar el GA3 del medio de cultivo para su posterior purificacin. Los mtodos hasta ahora utilizados para el aislamiento del GA3 son: 1. Adsorcin en carbn activado. 2. Extraccin lquido-lquido con solventes orgnicos. 3. Intercambio inico mediante resinas sintticas. 4. Adsorcin en resinas no inicas sintticas. El primer mtodo consiste en adsorber el GA3 en carbn activado (20-30% de humedad) para la posterior desorcin del GA3 (y dems sustancias adsorbidas) con acetona (Brian y col., 1957). Una vez que termina la desorcin se evapora el solvente bajo presin reducida hasta obtener un residuo acuoso. Se propone realizar la desorcin con metanol puro o amoniacal (Jefferys, 1970). Es obvio que este procedimiento es bastante sencillo; sin embargo, cuenta con las siguientes desventajas (Brkner y Blechschmidt, 1991): La desorcin requiere de una gran cantidad de solvente. No es posible la recuperacin total del material adsorbido. El carbn activado solo se puede utilizar una vez.

El segundo mtodo involucra la extraccin directa del medio de cultivo filtrado con solventes orgnicos como acetato de etilo, metil etil cetona y metil isobutil cetona (Chas.
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Pfizer & Co. Inc., 1959). Para realizar la extraccin el pH del medio de cultivo debe estar en el intervalo de 2 a 3.5. La temperatura para realizar la extraccin puede encontrarse entre 15 y 75 C. Una vez que se realiza la extraccin se evapora el solvente a presin reducida hasta que comienza la cristalizacin de las giberelinas presentes. Se utilizan otros solventes orgnicos como acetato de isoamilo y metil n-propil cetona (ICI, 1959). Las eficiencias de extraccin de GA3 para diversos solventes orgnicos van desde 19 hasta 98%. A pesar de tener eficiencias aceptables el problema surge en la gran cantidad de solvente a utilizar, ya que en algunos casos se requiere de hasta el triple del volumen del medio de cultivo para realizar la extraccin. El tercer mtodo involucra el uso de resinas de intercambio inico en donde se busca intercambiar el GA3 con los grupos funcionales de la resina. Para lograr este intercambio se propone la operacin en columna o en lote utilizando resinas fuertes o dbilmente bsicas. La elucin se realiza con metanol acidificado con HCl o H2SO4 (Merck & Co. Inc., 1960a). Los rendimientos son superiores al 90%. Se utilizan otros eluentes como metanol acuoso con NH4Cl obtenindose rendimientos superiores al 75% (Merck & Co. Inc., 1961), soluciones acuosas de cido frmico con rendimientos del 100% (Podojl y col., 1961) y soluciones de amoniaco acuoso obtenindose purezas de entre el 70 y el 85% (Societe dEtudes et dApplications Biochimiques, 1963). Se tiene reportado que la forma hidroxilo adsorbe mejor el GA3 que la forma cloro para el caso de resinas dbilmente bsicas (Podojl y col., 1961). Sin embargo, es importante sealar dos aspectos de este ltimo mtodo de aislamiento. El primer aspecto es que no solo el GA3 presente en el medio de cultivo es adsorbido en las resinas, tambin lo hacen las impurezas lo que provoca una disminucin en la capacidad de adsorcin de la resina adems de que estas impurezas, en el mejor de los casos, son desorbidas junto con el GA3. Esto termina con el aislamiento cuantitativo que se busca con las resinas de intercambio inico. El segundo aspecto, todava ms importante, es que el anillo de lactona presente en la estructura del GA3 es muy inestable tanto en medio cido como en medio alcalino. Estas condiciones se tienen con todos los eluentes mencionados. Adems durante el intercambio del grupo funcional de la resina por el GA3 el anillo de lactona puede destruirse.

El cuarto mtodo de aislamiento involucra el uso de resinas sintticas no inicas donde el anillo de lactona tiene poca probabilidad de ser destruido. Como eluentes se utilizan soluciones acuosas de metanol, etanol o acetona (Heropolitanski, 1979). Utilizando estas resinas se pueden desorber las giberelinas y las impurezas con el mismo solvente pero de diferente concentracin. Por ejemplo, las giberelinas se eluyen con soluciones acuosas de metanol del 35 al 80% y las impurezas se desorben con una solucin del 80 al 95%. Sin embargo, si se utiliza una solucin acuosa al 35% de metanol solo se puede recuperar el 55% del GA3, pero tambin con este mismo solvente se desorben el 25% de las impurezas. Con los cuatro mtodos anteriores en realidad lo que se logra es aislar una mezcla de giberelinas del medio de cultivo y en el mejor de los casos una concentracin de las mismas. Esta mezcla est compuesta principalmente por las giberelinas GA3, GA4 y GA7, siendo la giberelina GA3 la que se encuentra en mayor proporcin. En la purificacin se hace necesario separar el GA3 de las giberelinas GA4 y GA7. Lo anterior debido a que los efectos regulatorios en las plantas del GA3 y de la mezcla de giberelinas GA4 y GA7 difieren en algunos aspectos importantes y los compuestos tienen diferentes aplicaciones. Esta separacin se basa en los coeficientes de particin del GA3 y las otras giberelinas entre ciertos solventes orgnicos y el agua a cierto pH (Elson y Peterson, 1970; Durley y Pharis, 1972). El procedimiento es el siguiente, una vez que el medio de cultivo se trata con alguno de los mtodos anteriores (a excepcin del segundo mtodo) los residuos acuosos que se obtienen despus del aislamiento se acidifican a pH entre 2 y 3.5 y se extraen con acetato de etilo. El extracto orgnico se extrae con una solucin amortiguadora de pH entre 6 y 8. Esto dar un extracto orgnico rico en giberelinas GA4 y GA7 y el GA3 permanecer en la solucin amortiguadora. El pH de la solucin amortiguadora se disminuye a un valor entre 2 y 3.5 y se vuelve a extraer con acetato de etilo dando como resultado un extracto orgnico rico en GA3 (Merck & Co. Inc., 1960a; Elson y Peterson., 1970; Hitzman y Mills, 1963). Se adiciona al extracto orgnico sulfato de sodio anhidro, se filtra y se evapora a presin reducida para lograr la precipitacin del GA3. El problema que se vuelve a generar es que se requiere de una gran cantidad de solventes para lograr la purificacin deseada adems de que las giberelinas seguirn apareciendo, para soluciones concentradas, tanto en los extractos orgnicos como en los acuosos.

Tambin es posible separar el GA3 de las giberelinas GA4 y GA7 mediante la adicin al extracto orgnico de N-bencil-N-metilamina resultando la formacin de una sal de amina de giberelinas GA4 y GA7. Esta sal precipita dejando en solucin al GA3 (Mabelis, 1986). Otra forma de lograr esta separacin se basa en ajustar el pH de la solucin de manera que precipiten por separado las giberelinas GA4 y GA7 dejando en solucin al GA3 que se recupera mediante extraccin con acetato de etilo (Yan, 1995). Tambin es posible separar la giberelina GA4 de la giberelina GA7 (Crutcher, 1979; Ku y Sawick., 1996). Para la etapa de purificacin es posible utilizar cromatografa por elucin utilizando silica gel como fase estacionaria. Como fase mvil se utilizan un gran nmero de eluentes para lograr la purificacin (Pharis y Reid, 1985).

CAPITULO 3
MARCO TEORICO 3.1 Operaciones del proceso biotecnolgico. Los procesos biotecnolgicos comprenden una serie de operaciones divididas en dos grupos: operaciones previas (upstream) y operaciones posteriores (downstream). Dentro de las primeras se considera la preparacin del medio, la esterilizacin y el funcionamiento del biorreactor. Las operaciones posteriores, tambin llamadas bioseparaciones, involucran la recuperacin y purificacin de los productos provenientes del biorreactor, como se muestra en la Figura 3.1. Las operaciones posteriores comprenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo para la obtencin del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas.

Figura 3.1. Operaciones de un proceso biotecnolgico.

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3.2 Proceso idealizado de bioseparacin. La mayora de las bioseparaciones presentan cuatro pasos similares que ocurren secuencialmente: 1. Remocin de insolubles. Las operaciones unitarias generalmente se utilizan son la centrifugacin y la filtracin y su objetivo es remover clulas enteras, restos celulares y cuerpos de inclusin. En este punto no se presenta un mejoramiento de la calidad del producto ni una concentracin del mismo. 2. Aislamiento de productos. Estos pasos, que generalmente no son especficos, remueven materiales cuyas propiedades difieren enormemente de las propiedades del producto deseado. En este punto se presenta tanto una concentracin del producto como un mejoramiento de la calidad del mismo. La adsorcin y la extraccin son procesos tpicos de este punto. 3. Purificacin. Las tcnicas que aqu se aplican son altamente selectivas para el producto y permiten remover impurezas cuyas propiedades fsicas y funcionalidad qumica son muy similares a las del producto. La cromatografa, la electroforesis y la precipitacin son ejemplos de estas tcnicas. 4. Acabado. El uso final del producto dictamina la secuencia final a utilizar. La cristalizacin es a menudo la operacin ms utilizada. Una forma de poder apreciar estos pasos es tomando en cuenta como estn involucradas la concentracin y pureza del producto. En la Tabla 3.1 puede verse un perfil tpico del procesamiento de un producto (Belter y col., 1988). Note que el mayor incremento de la concentracin se da en el paso de aislamiento mientras que la calidad aumenta dramticamente durante la purificacin. En un proceso dado, la parte correspondiente a las bioseparaciones puede representar hasta un 60% del costo total de produccin sin considerar las materias primas (Tejeda y col., 1995). Debido a lo anterior, existe una relacin inversa entre el precio de venta de un producto biotecnolgico y la concentracin de ste en el caldo del biorreactor (Lightfoot,

