Doutorado Giselle Oliveira Seixas

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO
Caracterizao da frao p25 secretada pelo endotlio corneano e avaliao de sua utilidade clnica
Giselle Oliveira Seixas
Ribeiro Preto 2011
UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO
Caracterizao da frao p25 secretada pelo endotlio corneano e avaliao de sua utilidade clnica
Tese apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo - Ribeiro Preto como parte das exigncias para obteno do Ttulo de doutor em Cincias Mdicas. rea de concentrao: Mecanismos Fisiopatolgicos no Sistema Visual.
Orientador: Prof. Dr. Sidney Julio de Faria e Sousa
Ribeiro Preto 2011
Ficha Catalogrfica
Seixas, Giselle Oliveira Caracterizao da frao p25 secretada pelo endotlio corneano e avaliao de sua utilidade clnica / Giselle Oliveira Seixas Ribeiro Preto, 2011. Tese (doutorado) Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo Campus Ribeiro Preto Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabea e Pescoo. rea de concentrao: Mecanismos Fisiopatolgicos no Sistema Visual. Orientador: Sidney Julio de Faria e Sousa 1. transplante de crnea/ indicao; 2. crnea/ rejeio do enxerto; 3. crnea/ endotlio; 4. crnea/ secreo de protenas; 5. frao p25; 6. caracterizao da p25/ PGD2 sintase; 7. caracterizao p25/ cristalina B2; 8. western blot/ PGD2 sintase; USP/ FMRP nnn/11
Dedicatria
Dedico esta tese de doutorado ao meu grande amor, meu marido Alexandre, que com pacincia tem me acompanhado, amparado e me incentivado sempre. E a nossos filhos, Ana Laura e Pedro, que so motivo mais do que suficiente para querer continuar a lutar.
Agradecimentos
Obrigada pelo apoio e amor incondicional do meu pai Wilson e da minha me Pedrina, a quem sempre admirei como pessoas, pais e profissionais. A meu irmo Wilson Junior, que mesmo distncia est sempre presente e sempre disposto a me dar apoio e fora. A meus pais do corao Vicente e Anna Lcia pelo apoio e amor. Obrigada ao meu orientador Prof. Dr. Sidney pela confiana e orientao ao longo de todos estes anos. Ao Prof. Dr. Antnio Haddad que me ofereceu espao fsico e ajuda sempre que precisei. Ao Prof. Dr. Jorge Cury que compartilhou muitas vezes o laboratrio e aparelhos. Vani que me acolheu com carinho e presteza em seu laboratrio. Obrigada aos tcnicos Domingos, Cludia, Izilda, Tuca, Mara e Tereza. Obrigada aos secretrios da oftalmologia, Rogrio, Rita, Amlia e Ceclia. Um obrigado especial Carolina Mdulo (Carolzinha) que tantas vezes me salvou de apuros. Obrigada a todos os outros que me ajudaram na concluso desta tese.
Temos uma nica vida a ser vivida, mas, muitos so os desafios, muitos so os caminhos e muitas so as pessoas, que esto nesta estrada. Espero que sempre sejamos iluminados e tenhamos a sabedoria para escolher os melhores caminhos e muita fora para ir at o fim... Assim foi com esta tese e assim espero que seja com todos os outros desafios.
RESUMO
Seixas, G.O. Caracterizao da frao p25 secretada pelo endotlio corneano e avaliao de sua utilidade clnica. Ribeiro Preto, 2011. Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo. Objetivos: Caracterizar a frao p25 secretada pelo endotlio corneano de coelho, determinar se o endotlio corneano humano a produz e, se a produzir, caracteriz-la. Determinar se a p25 pode ser usada como marcador de susceptibilidade rejeio do transplante de crnea e descrever a modulao da p25 pelo uso de corticide subconjuntival em coelhos. Material e mtodos: Foram utilizadas 26 crneas de coelhos tratados com corticide, 20 de coelhos no tratados e 12 de humanos. Realizadas coletas de amostras de sangue de 30 pacientes submetidos a transplante de crnea, com ou sem rejeio, e de 6 pacientes para o grupo controle no transplantado. A caracterizao da p25 de crnea de coelho foi realizada utilizando-se o mtodo de SDS-PAGE - MALDI-TOF. A secreo da p25 de endotlios humanos foi avaliada por fluorografia e posteriormente caracterizada pelo mtodo de SDS-PAGE - MALDI-TOF. Para testar o sangue de pacientes transplantados e controles foi utilizado o western blot. As tcnicas de RT-PCR e de fluorografia foram usadas para avaliar a modulao da p25 de crneas de coelho. Resultados: A p25 do coelho foi caracterizada como sendo a sintase de prostaglandina D2 (PGDS). A p25 secretada pelo endotlio da crnea humana e foi caracterizada como a protena cristalina B2. Nos western blots de pacientes sem transplantes no foi observada marcao na regio da p25, naqueles de pacientes com transplante de crnea houve marcao em alguns exames. Na fluorografia das crneas de coelhos tratados com corticide, este modulou algumas fraes de protenas de baixo peso molecular secretadas. O mtodo do RT-PCR mostrou que a PGDS estava presente tanto nas crneas de coelhos tratados como dos no tratados. Concluses: A frao p25 da crnea de coelhos foi caracterizada como PGDS. Em humanos ocorre a secreo da frao p25 pelo endotlio corneano que a protena cristalina B2. A p25, neste estudo, no foi adequada para determinar ou para prever a ocorrncia de rejeio de transplante de crnea. Foi possvel avaliar que no h modulao negativa da p25 pelo uso de corticide.
ABSTRACT
Seixas, G.O. Characterization of the P25 fraction secreted by the corneal endothelial cells and evaluate its usefulness in clinical practice. Ribeiro Preto, 2011. Tese (Doutorado) School of Medicine of Ribeiro Preto, University of So Paulo. Purposes: Identify the p25 fraction secreted by the corneal endothelium of albino rabbits. Test to verify if the human corneal endothelium does produce it and if so to identify it. Test the p25 fraction as a way to predict or to identify patients that are susceptible for corneal transplant rejection. Describe the p25 modulation using subconjunctival corticosteroids in rabbits. Methods: rabbit corneas p25 were identified by means of the SDS-PAGE MALDI-TOF method. Human corneas were used for fluorography and afterwards the SDS-PAGE MALDI-TOF. Western blot to test patients that underwent corneal graft transplants and the ones who did not. Fluorography and RT-PCR were used to evaluate corticosteroid modulation of the p25 fraction. Results: The rabbits p25 is the prostaglandin D synthase. There is a p25 secreted by the human corneal endothelium, which is the B2 crystallin protein. Western blot of control patients did not have any correlation at the low molecular weight proteins site (as p25) the patients that had rejection had. Fluorography of rabbits treated with corticoids had some low weight proteins secreted that were different from the ones that the controls had. RT-PCR showed that the PGDS was present in both treated and control rabbits. Conclusions: Rabbits p25 protein is PGDS. In humans the p25 fraction is secreted by the corneal endothelium and is the crystallin B2. The p25 was not able to help determining when someone was to have rejection or already had it. It was possible to evaluate that the corticoids do not down regulate the PGDS.
ABREVIATURAS
AE CC CH Ci EDTA
atividade especfica; crnea de coelho crnea humana Curier cido etileno diamino tetractico (sal de sdio dihidratado) quilobase meio miliamperagem matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry micrograma microlitro mililitro nanmetro milimolar milimol polymerase chain reaction (reao de cadeia de polimerase) sintase de prostaglandina D2 peso molecular protena
Kb M mA MALDI TOF
g L mL nm mM mmol PCR
PGD2S PM Ptn
RT SA SDS SDSPAGE T TBq Temed N,N,N,N Tris tris (hidroximetil) V W
Reverse Transcription (Transcrio Reversa) soluo de amostra dodecil sulfato de sdio eletroforese em gel de poliacrilamida com uso de SDS tecido terabequerel Tetrametiletilenodiamina. aminometano volts Watts
SUMRIO
1. INTRODUO ...................................................................................................... 12 2. OBJETIVOS.......................................................................................................... 19 3. MATERIAL E MTODOS ..................................................................................... 21 3.1 Obteno das crneas de coelho ................................................................ 22 3.2 Obteno das crneas humanas ................................................................. 22 3.3 Caracterizao da frao p25 ...................................................................... 23 3.4 Secreo da frao p25 pelo endotlio humano.......................................... 23 3.4.1 Obteno dos endotlios.................................................................. 23 3.4.2 Cultura endotelial ............................................................................. 23 3.4.3 Processamento dos meios de cultura .............................................. 24 3.4.4 Liofilizao........................................................................................ 25 3.4.5 Processamento bioqumico das crneas.......................................... 25 3.4.6 Dosagem de protenas dos tecidos e meios .................................... 25 3.4.7 Eletroforese ...................................................................................... 26 3.4.8 Fluorografia ...................................................................................... 27 3.5 Marcador de rejeio endotelial ................................................................... 27 3.5.1 Obteno de sangue humano .......................................................... 27 3.5.2 Western Blot..................................................................................... 28 3.5.2.1 Eletroforese do meio de cultura de crnea de coelho.............. 28 3.5.2.2 Transferncia das protenas para uma membrana de nitrocelulose (NC) ................................................................................ 28 3.5.2.3 Reao com a membrana de nitrocelulose (Western Blot) ...... 29 3.6 Avaliao da modulao da frao p25 pelo corticide ............................... 29 3.6.1 Fluorografia ...................................................................................... 29 3.6.2 PCR.................................................................................................. 30 3.6.2.1 Transcrio reversa do mRNA da crnea para cDNA ............. 31 3.6.2.2.Teste de presena do cDNA da PGDS por meio da PCR........ 31 4. RESULTADOS...................................................................................................... 33 4.1 Caracterizao da p25 de coelhos............................................................... 34 4.2 Secreo da frao p25 pelo endotlio humano.......................................... 34 4.2.1 Fotografias dos gis de eletroforese ................................................ 34
