Gua Prctica 4

Fusarium oxysporum
Enfermedad: Amarillamiento por Fusarium
Contenido

Manejo del hongo en el laboratorio

Guillermo Castellanos, Experto en Investigacin2 Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigacin Gloria Mosquera, Fitopatloga, Ph.D., Lder de Proyecto Fitopatologa de Frijol

Generalidades Procedimientos A. Recoleccin y transporte de las muestras B. Preparacin del medio de cultivo PDA C. Aislamientos de F. oxysporum 1. En el medio de cultivo PDA 2. Cultivo monosprico D. Incremento de F. oxysporum 1. Sobre el medio de cultivo PDA E. Inoculacin de las plantas F. Conservacin para almacenamiento 1. Liofilizacin 2. Conservacin en papel filtro a 20 C 3. Conservacin como suspensin en solucin de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 C G. Prueba de almacenamiento H. Recuperacin del hongo almacenado 1. Liofilizado en ampolletas 2. Conservado en papel filtro a 20 C 3. Conservado a 20 C en papel filtro de suspensin en peptona-sucrosa

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Generalidades
Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli es el agente que causa la enfermedad conocida como amarillamiento por Fusarium o marchitamiento por Fusarium. Invade y deteriora el sistema vascular de la planta, que por ello se marchita y, finalmente, muere (Fotos 1 y 2). El hongo penetra en la planta por las races, invade luego algunos vasos del xilema y pronto tapona todo el sistema vascular. El primer sntoma es un amarillamiento, ms adelante se observa la marchitez de las hojas por falta de nutrientes y, por ltimo, la defoliacin de la planta.

Foto 1

Foto 2

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Procedimientos
A. Recoleccin y transporte de las muestras
Fusarium oxysporum se asla de tejidos vegetales que presenten sntomas tpicos de la enfermedad, es decir, de la raz y de parte del hipocotilo. Generalmente, el hongo infecta estas dos estructuras de la planta.

Materiales
Para recolectar las muestras de tejido infectado en el campo, se necesitan tres elementos: toallas de papel, bolsas de papel y rtulos para identificar las muestras. Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol infectado (races o tallos) que se colect se envuelve en una toalla de papel que sirve, adems, para absorber su humedad. Si no hay toallas, pueden usarse materiales similares como servilletas, papel higinico, pauelos faciales y, en ltimo caso, papel peridico. Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado envueltas en algn papel absorbente se colocan en bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas plsticas porque no son porosas y contribuyen, por ello, a la acumulacin de humedad en su interior; esta humedad favorece el crecimiento de microorganismos saprofitos, que dificultarn el aislamiento del patgeno desde los tejidos de frijol.
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Rtulos para marcar las muestras. Es muy importante identificar claramente la muestra con la siguiente informacin: variedad (o genotipo) de frijol, tamao y color de sus granos, lugar donde se toma la muestra (localidad, provincia, departamento, pas), fecha de recoleccin de la muestra, nombre del recolector y, en lo posible, latitud y longitud (aproximadas) del lugar en que se hizo la recoleccin. El rtulo debe quedar bien adherido en cada muestra.

Recomendaciones
Indicar en el rtulo si la recoleccin se hizo en el campo de un agricultor o en una estacin experimental. Cuando no haya suficientes rtulos para todas las muestras, marcar las bolsas con un cdigo y registrar la informacin completa en una libreta de campo. No recolectar material vegetal hmedo; si est en esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes de ser transportado. Una vez en el laboratorio, y si no se procesa inmediatamente, dejarlo al aire libre para que termine de secarse.

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Pasos del proceso

Paso 1 Tomar muestras de la raz o del tallo de plantas que presenten sntomas de amarillamiento por Fusarium (ver A. Recoleccin y). Paso 2 Envolver la muestra en una toalla de papel y colocarla dentro de una bolsa o sobre de papel, y adherir a sta el rtulo que corresponda (ver A. Recoleccin y). Paso 3 Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al sitio o laboratorio donde se har el aislamiento. Nunca enve las muestras dentro de bolsas plsticas o envueltas en papel aluminio (ver antes).

B. Preparacin del medio de cultivo PDA

Las siglas PDA corresponden a los componentes del medio: papa, dextrosa y agar. Este medio se usa para aislar ste y otros patgenos.

