Manual de Indicaciones Tcnicas para Insectarios

Dra. Omayda Prez, Lic. Jinnay Rodrguez, Lic. Juan A. Bisset PhD, Tc. Maureen Leyva, Tc. Manuel Daz, Lic. Omar Fuentes, Tc. Francisco Ramos, Tc. Ral Gonzlez y Lic. Israel Garca PhD

Ciudad de La Habana, Editorial Ciencias Mdicas, 2004

CONTENIDO Resumen / 1. Introduccin/ 2-3. Captulo I: Reglamento y regulaciones internas /4. Captulo II: Caractersticas de las instalaciones/5-8. Captulo III: Normas generales del insectario/9. Captulo IV: Principios ticos/10. Captulo V: Medidas higinico sanitarias/11-12. Captulo VI: Especies perjudiciales/13-15. Captulo VII: Manejo de las especies en insectario: metodologa de cra y medidas de bioseguridad/16-53. ndice de fotos. Foto 1. Instalacin de la fase larval de cualquier especie de culcido/5. Foto 2. Instalacin para la fase adulta de cualquier especie de insecto/6. Foto 3. La araa Nesticodes rufipes aislada en nuestro laboratorio/13. Foto 4. Tapinoma melanocephalum hormiga depredadora de huevos de Aedes aegypti/14. Foto 5. Diferentes estadios inmaduros de Aedes aegypti/18. Foto 6. Jaula para adultos de mosquitos Aedes aegypti/27. Foto 7. Animales utilizados para la hematofagia. A: Curiel, B: Ave corral, cepo que la contiene/29-30. Foto 8. Diferentes estadios inmaduros (larvas y pupas) de Culex quinquefasciatus/33. Foto 9. Eliminacin de larvas o pupas y el lquido de cra con tamiz/36. Foto 10. Tratamiento para desechar torundas con azcar utilizados en la fase adulta de culcidos/38. Foto 11. Alimentacin de Triatoma flavida, utilizando curiel/41. Foto 12. Recipiente de mantenimiento de Blattella germanica/43. Foto 13. Bandeja con medio contenida en la de aserrn/51. Foto 14. Larvas y pupas que migraron del medio al aserrn/52. Bibliografa/54-59. Agradecimientos/60.

MANUAL DE INDICACIONES TCNICAS PARA INSECTARIOS.

RESUMEN. El insectario constituye la base para la cra y el mantenimiento de insectos que se utilizan con fines investigativos, docentes u otros. El presente trabajo, responde a la necesidad de que exista un manual para la cra y manejo de las diferentes especies de insectos, vectores de enfermedades del hombre y otros animales, que se colonizan en el Insectario del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kour , que permita homogenizar los parmetros a tener en cuenta, con el propsito de obtener un material biolgico de ptima calidad. Este manual tambin incluye las medidas de bioseguridad que deben ser consideradas para el trabajo con estos insectos. En este documento se describen procedimientos o metodologas para la cra de insectos de las familias: Culicidae (Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus), Blattellidae (Blatella germanica), Muscidae ( Musca domestica ) y Reduviidae (Triatoma flavida ) elaborados en base a la propia experiencia de 5 aos de trabajo, y a lo descrito en la literatura. Se incluyen adems, aspectos relativos a: Reglamento y regulaciones internas del insectario, caractersticas de las instalaciones (iluminacin, temperatura y humedad relativa), rea de cuarentena, principios ticos, medidas higinico sanitarias y organismos perjudiciales.

INTRODUCCION El Insectario constituye la base para la cra y mantenimiento de los insectos que se utilizan con fines investigativos, docentes u otros. El Insectario del Departamento de Control de Vectores del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kour , en la Ciudad de la Habana, Cuba, se dedica a la colonizacin de algunas especies de insectos que resultan de inters para las investigaciones mdicoepidemiolgicas, que estn directamente vinculadas a las prioridades de los Programas Nacionales de Salud del pas. Las principales especies representadas pertenecen a las familias: Culicidae (Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus), Blattellidae (Blatella germanica), Muscidae (Musca domestica) (Triatoma flavida). Es un requisito fundamental en la cra y mantenimiento de insectos, el conocimiento de las tcnicas y condiciones ambientales necesarias para el y desarrollo de estos, lo que justifica la creacin de una gua o manual que las refleje, con el objetivo de lograr homogeneidad, tanto en una como en otro, as poder obtener un material biolgico ptimo para el trabajo con los mismos. Otro aspecto importante es el relacionado con el control y la exigencia al personal involucrado en el trabajo con estas especies, ya que constituyen vectores de enfermedades del hombre y otros animales. Entre los pocos trabajos que reflejan de manera integrada el manejo de insectos en condiciones de insectarios se encuentran: Manual de la OPS, 1984, Consoli e De Oliveira, 1994, adems en nuestro pas existe la necesidad de buscar uniformidad en el trabajo de la cra y mantenimiento de los diferentes insectos que se utilizan en las investigaciones bsicas y aplicadas en el campo de la 2 y Reduviidae