4.3 Fluorografias ................................................................................................ 35 4.3.1 Fluorografias de crnea humana e de coelho para comparao. .... 35 4.3.2 Fluorografia de crnea humana para evidenciar a p25. ................... 36 4.4 Caracterizao da p25 humana ................................................................... 36 4.5 Marcador de rejeio endotelial - Western Blot ........................................... 37 4.5.1 Western Blot mostrando membranas de soros de pacientes normais ..................................................................................................... 37 4.5.2 Western Blot mostrando membranas de soros de pacientes com histria de rejeio. ................................................................................... 38 4.5.3 Western Blot mostrando membranas de soros de pacientes sem histria de rejeio. ................................................................................... 39 4.6 Avaliao da modulao da frao p25 pelo corticide ............................... 40 4.6.1 Fluorografia de crneas de coelho controle e tratadas com corticide................................................................................................... 40 4.6.2 Teste de presena da PGD2S por meio da PCR.............................. 41 5. DISCUSSO ......................................................................................................... 42 6. CONCLUSES ..................................................................................................... 50 7. REFERNCIAS..................................................................................................... 52 APNDICE................................................................................................................ 58 ANEXOS ................................................................................................................... 64 ANEXO DE PUBLICAO....................................................................................... 69
1. INTRODUO
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O transplante de crnea proporciona a recuperao visual, de forma eficiente e a baixo custo, de pessoas cujos olhos apresentem distrbios da transparncia e da regularidade ptica da crnea (SUTPHIN, 1999). Ele tambm auxilia no alvio da dor provocada pelo edema crnico dessa estrutura. Mas, como em qualquer transplante, tem a potencialidade de transmitir doenas devastadoras como a SIDA, a Hepatite, a Raiva e a enfermidade de Creutzfeldt-Jakob (BELFORT JR e KARA-JOS, 1997, LOTTENBERG e BELFORT JR, 1997: 463-469, SILVA, FARIA E SOUSA e FERRANTE, 2006). Outro problema que, na maioria dos casos, o candidato cirurgia no cego, na concepo real de cegueira. Pode estar incapacitado para o trabalho, para o estudo, mas no para a deambulao ou para as atividades corriqueiras da vida. Se o transplante falhar, h chances da perda completa da viso e do surgimento de dor e irritao crnica provocados pelo edema de crnea, pelo glaucoma ou por ambos. Acresa a isso, o fato das indicaes de transplantes de crnea ainda no estarem devidamente sistematizadas (SILVA, FARIA E SOUSA e FERRANTE, 2006). Nos transplantes de rgos como os de rim, pulmo e corao esse problema no tende a ser to relevante, uma vez que a indicao cirrgica habitualmente feita como ltimo recurso de preservao da vida. Se o enxerto durar pouco, ganhou-se tempo; se falhou, foi tentativa vlida extrema. Por causa dessas singularidades, a responsabilidade tanto da indicao cirrgica quanto do controle de qualidade do tecido doado so particularmente crticos no transplante de crnea (SILVA, FARIA E SOUSA e FERRANTE, 2006). A seleo do tecido doador se assenta em trs conceitos: inocuidade, transparncia e vitalidade. Inocuidade a propriedade que enxerto deve ter de no
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causar mal ao receptor. Ela se baseia no principio hipocrtico do primo non nocere. A preocupao que a crnea no transmita doenas oculares ou sistmicas. A transparncia da crnea testada no globo ocular ntegro, ainda dentro da cmara mida, com o auxilio de uma lmpada de fenda, com aumento de 10 vezes. A Figura 1 mostra um suporte, para prender a cmara mida Lmpada de Fenda.
Figura 1. Fotografia ilustrando brao do suporte acoplado lmpada de fenda que fixa o recipiente da cmara mida para realizar exame da crnea antes de sua preservao em Optisol-GS.
Vitalidade a propriedade da crnea permanecer desidratada e transparente no leito hospedeiro. Como isso depende essencialmente da sade do endotlio, o ideal que ela fosse avaliada por meio de algum teste de funcionalidade endotelial (KAUFMAN, 1999, VILA, HASANY, PARKER et al., 1996, WALKENBACH, BONEY e YE, 1992, WILSON e BOURNE, 1989). Como na prtica esse teste ainda no existe, a alternativa analisar a morfologia do endotlio e conjecturar sobre seu funcionamento. A anlise da morfologia endotelial feita no boto crneo-escleral, mergulhado em meio lquido de preservao, com o auxlio de lmpada de fenda ou microscpio especular. O boto crneo-escleral composto pela crnea e por um anel de esclera, de aproximadamente 2 mm de largura, que serve para o manuseio do tecido. A vantagem da anlise in vitro que ela pode ser feita pelo lado interno
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da crnea. Isso evita as eventuais dificuldades de visualizao do endotlio motivadas pelo edema corneano ps-morte. O exame da lmpada de fenda feito diretamente atravs do frasco de preservao, com a crnea imobilizada dentro do frasco ou com o frasco imobilizado por suporte fixo. Um desses suportes o analisador de Cowden (COWDEN, 1979). Ele mantm o frasco imvel na vertical e, por meio de um espelho inclinado 45 projeta seu fundo com o boto crneo-escleral. Com aumento de 40 vezes possvel ver segmentos do mosaico endotelial refletidos pelo espelho (Figura 2). O exame com microscpio especular tem as vantagens e desvantagens do maior aumento: vem-se melhor as clulas, mas em campos menores. Outra convenincia desse instrumento permitir a contagem endotelial.
Figura 2. Fotografia ilustrando o analisador de Cowden que permite o exame da crnea in vitro.
Uma vez passado nos trs testes acima descritos a crnea mantida no meio de preservao at ser utilizada nos transplantes. O primeiro meio de preservao de crnea, criado por McCarey e Kauffman em 1974, garantia a qualidade de
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preservao do endotlio corneano por apenas 36 horas (MCCAREY e KAUFMAN, 1974). O mais atual, o Optisol-GS, supostamente preserva o endotlio por at 14 dias (bula do fabricante: CHIRON VISION, KAUFMAN, 1999), fornecendo folga considervel de trabalho aos Bancos de Olhos em suas funes de anlise e distribuio dos tecidos. Ocorre que o tempo de preservao desses meios
determinado indiretamente pelas fbricas de origem, utilizando-se mtodos que normalmente destroem o tecido, uma vez que ainda no existe teste funcional prtico da funo endotelial. Estudando o perfil de sntese e secreo das protenas corneanas de coelho, imersas em meio de cultura RPMI-1640 enriquecido com prolina, fucose e metionina marcadas foi observado por GOBBI, um dos ex-alunos de nossa ps-graduao, que o endotlio estava associado a uma protena de peso molecular entre 20 e 30 KDa (p20/30) (GOBBI, 2002). O que despertou nossa ateno que ela estava presente no meio de cultura no no tecido corneano. Outro fato relevante que ela s aparecia na presena do endotlio. Conclui-se ento que ela era secretada pelo endotlio corneano (GOBBI, 2002). Especulou-se ento que ela poderia servir como marcador da funo endotelial de crneas imersas em Optisol-GS (meio de preservao de crneas humanas), fornecendo, portanto estimativa do tempo de viabilidade endotelial nesse meio. O estudo foi continuado por SEIXAS, 2005 num experimento em que as crneas de coelho eram preservadas em meio de Optisol-GS por 4, 7, 14 e 21 dias no final dos quais elas eram incubadas em meio de cultura RPMI-1640 enriquecido com prolina triciada (SEIXAS, 2005). Concluiu-se que em todos os perodos havia secreo da frao p20/30. Como do ponto de vista histolgico, aps 21 dias, as camadas corneanas no se encontravam mais em condies apropriadas de
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transplante, devido ao edema, o mtodo no nos pareceu adequado. Utilizando um gel de eletroforese (SDS-PAGE) com maior concentrao que o utilizado por Gobbi o peso aparente da frao p20/30 foi re-estimado como tendo 25 KDa (SEIXAS, 2005). A frao passou ento a ser referida como p25. Restava caracterizar essa frao mediante o estudo do sequenciamento dos seus aminocidos. Ela poderia ser uma nova protena ou uma protena j conhecida, mas ainda no descrita como sendo produzida pelo endotlio. O principal problema com transplantes, de crneas, bem sucedidos a rejeio endotelial com conseqncias devastadoras para a viso. Embora o fenmeno seja mais prevalente no ps-operatrio recente ele pode manifestar-se em qualquer poca da vida do transplantado. A taxa mdia de rejeio endotelial de 10%, podendo chegar a 60% nos re-transplantes (CHALITA, DIAZGRANADOS, SATO, et al., 2000, COSTA e KARA-JOS, 2008, SILVA, FARIA E SOUSA e FERRANTE, 2006, THOMAZ, ANDO, AKAISHI et al., 1990). O enxerto de crnea mais prevalente o penetrante, onde todas as camadas da crnea so transplantadas. Entretanto, de todas elas, o endotlio o mais importante na
manuteno da transparncia do enxerto, justamente por estar associado ao controle das trocas hdricas da crnea. O edema resultante da disfuno endotelial leva opacificao do enxerto e perda visual. Como no transplante, parte do endotlio passa a ser o do doador, a secreo da frao p25 poderia contribuir na gnese da rejeio. Se fosse secretada pelo endotlio humano, poderia vir a funcionar como marcador da rejeio ou da propenso a ela, particularmente se a frao pudesse ser detectada no sangue. Nem toda opacificao do enxerto se deve a rejeio. Parte dela motivada por uma insuficincia da funo endotelial devida ao baixo nmero de clulas
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endoteliais do prprio tecido transplantado. Isto pode ser explicado pelos seguintes motivos: baixa contagem endotelial da crnea doadora, trauma cirrgico e inflamao ps-operatria. A rejeio um tipo especfico de inflamao ps-
operatria gerada pelo ataque do sistema imunolgico a um tecido identificado como estranho ao organismo. O tratamento da mesma consiste no controle da inflamao com corticides tpicos ou sistmicos por perodo varivel de acordo com a resposta de cada organismo (COSTA, CASTRO, CAMARGO et al., 2008, SILVA, FARIA E SOUSA e FERRANTE, 2006). Como o corticide diminui a inflamao da rejeio, se a frao p25 estiver relacionada rejeio, ela poderia ser modulada, positiva ou negativamente, pelo tratamento. Se a sntese fosse inibida, a frao poderia estar relacionada com a promoo da rejeio; se fosse estimulada, estaria associada proteo contra a rejeio.
2. OBJETIVOS
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Em funo das consideraes anteriores fixamos como objetivos do presente estudo: 1. Caracterizar a frao p25 secretada pelo endotlio corneano do coelho. 2. Verificar se a frao p25 secretada pelo endotlio corneano humano e caracteriz-la. 3. Determinar se a frao p25 pode ser usada como marcador para identificar pacientes mais susceptveis rejeio do transplante de crnea. 4. Descrever a modulao da frao p25 pelo uso de corticide subconjuntival em coelhos.
3. MATERIAL E MTODOS
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3.1 Obteno das crneas de coelho