Materiales
PDA deshidratado Agua destilada Frascos erlenmeyer de 1000 ml Cajas petri
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39 g/litro 1 litro 2 50

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Preparacin
Se pesan los ingredientes (Foto 3), se colocan en un recipiente grande, que puede ser un vaso de precipitado, y se les agrega el agua; esta solucin se envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en cada uno). Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo PDA se esterilizan en autoclave. Esta mquina, con una presin de 20 libras y una temperatura de 121 C, realiza el proceso total de esterilizacin en 40 minutos. El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda manipularse (Foto 4), y se vierte luego en cajas petri, a razn de 20 ml por caja (Foto 5).

Foto 3

C. Aislamientos de F. oxysporum
1. En el medio de cultivo PDA
Foto 4

Materiales
Cmara de flujo laminar Tijeras Cajas petri, de 100 y 60 mm Agua destilada estril Hipoclorito de sodio al 2.5% Toallas de papel Mechero Marcador Incubadora
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Foto 5

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Medio de cultivo PDA Pinzas Muestra vegetal con sntomas

Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de la cmara de flujo laminar; adems, deben cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exigen en un laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas prcticas microbiolgicas (BPM).

Foto 6

Pasos del proceso

Paso 1 Cortar varios trozos del tejido enfermo utilizando una tijera estril (Foto 6). Paso 2 Desinfectar los trozos de muestra en una caja petri de 60 mm que contenga una solucin de hipoclorito de sodio al 2.5%, durante 3 minutos. Enjuagar luego los trozos desinfectados con agua destilada estril en otra caja petri, vertiendo el agua sobre la muestra con una pipeta estril (Foto 7). Paso 3 Colocar los trozos lavados sobre toallas de papel estriles durante 10 minutos para que se sequen (Foto 8).
Foto 8 Foto 7

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Foto 9

Paso 4 Cuando los trozos estn secos, tomarlos con una pinza estril y sembrarlos en una caja petri que contenga el medio de cultivo PDA (Foto 9). Hacer lo mismo con las dems cajas (para multiplicar las muestras). Incubar las cajas a 24 C durante 7 das, tiempo en que el hongo producir masas de conidias y micelio (Fotos 10 y 11).

2. Cultivo monosprico
La pureza gentica de un aislamiento de F. oxysporum se garantiza si este aislamiento se hace partiendo de una sola conidia. En una muestra de tejido enfermo puede haber una mezcla de cepas del patgeno. Los cultivos monospricos se obtienen del aislamiento que se hizo del patgeno presente en una muestra de tejido enfermo, el cual se desarroll en el medio de cultivo y produjo masas de conidias (ver proceso anterior, Pasos 3 y 4).

Foto 10

Pasos del proceso

Paso 1 Observar mediante un estereoscopio la masa de conidias del hongo.

Foto 11

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Paso 2 Tocar, con un alfiler flameado, la masa de conidias para que varias de ellas queden adheridas a la punta del alfiler. Paso 3 Desprender (sobre el medio de cultivo PDA de una caja petri) las conidias del alfiler con agua destilada estril contenida en una pipeta: se vierten de 4 a 6 gotas del agua en el alfiler suspendido sobre el medio. Esparcir bien, con un tringulo de vidrio, sobre la superficie del medio las gotas de agua con las conidias. Esta operacin exige el uso de instrumentos estriles; el tringulo de vidrio, por ejemplo, se debe flamear antes de cada uso para no contaminar el medio. Paso 4 Incubar las cajas petri del paso anterior a 20 C durante 24 horas. Pasado ese tiempo, las conidias empiezan a germinar y estn listas para ser transferidas individualmente.

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Paso 5 Enfocar las conidias germinadas con un estereoscopio. Elegir una y sacarla con un alfiler previamente flameado para transferirla a una caja petri que tenga PDA e incubarla luego a 24 oC. La conidia se desarrolla en ese medio el cual, despus de 10 das, queda totalmente cubierto por las estructuras del hongo (cultivo monosprico). El aislamiento monosprico es el punto de partida de los diversos procesos que requieren un aislamiento especfico del patgeno (inoculacin, extraccin de ADN del micelio, conservacin).