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1999). Puede decirse entonces que el xito comercial de un proceso biotecnolgico depende en gran medida de la adecuada seleccin del proceso de bioseparacin. Tabla 3.1. Perfil tpico de proceso biotecnolgico. Producto Paso Caldo de cultivo Remocin de insolubles Aislamiento Purificacin Acabado 3.3 Adsorcin. La adsorcin es una de las operaciones que ms se utilizan en la etapa de concentracin de caldos acuosos diluidos. Mediante la adsorcin las molculas de un soluto se concentran en una superficie slida por la accin de fuerzas intermoleculares entre el soluto y el slido. Debido a la naturaleza de estas fuerzas el fenmeno es fcilmente reversible. La adsorcin es esencialmente un fenmeno de superficie y debe distinguirse de la absorcin la cual implica la penetracin de una sustancia en el seno de la otra. La concentracin de uno o varios solutos de un caldo por medio de la operacin de adsorcin requiere cuatro pasos esquematizados en la Figura 3.2. Primero el adsorbente y la solucin se ponen en contacto. Al efectuarse la adsorcin, el soluto se une preferentemente a la superficie del adsorbente respecto a otros solutos. Una vez concluida la adsorcin, es necesario lavar la columna con una solucin que no provoque la desorcin del soluto de inters. Finalmente se efecta la recuperacin del soluto utilizando un fluido que favorezca la desorcin, operacin conocida como elucin. Proceso tpico Fermentacin Filtracin Extraccin Cromatografa Cristalizacin Concentracin (g/l) 0.1-5 1.0-5 5-50 50-200 50-200 Calidad (%) 0.1-1.0 0.2-2.0 1-10 50-80 90-100

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Figura 3.2. Etapas del proceso de adsorcin. En el anlisis de la operacin de adsorcin, al igual que en otras operaciones de transferencia de masa, se utilizan modelos para el diseo, anlisis de alternativas (columnas en serie contra columnas en paralelo), optimizacin o simplemente para la obtencin de datos experimentales. La formulacin de algunos de estos modelos requiere: El establecimiento de las relaciones de equilibrio y de la capacidad de adsorcin de los sistemas. El establecimiento de la rapidez de la adsorcin con respecto a los fenmenos difusivos y cinticos de superficie.

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Los balances de masa y energa del sistema de adsorcin especfico (intermitente, continuo, serie, paralelo, etc.). Las condiciones iniciales y de frontera del sistema.

3.3.1 Fundamentos del proceso de adsorcin. Las operaciones de adsorcin se utilizan en la obtencin de varios tipos de productos biotecnolgicos como aminocidos, antibiticos, vitaminas y protenas. Debido a lo anterior, cada vez existe una mayor necesidad de profundizar en los aspectos fundamentales de la operacin (principalmente en el contexto del procesamiento de caldos biolgicos), de los cuales se pueden destacar cuatro: Los tipos de adsorcin segn el tipo de interaccin soluto-adsorbente. Los tipos de adsorbentes. Las relaciones de equilibrio. La cintica de adsorcin.

3.3.2 Tipos de adsorcin segn el tipo de interaccin soluto-adsorbente. De acuerdo al tipo de interaccin del soluto con el adsorbente, se pueden distinguir cuatro tipos bsicos de adsorcin: Fsica Inica Hidrofbica Por afinidad

En la adsorcin fsica las fuerzas de atraccin entre el soluto y el adsorbente son de tipo London-van Der Waals. En la adsorcin inica la diferencia de cargas entre el adsorbente y el soluto genera atracciones electrostticas ms fuertes y selectivas. La adsorcin hidrofbica se produce por interacciones entre regiones hidrofbicas del soluto y el
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adsorbente. La adsorcin por afinidad se basa en interacciones altamente especficas entre el adsorbente y el soluto, lo que caracteriza a este tipo de adsorcin como altamente selectiva. 3.3.3 Tipos de adsorbentes. En el establecimiento de un sistema de adsorcin es necesario seleccionar cuidadosamente el tipo de adsorbente que se va a utilizar. En este proceso de seleccin los principales parmetros a considerar son las propiedades fsicas del adsorbente, tales como: resistencia mecnica, rea por unidad de volumen, porosidad interna y del lecho, forma de la partcula y tamao. Asimismo, es de fundamental importancia la capacidad de adsorcin del slido, la cual est fuertemente influida por su carga y su relativa hidrofobicidad. Actualmente se utilizan diferentes tipos de adsorbentes en la operacin de adsorcin. En el caso de la adsorcin fsica, el adsorbente ms utilizado en bioseparaciones es el carbn activado (vegetal) y en menor grado la silica gel. Tambin se utilizan como adsorbentes resinas sintticas. Las resinas no polares derivadas del estireno-divinilbenceno se utilizan para la adsorcin de solutos no polares a partir de solventes polares. Las resinas basadas en steres acrlicos tienden a ser ms efectivas para remover solutos polares de solventes no polares. Los adsorbentes que se utilizan en intercambio inico pueden ser orgnicos o sintticos. Los inorgnicos como las zeolitas son poco utilizados. Los adsorbentes inicos sintticos estn formados por matrices de polmeros unidos lateralmente. A la matriz se le unen grupos funcionales que le dan la capacidad de intercambio inico. Las resinas de estirenodivinilbenceno catinicas se producen en un paso por accin de un cido sobre el grupo benceno. Las aninicas se producen en dos pasos: primeramente, se produce una clorometilacin del benceno. En el segundo paso, se efecta una aminacin. Las matrices de celulosa activada tambin son utilizadas para adsorcin por intercambio inico. En la adsorcin por afinidad el adsorbente consta de dos partes, el soporte o matriz y el ligando. El ligando se une a la matriz por medio de un brazo que evita impedimentos estricos en un determinado arreglo.

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Las matrices que se utilizan en la adsorcin por afinidad son fabricadas de celulosa, celulosa modificada, poliacrilamida (o derivados), dextrano y agarosa. 3.3.4 Relaciones de equilibrio. El anlisis de los procesos de adsorcin requiere de datos de equilibrio que se expresan normalmente como isotermas de adsorcin. Las isotermas son parte esencial para modelar la adsorcin y por lo tanto para el diseo, clculo de eficiencias y costos de la adsorcin. Las isotermas permiten estimar el grado de purificacin que puede alcanzarse, la cantidad de adsorbente requerido y la sensibilidad del proceso respecto a la concentracin del producto. En los procesos de adsorcin que se presentan en las bioseparaciones existen cuatro tipos bsicos de isotermas: la isoterma de Freundlich, la lineal, la de Langmuir y la irreversible (Figura 3.3). Las isotermas tipo Freundlich normalmente se presentan en sistemas de adsorcin por intercambio inico mientras que la adsorcin por afinidad generalmente presenta isotermas tipo Langmuir. La isoterma lineal es menos comn, pero puede utilizarse para aproximar las otras isotermas en la regin de baja concentracin de soluto. Las isotermas irreversibles son caractersticas de sistemas altamente especficos. La isoterma de Freundlich se describe por medio de una ecuacin exponencial emprica de la siguiente forma: q = K f y en (1)

Donde q es la cantidad de soluto adsorbida por cantidad de adsorbente, ye es la concentracin de equilibrio en la solucin, n es una constante adimensional y Kf es una constante cuyas unidades dependen de n. Cuando las isotermas de adsorcin son cncavas hacia el eje de las abscisas es decir cuando n < 1, la isoterma se llama favorable ya que se puede obtener una buena adsorcin an a concentraciones bajas de soluto. Las isotermas cncavas hacia el eje de las ordenadas o sea para n > 1, se llaman desfavorables. Las isotermas lineales se pueden describir por la ecuacin de una recta que pasa por el origen de la forma:
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q = K l ye Las isotermas tipo Langmuir estn dadas por expresiones de la siguiente forma: qo ye K d + ye

(2)

q=

(3)

Donde qo es la capacidad mxima del adsorbente y Kd es la constante de equilibrio de desorcin. Un caso particular de la isoterma de Langmuir se presenta cuando Kd es muy pequea y la adsorcin es irreversible. En este caso q = qo para cualquier valor de ye.

Figura 3.3. Isotermas de adsorcin ms comunes. 3.4 Cintica de adsorcin. El estudio de las isotermas de adsorcin permite determinar, para un sistema soluto adsorbente dado, el grado de separacin que puede lograrse y la sensibilidad del proceso con respecto a la concentracin del soluto. Sin embargo, para el desarrollo del modelo de la adsorcin es necesario poder establecer, mediante el empleo de coeficientes de transferencia de masa, la velocidad de la adsorcin o el tiempo necesario para alcanzar una cierta separacin.

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En el caso que la adsorcin sea bastante rpida, el sistema permanecer esencialmente en equilibrio y el modelo se simplifica. En la mayora de los casos las interacciones solutoadsorbente no ocurren instantneamente. La velocidad efectiva de la adsorcin depende tanto de las condiciones de operacin (flujo, temperatura, composicin y presin), como de la configuracin del sistema (intermitente, columna, etc.) y del tamao del equipo donde se realizar la operacin. El estudio de ambos efectos se divide en dos grandes conceptos: Los mecanismos de transporte (fsicos y qumicos). Los efectos de mezclado.

3.4.1 Mecanismos de transporte. El estudio de los mecanismos de transporte consiste en establecer las expresiones de la rapidez de la adsorcin a nivel local, es decir considerando el comportamiento de una partcula de adsorbente o un elemento de volumen de un sistema. En los procesos de adsorcin se utilizan materiales porosos que ofrecen una gran rea por unidad de volumen con el propsito de recuperar la mayor cantidad de soluto posible en un volumen dado. Para que una partcula de soluto pueda adsorberse en la superficie de un poro del adsorbente, el soluto tiene que pasar del seno de la fase lquida a la superficie del adsorbente. Varias resistencias al movimiento del soluto existen en este proceso que pueden visualizarse principalmente como (Figura 3.4): Resistencia de la pelcula del lquido que rodea el adsorbente. Primero el soluto se difunde desde el seno del lquido a travs de la pelcula de lquido que rodea a la partcula adsorbente. Resistencia a la difusin en el seno del adsorbente. En algunos tipos de adsorbentes el soluto se difunde a travs del seno del adsorbente. A este fenmeno se le conoce como difusin en la fase del adsorbente. Resistencia a la difusin dentro del poro. Debido a que el rea de la superficie interior del poro es mucho mayor que la superficie exterior, generalmente la adsorcin se

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efecta principalmente dentro del poro, por lo que el soluto debe difundirse a travs del lquido al interior de los poros. Resistencia a la reaccin en la superficie. El soluto una vez que se sita en el sitio de adsorcin se une a ste por medio de una reaccin de superficie, lo cual es un proceso finito pero generalmente ms rpido que los procesos anteriores. Generalmente la resistencia de la pelcula o la del poro o una combinacin de ambas, controla la velocidad de adsorcin local.