No experimento completo utilizou-se 46 crneas de 23 coelhos albinos (New Zealand), machos, pesando cerca de 2500g, com idade de 2 a 3 meses, sem alteraes oculares. Todos foram anestesiados utilizando cloridrato de ketamina 10% (Ketamina Agener 10%, Agener Unio, Unio Qumica Farmacutica Nacional S.A., So Paulo, Brasil) e Cloridrato de xilazina (Dopaser, Laboratrios Calier S.A., Barcelona, Espanha). Aps o sacrifcio, por decapitao, as cabeas eram colocadas em caixa de poliestireno com gelo, com os olhos fechados, voltados para cima e levados para o laboratrio para a retirada das crneas. A retirada da crnea era iniciada com uma inciso corneana circurferencial a 0,5 mm do limbo e completada com tesoura curva. O uso dos animais neste estudo foi aprovado pela Comisso de tica em Experimentao Animal da FMRP-USP sob nmero: 110/2010.
3.2 Obteno das crneas humanas
Os olhos humanos foram fornecidos pelo Banco de Olhos do HCFMRP USP. Faziam parte do material descartado devido a sorologia positiva (HBSag,
HCV, HIV) ou a defeitos estruturais que o incapacitava para transplantes. As crneas eram retiradas dos olhos, preservados em cmara mida, na capela de fluxo laminar do prprio do Banco de Olhos. Eram transportadas para o laboratrio em placa para cultura de 24 poos (Corning Incorporated ), imersas em soro fisiolgico. A retirada da crnea era feita da mesma forma que nos coelhos. O uso do tecido humano, na presente investigao, foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa do HCFMRPUSP sob nmero: 10736/2006.
3.3 Caracterizao da frao p25
Para caracterizar a frao p25, uma crnea de coelho e uma crnea humana foram colocadas separadamente em meio de cultura RPMI - 1640 sem prolina triciada (3H-prolina) como processo preparatrio para eletroforese. Todo o procedimento de eletroforese utilizou gel na concentrao de 12,5%, corado pelo Coomassie Coloidal. A regio correspondente frao p25 foi cortada e analisada pelo mtodo do MALDI TOF.
3.4 Secreo da frao p25 pelo endotlio humano
3.4.1 Obteno dos endotlios
Neste estudo utilizou-se endotlios de 11 crneas humanas e 5 crneas de coelhos. As crneas animais foram usadas para comparao com as humanas. Tanto nas crneas humanas como nas de coelho, o endotlio era separado do estroma com o auxilio de duas pinas dentro de placas de Petri com soro fisiolgico. Os endotlios eram ento transferidos para placas de cultura de clulas de 24 poos (Corning Incorporated ).
3.4.2 Cultura endotelial
Cada poo continha uma nica unidade endotelial, com as clulas voltadas para cima. O correspondente a 50 l de prolina-3H (prolina triciada prolina L-[2,3-3H]; 1,6TBq/mmol; 42,00Ci/mmol 1L=1Ci), equivalente a 50 Ci para cada crnea, era
deixado secar em bomba de vcuo, por aproximadamente 2 horas. Depois de resuspenso com 1 mL de RPMI-1640, era despejado nos poos da placa de cultura. Em seguida todo material era incubado a 37C, em ambiente com 5% de CO2 durante aproximadamente 20 horas (BERTAZZOLI-FILHO, 1993, BERTAZZOLI-FILHO, LAICINE e HADDAD, 1996, GOBBI, 2002, RODRIGUES, BERTAZZOLI-FILHO, LAICINE et al., 1998, SEIXAS, 2005).
3.4.3 Processamento dos meios de cultura
Aps a incubao, os meios dos poos das placas eram transferidos separadamente para tubos Eppendorf de 1,5 mL e centrifugados a 14.000 rpm por 30 minutos a 4C (centrfuga refrigerada Eppendorf 5804R). Determinavam-se os volumes dos sobrenadantes que, em seguida, eram colocados em sacos de membrana de dilise (Sigma Diagnostics), que filtravam protenas com peso inferior a 12KDa (SEIXAS, 2005). A membrana era cortada aproximadamente com 6,0 cm de comprimento e fechada com grampo especfico em uma das extremidades, depois era umedecida com gua mili-Q (facilitando a sua abertura para colocar o meio dentro). Aps os meios serem colocados dentro das respectivas membranas, estas eram fechadas, na parte superior, com outros grampos, nos quais eram amarrados barbantes identificadores que os mantinham em posio vertical, imersos em 1 litro de gua mili-Q, a 4C, dentro de um frasco de Becker de 2 litros (SEIXAS, 2005). Os meios eram colocados sob agitao constante (agitador magntico) dentro de uma cmara fria a 4C, durante 24 horas. Eram realizadas 2 trocas de gua miliQ (a 4C) com intervalos de 8 horas. Aps a dilise, eram tomadas, de cada saco, amostras de 50 l para a dosagem de protenas e amostras de 5 l para a
radiometria. O volume restante era quantificado e em seguida liofilizado. Posteriormente, era re-suspenso em uma quantidade adequada de soluo de amostra (SA) para no ultrapassar 30 g de protenas por poo de gel de eletroforese (SEIXAS, 2005).
3.4.4 Liofilizao
Para a liofilizao a amostra era colocada em um Eppendorf, fechado com Parafilm onde eram feitos diversos furos com agulha de 23G. O Eppendorf era congelado com nitrognio lquido e por fim colocado dentro do frasco de liofilizao do liofilizador (Flexi-Dry - Microprocessor Control FTS systems). A amostra permanecia congelada durante toda a liofilizao. A durao da liofilizao dependia do volume de cada Eppendorf.
3.4.5 Processamento bioqumico das crneas
As crneas foram divididas em 2 partes iguais e depois fixadas com cinco banhos de etanol 70%, de 5 minutos cada. Uma parte era dissolvida em SDS a 4%, para posterior dosagem de protenas, e a outra em SA para eletroforese, ambas na proporo de 1mg de tecido para 20 L de cada soluo.
3.4.6 Dosagem de protenas dos tecidos e meios
Utilizou-se como reagente A uma soluo de cido bicinchonnico (Sigma) e como reagente B uma soluo de sulfato de cobre II pentahidratado (Sigma). A relao entre quantidade de A: B era de 50: 1. Foram retirados 10L das amostras
de tecidos dissolvidas em SDS 4%, 50L das amostras dos meios dialisados. Aps o aquecimento a 60C por 5 minutos as amostras e suas duplicatas eram centrifugadas e os sobrenadantes eram processados para a dosagem de protenas com um espectrofotmetro Hitachi U2000. O parmetro de comparao uma curva obtida com uma soluo de BSA de 1mg/mL (protena Standard - albumina srica bovina - Sigma) submetida aos mesmos tratamentos do material testado. Em todas as dosagens foram utilizados tubos de ensaio Dispens-A-Pak, Borex de 12X75 mm. O mtodo se baseia na converso de Cu+2 em Cu+ que confere ao meio cor prpura intensa, com pico de absorbncia mxima de 562 nm (SEIXAS, 2005).
3.4.7 Eletroforese
As amostras dos tecidos e dos meios, dissolvidos em SA, foram submetidas eletroforese segundo o procedimento de LAEMMLI, 1970, DUBAR, 1998. A montagem e a corrida do gel foram feitas em instrumentos dedicados da Mighty Small II SE250 Hoefer. Aps o preparo da soluo de separao de bis-tris poliacrilamida a 12,5%, esta era despejada entre o vidro e a placa de alumina. Aps a polimerizao era colocado o pente de cinco poos e a soluo de acrilamida de empilhamento. Aps a polimerizao da ltima, o pente era retirado e as amostras de estudo (tecido ou meio) eram aplicadas nos poos deixados pelos dentes do mesmo. O volume colocado nos poos era o mesmo para cada gel, com a ressalva que nenhum deles poderia conter mais de 30g de protenas. O primeiro poo era destinado ao peso molecular; nos demais, o preenchimento alternava tecido e meio, nessa ordem. A eletroforese era mantida sob as mesmas condies: 15 mA de corrente, 70200 V e 1-2 W. Durava aproximadamente 2 horas. Ao fim da mesma os gis eram
retirados das placas, fixados por 30 minutos em soluo de metanol-actico (fixador de gel ver apndice) e corados com Azul Brilhante de Coomassie 0,1% (apndice) por 1 hora. O excesso do corante era lavado com soluo de cido actico a 7% (apndice), por tempos variveis, at a obteno de um contraste adequado e, em seguida, fotografado e processado para fluorografia.
3.4.8 Fluorografia
A preparao para a fluorografia consistia em deixar o gel, submetido eletroforese, imerso em soluo amplificadora (Amplify - Amersham Biosciences Inc., Amersham, Reino Unido) por 30 minutos. Depois de secado a vcuo por 2 horas a 80C, em um secador de gel Hoefer SE 540, o gel era colocado contra o filme Hyperfilm MO (Amersham Biosciences Inc.) e guardado em cassete a prova de luz a -80C. Aps exposio por 30 a 90 dias o filme era revelado, em cmara escura, com revelador e reforador GBX (Kodak, Eastman Kodak, Rochester, NY) por 5 minutos. A seguir, lavado com cido actico 2% por 30 segundos e depois fixado no fixador e reforador GBX (Kodak) por 5 minutos.
3.5 Marcador de rejeio endotelial
3.5.1 Obteno de sangue humano
Sangue venoso foi colhido de pacientes do ambulatrio de Doenas Oculares Externas (DOE) do HCFMRPUSP com a aprovao pelo Comit de tica em Pesquisa do hospital sob nmero: 10736/2006.
Foram includos 13 pacientes com diagnstico clnico de rejeio do enxerto de crnea, 17 pacientes transplantados de crnea, sem rejeio, e um grupo controle de 6 pacientes, no submetidos a transplante e sem doenas oculares inflamatrias. De cada paciente foi colhido 1 mL de sangue da veia braquial. No mesmo dia da coleta, o sangue era submetido centrifugao (centrifuga Eppendorf) por 5 minutos, a 14.000 rpm, em temperatura ambiente. O soro era separado e armazenado a -20C por tempos variveis at serem usados nos western blot.
3.5.2 Western Blot
O mtodo escolhido para teste da existncia do anticorpo anti-p25 em soro humano foi Western Blot. Ele envolveu os seguintes passos: 1. eletroforese do meio de cultura de crnea de coelho; 2. transferncia das protenas para uma membrana de nitrocelulose; 3. reao da membrana de nitrocelulose com soro de cabra, soro dos pacientes e anticorpo de cabra anti-IgG humano.
3.5.2.1 Eletroforese do meio de cultura de crnea de coelho:
semelhana do descrito no item 3.4.7, utilizando-se a crnea do coelho com todas as camadas, uma vez que s o endotlio era capaz de secretar a p25.
3.5.2.2 Transferncia das protenas para uma membrana de nitrocelulose (NC):
As protenas do gel de eletroforese do meio de cultura de crnea de coelho foram transferidas para a membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences Inc), com poros de 45m, temperatura ambiente, usando-se o aparelho Mighty Small
Transfer Tank (Hoefer). As membranas eram colocadas em Pirex com Ponceau S 0,5% (Sigma - apndice) e eram deixadas para secar.
3.5.2.3 Reao com a membrana de nitrocelulose (Western Blot):
Neste procedimento a membrana era mantida sob agitao durante 12 horas numa soluo de estoque composta por leite desnatado (Molico, Nestl, Sua) a 5% em tampo fosfato com 0,3% de Tween 20 (PBS-T), acrescido de soro de cabra na proporo de 1: 500. Em seguida ela era lavada duas vezes com PBS-T e mergulhada, de novo, na soluo de estoque acrescida do soro dos pacientes, na proporo de 1: 125, ficando sob agitao em cmara fria durante 2 horas. Outra vez, a membrana era lavada 2 vezes com PBS-T e imersa na soluo de estoque, agora com anticorpo de cabra antiIgG humano, na proporo de 1:500, (Peroxidase-Labeled Affinity Purified Antibody to Human IgG (H+L) - produced in goat - KPL Inc., Gaithersburg, MD, USA). Aps agitao em cmara fria durante 2 horas, era novamente lavada duas vezes com PBS-T. Para revelar a membrana era usada soluo de DAB (33
diaminobenzidina, Sigma) em tampo fosfato 0,2M pH7,2 7,4 (apndice) e gua oxigenada. A eficcia do DAB era testada com soluo de hipoclorito de sdio 2,5%.
3.6 Avaliao da modulao da frao p25 pelo corticide
3.6.1 Fluorografia