entomologa mdica y en el control de vectores. Por estas razones nos dimos a la tarea de elaborar el presente manual, para las condiciones propias de Cuba.

Captulo I: Reglamento y Regulaciones internas Este reglamento constituye un documento oficial, y fue elaborado por directivos e investigadores del Departamento de Control de Vectores del IPK. Contiene las indicaciones para el trabajo en el insectario, y se cre para regular la actividad del mismo desde su inicio. Este contempla los siguientes acpites: 1. - Acceso al Insectario. Ser limitado para el personal ajeno al mismo, el cual deber ser autorizado por los directivos establecidos. Se dispondr de un libro de registro y control del personal. 2. Regulacin de especies vectoras a colonizar. Las especies en cra se expondrn de manera visible y su utilizacin se justificara debidamente, acorde con los temas de investigacin de nuestra Institucin, u otros autorizados por el personal correspondiente. En cada cubculo, se deben delimitar las especies de mosquitos, u otros

insectos, de riesgo biolgico con barreras fsicas para evitar su fuga. 3. Solicitud de material biolgico institucional.Todo material biolgico

que se solicite; se debe controlar mediante un registro. 4. - Solicitud de transportacin de material biolgico del Insectario a otros centros. Se realizar con previa autorizacin de los directivos establecidos.

Captulo II: Caractersticas de las Instalaciones II.1 Distribucin de los locales. Nuestro insectario se proyect segn normativas nacionales e internacionales que responde a los requisitos descritos por algunos artculos tales como: Consoli e De Oliveira ( 1994 ), de Vectores OPS OMS, (1983, 1984) y el Curso Internacional Control y Epidemiologa y Control de Enfermedades Transmitidas por entrada y salida del personal, y tiene en total 10

Vectores, Universidad Carolina del Sur, EUA (1982). * Presenta una puerta de instalaciones: 4 cuartos para la cra de la fase larval. Ver Foto 1.

Foto 1. Instalacin de la fase larval de cualquier especie de culcido

4 para la cra de adultos de diferentes especies de insectos. Ver Foto 2

Foto 2. Instilacin para la fase adulta de cualquier especie de insecto. - Un rea independiente, para bioensayos de culcidos, donde se evala la la cual dispone de estantes movibles, donde se

susceptibilidad a insecticidas, los insectos hematfagos.

mantienen los animales (mamferos) que sirven de fuente de alimentacin para - Un ltimo cuarto, destinado a la cuarentena de los insectos que ingresan al Laboratorio procedente de la naturaleza. Cada grupo de trabajo, dispone de una o dos instalaciones para desarrollar la colonizacin de las especies de acuerdo a sus requerimientos bioecolgicos. Estas instalaciones cumplen con los siguientes requisitos:

Para la fase adulta, se disponen de cubculos que tienen los compartimientos (tres) limitados por puertas con mallas de orificios pequeos (1 mm cuadrado), para evitar la fuga de insectos voladores.

Para las larvas, poseen una sola barrera, que es la puerta que comunica la instalacin con la puerta de salida. Todos los conductos de salida de ventilacin, as como las puertas estn protegidos por mosquiteros. El piso posee un tragante especfico con tapa de rosca.

* En lo adelante se designara con las siglas CICVECETV( 1982). II. 2 Iluminacin. Debe ser permanente y estable, segn OPS- OMS (1983) que plantea que tanto la intensidad como el foto perodo afectan el ciclo de vida de los mosquitos, y que ambos tienen valores especficos para cada especie. No obstante, otros investigadores Consoli e De Oliveira (1994), CICVECETV (1982); sealan que 10 horas de oscuridad y 14 de luz es lo ms indicado para la mayora de la especies. En nuestro laboratorio, lmpara de disponemos de iluminacin artificial fluorescente, una con un foto

40 Watt en cada compartimiento de la instalacin,

perodo de 10 horas de luz y 14 de oscuridad para todas las especies. Existen otras experiencias ( CICVECETV, 1982 ) en las que se ha aplicado este mismo foto perodo para el estadio larval de mosquitos, y completa oscuridad para la fase adulta, a fin de estimular la reproduccin. En condiciones similares trabajaron Gonzlez (1985) y Flaming (1987) para la colonizacin de Anophele, las cuales no mantuvieron para otras especies.