Figura 3.4. Resistencias en el proceso de adsorcin. 3.4.2 Efectos de mezclado. La velocidad de adsorcin efectiva tambin puede disminuir por efectos de un mezclado imperfecto. Esta situacin es caracterstica de columnas largas donde se presentan irregularidades en el flujo (canalamiento) o en el mezclado (estancamiento, difusin molecular o dispersin axial). En la construccin de algunos modelos de adsorcin no se consideran los efectos de mezclado y de flujo no ideal. Sin embargo, debido a que en el proceso de escalamiento de
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columnas este efecto puede ser importante, es necesario considerar algunos aspectos fundamentales de este fenmeno. Uno de los modelos que ms se utilizan para describir la desviacin del comportamiento ideal del flujo al interior de columnas es el modelo de flujo tapn con dispersin, en donde los efectos de la dispersin axial debida a remolinos y a la difusin molecular se agrupan en el concepto de coeficiente de dispersin axial (Tejeda y col., 1995). La Figura 3.5 muestra una representacin del modelo de flujo tapn con dispersin.

Figura 3.5. Modelo de flujo tapn con dispersin. 3.5 Adsorcin en lecho fijo. La adsorcin en lecho fijo es la operacin que ms se emplea a escala industrial para la concentracin de caldos. Este tipo de operacin se efecta en columnas empacadas con adsorbente. Por la parte superior de la columna se alimenta la solucin que contiene el soluto de inters. Durante su paso por la columna el soluto se adsorbe en el lecho y la solucin agotada se obtiene en el fondo de la columna. Una vez que la concentracin de soluto a la salida alcanza una cierta concentracin, se interrumpe la operacin y se recupera el soluto concentrado. A esta tcnica tambin se le conoce como cromatografa frontal. 3.5.1 Curva de rompimiento. En la descripcin de la adsorcin en columna se utilizan grficas de la variacin de la concentracin de soluto a la salida de la columna con el tiempo. Estas grficas se llaman curvas de rompimiento. La Figura 3.6 muestra una curva de rompimiento tpica en donde se pueden distinguir tres eventos importantes.

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Para tiempos menores al tiempo de rompimiento, tR, cuando la zona de transferencia de masa an no llega a la salida de la columna, la concentracin de soluto en la solucin de salida de la columna es muy baja e igual a la mnima detectada por el adsorbente (para fines prcticos esta concentracin puede tomarse como cero). En el tiempo tR la zona de transferencia de masa alcanza la salida de la columna, de tal manera que se incrementa la concentracin de soluto en la solucin de salida alcanzando el valor de diseo en el tiempo de rompimiento, yR. Este valor es la mxima concentracin de soluto que se permite en la solucin de salida y representa las prdidas de soluto tolerables en el proceso. El tiempo tR marca la terminacin del ciclo de adsorcin.

Figura 3.6. Curva de rompimiento tpica. En caso de continuar la operacin la concentracin de soluto en la solucin de salida seguir incrementndose hasta igualar la concentracin de soluto en la alimentacin, yf. La forma particular que toma la curva depende tanto del tipo de equilibrio del sistema que se trate, como de los mecanismos de transporte involucrados. La prediccin del comportamiento real de la curva de rompimiento permite disear columnas para lograr cierto grado de recuperacin, estimar las prdidas y determinar el tiempo de ruptura de cada ciclo, as como para estimar dimensiones y arreglos de los equipos para la fase de adsorcin. Existen diferentes mtodos para predecir la forma de la curva de rompimiento entre los cuales se encuentran: Los mtodos aproximados. Los mtodos basados en la teora de platos.
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Los mtodos basados en la teora cintica. Los mtodos basados en la teora de equilibrio

Los dos primeros mtodos no estn basados en la obtencin de modelos a partir de relaciones de equilibrio y balances de masa, mientras que los mtodos tercero y cuarto si lo estn. Esta variedad de mtodos se debe principalmente a que las expresiones matemticas de las curvas de rompimiento son difciles de manejar en algunos casos. 3.6 Teora cintica. Los modelos de columnas de adsorcin que se enmarcan dentro de la teora cintica se desarrollan mediante la combinacin de balances de masa, relaciones de equilibrio, relaciones de transferencia de masa entre las fases y las condiciones iniciales y de frontera del sistema. Considerando una seccin de una columna como la que se muestra en la Figura 3.7, el balance de soluto en la fase lquida en un elemento de volumen se puede expresar en palabras como: Velocidad de acumulacin de soluto en la fase lquida = velocidad de entrada de soluto por conveccin velocidad de salida de soluto por conveccin + velocidad de entrada de soluto por dispersin velocidad de salida de soluto por dispersin velocidad de adsorcin de soluto por el slido. En un sistema isotrmico considerando simetra angular y despreciando los efectos radiales este balance se puede escribir de la siguiente forma: Vy t + t Vy t t y y = Q y z Q y z + z + E A z E A z + z RV z z

(4)

Donde E es el coeficiente de dispersin axial, A es el rea de seccin transversal de la columna, es la porosidad del lecho, Q es el flujo volumtrico y R es la velocidad de

22

transferencia de masa entre las fases. Dividiendo entre V = Az y tomando lmites, se obtiene la ecuacin diferencial que describe el balance de soluto en una columna: y 2 y y = E 2 v R t z z

(5)

La diversidad de modelos existentes para lechos empacados de acuerdo a la teora cintica, se deriva por un lado de los diferentes mecanismos que pueden controlar la velocidad de transferencia de masa entre las fases (pelcula, poro, resistencia combinadas, etc.), es decir, de la forma que adopta el trmino R de la ecuacin 5 y, por otro lado, de la forma de la curva de equilibrio (lineal, Langmuir, etc.) que tambin introduce variabilidad en el modelo. Adems, el modelo puede o no considerar los efectos de flujo no ideal contemplados en el trmino de dispersin axial.

Figura 3.7. Componentes del balance de soluto en la columna.

23

El balance de masa del soluto sobre el adsorbente se puede expresar como:

(1 ) q = R
t

(6)

El trmino R de las ecuaciones 5 y 6 slo depende del mecanismo controlante de la transferencia de masa. Si la velocidad de transferencia de masa est controlada slo por la pelcula del fluido que rodea la partcula de adsorbente entonces se tiene que: R = k L a(y y e ) (7)

La isoterma de adsorcin que se obtenga para cada resina se sustituye en la ecuacin 7 para eliminar la concentracin de equilibrio, ye. Las condiciones iniciales asociadas con las ecuaciones 5 y 6 son: @ t = 0, y = 0, q=0 para 0 z L (8)

Las condiciones de frontera asociadas con la ecuacin 2 son las del tipo Danckwerts: y z

@ z = 0, @ z = L,

vy f = vy E y =0 z

para t > 0 t>0

(9) (10)

para

Estas condiciones de frontera fueron propuestas por Danckwerts (1953) y se comprobaron por Seidel-Morgenstern (1991). La ecuacin 9 expresa que la velocidad a la que el soluto se alimenta a la columna es igual a las velocidades combinadas de conveccin y dispersin conforme atraviesan el plano de entrada en la columna. La ecuacin 10 expresa que el gradiente de concentracin a la salida es igual a cero puesto que ya no se presenta el proceso de adsorcin.

24

Las suposiciones asociadas con el modelo formado por las ecuaciones 5 y 6 son: 1. El proceso en lecho fijo es isotrmico. 2. La velocidad de la fase mvil es constante y su compresibilidad es despreciable. 3. El material de empaque est formado por partculas esfricas y porosas de tamao uniforme. 4. El gradiente de concentracin en la direccin radial es despreciable. 5. Existe equilibrio local entre la superficie del poro y la fase fluida. 6. El coeficiente de dispersin axial es constante. 7. La resistencia a la transferencia de masa dentro de la partcula es despreciable. En este punto se toma en cuenta la baja velocidad a la que se realizan los experimentos de adsorcin adems de que la partcula de adsorbente generalmente es muy pequea.

25

CAPITULO 4
MATERIALES Y METODOS 4.1 Resinas. Las resinas sintticas utilizadas en este trabajo para el aislamiento del GA3 son tres. Los nombres comerciales son Amberlita XAD-4 (referida en el presente trabajo como XAD4S), distribuida por Supelco, Amberlita XAD-4 (referida en el presente trabajo como XAD4R), distribuida por Rohm and Haas, y Amberlita IRA 400 (referida en el presente trabajo como IRA 400), distribuida por Supelco. Las dos primeras son resinas de adsorcin y la tercera es una resina de intercambio inico. Las resinas XAD-4 son adsorbentes polimricos en forma de esferas blancas que cuentan con una gran rea superficial, adems de presentar estabilidad fsica, qumica y trmica. Estas resinas han sido utilizadas tanto para adsorber compuestos orgnicos voltiles como compuestos orgnicos disueltos en agua y son una buena eleccin para remover sustancias orgnicas de bajo peso molecular. Algunas aplicaciones son el aislamiento de cefalosporina C (Voser, 1973), recuperacin de tilosina (Varesio y col., 1986), aislamiento de cido ctrico (Margurreanu y Gutman, 1989), entre otras. La resina Amberlita IRA 400 (forma cloro) pertenece al grupo de resinas de intercambio inico fuertemente bsicas. Esta resina es capaz de remover cualquier anin presente en una solucin acuosa. Algunas aplicaciones son la purificacin de cido glutmico (Kyowa Hakko Kogyo KK, 1959), purificacin de antibiticos (Commercial Solvents Corp, 1957; Merck & Co. Inc., 1960b) y purificacin de agua. La Tabla 4.1 muestra algunas propiedades de la resina XAD-4R as como algunas condiciones de operacin. 4.2 Preparacin de las resinas. Las resinas se embarcan como un producto hmedo que contiene NaCl y Na2CO3 para retardar el crecimiento bacteriano. Estas sales deben eliminarse del adsorbente antes de
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usarlas por primera vez. Para esto se lavaron las resinas, colocadas previamente en la columna, con agua a un flujo lineal de 1.4x10-3 m/s hasta que el pH del agua de salida fue el mismo que el pH del agua de entrada. Para remover cualquier impureza orgnica se hizo pasar por la resina un poco de metanol y finalmente se lav con agua para eliminar el alcohol. Tabla 4.1. Propiedades de la resina XAD-4R. Matriz Forma fsica rea superficial (m2/g) Dimetro de poro (A) Volumen de poro (cm3/g) Rango de pH Lmite mximo de temperatura (C) 4.3 Estudios de equilibrio. El objetivo de los estudios de equilibrio es determinar una relacin funcional entre la cantidad de GA3 adsorbido en la resina y su concentracin de equilibrio en la solucin (isoterma de adsorcin). El procedimiento que se sigui se muestra a continuacin: 1. Se colocaron pesos distintos de la resina seca en matraces de 500 ml. 2. Se agregaron a cada matraz 100 ml de una solucin de GA3 de concentracin conocida. 3. Se colocaron los matraces en un bao a temperatura constante y se agitaron a 200 rpm por 4 horas. 4. Se filtr el contenido del matraz y se tom una muestra de 6 ml. 5. Se tomaron 3 ml del filtrado y se determin la concentracin de GA3. El tiempo de contacto para alcanzar el equilibrio se determin previamente para cada resina. La concentracin de GA3 en la resina, q, se calcul a partir de las concentraciones
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Poliaromtica Esferas blancas 750 140 0.7 0-14 150

inicial y final del GA3 en la solucin, el volumen de lquido y la masa de resina de acuerdo a la ecuacin 11. q = (y in y fi ) Vi M