Neste experimento foram usados 6 crneas de 3 coelhos. Exceto no grupo controle, cada olho recebeu injeo subconjuntival de 0,1 mL de acetato de metilprednisolona (Depo-Medrol Pfizer - 40mg/mL) sob anestesia geral e suas
crneas foram incubadas com 5 gotas de dexametasona lcool a 0,1% (Maxidex, Alcon) diludos em 1 mL de RPMI 1640, enriquecido com prolina triciada por 20 horas. Os dois primeiros animais receberam duas injees separadas por 7 dias e foram sacrificados no 14 dia. O terceiro animal no recebeu tratamento, funcionando como controle para os demais, e suas crneas foram incubadas em 1mL de RPMI 1640 enriquecido com prolina triciada. Todas as crneas foram submetidas eletroforese de protenas como descrito na seo 3.4.7 e os gis correspondentes, fluorografia como explicado na seo 3.4.8.
3.6.2 PCR
Este passo do trabalho s pode ser feito aps a caracterizao da frao p25, que revelou ser uma protena sintase de prostaglandina D (PGDS). A modulao da protena pelo uso de corticide subconjuntival, em coelhos foi avaliada atravs da fluorografia e da PCR. Foram estudados ambos os olhos de 12 coelhos, divididos em 4 grupos, cada qual constitudo por 6 olhos. Exceto no grupo controle, cada olho recebeu injeo subconjuntival de 0,1 mL de acetato de metilprednisolona (Depo-Medrol Pfizer 40mg/mL) sob anestesia geral. Os grupos ficaram assim constitudos: grupo 1 - uma nica injeo de corticide e sacrifcio no 7 dia; grupo 2 - uma nica injeo de corticide e sacrifcio no 14 dia; grupo 3 - duas injees de corticide com intervalo de 7 dias e sacrifcio no 14 dia; grupo 4 - controle, no submetidos injeo de corticide. O mtodo inclui os seguintes passos: 1. Transcrio reversa do mRNA da crnea para cDNA; 2. Teste de presena do DNA da PGD2 por meio da PCR; 3. Amplificao e quantificao do cDNA alvo em tempo real.
3.6.2.1 Transcrio reversa do mRNA da crnea para cDNA
Cada crnea era lavada com soro fisiolgico e colocada em Eppendorf onde era triturada com 500 L trizol (Trizol Reagent, Invitrogen, CA, USA). Aps 5
minutos adicionava-se 100 L de clorofrmio (Merck) e o conjunto era agitado por 10 segundos. Aps descanso de 3 minutos o material era centrifugado por 20 minutos a 14.000 rpm e 4C. O sobrenadante era colocado em outro Eppendorf com 350 L de isopropanol (Merck) a -20C, por 12horas. Em seguida este era centrifugado por 30 minutos a 14.000 rpm a 4C. O novo sobrenadante era desprezado e o resduo homogeneizado com 1 mL de lcool etlico 75% (Merck). Aps 15 minutos a soluo era centrifugada por 5 minutos a 14.000 rpm, temperatura ambiente. O sobrenadante era desprezado e o resduo secado em bomba de vcuo. Ento, o mesmo ressuspenso em 10 L de gua miliQ e aquecido em banho seco 70C, por 5 minutos. A determinao da quantidade de RNA das amostras foi feita com dosador de RNA e DNA (RNA/DNA Calculator - Gene Quant Pro). A transcrio reversa foi feita com o Kit de Sntese de cDNA (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, K1621, Fermentas). No final desta fase, sobram dentro de cada Eppendorf, 20 L de cDNA, resultante da transcrio reversa (RT).
3.6.2.2.Teste de presena do cDNA da PGDS por meio da PCR
Para a feitura do PCR foi acrescentado ao volume final de cada Eppendorf do RT, 30 L de gua mili Q. Cerca de 5 L dos 50 L resultantes, eram adicionados a 45 L de uma soluo de estoque, fornecida pelo fabricante (kit da Fermentas ver apndice), para que cada Eppendorf voltasse a conter 50 L. Na referida soluo de
estoque foi usado primer upper e lower de PGD2S. Estas eram ento colocadas na mquina de PCR (Mini Cycler MJ Research INC., Watertown, MA, USA), programada da seguinte forma: 2 minutos a 94C, seguidos de 35 ciclos de: 1 minuto a 94C, 1 minuto a 64C e 1 minuto a 72C. Ao fim destes ciclos o processo era completado com 10 minutos a 72C. Ao final, aps aproximadamente 3 horas, eram retirados 10 L de cada amostra e colocados para correr em gel de agarose.
Tabela 1 seqncia de aminocidos dos Primers upper e lower de PGD2 Primer PGD2 PGD2 RT Upper CAA GTT CCT GGG GCG CTG GTT CAC PGD2 RT Lower CGT CTC GCA CTG GTT TTT CCT G
O Gel de agarose (Molecular Grade, Bio 41026, Bioline) 1,5% era preparado logo antes de realizar a PCR. Aps a solidificao em um suporte mini-gel horizontal com pente de 8 poos, este era coberto com tampo de corrida TAE, na concentrao de 1X, antes de receber os 12L das amostras para a corrida, diludas em tampo de aplicao de DNA. No primeiro poo era sempre colocado o marcador de DNA de 1Kb (quilo base), no segundo gua e no terceiro o controle positivo. Nos demais eram colocadas as amostras. Aps a corrida, o gel era colocado em soluo de brometo de etdio por 20 minutos para a reao com as bases do DNA. Em seguida, era exposto a uma fonte de luz ultravioleta para a visualizao da fluorescncia das bases de do PGD2.
4. RESULTADOS
Resultados | 34
4.1 Caracterizao da p25 de coelhos A frao secretada pelo endotlio de coelhos foi caracterizada pelo mtodo de MALDI TOF. Ela a sintase de prostaglandina D contem 191 aminocidos,
apresenta score de Smith-Waterman: 389; 97,0 59% identidade (100% similar) e sua seqncia de aminocidos : TLLLQPAGR (968.7) EFALLYSEGAK (1227.8) TLLLQPAGRPGR (1278.9) VTQGTTSVVQSFNR (1524.0) AQGFTEDLVVFLPR (1592.0) 4.2 Secreo da frao p25 pelo endotlio humano 4.2.1 Fotografias dos gis de eletroforese Os gis abaixo apresentam as protenas corneanas tanto do tecido endotelial quanto do seu meio de cultura. Em nenhum dos dois gis possvel observar bandas correspondentes frao p25. A B
66KDa
45KDa
24KDa
18,4KDa
PM
TCC
MCC
TCH1 MCH1
PM
TCH2 MCH2
TCH3
MCH3
Figura 3 (A e B) Fotografias de gis de eletroforese a 10,0%. PM: peso molecular. TCC: tecido de crnea de coelho; MCC: meio de crnea de coelho; TCH: tecido de crnea humana; MCH: meio de crnea humana.
Resultados | 35
4.3 Fluorografias
4.3.1 Fluorografias de crnea humana e de coelho para comparao.
66KDa
45KDa
24KDa
18KDa
PM
TCC
MCC TCH1
MCH1
PM TCH2
MCH2
TCH3 MCH3
Figura 4 (A e B) Fluorografias de gis de eletroforese 10,0%, correspondentes aos gis mostrados na figura 1. PM: peso molecular. TCC: tecido de crnea de coelho; MCC: meio de crnea de coelho; TCH: tecido de crnea humana; MCH: meio de crnea humana. As setas isoladas tanto do MCC quanto do MCH mostram a banda da protena p25.
Resultados | 36
4.3.2 Fluorografia de crnea humana para evidenciar a p25.
24 kDa 18 kDa 14.5kDa
Figura 5 Fluorografia de gel de eletroforese 12,5%. PM: peso molecular; MCH: meio de crnea humana. As trs setas paralelas do MCH mostram a banda da protena p25.
4.4 Caracterizao da p25 humana
A protena secretada pelo endotlio de humanos foi caracterizada pelo mtodo de MALDI TOF ela a cristalina B2.
Resultados | 37
4.5 Marcador de rejeio endotelial - Western Blot
4.5.1 Western Blot mostrando membranas de soros de pacientes normais.
Figura 6 Western Blot do soro de pacientes normais. No houve marcao da regio da frao p25. Chama ateno a marcao apenas das protenas de alto PM (flechas).
Resultados | 38
4.5.2 Western Blot mostrando membranas de soros de pacientes com histria de rejeio.
10
11
Figura 7 Western Blot do soro de pacientes com histria de rejeio. 1-4. Sem uso de corticides. Aparentemente houve marcao da regio da frao p25 nas membranas 1 e 2 (flechas); 5-11. Em uso de corticide. Em todas essas membranas no houve marcao da regio da frao p25. Entretanto em 3, 4, 6, 8, 10 e 11 aparecem leves marcaes de protenas de baixo peso no presentes nos olhos normais estudados. .
Resultados | 39
4.5.3 Western Blot mostrando membranas de soros de pacientes sem histria de rejeio.
10 11
12
13
14
Figura 8 Western Blot do soro de pacientes transplantados sem histria de rejeio. 1-7. Sem uso de corticide tpico. Aparentemente houve marcao da regio da frao p25 nas membranas 2, 4, 6 e 7 (flechas); 8-14. Em uso de corticide. Aparentemente houve marcao da regio da frao p25 nas membranas em 8 e 10 (flechas).
Resultados | 40
4.6 Avaliao da modulao da frao p25 pelo corticide
4.6.1 Fluorografia de crneas de coelho controle e tratadas com corticide.
66 45 24 18 14 PM 1 2 3
Figura 9 Fluorografia de gel de eletroforese 12,5% de crneas de coelhos. PM: peso molecular; 1: crnea controle, sem uso de corticide. Os tringulos mostram protenas de baixo PM, com peso inferior a das raias vizinhas. 2 e 3: crneas aps 2 injees de corticide subconjuntival, com intervalo de 7 dias, incubadas com dexametasona 0,1%, sacrifcios no 14 dia. As estrelas mostram protenas de baixo PM; As bandas proticas das raias 2 e 3 so semelhantes.
Resultados | 41
4.6.2 Teste de presena da PGD2S por meio da PCR
PM 1
Figura 10 - RT-PCR de crnea de coelhos. Gel de agarose 1.2%. PM: PM: marcador de peso de DNA 1Kb; 1: Controle negativo (gua); 2: endotlio. A seta mostra o DNA do PGD2S denotando que os primers (upper and lower) esto funcionando.
PM
Figura 11 RT-PCR. Gel de agarose 1,0%. PM - marcador de peso de DNA 1Kb ; 1: crnea de coelho com 2 injees com intervalo de 7 dias, e sacrificado no 14 dia. No se evidencia marcao na regio correspondente PGDS; 2: crnea de coelho com 1 injeo de corticide e sacrifcio no 7 dia.; 3 e 5: crneas de coelho controle, sem tratamento com corticide. Observa-se presena de marcao em 5 (seta); 4: crnea de coelho com uma injeo de corticide e sacrifcio no 14 dia. Observa-se presena de marcao em 4 (seta).
5. DISCUSSO
Discusso | 43
A caracterizao da frao p25 do coelho envolveu os seguintes passos: 1. Isolamento do endotlio corneano; 2. Incubao em meio de cultura celular por 20 horas; 3. Dilise do sobrenadante; 4. Liofilizao do sobrenadante; 5. Eletroforese do produto liofilizado ressuspenso em soluo de amostra; 6. Imerso em Coomassie coloidal; 7. Isolamento da regio do gel referente banda da p25; 8. Caracterizao da p25 pelo mtodo de MALDI-TOF. Esta se revelou como sendo a enzima Sintase de Prostaglandina D2 (PGDS), cujo sequenciamento foi apresentado na pgina 34. A sintase de prostaglandina D (PGDS) catalisa a isomerizao da PGH2 na produo da PGD2 (RAJAKARIAR, HILLIARD, LAWRENCE, et al., 2007, SHIMURA, SATOH, IGAWA, et al., 2009, TOKUDOME, SANO, SHINMURA, et al., 2009). A PGD2 regula a nocicepo, inibe a agregao plaquetria e age como mediadora alergnica (RAJAKARIAR, HILLIARD, LAWRENCE et al., 2007, SUZUKI, FUJII, FUJIGAKI, et al., 2010, TANIGUCHI, MOHRI, OKABE-ARAHORI, et al., 2007, YAMAMOTO, OKANO, FUJIWARA, et al., 2009). Foram identificados e nomeados dois tipos distintos de PGDS: enzima tipo lipocalina (L-PGDS) e enzima hematopoitica (RAJAKARIAR, HILLIARD, LAWRENCE, et al., 2007, TOKUDOME, SANO, SHINMURA, et al., 2009). Ela tambm tem importante papel no SNC estando associada transmisso sinptica, controle hipotalmico de temperatura,
recuperao aps convulses, liberao de hormnio luteinizante, alm de sedao e induo do sono (NAGATA, SUZUKI, IGARASHI, et al., 1991, QU, HUANG, XU, et al., 2006, WHITE, MIKOL, ESPINOSA, et al., 1992). Embora ela j tenha sido descrita como sendo produzida por clulas do crebro, cardacas (micitos), epidrmicas de Langerhans, dendrticas drmicas, dendrticas plasmocitides, dendrticas mielides e endoteliais vasculares (MAHMUD, UEDA, YAMAGUCHI, et
Discusso | 44