D. Incremento de F. oxysporum
1. Sobre el medio de cultivo PDA
El nmero de incrementos (o transferencias) del hongo que deben hacerse depende de la cantidad de plantas que se quiera inocular.

Materiales
Aislamiento esporulado del hongo Agua destilada estril Pipeta con chupo Tringulo de vidrio Medio de cultivo PDA

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Pasos del proceso

Paso 1 Agregar con la pipeta el agua destilada estril (de 3 a 4 ml) al aislamiento y raspar con la misma pipeta la superficie del medio de cultivo (en la caja petri), con el fin de desprender de ste masas de conidias y de micelio (Foto 12). Paso 2 Tomar 1 ml de la suspensin del hongo que se obtuvo en el paso anterior y trasladarla a otra caja petri que tenga medio de cultivo PDA (Foto 13). Esparcir, con un tringulo previamente flameado, la suspensin por toda la superficie de ese medio (Foto 14). Paso 3 Incubar las cajas petri del paso anterior a 24 oC durante 10 das.

Foto 12

Foto 13

Foto 14

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E. Inoculacin de las plantas

Materiales
Plntulas de frijol cuya semilla germin en materos con arena estril Suspensin de conidias del hongo (el inculo) Agua destilada estril Tijeras (Foto 15)

Paso 1 Incrementar el hongo 10 das antes de la inoculacin, segn el nmero de plantas que se quiera inocular. Calcular el nmero aproximado de cajas petri (con medio de cultivo PDA) que se necesitan y en ellas sembrar el hongo (ver D. Incremento de). Tres o cuatro cajas petri de cultivo son suficientes para preparar, ms o menos, 500 ml de inculo. Paso 2 Agregar agua destilada estril a los incrementos del hongo en las cajas petri del paso anterior, y raspar luego la superficie del medio con una esptula estril para desprender las conidias. Obtenida as la suspensin de conidias, filtrarla con una gasa estril para separar partculas, como restos de agar y de micelio, y recoger en una caja petri estril de 60 mm las conidias despus de la filtracin.

Foto 15

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Paso 3 Contar (empleando el microscopio) las conidias observadas en la cuadrcula central del hemacitmetro (los cuatro cuadros de las esquinas y el del centro). Multiplicar por 50.000 el nmero de conidias contadas. La concentracin que debe tener (en este caso) el inculo del patgeno es de 1 x 106 conidias/ml. Entonces, dado un volumen final del inculo que se asperjar (V2) y dada la concentracin de conidias del inculo original, utilizar la siguiente frmula para hallar el volumen del inculo original que se necesita para ajustar el de la aspersin: V1 x C1 = V2 x C2 Ejemplo Se contaron 125 conidias en el hemacitmetro. Por tanto, 125 x 50.000 = 625.000 = 6.25 x 106 (conidias en 1 ml) sta es la concentracin del inculo original. Ahora bien, si se necesitan 250 ml de un inculo que tenga una concentracin de 1 x 106 (conidias/ml), se sustituyen esos datos en la frmula anterior y se halla el valor del volumen (V1) del inculo original o inicial que se toma para preparar el que ahora se necesita: V1 x 6.25 x 106 = 250 ml x 1 x 106
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Por tanto, V1 = 250 ml x 1 x 106 = 40 ml 6.25 x 106 Tomar entonces 40 ml del inculo inicial y completarlos hasta 250 ml con agua destilada estril para obtener la concentracin final deseada.
Foto 16

Paso 4 Sacar cuidadosamente las plntulas de frijol del pote o matero donde germin su semilla y donde crecieron durante 8 das (tiempo previo a la inoculacin). Evitar que se destruyan las races. Lavar luego las races con agua retirando de ellas todos los restos de arena (Foto 16). Paso 5 Cortar con las tijeras las puntas de las raicillas (Foto 17) para que las heridas sirvan de entrada al hongo y se inicie as la infeccin de la planta. Paso 6 Sumergir, durante 4 minutos, las races recortadas de las plntulas en recipientes (Foto 18) que contengan la suspensin de inculo con la concentracin deseada (1 x 106 conidias/ml).