(11)

Los experimentos se efectuaron a 20 C y a pH de 2.5. Las condiciones de los experimentos para cada resina se muestran en las Tablas 4.2, 4.3 y 4.4. Tabla 4.2. Condiciones experimentales para la determinacin de la isoterma de adsorcin de GA3 sobre la resina XAD-4S. Matraz 1 2 3 4 5 6 4.4 Eluente ptimo. Una vez que se adsorbe el GA3 en las resinas es necesario removerlo de las mismas para completar el aislamiento del producto. El eluente que se utiliz fue una solucin acuosa de metanol de diferente concentracin. El procedimiento que se sigui se describe a continuacin: 1. Se tom una cantidad determinada de resina y se carg en la columna. 2. Se hizo pasar por la resina una solucin de GA3 de manera que se adsorbieran aproximadamente 20 mg de GA3 en la resina. Volumen de solucin (ml) 100 100 100 100 100 100 Concentracin de GA3 (g/l) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Peso de resina (g) 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0

28

3. Se homogeneiz la resina y se dividi en seis cantidades iguales. Cada porcin se coloc en columnas diferentes. 4. Se hizo pasar por cada columna el eluente a probar. 5. Se determin la concentracin de GA3 en el eluente. Tabla 4.3. Condiciones experimentales para la determinacin de la isoterma de adsorcin de GA3 sobre la resina XAD-4R. Matraz 1 2 3 4 5 6 7 Volumen de solucin (ml) 100 100 100 100 100 100 100 Concentracin de Peso de resina GA3 (g/l) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 (g) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0

Tabla 4.4. Condiciones experimentales para la determinacin de la isoterma de adsorcin de GA3 sobre resina IRA 400. Matraz 1 2 3 4 5 6 Volumen de solucin (ml) 100 100 100 100 100 100 Concentracin de GA3 (g/l) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Peso de resina (g) 1.0 2.0 4.0 6.0 7.0 8.0

El porcentaje de desorcin del GA3 con los diferentes eluentes se calcul a partir de la concentracin en el eluente y la cantidad de GA3 presente originalmente en la resina de acuerdo a la ecuacin 12.
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%R =

y elVe 100 Af

(12)

Las condiciones de los experimentos fueron los mismos para cada resina y se muestran en la Tabla 4.5. El flujo de elucin fue de 1.0 ml/min. Tabla 4.5. Condiciones experimentales para la determinacin del eluente ptimo. Composicin Columna del eluente (% metanol en agua) 1 2 3 4 5 6 4.5 Operacin de la columna. La operacin de la columna, que incluye los procesos de adsorcin, desorcin y regeneracin, se realiz tomando en cuenta los siguientes pasos: Humedecimiento de la resina 70 75 80 85 90 95 Volumen de elucin (ml) 100 100 100 100 100 100

La resina se humedeci antes de colocarse en la columna mediante el siguiente procedimiento: 1. Se transfiri la resina seca a un matraz de 500 ml. Se adicion suficiente agua para cubrir la cama de resina por 2.5 cm. 2. Se agit la resina suavemente por un minuto permitiendo que el material se depositar por 15 min. 3. Se decant cuidadosamente el exceso de agua.
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Llenado de la columna

1. Se adicionaron 2.5 cm de agua a la columna vaca. 2. Lentamente se adicion la resina a la columna. El exceso de agua se dren por el fondo de la columna sin permitir que el nivel de lquido disminuyera por debajo de la cama de resina. Se adicion la resina necesaria para alcanzar la altura de cama deseada. No se permiti la formacin de burbujas de aire ni de canalizaciones. Cargado de la resina

El proceso de hacer pasar la solucin que contiene al cido giberlico a travs de la columna, permitiendo que el cido giberlico se adsorba a la resina, se llama cargado. El flujo que se utiliz para el cargado de la resina fue de 8.5 ml/min. Durante el cargado de la resina se determin la curva de rompimiento. Elucin

Una vez que se realiz el cargado de la resina comenz la elucin con la solucin seleccionada. El flujo que se utiliz para realizar la elucin fue de 1 ml/min. Regeneracin

Para reutilizar la resina es necesario regenerarla. La solucin que se utiliz para la elucin tambin se utiliz para la regeneracin de la resina. El flujo de regeneracin fue de 1 ml/min. 4.6 Determinacin de curvas de rompimiento. Los experimentos de adsorcin de GA3 en columna se llevaron a cabo en una columna de 60 cm de altura y 2.5 cm de dimetro interno. La columna es de vidrio y la resina se empac hasta una altura de 50 cm. La alimentacin se realiz por la parte superior de la columna. La porosidad del lecho empacado se midi cargando resina hmeda en la columna para despus adicionar un volumen conocido de agua, Va, de manera que el nivel del lquido permaneciera por encima de la cama de resina. Se dej compactar la resina para despus eliminar el exceso de agua hasta que el nivel del lquido se encontrara al mismo
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nivel de la cama de resina. Este volumen de agua eliminado se cuantific y se le identific como Vae. La diferencia de estos volmenes determina el volumen ocupado por el agua y al dividirlo entre el volumen total de lecho determina la porosidad del lecho necesaria para resolver el modelo de adsorcin en columna. Para construir la curva de rompimiento se prepar una solucin de GA3 de 0.05 g/l en agua y se hizo pasar a travs de la resina. Durante este proceso se tomaron muestras de la solucin de salida a diferentes intervalos de tiempo y se determin la concentracin de GA3. Esto continu hasta lograr que la concentracin de GA3 en la salida fuera aproximadamente la misma que la concentracin de la alimentacin. 4.7 Aislamiento de GA3 de medios de cultivo. En el laboratorio donde se desarroll este trabajo, el GA3 se produce mediante fermentacin con el hongo Gibberella fujikuroi y se utilizan para ello dos biorreactores, uno de tanque agitado y el otro del tipo air lift. Los medios de cultivo que se utilizan para la produccin contienen dextrosa o aceite vegetal como fuente de carbono. La metodologa que se desarroll para el aislamiento y purificacin del GA3 se describe a continuacin. Independientemente de la fuente de carbono el primer paso para el aislamiento del GA3 es la remocin del material insoluble, biomasa principalmente. Para esto se tom el caldo de cultivo y se centrifug para despus filtrarlo a travs de una membrana de 0.45 m. Al caldo filtrado, que present una coloracin amarillenta, se le ajust el pH a un valor de 2.5 y se hizo pasar a travs de la resina dispuesta en la columna. Una vez que se realiz el cargado de la resina se hizo pasar el eluente por la misma para desorber el GA3. Para cuando el medio de cultivo contiene aceite vegetal es necesario un paso adicional para su remocin previo al cargado de la resina, para esto se realiz una extraccin lquido-lquido con hexano. 4.8 Factor de concentracin. El factor de concentracin, F, es la relacin entre la concentracin de GA3 presente en el eluente y la concentracin de GA3 presente inicialmente en el medio de cultivo. El factor de

32

concentracin calculado cuando se ha logrado desorber el 80% del GA3 presente inicialmente se identifica como F80%. 4.9 Cromatografa en capa fina. La identificacin de GA3 y otras giberelinas se realiz mediante cromatografa en capa fina en placas Kieselgel marca Merck utilizando como fase mvil una mezcla de acetato de etilo, cloroformo y cido actico (15:5:1). Como revelador se utiliz una solucin de H2SO4 al 5% en etanol (Cavell y col., 1966). 4.10 Cuantificacin de GA3. El equipo que se utiliz para la cuantificacin de GA3 fue un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin marca Varian con detector Uv-Vis de longitud de onda variable modelo 9050, bomba modelo 9012 y automuestrador modelo 9100. La columna que se emple fue una C18 de 15 cm de longitud. El mtodo que se utiliz es el reportado por Negrete (2002). 4.11 Cromatografa por elucin. La cromatografa por elucin se llev a cabo en una columna de 5 cm de altura y 1 cm de dimetro rellenada con silica gel F60 marca Merck. La fase mvil fue la misma que la utilizada en la cromatografa en capa fina. Durante esta cromatografa se tomaron fracciones de 0.7 ml y se determin su concentracin de GA3. 4.12 Solucin y ajuste de parmetros del modelo. Las ecuaciones 5 y 6 se resolvieron discretizando la coordenada espacial mediante diferencias finitas e integrando en el tiempo mediante la tcnica de Runge-Kutta de 4 orden una vez que se incorporaron las condiciones de frontera. La integracin se acopl al estimador de parmetros GREG (Stewart y col., 1990) para optimizar los valores de los coeficientes volumtrico de transferencia de masa, kLa, y de dispersin axial, E.

33

GREG es una subrutina escrita en cdigo Fortran que realiza la estimacin de parmetros de una funcin definida por el usuario minimizando la ecuacin 13 con base en ciertos rangos especificados para los parmetros. La Figura 4.1 muestra el diagrama de flujo para la estimacin de parmetros. El cdigo del programa se presenta en el Apndice 1.
Nob i =1

S = [O b (i ) Fu (i )]

(13)

Figura 4.1. Diagrama de flujo para la estimacin de parmetros.

