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Funcionalidad de las clulas Activacin Proliferacin Funcin efectora Sntesis de sustancias inmunoreguladoras (citoquinas) Expresin de Receptores Apoptosis Deteccin de tipos celulares Caracterizacin fenotpica Evaluacin nmero total de linfocitos Relaciones LT/LB, LT CD4+/ CD8+
In vitro
Activacin de Linfocitos por Mitgenos o Ag Cultivo Mixto Linfocitario (CML) Citotoxicidad Mediada por Clulas (CMC) Produccin de citoquinas, Acs (para LB) Muerte celular - Apoptosis
In vivo
Proliferacin Apoptosis Citotoxicidad
Activacin celular:
Medicin de citoquinas: ELISA, RIA ELISPOT Inmunofluorescencia Citometra de flujo
(Clulas en suspensin)
Microscopa
(cortes de tejidos, clulas adheridas a un soporte)
Proliferacin celular:
In vitro
Incorporacin de 3H-Timidina Incorporacin de Bromo-deoxiuridina CFDA-SE
In vivo
Apoptosis:
Anexina-V / PI
Tunel Hipodiploida Fragmentacin de ADN Tincin con Bromuro de etidio y Naranja de acridina dosaje biolgico de TNF- Vas de activacin de caspasas
CFDA-SE
enriquecimiento
purificacin
clulas mononucleares
Sangre perifrica
LT (80%) LB (10%) NK (10%)
Bazo
LT (50%) LB (40%) NK (10%)
Ganglios
LT (70%) LB (30%)
Separacin de clulas
Gradiente de Ficoll-Hypaque
A partir de stas fracciones se puede: Plasma
Desplaquetizar Separar clulas por adherencia (y diferenciar los monocitos a macrfagos) Separar clulas por gradiente de Percoll
Separacin de clulas
Gradiente de Percoll
Centrifugacin
Permite separar los linfocitos de los monocitos del halo del Ficoll (doble purificacin) pellet: linfocitos Halo de monocitos Accesibles en costo Simples
Separacin de clulas
LB
Adhesin de LB y macrfagos
MO MO
LT eluyen
LT LT
Separacin de clulas
MARCADOR
CD3 CD3 CD4 CD3 CD8 IgM de superficie CD19 CD21 CD16 CD14
Complemento
Y Y
Deplecin de la poblacin
Separacin de clulas
Y Y
Y Y Y
Tcnicas inmunomagnticas
SELECCIN NEGATIVA
SELECCIN POSITIVA
Separacin de clulas
Proliferacin celular
Activacin antgeno especfica: se utilizan antgenos o mezclas de antgenos respecto a los cuales se quiere ver la proliferacin.
Proliferacin celular
Ensayo y controles
Estimulacin con mitgeno para evaluar proliferacin de LT y LB. Clulas sin estimular Clulas estimuladas con mitgeno Proliferacin linfocitaria antgeno especfica. Clulas sin estimular Clulas estimuladas con antgeno. Clulas estimuladas con mitgeno.
Hubo proliferacin?
Proliferacin celular
Incorporacin de 3H-Timidina
3H-timidina
El ADN se transfiere a una membrana
Se miden las cuentas por minuto (3H) en cada muestra en un contador de centelleo
Proliferacin celular
Incorporacin de 3H-Timidina
70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4
Cintica de proliferacin
cpm x 10-3
CPM (x10-3)
50
25
0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
Proliferacin celular
La incorporacin de BrdU a las clulas se puede detectar utilizando un anticuerpo monoclonal anti-BrdU marcado con: - Una enzima (ej peroxidasa) - Un Fluorocromo (FITC) ELISA Citometra de Flujo
Proliferacin celular
Lisis y desnaturalizacin
Proliferacin celular
Proliferacin celular
Reacciona con las protenas formando uniones covalentes estables Atraviesa las membranas celulares con ms dificultad. Fluorescente
Proliferacin celular
- Proliferacin in vitro - Estudio de variaciones en la poblacin segn el nmero de divisiones experimentadas: Expresin de citoquinas Diferenciacin celular (ej: marcadores de clulas de memoria)
Proliferacin celular
CFDA-SE
Proliferacin
Linfocitos
Linfocitos inyeccin endovenosa a un animal o Estimulacin in vitro A medida que proliferan el CFSE se va diluyendo, generacin a generacin. Disminuye la intensidad de Fluoresencia detectada
Proliferacin celular
autofluorescencia
Clulas proliferando
Aumenta el nmero de divisiones celulares Proliferacin celular Disminuye la intensidad de fluorescencia
Clulas estimuladoras
5 a 7 das Ag: CMH alogeneico de CPA y LB Proliferacin por reconocimiento principalmente del CMH II UNIDIRECCIONAL: clulas estimuladoras tratadas con mitomicina C o irradiadas BIDIRECCIONAL Proliferacin celular
Microscopa
(cortes de tejidos, clulas adheridas a un soporte)
PCR
Se sensibilizan placas de microtitulacin con fondo de nitrocelulosa horneada con el anticuerpo anti-citoquina de inters Se cultivan las clulas productoras de citoquinas en presencia de estmulos. Las citoquinas secretadas se unen a los anticuerpos unidos a la placa. Se lisan las clulas. Se incuba con otro anticuerpo anti-citoquina de inters biotinilado. Se incuba con la enzima unida a avidina Se revela con el sustrato de la enzima que genera un precipitado (spot), cada spot indicara el sitio que ubicaba una clula productora de citoquinas (Unidad productora de citoquinas)
ELISPOT
Mtodo rpido Mantiene integridad del RNA Prevenir contaminacin con RNAsas
Transcriptasa reversa
Transcripcin reversa
Primers (oligo-dT, primers diseados al azar, primers especficos para un gen) dNTPs
cDNA
citoquina
Expresin relativa
(densitometra)
citoquina
curva de melting
Real time PCR usando sondas TaqMan Sondas de hidrlisis Emiten fluorescencia cuando la actividad exonucleasa 5-3 de la TaqPol hidroliza la sonda El reporter se separa del quencher La sonda est fosforilada en 3, no puede ser extendida por TaqPol Se mide fluorescencia al final de la extensin Las sondas se van consumiendo, y la fluorescencia aumentando No hay curva de melting
No se distingue entre cDNA y DNA genmico hay que correr un gel de agarosa
Se grafica, nmero de ciclos versis log de la cantidad de DNA inicial y se obtiene una linea recta. Puede obtenerse una curva de calibracin utilizando cantidades conocidas de cDNA.