Foto 17

Foto 18

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Paso 7 Sembrar de nuevo las plntulas en potes individuales que contengan suelo estril, de tal manera que todo el sistema radicular quede cubierto (Foto 19), y regarlas con agua corriente. Colocar luego los potes inoculados en cmara hmeda durante una semana (Foto 20). En la cmara, la temperatura ser de 22 C y la humedad relativa estar entre 90% y 100%. Paso 8 Despus de una semana de incubacin en la cmara hmeda, trasladar los potes a una mesa de invernadero a temperatura ambiente y dejarlos all 15 das ms. El material vegetal presentar, durante ese tiempo, los sntomas tpicos de la enfermedad y podr ser evaluado. Generalmente, la respuesta del germoplasma se registra como susceptible (muerte de la planta) o como resistente (no presenta sntomas). No es comn observar reacciones intermedias.

Foto 19

Foto 20

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F. Conservacin para almacenamiento

Para conservar el hongo F. oxysporum se emplean dos mtodos: la liofilizacin y el papel de filtro impregnado con una suspensin del hongo en solucin de peptonasucrosa.

1. Liofilizacin
Es un mtodo confiable para conservar microorganismos en almacenamiento.

Materiales
Liofilizador con dos tipos de soportes: gradilla y rbol Ampolletas para liofilizar de cristal neutro (neutral glass) de 0.5 ml Pipetas pasteur largas Tijeras y algodn Incremento del hongo, en medio de cultivo PDA Peptona al 10% Sucrosa al 20% (Foto 21)

Foto 21

Nota: Los aislamientos deben prepararse 10 das antes de empezar el proceso de liofilizacin (ver C., 2. Cultivo monosprico). Al iniciar este proceso de almacenamiento deben estar esporulados (con conidias).

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Pasos del proceso

Paso 1 Escribir o marcar en papel filtro la identificacin de los aislamientos que se van a liofilizar. La identificacin incluye el nombre del hongo (gnero y especie), el nombre del aislamiento (cdigo empleado por cada laboratorio) y la fecha en que se almacena el hongo. Esta informacin se escribe con letra pequea en reas reducidas del papel (1 a 2 cm2). Paso 2 Cortar, con una tijera estril, los trozos de papel filtro con la identificacin del hongo e introducir uno en cada ampolleta hasta el fondo. Preparar luego el tapn de algodn con que se tapa la ampolleta, de modo que cubra, ms o menos, los dos tercios superiores de la ampolleta. Extender un trozo de algodn hasta que tenga unos 5 x 3 cm y enrollarlo sobre una pinza (o la parte delgada de un asa), presionando con los dedos hasta formar el tapn sobre ese extremo del asa (Fotos 22, 23 y 24). Dejar un poco de algodn sin enrollar en el lado opuesto del tapn. Introducir el tapn en la ampolleta y retirar la pinza (o el asa) suavemente con una mano, mientras se sostiene el tapn dentro de la ampolleta con la otra.
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Foto 22

Foto 23

Foto 24

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Preparar ampolletas adicionales con sus respectivos tapones para tener ms tapones en caso de que se necesiten. Si un tapn se desintegra al ser manipulado, es necesario remplazarlo con uno que est esterilizado en las ampolletas adicionales.

Paso 3 Llevar este material (ampolletas con sus tapones) al autoclave para esterilizarlo durante 40 minutos. Paso 4 Preparacin de las soluciones de peptona y de sucrosa Se toman 10 g de peptona y se disuelven en 100 ml de agua destilada. Se prepara de igual modo una solucin de sucrosa al 20%, disolviendo 20 g de este producto en 100 ml de agua destilada. Las dos soluciones, que se preparan por separado, se llevan al autoclave. Una vez esterilizadas, se mezclan partes iguales de cada una en un recipiente estril para hacer una solucin homognea de peptona-sucrosa. Paso 5 Con una pipeta pasteur larga, succionar de 2 a 3 ml de la mezcla peptona-sucrosa (ver Paso 4) y depositarlos sobre el cultivo del hongo (Foto 25). Obtener luego un homogenizado con el hongo y la solucin de peptona-sucrosa haciendo primero un raspado del cultivo (micelio y conidias) y luego, mediante succin y expulsin repetidas de la mezcla con la misma pipeta pasteur, lograr el homogenizado.
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Foto 25