34

CAPITULO 5
RESULTADOS Y DISCUSIN 5.1 Isotermas de adsorcin 5.1.1 Resina XAD-4R. En la Figura 5.1 se muestra la isoterma de adsorcin de GA3 sobre la resina XAD-4R a una temperatura de 20 C y pH de 2.5. La isoterma obtenida es del tipo favorable y los datos obtenidos fueron ajustados a los modelos de isoterma lineal, de Langmuir y de Freundlich. Los valores de los parmetros estimados se muestran en la Tabla 5.1 y las Figuras 5.2 y 5.3 presentan los residuales obtenidos para los modelos de Freundlich y Langmuir.
1 0.8 q* 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 y* 0.6
Datos experimentales Freundlich Langmuir Lineal

0.8

Figura 5.1. Isoterma de adsorcin de GA3 sobre XAD-4R. Tabla 5.1. Parmetros de los modelos de las isotermas de adsorcin de GA3 sobre XAD-4R. % Error Modelo Parmetro Valor R2 promedio Lineal Freundlich Langmuir Kl n Kf qo Kd 0.0132 0.6252 4.94x10-3 1.557x10-3 0.0478 0.8883 0.9942 0.9513 14.2 2.31 5.48

35

0.03 0.02 0.01 Residual 0 -0.01 -0.02 -0.03 q* estimado 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Figura 5.2. Residuales para el modelo de Freundlich para la resina XAD-4R.

0.08 0.04 Residual 0 0.2 -0.04 -0.08 -0.12 q* estimado 0.4 0.6 0.8 1

Figura 5.3. Residuales para el modelo de Langmuir para la resina XAD-4R. Como se puede apreciar en la Figura 5.1 el modelo de isoterma lineal es incapaz de predecir la isoterma de adsorcin de GA3 sobre la resina XAD-4R. El modelo de Freundlich y el modelo de Langmuir presentaron un factor de correlacin aceptable sin embargo en los residuales obtenidos con el modelo de Langmuir se visualiza una clara tendencia lo que no sucede en los residuales del modelo de Freundlich. As, el modelo de Freundlich es el que ajust de mejor manera los datos experimentales de la adsorcin de GA3 sobre la resina XAD-4R. La forma de la isoterma obtenida indica que no existe una

36

competicin fuerte por parte del solvente para unirse a los sitios de la superficie del adsorbente (Dechow, 1989). Esto era de esperarse ya que la resina XAD-4R es hidrofbica. 5.1.2 Resina XAD-4S. En la Figura 5.4 se muestra la isoterma de adsorcin de GA3 sobre la resina XAD-4S a una temperatura de 20 C y pH de 2.5. La isoterma obtenida es del tipo desfavorable y los datos obtenidos fueron ajustados a los modelos de isoterma lineal y de Freundlich. Los valores de los parmetros estimados se muestran en la Tabla 5.2 y las Figuras 5.5 y 5.6 presentan los residuales obtenidos para los modelos de isoterma lineal y de Freundlich.
1 0.8 q* 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 y* 0.6
Datos experimentales Freundlich Lineal

0.8

Figura 5.4. Isoterma de adsorcin de GA3 sobre XAD-4S. Tabla 5.2. Parmetros de los modelos de las isotermas de adsorcin de GA3 sobre XAD-4S. Modelo Lineal Freundlich Parmetro Kl n Kf Valor 0.0522 1.2652 0.1050 R2 0.9718 0.9993 % Error promedio 21.9 1.66

El modelo de Freundlich represent de manera satisfactoria la isoterma de adsorcin de GA3 sobre la resina XAD-4S. Los residuales obtenidos con el modelo de Freundlich no presentaron tendencia lo que s sucede con los residuales del modelo de isoterma lineal. La forma de la isoterma obtenida indica que existe una atraccin intermolecular fuerte dentro
37

de la capa de GA3 adsorbida y que la molcula de GA3 cuenta con un solo punto de unin fuerte a la superficie de la resina.
0.02 0.015 0.01 Residual 0.005 0 -0.005 -0.01 -0.015 q* estimado 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Figura 5.5. Residuales para el modelo de Freundlich para la resina XAD-4S.

0.08 0.04 Residual 0 0 -0.04 -0.08 q* estimado 0.5 1

Figura 5.6. Residuales para el modelo lineal para la resina XAD-4S. 5.1.3 Resina IRA 400. En la Figura 5.7 se muestra la isoterma de adsorcin de GA3 sobre la resina IRA 400 a una temperatura de 20 C y pH de 2.5. La isoterma obtenida es del tipo favorable y los datos obtenidos fueron ajustados a los modelos de Freundlich y Langmuir. Los valores de los

38

parmetros estimados se muestran en la Tabla 5.3 y las Figuras 5.8 y 5.9 presentan los residuales obtenidos para los modelos de Freundlich y Langmuir.
1 0.8 q* 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 y* 0.6 0.8 1
Datos experimentales Freundlich Langmuir

Figura 5.7. Isoterma de adsorcin de GA3 sobre IRA 400. Tabla 5.3. Parmetros de los modelos de las isotermas de adsorcin de GA3 sobre IRA 400. Modelo Freundlich Langmuir Parmetro n Kf qo Kd Valor 0.4105 2.72x10-3 1.22x10-3 0.0239 R2 0.9987 0.9795 % Error promedio 0.83 2.61

0.01 0.005 Residual 0 0.4 -0.005 -0.01 -0.015 q* estimado 0.6 0.8 1

Figura 5.8. Residuales para el modelo de Freundlich para la resina IRA 400.
39

0.03 0.02 0.01 Residual 0 -0.01 0.4 -0.02 -0.03 -0.04 -0.05 -0.06 q* estimado 0.6 0.8 1

Figura 5.9. Residuales para el modelo de Langmuir para la resina IRA 400. El modelo de Freundlich es el que represent de mejor manera los datos experimentales de la adsorcin de GA3 sobre la resina IRA 400. An cuando el modelo de Langmuir present un factor de correlacin aceptable el anlisis de los residuales mostr una clara tendencia en los mismos, lo que no sucede con los residuales obtenidos del ajuste con el modelo de Freundlich. Nuevamente, la forma de la isoterma obtenida indica poco afinidad entre el solvente y los sitios de la superficie del adsorbente. Como era de esperarse la isoterma de Freundlich ajust de manera satisfactoria los datos experimentales para las tres resinas ya que la concentracin de GA3 a la que se est trabajando es muy baja. De los resultados anteriores se desprende que la resina XAD-4S present una mayor capacidad de adsorcin que las resinas XAD-4R e IRA 400. La capacidad de adsorcin de la resina XAD-4S para una concentracin de equilibrio de 0.05 g/l es tres veces mayor que la capacidad de las otras dos resinas y para una concentracin de equilibrio de 0.1 g/l esta capacidad es cinco veces mayor que la capacidad de las otras dos resinas. En la Tabla 5.4 se presentan las capacidades de adsorcin para las diferentes resinas. De lo anterior se tiene que la mejor resina para efectuar la adsorcin de GA3 es la XAD-4S. Comparando las resinas XAD-4R e IRA 400 se observa que por encima de una concentracin de equilibrio de 0.06 g/l la resina XAD-4R tiene una mayor capacidad de adsorcin que la resina IRA 400. Por debajo de esta concentracin sucede lo contrario, sin

40

embargo para la operacin en columna se obtendran resultados ms favorables si se utiliza la resina XAD-4R ya que la concentracin de GA3 en los medios de cultivo se encuentra generalmente por encima de 0.06 g/l. Tabla 5.4. Capacidades de adsorcin para las resinas utilizadas. Concentracin de equilibrio (g/l) 0.05 0.1 5.2 Eluentes ptimos. Previo a la utilizacin de una mezcla de metanol en agua como eluente se prob metanol acidificado con HCl. Este eluente arroj resultados nada satisfactorios ya que el GA3 sufri una degradacin total. En la Figura 5.10 se presenta el porcentaje de recuperacin de GA3, adsorbido previamente en la resina, para las diferentes concentraciones de metanol en agua y para cada una de las resinas empleadas.
100 90 80 %R 70 60 50 40 70 80 % metanol en agua XAD-4R XAD-4S IRA 400 90

Capacidad de adsorcin (g GA3/g) XAD-4S 2.37x10-3 5.70x10-3 XAD-4R 0.76x10-3 1.17x10-3 IRA 400 0.80x10-3 1.06x10-3

Figura 5.10. Porcentaje de recuperacin para el aislamiento de GA3.

41

De la Figura 5.10 se desprende que con la resina XAD-4S y el eluente empleado se desorbi ms fcilmente el GA3 que con las resinas XAD-4R e IRA 400. La concentracin del eluente ptimo para esta resina fue del 85% de metanol en agua y del 80% para las otras dos resinas estudiadas. La Figura 5.10 tambin implica que para recuperar todo el GA3 adsorbido (como se logra con la resina XAD-4S) en las resinas XAD-4R e IRA 400 sera necesario utilizar una mayor cantidad de eluente. De los resultados anteriores se tiene que la mejor resina para el aislamiento de GA3 presente en medios de cultivo fue la XAD-4S no solo por su alta capacidad de adsorcin sino por su capacidad de desorcin con el eluente probado en este trabajo. Se decidi utilizar las resinas XAD-4S y XAD-4R para el aislamiento de GA3 en columna ya que resultaron ser mejores que la resina IRA 400. Otro resultado importante es que el GA3 no se degrad cuando se utiliz la resina de intercambio inico lo que se debi al eluente utilizado. 5.3 Aislamiento y purificacin de GA3 de medios cultivo. La resinas que se utilizaron para el aislamiento de GA3 de los caldos de cultivo fueron la XAD-4S y la XAD-4R. Los resultados del aislamiento de GA3 de caldos de cultivo provenientes de cinco fermentaciones se muestran en la Tabla 5.5. Para todos los caldos tratados con la resina XAD-4S los porcentajes de recuperacin son mayores al 95% y los factores de concentracin son mayores a 1. Tabla 5.5. Aislamiento de GA3 de medios de cultivo. Concentracin Caldo 1 2 3 4 5 Resina XAD-4S XAD-4R XAD-4S XAD-4S XAD-4S inicial de GA3 (g/l) 0.109 0.090 0.165 0.120 0.106 5.6 2.7 3.2 9.6 5.2 2.7 1.6 1.4 5.4 2.3 97.4 86.1 97.4 97.5 96.9
42

F80%

%R

Cuando la etapa de aislamiento se realiza mediante una extraccin del caldo de cultivo con acetato de etilo es necesario utilizar hasta tres veces el volumen del caldo de acetato de etilo para lograr que todo el GA3 presente en la fase acuosa se transfiera a la fase orgnica. El factor de concentracin obtenido en el presente trabajo revel que para realizar el aislamiento de GA3 con la resina XAD-4S se requiere un volumen de eluente menor al volumen de caldo de cultivo tratado. Adems el eluente utilizado es ms econmico que el solvente utilizado en la extraccin lquido-lquido. Un anlisis de algunas de las sustancias presentes en el caldo que abandona la columna durante el cargado de la resina revel que ni la dextrosa ni otras sustancias inorgnicas presentes (como sulfatos o fosfatos) son adsorbidas por la resina. La cromatografa en capa fina del eluente obtenido durante el aislamiento present cinco sustancias siendo una de ellas el GA3. Una representacin de este resultado se muestra en la Figura 5.11. Una medida del desplazamiento de los solutos en la capa fina con respecto al desplazamiento del solvente es el llamado Rf, que es la relacin entre la distancia recorrida por el soluto y la distancia recorrida por el solvente.

