Diagnstico de laboratorio de infeccin por el VIH

Esther Cristina Barros Lian Grupo de Virologa

Subdireccin Red Nacional de Laboratorios Instituto Nacional de Salud

Infeccin por el Virus del VIH

En Colombia la prevalencia estimada es de 0,67% (VI Estudio centinela 171.504 El mayor riesgo para adquirir la infeccin continua siendo el contacto sexual sin proteccin.

UNAIDS.AIDS epidemic update 2007 Plan nacional de respuesta ante el VIH y el SIDA 2008-2011-MPS

www.nlm.nih.gov

Diagnstico de infection por el VIH

El diagnostico se hace generalmente por pruebas serolgicas (deteccin de anticuerpos)

www.geocities.com

Clasificacin de pruebas serolgicas

Tamizaje: proporcionan identificacin presuntiva.

una

Confirmatorias: usadas para confirmar si las muestras con resultados reactivos en las pruebas de tamizaje tienen anticuerpos especficos al VIH.

bp.blogspot.com/.../antigeno-anticuerpo.g

Pruebas de tamizaje: Elisa.

1. Generacin: Primeros ensayos usaban lisados de VIH1 purificado, a menudo les faltaba sensibilidad y especificidad. 2. Generacin: Ensayos mejorados basados en protenas recombinantes y/o los pptidos sintticos, que permitieron la produccin combinada de VIH 1 y 2. 3. Generacin: Pptidos recombinantes/sintticos de VIH-1 y VIH-2, ensayos tipo sndwich, usan un antgeno marcado como conjugado, muy sensibles. 4. Generacin: Pptidos recombinantes/sintticos de VIH-1 y VIH-2 y VIH-1 "O" y anticuerpos para detectar el antgeno p24, detectan tempranamente seroconversin reduciendo el perodo de ventana. Deben tener una sensibilidad de por lo menos el 99% y una especificidad de por lo menos el 98%.

WHO (2004): HIV Assays: Operational characteristics

Pruebas de tamizaje
Colorimetra Fluorescencia Quimioluminescencia Electroquimioluminiscencia Estrategia

Pruebas rpidas
Pruebas sencillas, no requieren instrumentos o equipos. Diferentes principios: aglutinacin, inmunofiltracin, inmunocromatografia. Presentacin: en forma tiras, tarjetas o cassettes. Se realizan en mximo 20 minutos. Lectura visual tiles en laboratorios que no tienen la complejidad para realizar rutinariamente pruebas de Elisa, Gestante en trabajo de parto sin tamizaje previo (Guia para el manejo de VIH/Sida Dec 3442/ 2006.) Deben tener una sensibilidad igual o superior al 99% y una especificidad cercana o superior al 98% (Guia para el manejo de VIH/Sida Dec 3442/ 2006.)

Presentaciones pruebas rpidas

HIV ASSAYS:OPERATIONAL CHARACTERISTICS.OMS

www.medmira.com

Pruebas confirmatorias
Se realizan cuando existen dos pruebas de tamizaje previas con resultado reactivos. Confirma la presencia de anticuerpos especficos. Escasa probabilidad de resultados falsos positivos. Pruebas confirmatorias recomendadas en el pas de acuerdo a la Guia de atencin en VIH (decreto 3442/2006).: Western Blott. EN LA ESTRATEGIA: utiliza como prueba confirmatoria HIV blot 2.2, determina anticuerpos al VIH-1 y VIH-2.

Tipos de pruebas confirmatorias

Western Blot: inmunoelectrotransferencia de lisado viral.

Tipos de pruebas confirmatorias

LIA y RIBA: ensayos que utilizan antgenos recombinantes y/o pptidos sintticos seleccionados.

Enferm Infecc microbiol clin 2007;25(10)632-8

Se deben tener en cuenta los criterios de interpretacin establecidos por cada Casa comercial

Problemas en las pruebas de tamizaje y confirmacin

Falsos Negativos: Periodo de ventana inmunologica estadios finales de la infeccion. y

Falsos positivos: autoanticuerpos, multitransfundidos, transplantados y enfermedades autoinmunes, tcnica utilizada. Indeterminados.