al., 1997, NAGATA, SUZUKI, IGARASHI, et al., 1991, QU, HUANG, XU, et al., 2006, SEDANO, VICTORIO, NEIRA, et al., 1997, SHIMURA, SATOH, IGAWA, et al., 2009, SUZUKI, FUJII, FUJIGAKI, et al., 2010, TOKUDOME, SANO, SHINMURA, et al., 2009, WHITE, MIKOL, ESPINOSA et al., 1992), no entanto, o primeiro estudo que demonstra a sua produo pelo endotlio corneano. Ela j havia sido descrita como produzida pela retina, ris e corpo ciliar e presente tambm nos fluidos oculares (BEUCKMANN, GORDON, KANAOKA, et al., 1996, GERASHCHENKO,
BEUCKMANN, MARCHESELLI, et al., 1998, URADE e HAYAISHI, 2000, URADE, TANAKA, EGUCHI, et al., 1995, URADE, WATANABE e HAYAISHI, 1995). Surgia ento a questo se essa enzima tambm seria secretada pelo endotlio humano, o que constituiu o prximo objetivo do trabalho. A procura da frao p25 seguiu, a mesma metodologia da caracterizao da frao p25 de coelho, at a quinta etapa, s que com endotlio humano. Na sexta, como o que interessava era verificar a presena da p25 como produto de secreo do endotlio humano, foi realizada fluorografia do gel. Verificou-se ento que havia marcao na regio de peso molecular correspondente a 25 kDa confirmando a suspeita. A caracterizao da frao p25 humana foi realizada da mesma forma como para o endotlio do coelho, s que agora, utilizando a totalidade dos passos do item anterior. Em vez da enzima PGDS foi encontrada a cristalina B2 que uma protena solvel em gua encontrada no cristalino e na crnea favorecendo a transparncia destas duas estruturas (REN, LIU, JIA, et al., 2010). Seu aparecimento nestas estruturas pode ser explicado pelo fato de terem a mesma morfognese e funcionalidade similar (REN, LIU, JIA, et al., 2010, XUE, YAO, ZHANG, et al., 2009).
Discusso | 45
A cristalina referida como enzimtica, por suas caractersticas de enzima (REN, LIU, JIA, et al., 2010). Ela tambm foi identificada em outras localidades como corao, retina humana, testculo e crebro de ratos, retina de bois e em cnceres de mama avanados (em humanos) (MAGABO, HORWITZ, PIATIGORSKY, et al., 2000, MOYANO, EVANS, CHEN et al., 2006). Em estudo recente, REN et al., 2010, descreveram a expresso de A, e cristalinas no epitlio e endotlio de ratos em estgio embrionrio e que se mantinha at a fase adulta e que sua expresso no estroma era muito pequena. Este grupo estudou tambm a expresso destas protenas em humanos usando cultura de clulas epiteliais e de boto descartado de crneas doadoras (crnea do anel escleral, desprezado depois de retirada da regio central para transplante), e nestes tambm h expresso, mas no fica claro em humanos se foi testada a expresso epitelial, estromal e endotelial separadamente. Tambm mostrada a expresso, mas no a sua secreo. Em outro estudo de JESTER, 2008, tambm descrita a presena de cristalina B2 na crnea, novamente no epitlio e estroma. At onde sabemos a primeira vez que a protena cristalina B2 descrita sendo secretada pelo endotlio corneano humano. Alguns estudos avaliaram a existncia de alteraes da quantidade e qualidade de protenas presentes no humor aquoso de pacientes com rejeio ao transplante de crneas ou com cataratas (FUNDING, VORUM, HONOR, et al., 2005, TRIPATHI, R., MILLARD e TRIPATHI, B., 1989), e foi visto que h diferena significativa. Esta diferena foi um dos fatores que fizeram com que fosse buscada uma forma de avaliar se seria possvel ver alteraes no sangue destes pacientes. Como a p25 era encontrada no meio de cultura e no no tecido endotelial, propriamente dito, concluiu-se que ela era secretada pelo endotlio corneano. Como
Discusso | 46
no transplante, parte do endotlio passa a ser o do doador, a secreo da p25 poderia contribuir na gnese da rejeio. Sendo secretada pelo endotlio humano, poderia vir a funcionar como marcador de rejeio ou de propenso a ela, particularmente se a protena pudesse ser detectada no sangue. Assumindo que as pessoas transplantadas pudessem, em certas
circunstncias, reconhecer a p25 heterloga, secretada pelo endotlio doador, haveria a possibilidade de se encontrar no soro do receptor, anticorpos contra a mesma. A presena dos mesmos seria indcio da percepo, pelo sistema imunolgico, da presena de um tecido estranho, passo inicial para o desenvolvimento da rejeio. Para a determinao dos anticorpos anti-p25 utilizou-se o soro de pacientes normais e transplantados. No mtodo do Western Blot os soros funcionaram como anticorpos primrios e anticorpos de cabra anti-IgG humano, como anticorpos secundrios. A primeira observao importante que em nenhuma membrana de nitrocelulose correspondente ao soro de pacientes no transplantados foi detectada marcao na regio da frao p25. Isto era um achado importante favorvel a nossa hiptese. Ver Figura 6. A rejeio uma reao imunolgica tratada com corticides tpicos ou sistmicos (COSTA, CASTRO, CAMARGO et al. 2008, SILVA, FARIA E SOUSA e FERRANTE, 2006). Como este diminui a inflamao, se a frao p25 estiver
relacionada rejeio, ela poderia ser modulada, positiva ou negativamente, pelo tratamento (TOKUDOME, SANO, SHINMURA, et al., 2009). A Figura 7 mostra o resultado do Western Blot do soro de pacientes com histria de rejeio do transplante de crnea dividido em dois grupos: 1. pacientes
Discusso | 47
sem uso de corticide e 2. pacientes em uso de corticide. Dos 4 soros do primeiro grupo, 2 apresentaram marcao na regio da p25. Nenhum dos 7 pacientes do segundo grupo apresentou essa marcao. A Figura 8 mostra o resultado do Western Blot do soro de pacientes sem histria de rejeio do transplante de crnea dividido em dois grupos: 1. Pacientes sem uso de corticide e 2. Pacientes em uso de corticide. Dos 7 soros do primeiro grupo, 4 apresentaram marcao na regio da p25. Dos 7 soros do segundo grupo 2 apresentaram marcao. Devido ao pequeno nmero de amostras de soro estudadas os resultados no podem ser conclusivos, mas podem-se formular algumas conjecturas a serem testadas futuramente. Para facilitar o acompanhamento do raciocnio apresentamos abaixo organogramas dos resultados numricos obtidos da anlise das figuras 7 e 8.
Com rejeio (11)
Sem rejeio (14)
Com corticide (7)
Sem corticide (4)
Com corticide (7)
Sem corticide (7)
Com marcao (0)
Sem marcao (7)
Com marcao (2)
Sem marcao (2)
Com marcao (2)
Sem marcao (5)
Com marcao (4)
Sem marcao (3)
Figura 12 Organogramas. Mostram pacientes com rejeio e sem rejeio, com ou sem uso de corticide e com ou sem marcao na regio da p25. Os nmeros entre parnteses se referem quantidade de pacientes em cada grupo.
Discusso | 48
No organograma da esquerda observa-se que dos 11 soros de pacientes com histria de rejeio, apenas 2 apresentaram marcao na regio da p25, expressando prevalncia de 18%. No organograma da direita observa-se que dos 14 soros de pacientes sem histria de rejeio, 6 apresentaram marcao na regio da p25 dando prevalncia de 43%. A primeira concluso importante que no soro de pacientes transplantados possvel detectar a marcao, o que no ocorre no soro dos no transplantados. Na eventualidade desses resultados no serem obra do acaso, a distribuio dos dados sugere que de alguma forma essa marcao tenderia a ser mais prevalente nos pacientes sem histria de rejeio. Poderia a rejeio inibir a produo dessa protena, por destruio celular ou por inibio do processo enzimtico envolvido na sua sntese? A comparao do organograma da esquerda com o da direita sugere menor prevalncia de marcao com o uso de corticide. No organograma da esquerda, no houve nenhuma marcao nos usurios de corticide, enquanto que nos no usurios ela foi de 50%. No da direita, os que usavam corticide tiveram prevalncia de 28% enquanto que os no usurios a prevalncia foi de 56%. Admitindo um efeito inibidor do corticide, a menor prevalncia de marcao nos pacientes transplantados com histria de rejeio poderia ser explicada tambm pela maior tendncia dos mesmos em usarem o corticide de maneira contnua. A PGDS era produzida pelo endotlio corneano de coelhos (GOBBI, 2002, SEIXAS, 2005), mas no se sabia se ela seria produzida aps o uso de corticides, por isso foi realizada a incubao de crneas de coelho aps a injeo subconjuntival de corticide. Para sua verificao foi realizada fluorografia como descrita no item 3.6.1 (material e mtodos), no entanto ela no nos mostrou a PGDS porque o gel correu
Discusso | 49
por pouco tempo, e com isso no houve uma boa separao das protenas na regio da PGDS. Entretanto por isso foi possvel descobrir que algumas protenas de mais baixo peso molecular, faixa prximo de 18KDa, estavam presentes na crnea do coelho controle, mas desapareciam nos coelhos tratados com corticide (modulao negativa). Paradoxalmente, podem ser descritas protenas de peso molecular pouco mais alto que 18KDa, na faixa entre 18 e 24KDa em que o inverso ocorreu, no existiam estas protenas no coelho controle e elas surgiram aps o tratamento com corticides (modulao positiva). Isso refora a conjectura de que pode ser que o corticide de alguma forma estimule a produo de algumas protenas e iniba a produo de outras na crnea humana. Em estudo de TOKUDOME et al., 2009 foi observada a modulao positiva de corticide sobre a sintase de prostaglandina D2, servindo como protetor cardaco. Em outro estudo de GARCA-FERNANDEZ, IIGUEZ, EGUCHI et al., 2000, tambm foi descrita a modulao positiva da PGDS, em clulas neuronais de ratos, dose e tempo dependentes, com o uso de corticide. Neste estudo, o corticide modulou a produo de protenas ora positivamente e ora negativamente, mas no sabemos quais so estas protenas. Como a fluorografia no havia sido capaz de nos mostrar se a PGDS continuava sendo produzida depois do uso de corticide utilizou-se da tcnica de PCR para tentar elucidar este ponto. Foi possvel determinar com esta tcnica que a PGDS produzida pelo endotlio corneano de coelhos tanto com o uso de corticides como na sua ausncia, como nos mostra a Figura 11. O que significa que ele no modula negativamente a PGDS.
6. CONCLUSES
Concluses | 51
1. A p25 secretada pelo endotlio da crnea de coelho a sintase de prostaglandina D. 2. o primeiro estudo que demonstra a produo da PGDS pelo endotlio corneano. 3. A p25 secretada pelo endotlio da crnea humana. 4. A p25 secretada pelo endotlio humano a cristalina B2. 5. Os pacientes no transplantados no apresentam marcao na regio da p25. 6. Pacientes transplantados podem apresentar uma marcao na regio da p25. 7. Aparentemente o corticide tpico ou sistmico nos pacientes transplantados de crnea tendem a diminuir a prevalncia de marcao na regio da p25. 8. Os pacientes com transplante de crnea apresentam nos western blot protenas de baixo peso molecular que os pacientes sem transplante no apresentam. 9. O corticide modulou algumas protenas de baixo peso molecular secretadas pela crnea de coelho ora positivamente e ora negativamente. 10. O cDNA da PGDS aparece nas PCRs de crneas de coelho, tratadas ou no, com corticide.
7. REFERNCIAS
Foram seguidas as regras constantes da ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS. NBR 6023. Informao e documentao: referncias elaborao. Rio de Janeiro: ABNT, 2000.
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APNDICE
Apndice | 59
SOLUES
1. Tampo de separao:
Tris-HCl 2,0 M pH 8,8 Tris (Sigma) - 12,1 g H2O destilada qsp 50,00mL *acertar pH com HCl e completar o volume
2. Tampo de empilhamento:
Tris-HCl 2,0M pH 6,8 Tris (Sigma) 12,10g H2O destilada qsp 50,00mL * acertar pH com HCl e completar o volume
3. Soluo de acrilamida (Acrilamida/ bisacrilamida 30:0,8):