Figura 5.11. Cromatografa en capa fina del eluente obtenido del aislamiento de GA3. Una vez que termin la elucin se evapor a vaco el eluente a 40 C. Despus de la evaporacin se obtuvo un residuo acuoso amarillento que fue extrado con acetato de etilo. El acetato de etilo extrajo a las giberelinas presentes, incluido el GA3, pero extrajo muy poco de la sustancia que da la coloracin amarilla al residuo acuoso. Una vez que se obtuvo el extracto orgnico se trat con sulfato de sodio anhidro y se evapor nuevamente a vaco a 40 C. El residuo se resuspendi en metanol y se coloc en un medio fro. Esto indujo la
43

cristalizacin de parte del GA3 presente. Se removieron estos cristales de la solucin y se volvieron a disolver para realizar una nueva cromatografa en capa fina. El resultado que se obtuvo se representa en la Figura 5.12 donde solamente se encuentran presentes las giberelinas GA3 y GA7. Esto implic que el mejor paso para la purificacin del GA3 es la induccin de la cristalizacin, sin embargo, la produccin de GA3 en el laboratorio donde se desarroll el presente trabajo es muy baja. Si la produccin fuese mayor la induccin de la cristalizacin provocara la formacin de una mayor cantidad de cristales lo que facilitara el proceso de purificacin.

Figura 5.12. Cromatografa en capa fina de cristales redisueltos de GA3. La solucin de metanol se tom para realizar la cromatografa por elucin. Se realiz cromatografa en capa fina para todas las fracciones obtenidas. La aparicin de GA3 comenz en la fraccin nmero cuatro y continu hasta la fraccin nmero nueve. La cromatografa en capa fina de la fraccin ms concentrada en GA3 se representa en la Figura 5.13 donde se observa que se logra purificar casi por completo al GA3 teniendo una pequea cantidad de GA7 como impureza. La Figura 5.14 muestra el cromatograma obtenido de la cromatografa por elucin. El nmero de etapas, N, result ser de 34.5 y se calcul con la ecuacin 14. La altura equivalente de un plato terico (HETP) se calcul mediante la ecuacin 15 y result igual a 0.145 cm. Este valor pequeo de HETP indica que la columna utilizada para la purificacin puede considerarse eficiente. N (t t o 1)2 y = y o exp 2

(14)

44

HETP =

Ls N

(15)

La Tabla 5.6 muestra la concentracin de GA3 obtenida en cada fraccin. Se alimentaron 0.0112 g de GA3 a la columna y se recuperaron 0.0105 g lo que indica un porcentaje de recuperacin del 93.1%.

Figura 5.13. Cromatografa en capa fina de fraccin purificada en columna de silica gel.
6 Concentracin (g/l) 5 4 3 2 1 0 0 5000 10000 15000 20000 25000 Tiempo (s)

Figura 5.14. Cromatograma obtenido durante la purificacin de GA3. A la biomasa que se obtuvo, despus de la remocin de insolubles, se le extrajo bikaverina de acuerdo al mtodo descrito por Balan y col. (1970) donde se cambia el metanol por etanol. La bikaverina es otro producto importante que se obtiene de la fermentacin y es un

45

antibitico efectivo contra el organismo patgeno Leishmania brasiliensis (Balan y col., 1970). Tabla 5.6. Resultados de la purificacin de GA3 en columna de silica gel. Fraccin 1 2 3 4 5 Concentracin de GA3 (g/l) 0 0 0 0.5079 3.7589 Fraccin 6 7 8 9 10 Concentracin de GA3 (g/l) 5.8950 3.6428 1.1550 0.0025 0

Tomando en cuenta los resultados anteriores se propone el esquema de recuperacin y purificacin de GA3 que se presenta en la Figura 5.15.

Figura 5.15. Esquema propuesto de recuperacin y purificacin de GA3.

46

5.4 Modelamiento matemtico. 5.4.1 Anlisis de discretizacin. Antes de realizar el ajuste de los datos experimentales al modelo de dispersin axial se efectu un anlisis de discretizacin variando el nmero de nodos que se encuentran uniformemente espaciados a lo largo de la columna de manera que se obtenga una buena aproximacin al valor real. Los resultados de este anlisis se muestran en la Figura 5.16 y se puede observar que conforme aumenta el nmero de nodos la solucin que se obtiene va cambiando hasta que a partir de 20 nodos de discretizacin la solucin cambia de manera poco apreciable. Las soluciones obtenidas con 25 y 40 nodos son muy similares y por esto se decidi utilizar 40 nodos de discretizacin para resolver las ecuaciones del modelo de dispersin axial.
0.05 Concentracin (g/l) 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0 3000 6000 9000 12000 Tiempo (s)
5 nodos 10 nodos 20 nodos 25 nodos 40 nodos

Figura 5.16. Anlisis de discretizacin. 5.4.2 Curvas de rompimiento. La curvas de rompimiento obtenidas para la adsorcin en columna de GA3 sobre las resinas XAD-4S y XAD-4R se muestran en las Figuras 5.17 y 5.18, respectivamente. Se presentan tambin los resultados estimados por el modelo de dispersin axial. La porosidad del lecho result ser igual a 0.35 para ambas resinas.

47

Los valores de los parmetros optimizados en el ajuste de los datos experimentales se presentan en la Tablas 5.7 y 5.8 para las resinas XAD-4S y XAD-4R, respectivamente. Se observ que los parmetros obtenidos convergieron al mismo valor desde diferentes suposiciones iniciales.

0.05 0.04 Concentracin (g/l) 0.03 0.02 0.01 0 0

Experimental Modelo

3000

6000

9000

12000

Tiempo (s)

Figura 5.17. Curva de rompimiento para la resina XAD-4S.

0.05 Concentracin (g/l) 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0

Experimental Modelo

3000

6000 Tiempo (s)

9000

Figura 5.18. Curva de rompimiento para la resina XAD-4R.

48

Tabla 5.7. Parmetros optimizados para la resina XAD-4S. Valor inicial kLa (s-1) 1.7x10-7 1.7x10-6 1.7x10-4 1.7x10-3 1.7x10-4 E (m2/s) 1.7x10-11 1.7x10-10 1.7x10-8 1.7x10-7 1.7x10-6 Valor optimizado kLa (s-1) 2.1x10-4 2.1x10-4 2.1x10-4 2.1x10-4 2.1x10-4 E (m2/s) 2.3x10-6 2.3x10-6 2.3x10-6 2.4x10-6 2.3x10-6 No. de iteraciones 5 7 7 5 3

Tabla 5.8. Parmetros optimizados para la resina XAD-4R. Valor inicial kLa (s-1) 1.7x10-7 1.7x10-6 1.7x10-4 1.7x10-3 1.7x10-4 E (m2/s) 1.7x10-11 1.7x10-10 1.7x10-8 1.7x10-7 1.7x10-6 Valor optimizado kLa (s-1) 2.3x10-4 2.3x10-4 2.3x10-4 2.3x10-4 2.3x10-4 E (m2/s) 4.8x10-6 4.8x10-6 4.8x10-6 4.8x10-6 4.8x10-6 No. de iteraciones 4 5 5 8 4

Las Figuras 5.19 y 5.20 muestran los residuales obtenidos del ajuste de los datos experimentales con el modelo de dispersin axial para las resinas XAD-4S y XAD-4R, respectivamente. No se observ una tendencia apreciable en ninguno de los casos. La capacidad de adsorcin en el tiempo de rompimiento para la resina XAD-4S result ser de 9.8x10-5 g/g y de 4.7x10-5 g/g para la resina XAD-4R. El tiempo de rompimiento es el tiempo en el que la concentracin de GA3 en la salida de la columna es igual al 10% de la concentracin de GA3 en la alimentacin. Como era de esperarse el valor del coeficiente volumtrico de transferencia de masa es muy parecido para ambas resinas puesto que la velocidad superficial de la solucin de GA3 fue la misma. Tambin los coeficientes de dispersin axial son del mismo orden de magnitud para ambas resinas por la misma razn.

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0.006 0.004 Valor estimado 0.002 0 -0.002 -0.004 -0.006 Residual 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

Figura 5.19. Residuales para el modelo de dispersin axial para la resina XAD-4S.
0.006 0.004 Residual 0.002 0 -0.002 -0.004 -0.006 Valor estimado 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

Figura 5.20. Residuales para el modelo de dispersin axial para la resina XAD-4R. Es posible calcular el valor de los coeficientes volumtrico de transferencia de masa y de dispersin axial mediante el uso de correlaciones. En la Tabla 5.9 se presentan los valores del coeficiente volumtrico de transferencia de masa calculado con dos correlaciones. La difusividad molecular se estim con la correlacin de Hayduk-Minhas (Reid y col., 1987) y el volumen molar se estim mediante el mtodo de Le Bas (Reid y col., 1987). En la Tabla 5.10 se presentan los valores del coeficiente de dispersin axial calculado, tambin, con dos correlaciones.

