UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE MORELOS

Facultad de ciencias qumicas e ingeniera

Procesos de fermentacin
Trabajo: Practica # 7

Cromatografia de liquidos (HPLC) Extracto de te verde

Jerome Otniel Sarmiento Uriostegui

4 junio del 2012

Practica # 7 Cromatografa de lquidos (HPLC) Objetivo: Entender la cromatografa de lquidos (HPLC), y desarrollar habilidad en el manejo del equipo y cromatograma.

Introduccin: La cromatografa de lquidos es un mtodo de separacin fsica basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre una fase estacionaria y una fase mvil que en este caso es un lquido. La cromatografa liquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase estacionaria. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones lo cual genero la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que la fase mvil fluya a velocidades razonables. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. Dependiendo del tipo de fase estacionaria y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, la cromatografa liquida de alta resolucin puede clasificarse en: 1. Cromatografa de adsorcin: La fase estacionaria es un solido y se utiliza casi exclusivamente slice (silica) y en casos discretos almina. 2. Cromatografa de reparto o particin. Actualmente se utiliza como fase estacionaria compuestos ligados qumicamente a un soporte solido de slice. Se puede subdividir en cromatografa en fase normal y en fase inversa (usualmente mal llamada reversa por traduccin de reversed). En la cromatografa en fase normal la fase estacionaria es polar (como por ejemplo slice) y la fase mvil es poco polar (hexano, diclorometano, cloroformo). En esta modalidad los compuestos ms polares quedan ms retenidos mientras que los menos polares eluyen primero. En la cromatografa en fase inversa, el compuesto unido qumicamente es no polar, frecuentemente hidrocarburo aliftico, y se emplean las fases mviles son solventes polares (agua, metanol, acetonitrilo). En este caso, las sustancias mas polares eluyen primero y las hidrofobicas quedan ms retenidas. 3. Cromatografa de iones.: Se utilizan columnas rellenas con fases estacionarias con una determinada carga que retienen iones de carga opuesta. Las fases estacionarias para la modalidad clsica de esta cromatografa son las resinas de intercambio inico. 4. Cromatografa de exclusin por tamao: La fase estacionaria esta formada por partculas de porosidad definida y uniforme. Las molculas de mayor tamao tienen menor capacidad para acceder a los poros y por mantenerse excluidas eluyen ms rpido, mientras que las de menor tamao que pueden penetrar en los poros y permanecer all ms tiempo eluyen en ltimo lugar.

Un equipo para cromatografa liquida de alta resolucin puede representarse por el siguiente esquema:

La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una proporcin determinada y realice la mezcla en una cmara de mezclado. Cuando durante toda la separacin se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar gradientes de composicin de solvente para aumentar el rango de polaridades de sustancias a separar acortando el tiempo total de anlisis. Estos gradientes de solvente tambin son realizados en forma automtica por las bombas. La bomba enva al solvente hacia la vlvula inyectora a travs de tuberas de dimetro pequeo, de acero inoxidable o de plsticos especiales. El objeto de utilizar este tipo de vlvulas es de no interrumpir el flujo de fase mvil a travs de la columna e introducir en el flujo de la misma un volumen de muestra que estar contenida en un tramo de tubera de volumen fijo (loop). Luego de que se produce la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan por el detector que genera una seal elctrica ante el pasaje de los analitos proporcional a la cantidad de sustancia. Esa seal es enviada al registrador o a la PC en donde queda registrado el cromatograma. En el caso ideal los picos cromatogrficos son gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El integrador puede calcular adems el rea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia. Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los productos que salen de l. De esta manera, dependiendo del tamao del loop de inyeccin y de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar adems de separaciones analticas, cromatografas preparativas. Parmetros Relevantes Los parmetros tericos que caracterizan las separaciones cromatogrficas por HPLC son idnticos a los descriptos en cromatografa gaseosa. En HPLC, en lugar de variar la

temperatura de la columna para mejorar la resolucin del cromatograma, se cambia la composicin de la fase mvil a lo largo de la separacin utilizando mezclas de entre dos y cuatro solventes. Etapas del Anlisis de una Muestra Son idnticas a las puntualizadas para cromatografa gaseosa. En lo que respecta a la optimizacin de las condiciones experimentales, en este caso es posible realizar ensayos preliminares orientativos utilizando cromatografa en capa delgada con la misma fase estacionaria que contiene la columna. Por otra parte es necesario tener en cuenta que dado que se utilizan altas presiones, es imprescindible evitar la presencia de partculas que puedan obstruir las tuberas y la formacin de burbujas que puedan deteriorar el relleno de las columnas y producir inestabilidad en la seal del detector. Para evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran con membranas de 0,45 a 0,22 m. Para evitar la formacin de burbujas, los equipos de HPLC cuentan con desgasificadores de solvente por vaco o por burbujeo con He y, en el caso de no contar con los mismos, se deben desgasificar los solventes por medio de ultrasonido o agitacin bajo vaco antes de utilizarlos como fase mvil. Reactivos y materiales: Te verde Metanol calidad HPLC Agua de baja conductividad para HPLC. Equipo millipore Jeringa para purgar Vaso de plstico Filtros de tefln de 0.4m Filtros de celulosa de 0.4m Equipo HPLC.