Acrilamida 30,00g Bisacrilamida 800,00mg H2O destilada qsp 100,00mL
4. Tampo de corrida: (soluo de estoque)

Tris (Sigma) 30,00g Glicina 141,10g SDS 10% 100,00mL H2O destilada qsp 1000mL pH 8,3- 8,4
Apndice | 60
5. Tampo de Transferncia para Western Blot (soluo de Towbin et al):

Tris 3,03g/l Glicina 14,42g/l Metanol PA (Merck) 15% (v/v)
6.Peso molecular para fluorografia:

Peso 70 SMW SDS 70 Fermentas 14,3kDa, 18,4 kDa, 24 kDa, 45 kDa e 66 kDa
7. Peso molecular para western blot:

PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas): 10-170KDa 10,0 KDa, 17,0 KDa, 26,0 KDa,34,0 KDa, 43,0 KDa, 55,0 KDa, 72,0 KDa, 95,0KDa,130,0 KDa e 170,0 KDa
8. Peso molecular para gel de agarose: 9. Gel de 10%; e 15%:

Parte de baixo, gel de separao: Tampo de separao (Tris-HCl 2,0M) 2,26mL Soluo de acrilamida 4,00mL Perssulfato de amnio 76,00L TEMED 14,00L H2O qsp para 12,00mL Parte de cima, gel de empilhamento: Tampo de empilhamento (Tris-HCl 2,0M) 0,25mL Soluo de acrilamida 664,00L
Apndice | 61
SDS 10% 40,00L Perssulfato de amnio 25,00L TEMED 6,00L H2O 2,94mL
10. Fixador para gel de protena

Metanol PA (Merck) 500,00mL cido actico glacial PA (Merck) 200,00mL H2O 50,00mL
11. Soluo de Amostra (estoque):

Glicerol 2,00mL 2-mercaptoetanol 1,00mL Tris-Hcl 0,5M pH 6,8 2,50mL SDS 20% 2,30mL Azul de bromofenol 0,20mL H2O destilada qsp 10,00mL
12. Tampo de Sorensen 0,1M

(Soluo A) Tampo fosfato monobsico 0,2 M Na2HPO4 53,65 g/l (Soluo B) Tampo fosfato dibsico 0,2 M Na2HPO4 - 27,60 g/l Para Sorensen 0,1 M: 23,00 mL de soluo A 77,00 mL de soluo B H2O destilada qsp para 200,00mL
13. Azul Brilhante de Comassie 0,1%:

Comassie Blue 0,10g Metanol PA (Merck) 50,00mL cido actico glacial PA (Merck) 20,00mL
Apndice | 62
H2O qsp para 120,00 mL Colocar Metanol primeiro
14. Tampo Tris imune 2X:

Tris HCl (100mM, pH 9,5) 10,00mL Nacl (100mM) 3,35mL H2O qsp para 100,00mL
15.Tampo de lavagem do Western:

Tampo Tris imune 1X 100mL Tween 20 10,00L
16. Soluo de estoque de bloqueio para Western blot:

Tris imune 2X 15,00mL Leite em p desnatado (Molico, Nestl) 1,5g BSA (albumina srica bovina - Sigma) 600mg Tween 20 9,00L H20 destilada qsp para 30,00mL
17. Tampo fosfato 0,2M pH 7,2-7,4 para revelar o western blot:

Sdio fosfato bibsico anidro Na2HPO4 22,72g Sdio fosfato monobsico monohidratado Na2HPO4.H2O 5,52g H2O qsp para 1,00 l
18. Ponceau 0,5%

Ponceau 0,5% 0,50g TCA 3% 6,00 mL H2O qsp 100,00 mL
Apndice | 63
19. Soluo de acido actico 7%

Acido actico glacial PA (Merck) 7,00mL H2O destilada qsp para 100,00mL
20. SDS 10%