50

Como se observa en la Tabla 5.9, los valores predichos por las correlaciones son un orden de magnitud mayores que el valor estimado en la optimizacin. Esto puede indicar la presencia de la resistencia intrapartcula (Chern y Chien, 2001). Los valores del coeficiente de dispersin axial son del mismo orden de magnitud de los estimados en la optimizacin, de hecho, el valor calculado por la correlacin 1 es muy similar al valor estimado para el caso de la resina XAD-4S. Tabla 5.9. Coeficiente volumtrico de transferencia de masa calculado mediante correlaciones existentes. Correlacin segn Cussler (1995) Wilson y Geankoplis (1966) kLa (s-1) 6.6x10-3 9.5x10-3

Tabla 5.10. Coeficiente de dispersin axial calculado mediante correlaciones existentes. Correlacin segn Latheef y col. (2000) Chung y Wen (1968) E (m2/s) 2.3x10-6 1.9x10-6

El modelo de dispersin axial que se est considerando desprecia la resistencia intrapartcula considerando que la resistencia que domina es la que existe en la pelcula. Es posible, mediante el clculo del nmero de Biot (definido en la ecuacin 16) saber que tan cierta es esta suposicin. La ecuacin de Rankin (Cussler, 1995) permite evaluar la difusividad efectiva del GA3 en los poros de la resina. Esta ecuacin ha sido utilizada con xito por Traving y col. (2003) para estimar la difusividad efectiva de cido ctrico en las resinas XAD-16 y XAD-4. Los nmeros de Biot calculados se presentan en la Tabla 5.11 tanto para el coeficiente volumtrico de transferencia de masa estimado en el ajuste de parmetros como el coeficiente calculado con la correlacin 1.

51

Bi =

k L Re Def

(16)

De acuerdo a Chen y col. (2001) cuando el nmero de Biot es igual o menor a 1, la resistencia en la pelcula domina por completo el proceso de transferencia de masa y cuando se encuentra entre 1 y 10 la resistencia en la pelcula es mayor que la resistencia en la partcula. De acuerdo a esto, el nmero de Biot calculado con el coeficiente volumtrico de trasferencia obtenido del ajuste es menor a 1 y por tanto la resistencia en la pelcula domina por completo el proceso de adsorcin de GA3 en la resina. Sin embargo, esto resultado es inherente al modelo que se est considerando. El nmero de Biot calculado con el coeficiente volumtrico de transferencia de masa calculado con la correlacin 1 implica la presencia de las resistencias en la pelcula y dentro de la partcula siendo mayor la primera que la segunda. De acuerdo a esto sera necesaria plantear un modelo de dispersin axial que considere las resistencias en la pelcula y dentro de la partcula para comprobar esta ltima afirmacin y establecer cul es la aportacin de cada una de las resistencias al proceso de transferencia de masa. Tabla 5.11. Nmeros de Biot calculados. kLa (s-1) 2.1x10-4 6.6x10-3 5.4.3 Anlisis de sensibilidad Para determinar la sensibilidad de la respuesta del modelo de dispersin axial a cambios en los parmetros del mismo y para encontrar cul de los parmetros es ms importante se efectu un anlisis de sensibilidad. La sensibilidad se define en la ecuacin 17. SS SS o P Po Bi 0.221 6.275

Sp =

(17)

52

El anlisis se realiz tomando los valores ptimos de los parmetros encontrados durante el ajuste de la curva de rompimiento para la resina XAD-4S. El resultado se presenta en la Figura 5.21. De la Figura 5.21 se desprende que el modelo de dispersin axial es ms sensible a los cambios en el valor del coeficiente volumtrico de transferencia de masa. Esto implica que se debe tener especial cuidado en la determinacin experimental del valor de este coeficiente.
3

kLa

2.5 2 1.5 1 0.5 0

SS/SSo

E
0 0.3 0.6

-0.6

-0.3

P/Po Figura 5.21. Sensibilidad de los parmetros del modelo de dispersin axial. 5.5 Resumen de resultados. Recapitulando, la resina XAD-4S es la que se propone para realizar el aislamiento de GA3 de caldos de cultivo. La Tabla 5.12 resume los resultados ms importantes de las resinas estudiadas y como puede verse la resina XAD-4S es superior en todos los aspectos a las resinas XAD-4R e IRA 400. Tabla 5.12. Resultados comparativos de las resinas estudiadas. Capacidad Resina XAD-4S XAD-4R IRA 400 de adsorcin (g/g) 2.37x10-3 0.76x10-3 0.80x10-3 % R mximo con el eluente ptimo 98.9 83.7 73.7 Capacidad de adsorcin en el tiempo tR (g/g) 9.8x10-5 4.7x10-5 % R de GA3 de caldos de cultivo 97.5 86.1 53

CAPITULO 6
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 6.1 Conclusiones El desarrollo del presente trabajo permiti aislar satisfactoriamente el GA3 de caldos de cultivo mediante la adsorcin en resinas sintticas. Adems se propuso un mtodo de purificacin parcial del GA3 mediante cromatografa por elucin. Las tres resinas estudiadas adsorben el GA3 de los caldos de cultivo aunque difieren en su capacidad de adsorcin. La resina XAD-4S result ser la ms adecuada para el aislamiento de GA3, no slo por su alta capacidad de adsorcin sino tambin por su capacidad de desorcin con el eluente probado. Su capacidad de adsorcin en el tiempo de rompimiento result ser dos veces mayor a la capacidad de adsorcin de la resina XAD-4R. Los porcentajes de recuperacin durante el aislamiento de GA3 de caldos de cultivo son superiores al 95% para el caso de la resina XAD-4S. El eluente ptimo para esta resina es una solucin de metanol en agua al 85% y se requiere de un volumen de eluente menor al volumen de caldo tratado para completar el aislamiento y la regeneracin de la resina. Adems, esta resina no adsorbe la dextrosa presente en los caldos ni otras sustancias inorgnicas lo que implica que es un tanto selectiva para la adsorcin de GA3. El estudio de la etapa de purificacin arroj que la induccin de la cristalizacin por enfriamiento de la solucin es la tcnica que acelera y facilita esta etapa. Adicionalmente se plante la cromatografa por elucin para purificar parcialmente el GA3 obtenindose recuperaciones superiores al 95%. Se desarroll un modelo matemtico para describir el proceso de adsorcin de GA3 en las resinas XAD-4 optimizando los valores de los coeficientes volumtrico de transferencia de masa y de dispersin axial mediante la subrutina GREG. Los valores de los coeficientes volumtricos de transferencia de masa son un orden de magnitud mayores a los calculados con correlaciones existentes lo que puede deberse a la presencia de resistencia a la transferencia de masa dentro de la partcula. Los valores de los coeficientes de dispersin axial son del mismo orden de magnitud de los calculados con correlaciones existentes.
54

6.2 Recomendaciones. Referente a las isotermas de adsorcin es recomendable obtenerlas a otras condiciones de temperatura y de pH para determinar si la adsorcin se favorece bajo otras condiciones. Se recomienda obtener curvas de rompimiento a otras condiciones de velocidad de manera que se puedan obtener ecuaciones que correlacionen el coeficiente volumtrico de transferencia de masa con la velocidad. Para la purificacin del GA3 es recomendable cambiar la composicin de la fase mvil para favorecer la separacin de GA3 de todas las impurezas presentes. Finalmente, se recomienda mejorar el modelo propuesto de manera que se considere la resistencia a la transferencia de masa dentro de la partcula de adsorbente.

55

APENDICES
A-1. Cdigo del programa para la solucin y la optimizacin de parmetros IMPLICIT DOUBLE PRECISION (A-H, O-Z) PARAMETER(NVAR=80,NSTEP=150) PARAMETER(NPAR=2,NOB=13) DIMENSION OBS(NOB),PAR(NPAR),BNDLW(NPAR) DIMENSION BNDUP(NPAR),CHMAX(NPAR),DEL(NPAR) DIMENSION DSC(3+2*NOB+NPAR*(NPAR+7+NOB)) DIMENSION ISC(5+3*NPAR+1) COMMON/P/PAR EXTERNAL MODEL, GREG, RKDUMB, RK4 C LECTURA DE DATOS OPEN(1,FILE="c:/romp.txt") READ(1,*) (OBS(I),I=1,NOB) ISC(1) = 1 ISC(2) = 10 ISC(3) = 1 ISC(4) = 50 ISC(5) = 2 ISC(6) = 1 BNDUP(1) = 7.0 BNDUP(2) = 0.3 BNDLW(1) = 0.00001 BNDLW(2) = 0.00000001 DEL(1) = -1.000000D-02 DEL(2) = -1.000000D-02 CHMAX(1)= 10.0 CHMAX(2) = 1.0 APIV = 1.0000D-02 RSTOL = 1.0000D-01 ITMAX = 1 LISTS = 2 EMOD = 1.4901D-08 RPTOL = 1.0000D-05 IDIF = 1 MDSC = 3+2*NOB+NPAR*(NPAR+7+NOB) MISC = 5+3*NPAR+1

56

VALORES INICIALES DE LOS PARAMETROS PAR(1) = 1.0 PAR(2) = 0.01 CALL GREG(NOB,OBS,NPAR,PAR,BNDLW,BNDUP,CHMAX,DEL,MDSC,DSC, 1 MISC,ISC,IOBS,IDET,EMOD,VPIV,APIV,RPTOL,RSTOL,MODEL) STOP END SUBROUTINE MODEL(PAR,F,NOB,NPAR,IDER,DERIV,MINFO) IMPLICIT DOUBLE PRECISION (A-H,O-Z) PARAMETER(NVAR=80,NSTEP=150) PARAMETER (NOBS=13,NPARAM=2) DIMENSION x(200),y(80,200),vstart(NVAR) DIMENSION F(NOBS), PAR(NPARAM), DERIV(NOBS,1) COMMON /path/ x,y OPEN(2,FILE="c:/int.txt") READ(2,*) x1, x2 vstart = 1.0E-8 call rkdumb(vstart,NVAR,x1,x2,NSTEP,derivs)

C C

la subrutina rkdumb se tom del Numerical Recipes VALORES ESTIMADOS F(1) = y(40,1) F(2) = y(40,14) F(3) = y(40,26) F(4) = y(40,39) F(5) = y(40,51) F(6) = y(40,63) F(7) = y(40,76) F(8) = y(40,89) F(9) = y(40,101) F(10) = y(40,114) F(11) = y(40,126) F(12) = y(40,138) F(13) = y(40,151) WRITE(*,*) par END SUBROUTINE rkdumb(vstart,nvar,x1,x2,nstep,derivs) IMPLICIT DOUBLE PRECISION (A-H, O-Z) PARAMETER (NMAX=80,NSTPMX=200)
57