Enferm Infecc microbiol clin 2007;25(10)632-8

Resultados indeterminados

Clin.Vaccine Immunol 2007, Vol 14 p. 649-659

Resultados indeterminados y embarazo

El embarazo puede considerarse un factor de riesgo para resultados indetermininados.

Las embarazadas pueden desarrollar autoanticuerpos a proteinas celulares que comigran con proteinas del VIH-1 en el WB.

BJID 2005; 9

Recomendaciones: Recoleccin, conservacin y transporte de muestras para pruebas Serolgicas

Recolectar suero o plasma por venopuncion. Tubos de muestras debidamente rotulados. Mientras se procesa o enva la muestra debe estar refrigerada de 2-8 C (max 5 das) o congelada a -20C si el tiempo de conservacion es mayor. Evitar ciclos repetidos de congelacin descongelacin En lo posible no procesar muestras hemolizadas o hiperlipemicas. En caso de tener que transportar las muestras, este debe realizarse de acuerdo a los estndares internacionales de triple embalaje y a una temperatura estable.

CARGA VIRAL
Medicin de la cantidad de copias del genoma del virus de VIH que se encuentran circulando en sangre y en otros fluidos biolgicos mediante la amplificacin in vitro del material gentico viral (ARN).

Carga viral
Evaluacin y seguimiento de pacientes infectados con el virus. Junto con el recuento de CD4 constituye un marcador pronstico de la infeccin. Determinar inicio de la terapia antiretroviral. Evaluacin de la eficacia de ARV. Toma de decisiones frente al tratamiento. Diagnostico inicial en recin nacidos.

Principios de los ensayos de carga viral disponibles

Amplificacin de ADN por RT-PCR: utiliza unaenzima para multiplicar al VIH de la muestra. Una reaccin qumica marca al virus y son medidos para calcular cantidad virus.

Amplificacin de seales bDNA (branched ADN): Combina la muestra con un material que emite luz. Se mide la cantidad de luz y se calcula la cantidad virus. Mide el RNA directamente.

Amplificacin de secuencias de ARN: se fundamenta en la amplificacin por la transcripcin (viriones) y una deteccin basada en el mtodo de electroquimioluminiscencia para producir un conteo.

Abbott Tiempo Real Tecnologia Tiempo Real PCR Limite de cuantificion Region blanco 40 copias pol/integrasa

Roche Cobas TaqMan Tiempo Real PCR 48 copias gag

Roche Cobas Amplicor Punto final PCR 50 copias / 400 copias gag

Siemens Versant Branched DNA 75 copias integrasa

Biomerieux NucliSense NASBA 176 copias 40 copias gag

Fuente: insertos de las tecnica, www.plosmedicine.org/2006

Tipo de prueba a usar da conteos de carga viral DIFERENTES. Las cifras no son estrictamente Comparables. Debera hacerse siempre el mismo tipo de anlisis para monitorear la carga viral.

Carga Viral
El resultado se expresan en forma logartmica decimal y en nmeros enteros (En numero de copias de ARN/ ml de muestra. Forma Logartmica valora mejor efecto del tratamiento. El informe del numero de copias interpreta e informa teniendo en cuenta el limite de cuantificacion de la tecnica. Copias/ml Logaritmo Base 10 1 2 3 4 5 6

10 100 1000 10000 100000 1000000

Recoleccin de muestra para carga viral.

Tubo tapa perla de plstico (plasma) por venopuncion Conserve la muestra refrigerada hasta 5 dias. Por tiempos de conservacion mayores a 5 dias congele de -20 a -70C. Evite muchos ciclos de congelacin y descongelacin. Si requiere transportar las muestras: Sistema de Triple embalaje

Recuento de Linfocitos
Permite conocer el nmero absoluto de subpoblaciones de linfocitos T por mL de sangre perifrica : CD4 positivos CD8 positivos Numero total de linfocitos T(CD3 positivos) Se utiliza la tcnica de citometria de flujo.