II. 3 Temperatura y Humedad Relativa. Las larvas de los mosquitos viven en medio acutico, y las mismas pueden verse afectadas por variaciones de la temperatura ambiente. De manera general, se reconoce la existencia de un rango de temperatura, cuyo limite mnimo corresponde al retardamiento o parada del desarrollo de la larva ,y el limite mximo a un efecto letal . Existe otro rango favorable al desarrollo larval , que se identifica en base a la tasa de mortalidad, de 14 a 30 0 C (Forattini, 2002). La temperatura optima para el desarrollo, varia para cada especie, encontrndose entre 24 y 28
0

se sita entre 20 y 30

C,

aunque se pueden observar casos como el del Aedes aegypti, con un intervalo

C para la mayora de los mosquitos tropicales; y la humedad

relativa se describe, entre 70 80 % ( Consoli e De Oliveira, 1994 ) . Segn la OPS (1983), la mayor dificultad en los pases tropicales es mantener estas condiciones, para lo que recomiendan instalar plantas de aire acondicionado y equipos humidificadores que provean de la temperatura y humedad necesaria. Similares condiciones existen en nuestro insectario. II. 4 rea de Cuarentena. Se debe crear con el propsito de observar adecuadamente a los insectos que se ingresan de la naturaleza, para evitar la reproduccin de especies que no sean las deseadas. Las deseadas debern reproducirse al menos una generacin bajo estas condiciones, y despus se deben eliminar los individuos que les dieron origen. (Ponencia Normas en la manipulacin del Insectario, Avila, 1989, sin publicar).De esta manera, se impide la introduccin de patgenos al local donde se encuentran las colonias establecidas. El resultado ser una F1, a partir de la cual se trabajar (Hernndez y Garca, 2000).

Captulo III. Normas generales del Insectario.

Las normas generales (Consoli e De Oliveira, 1994) para este tipo de instalacin son: Deben estar alejadas del almacenamiento de productos qumicos. Deben tener buen aislamiento trmico y de la humedad. No debe tener ventanas. Las superficies de las paredes deben ser lisas, claras y lavables, y el piso de cermica. Debe haber suficiente agua potable en las llaves y al menos una debe estar instalada al agua declorinada. Solamente se dispondr de una puerta de entrada y salida al insectario, aledao a una antecmara pintada de color claro y bien iluminada la cual debe poseer otra puerta de cierre hermtico. Antes de salirse del insectario, se debe revisar bien para evitar que escapen mosquitos. Proteger con mosquiteros las salidas de ventilacin. Tratar por filtracin o ebullicin el agua de las cras de culcidos antes de desechar. Los huevos se pondrn a eclosionar en bandejas tapadas. Diariamente se recolectan las pupas de las bandejas y se colocan recipientes con agua dentro de las jaulas. Se recomienda, para alimentar a los adultos, colocar los animales sobre la jaulas y no dentro de ellas. en

Captulo IV. Principios ticos. Existen regulaciones para la cra de mosquitos y otros insectos, que constituyen vectores de enfermedades humanas y de otros animales. Estas regulaciones han sido dictadas por: el Ministerio de Salud Pblica de Cuba (MINSAP), la Unidad Nacional de Vigilancia y Lucha Antivectorial (UNVLA), el Reglamento Interno del Departamento de Control de Vectores del IPK para el trabajo en este tipo de instalaciones y, ms recientemente la Resolucin 103 del 2002 de la Academia de Ciencias de Cuba (ACC), que plantea que se debe justificar correctamente la cra de especies transmisoras de enfermedades y evitar la introduccin de especies vectores que no existan en el pas. Investigadores como Consoli e De Oliveira (1994) y Torrealba (1998), coinciden con el criterio de que estas especies deben ser colonizadas de manera justificada. Para el uso de los animales como fuente de alimentacin en el insectario, se han tenido en cuenta las regulaciones de los Principios ticos Internacionales para la experimentacin animal. Entre ellos se plantean como aspectos generales mas importantes La responsabilidad del experimentador de evitar al animal todo sufrimiento fsico o psquico. Debe llevar a cabo los mtodos que permitan limitar el sufrimiento y los dolores en caso que estos sean inevitables (Revista de Experimentacin Animal (SEEA) 1990), vigentes en nuestro pas y de conocimiento del Instituto Medicina Veterinaria de Cuba. (Consulta personal, Dr. Oscar Ricardo Reyes (Julio, 2004).