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Paso 6 Tomar, con la misma pipeta pasteur, unas gotas (2 a 3 ml) de esa suspensin del hongo (Fotos 26 y 27) y depositarlas en el interior de la ampolleta, haciendo las siguientes operaciones: Tomar con una mano la pipeta pasteur y con la otra la ampolleta con su respectivo tapn (ver Paso 2). Tomar la pipeta pasteur con los dedos ndice y pulgar, y con el meique de la misma mano, sujetar el extremo del tapn de algodn de la ampolleta contra el borde interior de la mano, retirarlo cuidadosamente y mantenerlo firmemente en ese sitio, mientras vierte (desde la pipeta) la suspensin del hongo en el fondo de la ampolleta y sobre el papel filtro que lleva la identificacin del aislamiento. Tapar luego la ampolleta introduciendo suavemente en ella (Foto 28) el tapn que ha estado sostenido entre el meique y la palma de la mano (ver antes).
Foto 26

Foto 27

Si el algodn del tapn entra en contacto con otra superficie o con alguna sustancia, se contamina, por lo que se debe desechar y remplazar con uno de los que se haban preparado (ver Paso 2) para estos casos.
Foto 28

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Paso 7 Cortar, con una tijera flameada, la parte del tapn que qued por fuera de la ampolleta (Foto 29). Introducir finalmente en la ampolleta el resto del tapn de algodn empleando la punta de la tijera, hasta dejar 1 cm entre el borde de la ampolleta y el tapn (Foto 30).
Foto 29

Paso 8 Colocar las ampolletas en una gradilla. Empujar luego el algodn hacia el fondo de cada una hasta que toque el trocito de papel filtro que lleva la identificacin del hongo; para ello se utiliza un objeto alargado (como la parte superior de un asa), el cual se flamea constantemente para evitar que se contaminen los tapones (Foto 31). La parte superior de la ampolleta, que no tiene algodn, se sellar despus del proceso de liofilizacin (Paso 13). Paso 9 Una vez organizadas las ampolletas, llevarlas a un congelador a 0 C durante 15 minutos. Cuando las muestras se hayan congelado, se inicia el proceso de liofilizacin.

Foto 30

Foto 31

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Paso 10 Colocar la gradilla en la campana del liofilizador y encenderlo (Foto 32). El aparato hace descender en su interior la temperatura hasta 55 C e inicia un proceso de secamiento de la muestra porque le extrae el agua mediante una bomba de vaco. Este proceso tarda entre 20 y 22 horas. Paso 11 Al da siguiente, apagar el liofilizador y retirar de l la gradilla con las ampolletas. Preparar luego una pistola de gas propano y proceder al estiramiento de las ampolletas en la parte opuesta a aquella en que est la muestra, es decir, hacer un cuello en cada una ablandando el vidrio con la llama y estirando la ampolleta por sus extremos (Fotos 33 y 34). El procedimiento requiere mucha precaucin para evitar quemaduras en las manos por la llama. El objetivo de este paso es reducir el espacio por donde puede entrar aire (con humedad) a la muestra, antes de sellarla completamente. Paso 12 Una vez estiradas todas las ampolletas, colocarlas en el rbol del liofilizador insertando el extremo abierto de cada una en los soportes del rbol. De esta manera, el extremo que contiene la muestra quedar ms visible (Foto 35). Repetir el proceso de secamiento en el liofilizador durante 1 hora, aproximadamente, para eliminar la humedad que pudo haber llegado a la muestra en el Paso 11.
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Foto 32

Foto 33

Foto 34

Foto 35

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Paso 13 Sin apagar el liofilizador, sellar al vaco las ampolletas, una por una, empleando la pistola de gas propano, derritiendo el vidrio con la llama donde se hizo el cuello o estiramiento (Foto 36). Una vez selladas, finaliza el proceso de liofilizacin. En caso de que se pierda el vaco al estar sellando una ampolleta, retirar esta parte de la ampolleta, remplazarla por una nueva y esperar que el vaco llegue al punto indicado para poder continuar con el sellado de las otras ampolletas. La duracin de una muestra en almacenamiento, conservada mediante el proceso de liofilizacin, no se ha establecido formalmente; sin embargo, en nuestro laboratorio se han recuperado muestras liofilizadas que permanecieron almacenadas durante 30 aos. La liofilizacin de muestras microbiolgicas tiene, no obstante, una desventaja: para recuperar una muestra hay que romper toda la ampolleta y, por consiguiente, es necesario tener varias copias de cada una de las muestras liofilizadas para poder mantener adecuadamente una coleccin.