Recoleccin de muestra para recuento de linfocitos

Recolectar en tubo tapa lila con EDTA venopuncion La muestra debe ambiente 18-25 C permanecer a por

tempuratura

Se debe procesar entre las 24 y 48 (Maximo) una vez recolectada la muestra. Evitar los cambios bruscos de temperatura.

(CDC Guidelines, 2003)

Aplicaciones Clnicas

El recuento absoluto de linfocitos CD4 y CD8 es importante para el estudio del estado del sistema inmunolgico de pacientes infectados con el virus del VIH. La reduccin progresiva de Linfocitos T CD4+ est altamente asociada con la severidad del VIH y un pronstico desfavorable.

Estrategas de diagnstico de VIH

OMS ONUSIDA

Estrategas de diagnstico de VIH, OMS ONUSIDA

Estrategia 1

Vigilancia Seguridad transfusin/transplante

T11 T1 Reportar Negativo3

T1+ Considerar Positivo2

1 2

Test T1, T2, T3 representan 3 tests diferentes. Como resultado no es adecuado para propsitos de diagnstico; usar las estrategias 2 o 3. Cualquiera que sea el diagnstico final, las donaciones que sean inicialmente reactivas no deben ser usadas para transfusiones o transplantes. 3 Reporte: el resultado puede reportarse.

Estrategas de diagnstico de VIH, OMS ONUSIDA

Estrategia 2 Vigilancia Diagnstico T1+

T11 T1 Reportar Negativo3

T21 T1+ T2+ Reportar Positivo4 T1+ T2

Repertir T1 y T2 T1+ T2+ Reportar Positivo4 T1+ T2 Considerar Indeterminado5 T1 T2 Reportar Negativo3

1 3 4

Test T1, T2, T3 representan 3 tests diferentes. Reporte: el resultado puede reportarse. Para individuos con primer diagnstico, un resultado positivo debe ser confirmado en una segunda muestra. La prueba debe ser repetida en una segunda muestra tomada despus de 14 das.

Estrategas de diagnstico de VIH, OMS ONUSIDA T11 T1+ Estrategia 3 Diagnstico T1+ T2+ T1+ T2 Repetir T1 y T2 T1+ T2+ T31 T1+ T2+ T3+ Reportar Positivo4 T1+ T2+ T3 T1+ T2 T3+ Considerar Indeterminado5 T1+ T2 T1 T2 Reportar Negativo3 T21 T1 Reportar Negativo3

T1+ T2 T3

Alto riesgo Considerar Indeterminado5

Bajo riesgo Considerar Negativo6

1 3 4 5 6

Test T1, T2, T3 representan 3 tests diferentes. Reporte: el resultado puede reportarse. Para individuos ______, un resultado positivo debe ser confirmado en una segunda muestra. La prueba debe ser repetida en una segunda muestra tomada despus de 14 das. El resultado es considerado negativo en la ausencia de cualquier riesgo de infeccin con VIH.

Flujograma para el diagnstico de VIH

Decreto 3442 de 2006

Flujograma diagnostico Gua para el manejo de VIH/SIDA- 22/09/06

Algoritmo Diagnostico Gestantes

Algoritmo Diagnostico Gestantes

Emisin de resultados
Al emitir un resultado este debe contar como minimo con datos como: Datos del paciente: Nombre ( la sugerencia es que se debe informa tal como aparece en el tubo con la muestra, Numero de Identificacin de la muestra Cdigo de la muestra. Fecha resultado Tcnica utilizada Lote del reactivo Interpretacin del resultado de acuerdo a la prueba realizada. Responsable de la prueba.

Para recordar
Elisas: Informa puntos de corte y absorbancias de la muestra. Western Blot: informar la bandas presentes y la interpretacin del resultado. Carga viral: informar en numero de copias de ARN/ml y el logaritmo correspondiente. Recuento de linfocitos: Informar el conteo total de CD3, CD4, CD8 y la relacin CD4/CD8

Reportes..

Reportes..

Cuntos nios ms deben nacer con SIDA ?

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