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Captulo V. Medidas Higinico Sanitarias. Nuestras experiencias de trabajo nos permiten sugerir las siguientes medidas: 1. Todo el instrumental que se utiliza en el laboratorio, se debe limpiar

mecnicamente con abundante agua potable sin detergente (en caso de aplicarse, debe enjuagarse bien y no utilizarse en el momento). Las jaulas de mosquitos y cepos de animales si debe incluirse la desinfeccin mecnica con soluciones de detergente y despus de enjuagarse bien, aplicar secado con rayos solares, para utilizar la accin bactericida de los rayos ultravioletas. 2. Asimismo se debe evitar el contacto con el piso, u otras fuentes de infeccin, del material para el mantenimiento de los insectos. 3. Otro aspecto de importancia es la desinfeccin: Fsica (por autoclave) de las bandejas esmaltadas o metlicas, as como la qumica de las mismas con cidos fuertes (mezcla sulfocrmica), con una periodicidad, semestral. 4. No se debe poner en contacto ningn material del insectario (jaulas, bandejas, jamos y tamices entre otros) con insecticidas qumicos. 5. El personal que trabaja en el rea, debe utilizar artculos de proteccin e

higiene como: Batas sanitarias, guantes, nasobucos u otros, segn se requiera. Estas medidas estn encaminadas a proteger el material biolgico que se

reproduce en estas instalaciones, pues de este modo evitamos la incorporacin de agentes infecciosos. Sobre este aspecto, Consoli e De Oliveira, 1994 sealan que la contaminacin accidental de colonias de mosquitos puede ocurrir a travs

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del agua, el alimento no esterilizado y los utensilios contaminados. Sin embargo especficamente para la cra de Anopheles nueztovari, Avila et al, 1993 apuntaron que el elemento clave consiste en la limpieza diaria del medio de cra.

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Captulo VI. Especies perjudiciales. De acuerdo a nuestras experiencias podemos decir que, en las condiciones de nuestro insectario, existen especies que conviven con los organismos en cra, y que son ajenas a ellos, algunas de las cuales les identificado araas en muestra en la Foto 3 diferentes sitios provocan daos. Se han siendo la ms perjudicial Nesticodes

rufipes (Lucas, 1846), la cual habita en las jaulas de los mosquitos adultos. Se

Foto 3: La araa Nesticodes rufipes, aislada en nuestro laboratorio. As como la cucaracha Periplaneta americana (Linnaeus, 1758),que invade las colonias de B. germanica, y la hormiga Tapinoma melanocephalum (Fabricius 1793),que daa los huevos de los culcidos en cra. Ver Foto 4. (Ref Pg. 14).

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A: Vista lateral

B: Vista dorsal

Foto 4. Tapinoma melanocephalum hormiga depredadora de huevos de Aedes aegypti. Imagen tomada; base de datos Japonesa, disponible en: http//ant.edb.miyakyo-u.ac.jp/E/Taxo/F70301.htm Las muestras fueron procesadas y diagnosticadas por especialistas del Instituto de Ecologa y Sistemtica y del Museo Nacional de Historia Natural, pertenecientes a la Academia de Ciencias de Cuba. La hormiga T. melanocephalum estuvo presente en el insectario en todas las estaciones del ao, y es capaz de depredar huevos de Aedes aegypti tanto en las tiras de papel como en los recipientes donde se produce la ovipuesta ( Prez O, 2004; en Publicacin. Efecto de Tapinoma melanocephalum ( Hymenoptera: Formicidae) sobre huevos de Aedes aegypti ( Dptera:Culicidae ). Tambin fue hallada depredando los huevos de Triatoma flavida. Las araas identificadas en las instalaciones de cras, se consideran inofensivas para el hombre, sin embargo, la especie Nesticodes rufipes, aislada del interior de las jaulas de mosquitos de la especie Culex quinquefasciatus y Aedes aegypti, provoca inmovilizacin de los adultos por medio de la tela de araa que construye, lo que le permite extraer los lquidos corporales y albopictus por Sulaiman et al (1996), identificar especies de 14 queda slo el exoesqueleto de estos. Estas observaciones coinciden con las realizadas en Aedes al aplicar una tcnica serolgica e

araas que representaron nuevos registros de hospederos depredadores de esta especie de mosquito. Las cucarachas Periplaneta americana, se consideran vectores mecnicos de

agentes infecciosos,

y pueden ser encontradas dentro de los cuartos de cra

(Consoli e De Oliveira, 1994).