Foto 36

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2. Conservacin en papel filtro a 20 oC

Este mtodo permite conservar microorganismos durante perodos largos de tiempo.

Materiales
Papel filtro estril, cortado en trozos pequeos Incremento de F. oxysporum Pinzas Cajas petri estriles Agua destilada estril Pipeta Sobres de papel mantequilla

Pasos del proceso

Paso 1 Cortar cuadritos (60-80) de papel filtro de 1 cm2, colocarlos dentro de una caja petri o de un contenedor cerrado y esterilizarlos en autoclave. Paso 2 Colocar 10 cuadritos de papel filtro esterilizado sobre el medio de cultivo PDA en cada caja petri.

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Paso 3 Preparar una suspensin de conidias y micelio de un aislamiento del hongo, de la siguiente manera: Agregar agua destilada estril sobre el aislamiento desarrollado en la caja petri. Raspar luego la superficie del aislamiento con la punta de la pipeta hasta que se logre la suspensin.

Tomar un poco de esa suspensin con la pipeta y colocar una gota en cada cuadrito de papel filtro esterilizado (en las cajas petri del Paso 2). Un paso alterno es colocar sobre cada cuadrito de papel filtro un cuadrito (igual o menor que el anterior) de medio de cultivo PDA en el que est creciendo el hongo que se quiere almacenar (ver C., 2. Cultivo monosprico). Paso 4 Incubar las cajas a 24 C durante 10 das. Paso 5 Pasados los 10 das, retirar los cuadritos de papel filtro de las cajas petri de incubacin con una pinza estril y, cumpliendo todas las condiciones de asepsia, depositarlos en una caja petri estril vaca. Colocarlos invertidos (la cara en que est el hongo hacia abajo) para que no se enrollen al secarse. Secar los cuadritos de papel filtro durante 7 das a 24 C.

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Paso 6 Pasar los cuadritos secos (con una pinza flameada) a bolsitas de papel mantequilla estril, las cuales se introducen, a su vez, en otra bolsa ms grande del mismo material (o en una cajilla adecuada), para almacenarlos (ver Fotos 40 y 41). Esta ltima bolsa, en la que se coloca toda la informacin referente al hongo F. oxysporum, se almacena a 20 C.

3. Conservacin como suspensin en solucin de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 oC

La conservacin de un patgeno suspendido en solucin de peptona-sucrosa (o peptona-dextrosa) que se deposita en papel filtro es, despus de la liofilizacin, uno de los mtodos ms efectivos para almacenarlo.

Materiales
Peptona al 10% Sucrosa al 20% Cajas petri Pipetas Soluciones de peptona y de sucrosa (se preparan como en el Paso 4 del proceso de liofilizacin) Pinza Esptula Cuadritos de papel filtro de 0.5 cm2

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Pasos del proceso

Paso 1 Cortar varios cuadritos de papel filtro de 0.5 cm2 y esterilizarlos en autoclave dentro de un recipiente cerrado.
Foto 37

Paso 2 Tomar una caja petri que contenga un aislamiento esporulado del hongo y agregarle 2 ml de la solucin de peptona-sucrosa (Foto 37). Paso 3 Raspar con una esptula estril, o con la misma pipeta con que se agrego la solucin, la superficie del aislamiento contenido en la caja petri para desprender las conidias del hongo. De este modo se obtiene una suspensin de conidias.

Foto 38

Paso 4 Depositar con pinza estril 20 cuadritos de papel filtro en la caja petri del paso anterior e impregnarlos con la suspensin del hongo en la solucin de peptona-sucrosa (Foto 38). Paso 5 Retirar los cuadritos de papel filtro de esa caja petri con una pinza estril y colocarlos en una caja petri estril que tenga papel filtro en el fondo, para que se sequen durante 7 das a 24 C (Foto 39).