SDS (Sigma) 100,00 mg H2O destilada qsp para 1,00 mL
21. Perssulfato de amnio 10%

perssulfato de amnio 10% (Fluka) 100,00 mg H2O destilada qsp para 1,00 mL
22. Mistura para PCR: (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit #K1621 Fermentas)
Tampo 10X 30,00 L 25mM MgCl2 12,00 L dNTP 2mM 30,00L Primer upper* (10pmol/L) 15,00 L Primer lower* (10pmol/L) 15,00 L Taq polymerase 0,5L tubo 3,00 L H2O destilada qsp para 300,00 L *Bioneer, PGD2 RT upper (CAA GTT CCT GGG GCG CTG GTT CAC) e lower (CGT CTC GCA CTG GTT TTT CCT G)
23. Gel de agarose 1,5%:

Agarose 450 mg TAE (estoque) 600 L H2O destilada qsp para 30 Ml
ANEXOS
Anexos | 65
Anexo 1
HOSPITAL DAS CLNICAS FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO UNIVERSIDADE DE SO PAULO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu, ________________________________________________________________,
abaixo assinado, tendo sido diagnosticado com rejeio de crnea/ realizado transplante de crnea, concordo em doar 5mL de sangue venoso para realizao de pesquisa ligada rejeio de crnea. Estou ciente, que no ato da puno venosa, pode haver formao de hematoma ou edema local. Estou ciente ainda de que meu nome ser guardado em sigilo e que a qualquer momento posso pedir para ser excludo do estudo, no acarretando isto, nenhuma perda ao acompanhamento de meu quadro clinico. O estudo em questo visa caracterizao de uma protena (p25) que produzida pelo endotlio corneano e pode estar relacionada rejeio corneana. A pesquisa est sendo realizada pela mdica Giselle Oliveira Seixas, tendo como orientador o Prof. Dr. Sidney Jlio de Faria e Sousa.
Ribeiro Preto, ________ de ____________ de 20__.
Assinatura do paciente ou seu responsvel legal Telefones para contato: Giselle Oliveira Seixas 3602-3147 Prof. Dr. Sidney Jlio de Faria e Sousa 3602-2862
Anexos | 66
Anexo 2

Eu, ________________________________________________________________,
abaixo assinado responsvel pelo Sr (a)_________________________________________, falecido em _________________, estou ciente e de acordo estou ciente e de acordo que em alguns casos (HIV, hepatites, VDRL positivo, tumores com metstases) para segurana do receptor, as crneas deste meu parente podem vir a no serem utilizadas para transplante de crnea, e se isto ocorrer podero ser utilizadas na pesquisa realizada pela mdica Giselle Oliveira Seixas, tendo como orientador o Prof. Dr. Sidney Jlio de Faria e Sousa. Sei ainda que tenho garantido tanto o sigilo do doador e meu, quanto da causa que fez com que ele(a) no pudesse ter suas crneas transplantadas. O estudo visa caracterizao de uma protena (p25) que produzida pelo endotlio corneano e pode estar relacionada rejeio corneana.
Ribeiro Preto, ________ de ____________ de 200_.
Assinatura do responsvel pelo falecido
Anexos | 67
Anexo 3
Anexos | 68
Anexo 4
ANEXO DE PUBLICAO
Anexo de Publicao | 70
Caracterizao da protena p25 secretada pelo endotlio corneano
Giselle Oliveira Seixas, Sidney Julio de Faria e Sousa
Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e cirurgia de Cabea e Pescoo do Hospital das Clinicas de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo.
Endereo para correspondncia: Prof. Dr. Sidney Jlio de Faria e Sousa Av. dos Bandeirantes, 3900 Monte Alegre CEP: 14049-900 Ribeiro Preto SP Fone: 16- 3602-2862 Fax: 16- 3602 2860 e-mail: sidneyjulio@gmail.com.br
Resumo
Objetivos: Caracterizar a frao p25 secretada pelo endotlio de coelho, determinar se o endotlio humano a produz e se a produzir caracteriz-la. Material e mtodos: Crneas de coelho para caracterizar a p25 pelo mtodo de SDS PAGE - MALDITOF. Crneas humanas para fluorografia e posteriormente MALDI TOF. Resultados: A p25 do coelho a sintase de prostaglandina D (PGDS). A p25 que secretada pelo endotlio da crnea humana, vista na fluorografia, a cristalina B2. Concluses: As protenas secretadas pelo endotlio corneano de coelho (PGDS) e humano (cristalina B2) so conhecidas, inclusive presentes no olho, mas nunca haviam sido descritas como secretadas pelos endotlios corneanos.
Introduo
Estudando o perfil de sntese e secreo das protenas corneanas de coelho, imersas em meio de cultura RPMI-1640 enriquecido com prolina, fucose e metionina marcadas foi observado por Gobbi1 que o endotlio estava associado a uma frao de peso molecular entre 20 e 30 KDa (p20/30). O que despertou nossa ateno que ela estava presente no meio de cultura no no tecido corneano. Outro fato relevante que ela s aparecia na presena do endotlio. Conclui-se ento que ela era secretada pelo endotlio corneano1. Especulou-se ento que ela poderia servir como marcador da funo endotelial de crneas imersas em Optisol-GS (meio de preservao de crneas humanas)2,3,4,5,6, fornecendo, portanto estimativa do tempo de viabilidade endotelial nesse meio. Seixas7 realizou um estudo em que as crneas eram preservadas em meio de Optisol-GS por 4, 7, 14 e 21 dias no final dos quais elas eram incubadas em meio de cultura RPMI-1640 enriquecido com prolina triciada. Concluiu-se que em todos os perodos havia secreo da frao p20/30. Como do ponto de vista histolgico, aps 21 dias, as camadas corneanas no se encontravam mais em condies apropriadas de transplante, devido ao edema, o mtodo no nos pareceu adequado. Utilizando um gel de eletroforese (SDS-PAGE) com maior concentrao que o utilizado por Gobbi o peso aparente da frao p20/30 foi re-estimado como tendo 25 KDa7. A frao passou ento a ser referida como p25. Restava
caracterizar essa frao mediante o estudo do sequenciamento dos seus aminocidos. Ela poderia ser uma nova protena ou uma protena j conhecida, mas ainda no descrita como sendo produzida pelo endotlio. Restava ainda saber se esta frao tambm seria produzida pelo endotlio corneano humano, afinal at ento s havia sido estudado em coelhos.
Objetivos
Em funo das consideraes anteriores fixamos como objetivos do presente estudo: 1. Caracterizar a frao p25 secretada pelo endotlio corneano do coelho. 2. Verificar se a frao p25 secretada pelo endotlio corneano humano e caracteriz-la.
Material e Mtodos
Neste estudo foram utilizados os endotlios de 11 crneas humanas e de 5 crneas de coelhos. Os coelhos eram albinos (New Zealand), machos, pesando cerca de 2500g, com idade de 2 a 3 meses, sem alteraes oculares. Todos foram anestesiados utilizando cetamina 10% (Ketamina Agener 10%, Agener Unio, Unio Qumica Farmacutica Nacional S.A., So Paulo, Brasil) e Cloridrato de xilazina (Dopaser, Laboratrios Calier S.A., Barcelona, Espanha). A retirada da crnea era iniciada com uma inciso corneana circurferencial a 0,5 mm do limbo e completada com tesoura curva. O uso dos mesmos foi aprovado pela Comisso de tica em Experimentao Animal da FMRP-USP sob nmero: 110/2010. Os olhos humanos foram fornecidos pelo Banco de Olhos do HCFMRP USP. Faziam parte do material descartado devido a sorologia positiva (HBSag,
HCV, HIV) ou a defeitos estruturais que o incapacitava para transplantes. A retirada da crnea era feita da mesma forma que nos coelhos. O uso do tecido humano foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa do HCFMRPUSP sob nmero: 10736/2006. Tanto nas crneas humanas como nas de coelho o endotlio era separado do estroma com o auxlio de duas pinas dentro de placas de Petri com soro fisiolgico.
Os endotlios eram ento transferidos para placas de cultura de clulas de 24 poos (Corning Incorporated ). Cada poo continha uma nica unidade endotelial, com as clulas voltadas para cima. O correspondente a 50 l de prolina-3H (prolina triciada prolina L-[2,33
H]; 1,6TBq/mmol; 42,00Ci/mmol 1L=1Ci, Amershan), equivalente a 50 Ci
para cada crnea, era deixado secar em bomba de vcuo, por aproximadamente 2 horas. Depois de re-suspenso com 1 mL de RPMI-1640, era despejado nos poos da placa de cultura. Em seguida todo material era incubado a 37C, em ambiente com 5% de CO2 durante aproximadamente 20 horas1,7,8,9,10. Aps a incubao, os meios dos poos das placas eram preparados para dilise que durava 24 horas, perodo em que ficava sob agitao em cmara fria a 4C. Eram realizadas 2 trocas de gua mili-Q (a 4C) com intervalos de 8 horas. Aps a dilise, o volume era quantificado e em seguida liofilizado. Posteriormente, era re-suspenso em uma quantidade adequada de soluo de amostra (SA) para no ultrapassar 30 g de protenas por poo de gel de eletroforese7. Os endotlios eram divididos em 2 partes iguais e depois fixados com cinco banhos de etanol 70%, de 5 minutos cada. Uma parte era dissolvida em SDS a 4%, para posterior dosagem de protenas, e a outra em SA para eletroforese, ambas na proporo de 1mg de tecido para 20 L de cada soluo. Para a dosagem de protenas utilizou-se o mtodo do cido bicinchonnico com um espectrofotmetro (Hitachi U2000) com pico de absorbncia mxima de 562 nm7. As amostras dos tecidos e dos meios, dissolvidos em SA, foram submetidas eletroforese segundo o procedimento de Laemmli, 197011,12. A montagem e a corrida do gel foram feitas em instrumentos dedicados da Mighty Small II SE250 - Hoefer. Os gis eram todos de bis-tris poliacrilamida a 12,5%. O primeiro poo era destinado
ao peso molecular; nos demais, o preenchimento alternava tecido e meio, nessa ordem. A eletroforese era mantida sob as mesmas condies: 15 mA de corrente, 70-200 V e 1-2 W. Durava aproximadamente 2 horas. Ao fim da mesma os gis eram fixados e corados com Azul Brilhante de Coomassie 0,1% por 1 hora. Ao fim deste tempo o gel era fotografado e processado para fluorografia. A fluorografia consistia em deixar o gel, submetido eletroforese, imerso em soluo amplificadora (Amplify - Amersham Biosciences Inc., Amersham, Reino Unido) por 30 minutos. Depois de secado a vcuo (secador de gel Hoefer SE 540) era colocado contra o filme Hyperfilm MO (Amersham Biosciences Inc.) e guardado em cassete a prova de luz a -80C. Aps exposio por 30 a 90 dias o filme era revelado segundo instrues do fabricante do revelador e reforador GBX e do fixador e reforador GBX (Kodak)7. Para caracterizar a frao p25, 1 crnea de coelho e 1 crnea humana foram colocadas separadamente em meio de cultura RPMI - 1640 sem prolina triciada (3Hprolina) como processo preparatrio para eletroforese. Todo o procedimento de eletroforese utilizou gel na concentrao de 12,5%, corado pelo Coomassie Coloidal. A regio correspondente frao p25 foi cortada e analisada pelo mtodo do MALDI TOF.
Resultados
Caracterizao da p25 de coelhos A frao secretada pelo endotlio de coelhos foi caracterizada pelo mtodo de MALDI TOF. Ela a sintase de prostaglandina D e sua seqncia de aminocidos a que segue:
TLLLQPAGR (968.7) EFALLYSEGAK (1227.8) TLLLQPAGRPGR (1278.9) VTQGTTSVVQSFNR (1524.0) AQGFTEDLVVFLPR (1592.0)
Secreo da frao p25 pelo endotlio humano
24 kDa 18 kDa 14.5kDa
Figura 5 Fluorografia de gel de eletroforese 12,5%.
PM: peso molecular; MCH:
meio de crnea humana. As trs setas paralelas do MCH mostram a banda da frao p25.
Caracterizao da p25 humana
A frao secretada pelo endotlio de humanos foi caracterizada pelo mtodo de MALDI TOF ela a cristalina B2.
Discusso
A caracterizao da p25 de coelhos revelou que ela a enzima Sintase de Prostaglandina D (PGDS). Ela catalisa a isomerizao do PGH2 na produo da PGD213,14,15. A PGD2 regula a nocicepo, inibe a agregao plaquetria e age como mediadora alergnica15,16,17,18. Foram identificados e nomeados dois tipos distintos de PGDS: enzima tipo lipocalina (L-PGDS) e enzima hematopoitica14,15. Ela tambm tem importante papel no SNC estando associada transmisso sinptica, controle hipotalmico de temperatura, recuperao aps convulses, liberao de hormnio luteinizante, alm de sedao e induo de sono19,20,21. A PGDS j foi descrita como expressa na retina, ris e corpo ciliar e presente tambm nos fluidos oculares24,25,26,27,28. Alm de j ter sido descrita como sendo produzida por clulas do crebro, cardacas (micitos), epidrmicas de Langerhans, dendrticas drmicas, dendrticas plasmocitides, dendrticas mielides e endoteliais
vasculares13,14,16,19,20,21,22,23, no entanto, o primeiro estudo que demonstra a sua produo pelo endotlio corneano. Surgia ento a questo se e essa enzima tambm seria secretada pelo endotlio humano, o que constituiu o prximo objetivo deste estudo. Ela secretada pelo endotlio humano, mas ao invs da enzima PGDS foi caracterizada a cristalina B2,que uma protena solvel em gua encontrada no cristalino e na crnea favorecendo a transparncia destas duas estruturas29. Seu
aparecimento nestas estruturas pode ser explicado pelo fato de terem a mesma morfognese e funcionalidade similar29,30. A cristalina referida como enzimtica, por suas caractersticas de enzima29. Ela tambm foi identificada em outras localidades como corao, retina humana, testculo e crebro de ratos, retina de bois e em cnceres de mama avanados (em humanos)31,32. Em estudo recente, Ren et al.29 descreveram a expresso de A, e cristalinas no epitlio e endotlio de ratos em estgio embrionrio e que se mantinha at a fase adulta e que sua expresso no estroma era muito pequena. Este grupo estudou tambm a expresso destas protenas em humanos usando cultura de clulas epiteliais e de boto descartado de crneas doadoras (crnea do anel escleral, desprezado depois de retirada da regio central para transplante), e nestes tambm h expresso, mas em humanos no foi testada a secreo epitelial, estromal e endotelial separadamente. Outro estudo de Jester31 tambm descrita a presena de cristalina B2 na crnea, tambm no epitlio e estroma. At onde sabemos a primeira vez que a protena cristalina B2 descrita sendo secretada pelo endotlio humano. Alguns estudos avaliaram a existncia de alteraes da quantidade e qualidade de protenas presentes no humor aquoso de pacientes com rejeio ao transplante de crneas ou com cataratas34,35, e foi visto que h diferena significativa. Surge agora a dvida de se esta protena teria interferncia ou levaria de alguma forma rejeio dos transplantes de crnea, j que ela secretada pelo endotlio humano.
Concluses
1. A p25 secretada pelo endotlio da crnea de coelho a sintase de prostaglandina D.
2. o primeiro estudo que demonstra a produo da PGDS pelo endotlio corneano. 3. A p25 secretada pelo endotlio da crnea humana. 4. A p25 secretada pelo endotlio humano a cristalina B2. 5. Primeiro estudo que demonstra secreo da cristalina B2 pelo endotlio corneano humano.
Anexo 1
HOSPITAL DAS CLNICAS FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Eu, ________________________________________________________________,
abaixo assinado, tendo sido diagnosticado com rejeio de crnea/ realizado transplante de crnea, concordo em doar 5mL de sangue venoso para realizao de pesquisa ligada rejeio de crnea. Estou ciente, que no ato da puno venosa, pode haver formao de hematoma ou edema local. Estou ciente ainda de que meu nome ser guardado em sigilo e que a qualquer momento posso pedir para ser excludo do estudo, no acarretando isto, nenhuma perda ao acompanhamento de meu quadro clinico. O estudo em questo visa caracterizao de uma protena (p25) que produzida pelo endotlio corneano e pode estar relacionada rejeio corneana. A pesquisa est sendo realizada pela mdica Giselle Oliveira Seixas, tendo como orientador o Prof. Dr. Sidney Jlio de Faria e Sousa.
Ribeiro Preto, ________ de ____________ de 20__.
Assinatura do paciente ou seu responsvel legal Telefones para contato: Giselle Oliveira Seixas 3602-3147 Prof. Dr. Sidney Jlio de Faria e Sousa 3602-2862
Anexo 2