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Captulo VII. Manejo de las especies en el Insectario: Metodologa de cra y medidas de seguridad biolgica. Para la cra de mosquitos y otras especies, resulta importante lograr un clima estable a temperatura y humedad ptimas, similares a las de su habitats. La mayora de las especies, admite parmetros de temperatura y humedad similares( para fase inmadura y adulto ), y muchos investigadores coinciden en que los rangos ptimos son los siguientes: 24 - 28 0 C para la temperatura y 70 -80 % de humedad relativa ( Consoli e De Oliveira, 1994, Carrillo et al, 1981, Van Handel E, 1986 y Moreno S, 1999). No obstante, cada especie debe tener su cuarto de cra independiente, ya que su desarrollo no depende slo de la temperatura y la humedad relativa, sino que cada una tiene otros requerimientos que le son propios, segn su bioecologa. Aedes aegypti ( Linnaeus , 1762). Huevos Se recolectan sobre una superficie slida hmeda, proporcionada por un papel de filtro (o de cualquier tipo rugoso) de 4-5 cm de dimetro, que se coloca en el interior del recipiente de ovipuesta, y que se le aade agua hasta una altura en el papel, por encima de los 2,5 cm. La misma debe estar lo ms limpia posible por las exigencias de esta especie. Despus de que se extraen los huevos de estos recipientes, se someten a un proceso de maduracin del embrin. Para guardar huevos que puedan servir en otro momento, estos deben ser secados entre 24 y 48 horas de puestos, ya que este es el tiempo requerido para que se complete el desarrollo embrionario. Si

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este proceso se asegura, entonces resisten la desecacin por perodos de seis meses a un ao. (CICVECETV, 1982), Consoli e De Oliveira, 1994, Moreno. S, 1999, Hernndez et al, 2000). Otros autores, como Pumpini et al (1992), para este proceso de maduracin. Segn Pumpini (1992) y Forattini (2002), existe un fenmeno llamado diapausa que puede ocurrir en mosquitos que depositan sus huevos fuera del agua, como los de los gneros: Aedes, Haemagogus y Psorophora, el cual provoca una el para evitar dicha suspensin, se sugiere dejar que el suspensin temporal de la eclosin del huevo por quedar inconcluso desarrollo embrionario; propician este fenmeno: Foto perodo, temperatura y nutricin de la hembra en su etapa larval. Posteriormente al periodo de maduracin, los huevos recolectados se almacenan en el laboratorio a una temperatura de 25 280 C y una humedad relativa de 70 80 %, envueltos en papel gaceta debidamente rotulados y se mantienen en estuches de nylon, protegidos de la accin de las hormigas depredadoras. Nuestra experiencia nos permite inferir, que para la eclosin de los huevos, los mismos se deben colocar en agua declorinada (libre de Cloro) a una temperatura de 27 370 C y dejar en reposo 24 horas. Burguess (1959) recomienda, para favorecer la eclosin, la utilizacin de agua desoxigenada, la cual se obtiene por ebullicin de agua potable que se mantiene tapada hasta su utilizacin. Cuando se desea eclosionar los huevos, se coloca el
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proponen un rango de 30 a 40 horas

embrin madure. Adems plantean que existen varios factores extrnsecos que

papel que los contiene en el interior del recipiente tapado, con agua procesada a la temperatura (ideal) de 28 - 29 0 C. Los huevos no se deben utilizar antes de las 72 horas de la ovipuesta, pues de hacerlo, no se producira la eclosin, debido a la no maduracin del embrin referida anteriormente. (Pg. 16, ultimo prrafo y 17, 1er prrafo) Fase larval o fase inmadura. Esta fase se desarrolla en un medio acutico. Del huevo eclosionado emerge una larva de primer estadio, cuyo tamao es de 1 mm al inicio y al final, de 7mm, la cual pasa por tres estadios ms (II, III, IV). La diferencia entre los estadios larvales radica en el tamao, como se muestra en la Foto 5.