Foto 39

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Paso 6 Transcurrido ese tiempo, guardar los cuadritos de papel en sobres estriles de papel mantequilla (Foto 40) para almacenarlos a 20 C, escribiendo en ellos los datos que identifiquen el aislamiento del hongo: nombre del aislamiento, lugar de procedencia y fecha de almacenamiento (Foto 41). Colocar correctamente los sobres en el congelador.

Foto 40

G. Prueba de almacenamiento
Esta prueba es la forma clara, prctica y confiable de garantizar que el hongo secado por 7 das est libre de contaminantes, viable y que pueda ser almacenado.

Pasos del proceso

Paso 1 Tomar uno de los cuadritos de papel filtro que haba sido impregnado con la suspensin del hongo y que fue secado por 7 das a 24 C. Paso 2 Sembrar el cuadrito en un nuevo medio de cultivo PDA. Despus de 5 das, el patgeno debe haber crecido en este medio de cultivo (Foto 42).

Foto 41

Foto 42

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Paso 3 Observar el crecimiento del hongo en el estereoscopio. Si presenta agentes contaminantes, como otros hongos o bacterias, tanto la muestra observada como los dems cuadritos de papel filtro debern desecharse, y se repetir entonces el proceso de conservacin.

H. Recuperacin del hongo almacenado

1. Liofilizado en ampolletas Materiales
Ampolletas con el hongo liofilizado Solucin de peptona al 10% Solucin de sucrosa al 20% Cajas petri con medio de cultivo PDA Pipeta con chupo Mazo de mortero Servilleta estril Pinza (Foto 43)

Foto 43

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Paso 1 Romper la ampolleta que contiene el hongo golpendola con un mazo (Foto 44) por el extremo opuesto a aqul en que est el hongo liofilizado (la servilleta sirve para amortiguar el golpe y la rotura del vidrio). Retirar con la pinza el algodn que est dentro de la ampolleta (Foto 45). Paso 2 Depositar con la pipeta, en la mitad abierta de la ampolleta, cuatro gotas de la solucin de peptonasucrosa. Las clulas liofilizadas del hongo quedan as suspendidas en la solucin y pueden retirarse de la ampolleta (Foto 46). Paso 3 Sembrar la suspensin de conidias del hongo tomada de la ampolleta en una caja petri que contenga el medio de cultivo PDA, para reiniciar el proceso de crecimiento del microorganismo (Foto 47).

Foto 44

Foto 45

Foto 46

Foto 47

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2. Conservado en papel filtro a 20 oC Pasos del proceso

Paso 1 Trasladar, con una pinza estril, uno de los cuadritos de papel filtro con el hongo que haban sido almacenados en bolsitas a 20 C (ver F., 2. Conservacin en, Paso 6) a una caja petri (Foto 48) que contenga el medio de cultivo PDA.
Foto 48

Paso 2 Depositar 1 o 2 gotas de la solucin de peptonasucrosa en los cuadritos de papel filtro que contienen el hongo; as se hidrata el hongo y podr ser esparcido sobre toda la superficie del medio (Foto 49), usando la punta de la pipeta. De esta manera se aumenta el campo de crecimiento del hongo. Paso 3 Incubar las cajas petri del paso anterior a 24 C. El desarrollo del hongo se reactivar y despus de 12 das estar listo para ser usado en los procesos que se realizarn ms adelante.

Foto 49

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Gua Prctica 4: Fusarium oxysporum Enfermedad: Amarillamiento por Fusarium

3. Conservado a 20 oC en papel filtro de suspensin en peptona-sucrosa Pasos del proceso

Paso 1 Sacar de los sobres de papel mantequilla (ver F., 3. Conservacin como, Paso 6, Foto 41) 2 o 3 cuadritos de papel filtro que contienen el hongo almacenado en suspensin de peptonasucrosa, y sembrarlos en el medio de cultivo PDA contenido en cajas petri. Paso 2 Incubar las cajas petri del paso anterior a 24 C. Despus de 2 o 3 das, el hongo habr reiniciado su crecimiento y estar listo para ser incrementado.

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