DIMENSION vstart(nvar),xx(NSTPMX),y(NMAX,NSTPMX),dv(NMAX) DIMENSION v(NMAX), dydx(80),PAR(2) COMMON/P/PAR EXTERNAL derivs COMMON /path/ xx,y CU USES rk4 OPEN(3,FILE="c:/val.txt") READ(3,*) CH, eps, eng, vel, yf, f, const A = PAR(1)/eps/eng**2 B = vel/eps/eng C = PAR(2)/eps G = PAR(1)/ch/eng D = PAR(2)/(1.0-eps) do 11 i=1,nvar v(i)=vstart(i) y(i,1)=v(i) 11 continue xx(1)=x1 x=x1 h=(x2-x1)/nstep do 13 k=1,nstep dv(1)= A*(v(2)-2*v(1)+(vel*yf+G*v(1))/(vel+G))/CH**2.0-B/(2*CH)* $(v(2)-(vel*yf+G*v(1))/(vel+G))-C*(v(1)-(v(41)/const)**(1.0/f)) do j = 2,39 dv(j)= A*(v(j+1)-2*v(j)+v(j-1))/CH**2.0-B/(2*CH)*(v(j+1)-v(j-1)) $-C*(v(j)-(v(j+40)/const)**(1.0/f)) end do dv(40)=A*(v(40)-2*v(40)+v(39))/CH**2.0-B/(2*CH)*(v(40)-v(39)) $-C*(v(40)-(v(80)/const)**(1.0/f)) do j = 41,80 dv(j)= D*(v(j-40)-(v(j)/const)**(1.0/f)) end do call rk4(v,dv,nvar,x,h,v,derivs) if(x+h.eq.x)pause 'stepsize not significant in rkdumb' x=x+h xx(k+1)=x do 12 i=1,nvar y(i,k+1)=v(i) 12 continue 13 continue return END
58

A-2. Resultados experimentales tabulados A-2.1 Isotermas de adsorcin Tabla. A-2.1. Isoterma de adsorcin de GA3 sobre XAD-4R. q (g/g) ye (g/l) 3.24x10-4 5.50 x10
-4

0.0123 0.0327 0.0601 0.0652 0.0756 0.0840 0.0914

8.48 x10-4 9.20 x10-4 9.64 x10-4 10.52 x10-4 11.37 x10-4

Tabla. A-2.2. Isoterma de adsorcin de GA3 sobre XAD-4S. q (g/g) ye (g/l) 3.28x10-4 12.05 x10-4 15.86 x10-4 24.92 x10-4 39.99 x10
-4

0.0104 0.0291 0.0378 0.0511 0.0754 0.0903

50.57 x10-4

Tabla. A-2.3. Isoterma de adsorcin de GA3 sobre IRA 400. q (g/g) ye (g/l) 4.83 x10-4 6.24 x10
-4

0.0152 0.0264 0.0499 0.0631 0.0789 0.0924

8.01 x10-4 8.74 x10-4 9.53 x10-4 10.26 x10-4

59

A-2.2 Eluentes ptimos Tabla. A-2.4. Recuperacin de GA3 para diferentes eluentes. % de metanol en agua 70 75 80 85 90 95 A-2.3 Curvas de rompimiento Tabla. A-2.5. Curva de rompimiento para XAD-4S. y (g/l) 0 0 0 0 0 0 0.0031 0.0089 0.0118 0.0203 0.0372 0.0474 0.0489 t (s) 0 1200 2400 3600 4800 6000 7200 8400 9600 10800 12000 13200 14400 XAD-4S 88.49 91.58 93.39 98.88 78.95 74.74 %R XAD-4R 69.40 72.36 83.70 76.89 72.54 65.78 IRA 400 53.96 68.87 73.66 63.01 56.91 43.70

60

Tabla. A-2.6. Curva de rompimiento para XAD-4R. y (g/l) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0030 0.0040 0.0069 0.0085 0.0269 0.0286 0.0376 0.0468 0.0478 t (s) 0 900 1800 2700 3600 4500 5400 6300 7200 8100 9000 9900 10800

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BIBLIOGRAFIA
Balan, J., Fuska, J., Kuhr, I and Huhrov, V. (1970). Bikaverin, an Antibiotic from Gibberella fujikuroi, Effective against Leishmania brasiliensis. Folia Microbiologica, 15, 479-484. Belter, P. A., Cussler, E. L. and Hu, W. S. (1988). Bioseparations, Downstream Processing for Biotechnology. New York, NY: John Wiley & Sons. Brian, P. W., Radley, M. E., Curtis, P. J. and Elson, G. W. (1957). Gibberellic Acid and Derivates thereof. Patente GB783611. Brkner, B. and Blechschmidt, D. (1991). The gibberellin fermentation. Critical Reviews in Biotechnology, 11, 163-192. Cavell, B. D., MacMillan, J., Pryce, R. J. and Sheppard, A. C. (1966). Thin-Layer Chromatography of the Gibberellins. Phytochemistry, 2, 867-874. Chas. Pfizer & Co. Inc. (1959). Recovery Process for Gibberellins. Patente GB819110. Chen, B., Hui, C. W. and McKay, G. (2001). Pore-Surface Diffusion Modeling for Dyes from Effluent on Pith. Langmuir, 17, 740-748. Chern, J. M. and Chien, Y. W. (2001). Adsorption Isotherms of Benzoic Acid onto Activated Carbon and Breakthrough Curves in Fixed-Bed Columns. Industrial & Engineering Chemistry Research, 40, 3775-3780. Chung, S. F. and Wen, C. Y. (1968). Longitudinal Dispersion of Liquid Flowing Through Fixed and Fluidized Beds. AIChE Journal, 14, 857-866. Commercial Solvents Corp. (1957). A new antibiotic cycloserine and method of preparing the same. Patente GB768007. Cross, B. E., Grove, J. F., McCloskey, P., MacMillan, J., Moffatt, J. S.and Mulholland, T. P. C. (1961). The structures of the fungal Gibberellins. Advances in Chemistry Series, 28, 3-17. Crutcher, R. E. (1979). Gibberellin A4 separation. Patente US4156684. Cussler, E. L. (1995). Diffusion, mass transfer in fluid systems. New York, NY: Cambridge University Press. Danckwerts, P. V. (1953). Continuous flow systems. Chemical Engineering Science, 2, 1-9.

62

Dechow, F. J. (1989). Separation and Purification Techniques in Biotechnology. Park Ridge, NJ: Noyes Publications. Durley, R. C. and Pharis, R. P. (1972). Partition coefficients of 27 gibberellins. Phytochemistry, 2, 317-326. Elson, G. W. and Peterson, A. R. (1970). Process for the separation or gibberellins. Patente US3496194. Heropolitanski, R. (1979). Procedimiento para el aislamiento de giberelinas. Patente ES488592. Hitzman, D. O. and Mills, A. M. (1963). Conversion of hydrocarbons by Gibberella fujikuroi. Patente US3084106. Imperial Chemical Industries Ltd. (1959). Isolation Process. Patente GB821733. Jefferys, E. G. (1970). The gibberellin fermentation. Advances in Applied Microbiology, 13, 283-316. Ku, Y and Sawick, D. P. (1996). Method for separation of gibberellin mixtures. Patente US5562831. Kyowa Hakko Kogyo KK. (1959). Method for purification of glutamic acid. Patente GB811688. Latheef, I. M., Huckman, M. E. y Anthony, R. G. (2000). Modeling Cesium Ion Exchange on Fixed-Bed Columns of Crystalline Silicotitanate Granules. Industrial & Engineering Chemistry Research, 39, 1356-1363. Lightfoot, E. N. (1999). Speeding the Design of Bioseparations. A Heuristic Approach to Engineering Design. Industrial & Engineering Chemistry Research, 38, 3628-3634. Mabelis, R. P. (1986). Gibberellin amine salts. Patente US4578483. Margurreanu, G. and Gutman, F. (1989). Process for Producing Citric Acid. Patente US4855494. Merck & Co. Inc. (1960a). Gibberellic Acid. Patente GB847435. Merck & Co. Inc. (1960b). Purification of novobiocin and dyhidronovobiocin. Patente GB850240. Merck & Co. Inc. (1961). Elution of Organic Substances from Ion-Exchange Resins. Patente GB881855.

63

Negrete, X. R. (2002). Produccin de cido Giberlico (GA3) en Biorreactor de Tanque Agitado con Gibberella fujikuroi Empleando Aceite de Maz como Fuente de Carbono. Tesis de maestra, Instituto Tecnolgico de Celaya, Gto., Mxico. Pharis, R. P. and Reid, D. M. (1985). Hormonal Regulation of Development III. New York, NY: Springer-Verlag New York, Inc. Podojl, M., Sevcik, V., Kuhr, L., and Fuska, J. (1961). Isolation of Gibberellic Acid on IonExchange Resins. Folia Microbiologica, 6, 273-276. Reid, R. C., Prausnitz, J. M. and Poling, B. E. (1987). The properties of gases and liquids. New York, NY: McGraw-Hill. Seidel-Morgenstern, A. (1991). Analysis of boundary conditions in the axial dispersion model by application of numerical Laplace inversion. Chemical Engineering Science, 10, 2567-2571. Societe dEtudes et dApplications Biochimiques. (1963). Gibberellins. Patente GB936549. Stewart, W., Caracotsios, M. and Sorensen, J. (1990). GREG. Department of Chemical Engineering. University of Winsconsin, Madison. Tejeda, A., Montesinos, R. M. y Guzmn R. (1995). Bioseparaciones. Sonora, Mxico: Editorial Unison. Traving, M., Bart, H. J. and Neu, A. (2003). Organic acid recovery from fermentation broths using reactive sorption. Universitt Kaiserslautern, Germany. Varesio, C., Fabris, D., Oppici, E., Onoriro, R. and Lazzari, G. (1986). Process for Purifying Tylosin. Patente US4568740. Voser, W. (1973). Process for the Recovery of Hydrophilic Antibiotics. Patente US3725400. Wilson, E. J. and Geankoplis, C. J. (1966). Liquid Mass Transfer at Very Low Reynolds Numbers in Packed Beds. AIChE Journal, 5, 9-14. Yan, F. (1995). Method for stage extraction gibberellin A4 and A7 from gibberellin mixture. Patente CN1111286. Process for Purifying

64