Eu, ________________________________________________________________,
abaixo assinado responsvel pelo Sr (a)_________________________________________, falecido em _________________, estou ciente e de acordo estou ciente e de acordo que em alguns casos (HIV, hepatites, VDRL positivo, tumores com metstases) para segurana do receptor, as crneas deste meu parente podem vir a no serem utilizadas para transplante de crnea, e se isto ocorrer podero ser utilizadas na pesquisa realizada pela mdica Giselle Oliveira Seixas, tendo como orientador o Prof. Dr. Sidney Jlio de Faria e Sousa. Sei ainda que tenho garantido tanto o sigilo do doador e meu, quanto da causa que fez com que ele(a) no pudesse ter suas crneas transplantadas. O estudo visa caracterizao de uma protena (p25) que produzida pelo endotlio corneano e pode estar relacionada rejeio corneana.
Ribeiro Preto, ________ de ____________ de 200_.
Assinatura do responsvel pelo falecido
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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO

Giselle Oliveira Seixas

Ribeiro Preto 2011

Giselle Oliveira Seixas

Orientador: Prof. Dr. Sidney Julio de Faria e Sousa

Ribeiro Preto 2011

Giselle Oliveira Seixas

RT SA SDS SDSPAGE T TBq Temed N,N,N,N Tris tris (hidroximetil) V W

3.1 Obteno das crneas de coelho

3.2 Obteno das crneas humanas

3.3 Caracterizao da frao p25

3.4 Secreo da frao p25 pelo endotlio humano

3.4.1 Obteno dos endotlios

3.4.2 Cultura endotelial

3.4.3 Processamento dos meios de cultura

3.4.5 Processamento bioqumico das crneas

3.4.6 Dosagem de protenas dos tecidos e meios

3.5 Marcador de rejeio endotelial

3.5.1 Obteno de sangue humano

3.5.2 Western Blot

3.5.2.1 Eletroforese do meio de cultura de crnea de coelho:

3.5.2.2 Transferncia das protenas para uma membrana de nitrocelulose (NC):

3.5.2.3 Reao com a membrana de nitrocelulose (Western Blot):

3.6 Avaliao da modulao da frao p25 pelo corticide

3.6.2.1 Transcrio reversa do mRNA da crnea para cDNA

3.6.2.2.Teste de presena do cDNA da PGDS por meio da PCR

4.3.1 Fluorografias de crnea humana e de coelho para comparao.

4.3.2 Fluorografia de crnea humana para evidenciar a p25.

24 kDa 18 kDa 14.5kDa

4.4 Caracterizao da p25 humana

4.5 Marcador de rejeio endotelial - Western Blot

4.5.1 Western Blot mostrando membranas de soros de pacientes normais.

4.6 Avaliao da modulao da frao p25 pelo corticide

4.6.1 Fluorografia de crneas de coelho controle e tratadas com corticide.

4.6.2 Teste de presena da PGD2S por meio da PCR

Com rejeio (11)

Sem rejeio (14)

Com corticide (7)

Sem corticide (4)

Com corticide (7)

Sem corticide (7)

Com marcao (0)

Sem marcao (7)

Com marcao (2)

Sem marcao (2)

Com marcao (2)

Sem marcao (5)

Com marcao (4)

Sem marcao (3)

3. Soluo de acrilamida (Acrilamida/ bisacrilamida 30:0,8):

4. Tampo de corrida: (soluo de estoque)

5. Tampo de Transferncia para Western Blot (soluo de Towbin et al):

6.Peso molecular para fluorografia:

7. Peso molecular para western blot:

8. Peso molecular para gel de agarose: 9. Gel de 10%; e 15%:

10. Fixador para gel de protena

11. Soluo de Amostra (estoque):

12. Tampo de Sorensen 0,1M

13. Azul Brilhante de Comassie 0,1%:

H2O qsp para 120,00 mL Colocar Metanol primeiro

14. Tampo Tris imune 2X:

15.Tampo de lavagem do Western:

16. Soluo de estoque de bloqueio para Western blot:

Ribeiro Preto, de __ de 20.

Ribeiro Preto, de ____ de 200_.

Ribeiro Preto, de __ de 20.

Ribeiro Preto, de ____ de 200_.