Procedimiento: Seleccionar el solvente o composicin si es una mezcla, de acuerdo al analito que se estudiara. Y de acuerdo al catalogo del proveedor para la muestra de te verde. Segn el catalogo se utilizara un equipo: Zorbax SBC-8 4.6 * 150mm (dimetro por longitud de la columna) 3.5m (tamao de la slice) 75% 0.1% acido trifluoroacetico; 25% Metanol (es nuestro sistema: 75% agua que llevara 0.1% de acido trifluoroacetico y 25% Metanol) Puesta en marcha: 1- Preparacin de los solventes: - Los solventes se filtran con equipo millipore, en este caso se utilizaran Metanol y Agua. - Se utilizan filtros de tamao de poro de 0.4m. Para el Metanol se utilizan filtros de tefln y para el Agua de celulosa.

2- Preparamos la muestra a analizar, l te verde lo disolvemos en una cantidad pequea de agua. - Filtramos la muestra con una jeringa de 5ml unida a un soporte conteniendo un filtro de nylon de 0.45m, y se recoge en un vial. En otro vial adicionamos el agua. 3- Purgamos las lneas del solvente en el equipo HPLC. - Cerciorarnos cuales son las lneas de cada solvente y succionar con una jeringa de 10ml hasta sacar todas las burbujas que se encuentren, despus de la ultima burbuja succionar un poco mas de 5ml de solvente. - Verificamos que no se hallan mojado los sensores del equipo, si es as secarlo con un papel.

4-

Encender el equipo HPLC as como el monitor y el programa de comando: Esperar a que el equipo haga sus pruebas de calibracin. Purgamos las bombas, verificamos que no salgan burbujas. Checar que la columna este puesta y que el filtro no este sucio, si lo esta lo lavamos con agua con baja conductividad la misma que utilizaremos como solvente.

Modificamos el mtodo de acuerdo a las instrucciones del proveedor para el extracto de te verde.

Segn el proveedor debe ser el sistema ya mencionado de Metanol-Agua y con las siguientes condiciones: 5Flujo:1ml/min Temperatura: 40C UV 280nm Muestra 5l Tiempo 15 minutos. Estabilizamos la columna haciendo subir el flujo de 0.2 en 0.2 ml hasta llegar a 1ml que es el flujo estndar. (subimos gradualmente observando que se estabilice la presin de las bombas). De acuerdo a las graficas observar si esta contaminada la columna. Ya que se estabilice podemos comenzar a inyectar la muestra desde la computadora.

Observaciones: Fue necesario purgar las bombas y los solventes para un mejor anlisis de la muestra, adems que de lo contrario se puede daar el equipo por los cambios de presin que pudieran aparecer por las burbujas. Se utilizo el agua porque es un solvente para l te verde y el metanol de acuerdo al catalogo para obtener un mejor tiempo de retencin de los componentes y permitir que se observen en el cromatograma. Al desarrollar la prctica tuvimos que parar el equipo debido a que existan aun burbujas en las lneas del solvente Metanol, debido a una mala purga. La columna se estabiliza aproximadamente en 10 o 15 minutos, sin embargo por cuestiones de tiempo no esperamos por completo e inyectamos la muestra. Se obtuvo el siguiente cromatograma.

Observamos que el cromatograma nos proporciona la relacin de unidad de absorbancia (UA) contra el tiempo. Entre mas luz absorba el compuesto quiere decir que esta mas concentrado y por lo tanto el pico es mas alto. Aunque en el catalogo eran 5 picos los que tenan que salir, aqu solo obtuvimos 4 debido a que tal vez falto tiempo para que fuera completo el anlisis. Debajo de la grafica se encuentra una serie de datos que dan descripcin de los compuestos encontrados, sin embargo, el anlisis es de acuerdo a cada pico que se formo. Cada uno es un compuesto encontrado, el rea de cada pico es proporcional a la cantidad de sustancia. As la ultima columna de los datos donde dice rea %, su sumatoria debe dar el 100%. Conclusin: Con el desarrollo de esta practica y la explicacin del profesor pude conocer cada parte del equipo de cromatografa de lquidos HPLC (cromatografa liquida de alto rendimiento), adems de su correcto uso para el anlisis de una muestra. Adems de entender a grandes rasgos como leer un cromatograma y saber que datos arroja. Los compuestos obtenidos fueron del extracto de te verde que son: Epagallocatechin, epicatechin, epigallucatechin gallate y catechal. Me dio una visin mas amplia para conocer los compuestos y la cantidad de ellos en una muestra liquida. Bibliografa: catedras.quimica.unlp.edu.ar/qa3/guas/2008-TP-12-HPLC.pdf