Foto 5. Diferentes estadios inmaduros de Aedes aegypti.

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En esta fase, es importante que se tenga en cuenta el espacio vital, de acuerdo al tamao de las bandejas. Segn el Instituto Pasteur (1998) se mide en centmetros cuadrados el rea de la bandeja (A= ancho x largo) y al resultado se le aplica una Regla de Tres. En el caso de Aedes aegypti , las bandejas utilizadas fueron de 25x 25 cm2 para 500 700 larvas con 2 litros de agua, y en el caso de Culex quinquefasciatus de 35 x 35 cm2 para 800 1000 larvas por 3 litros de agua. Del mismo modo se puede calcular el agua que debe colocarse en las bandejas de cra. Ejemplo: Para una bandeja de un rea 121.5 cm2 (13.5 cm x 9.0 cm ) , entonces si para 500 larvas de Aedes aegypti la bandeja seleccionada tiene un rea de 625 cm2 , la Regla de Tres se planteara de la siguiente manera: 500 larvas ______________625 cm2 X larvas ______________121.5 cm2

500 larvas x 121.5 cm2 X larvas=--------------------------------------625 cm 2 Se cancelan los cm2 y la ecuacin queda: 500 larvas x 121.5 X = ------------------------------------------625 60750 X = ------------------------------------------ = 625 X = 97 larvas 97.2 larvas

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Es decir en una bandeja cuya rea sea larvas.

121.5

cm

, se podrn colocar 97

El clculo del espacio vital se debe realizar en el estadio I, y debe tenerse en cuenta el cuidado que hay que tener en esta etapa para la manipulacin de las larvas, por la poca Quitina que poseen. De tal modo, se deben utilizar goteros de boca ancha para el conteo de las mismas en un microscopio estereoscpico. Gadelha e Toda (1985) plantean que el ciclo larval dura de 5-7 das para esta especie, en dependencia de las condiciones del medio (temperatura, alimento, espacio vital). Soekiman et al (1986) por su parte reportan una media de 7.62 0.64 das para las especies Aedes aegypti y Aedes albopictus, a una temperatura
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entre 28 y 29 0C. En nuestras condiciones se obtuvo como resultado para Aedes aegypti 6.16 das y 7.51 para Aedes mediovittatus a una temperatura de 26 (Moreno S, 1999). Alimentacin del periodo larval, nutrientes y dosis. Numerosas son las dietas utilizadas para alimentar las larvas de mosquitos: las de origen natural y artificial; entre estas ltimas podemos mencionar: Levaduras, alimentos para perros (galletas), migas de pan, harina Bacterias, protozoos de excretas de conejillos de sangre disecada e hgado de ternero. (CICVECETV 1982). Entre las naturales, las ms utilizadas son: de indias, hierba de csped etctera. ( Fleming, 1986, CICVECETV, 1982 y OPS, 1983 ). Otros investigadores, como Clements (1963), sealan la importancia de fuentes proteicas para la produccin de huevos de mosquitos. C

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Existe una gran variedad de dietas, elaboradas con numerosos ingredientes de diferente naturaleza (Asahna, 1964; de protenas y carbohidratos, Gahan, 1966; Baerg, 1971; Reisen y de grasas; adems de Mahmood, 1980). No obstante, la mayora de las dietas tiene un alto contenido y una baja proporcin contener levaduras, vitaminas del complejo B y minerales. Consoli e De Oliveira, 1994 plantean que durante el perodo larvario cada larva debe consumir en total de 3 - 6 mg de alimento y del mosquito es sumamente importante, concidern que este perodo debido a que en esta etapa ellos

almacenan protenas y glicgeno, que son fundamentales para el desarrollo de los estadios de pupa y adulto. Adems indican que para que ocurra la produccin normal de huevos, la dieta debe contener por lo menos Fenilanina, Treonina, Triptfano y Valina. En cuanto a las necesidades de carbohidratos, los mismos autores sealan que su ausencia retarda el desarrollo larvario. Del mismo modo, sin la presencia de lpidos en la dieta, las larvas no logran sobrepasar los estadios finales, y el Colesterol, especialmente importantes. De acuerdo con nuestras experiencias prcticas, en Aedes aegypti , coincidencia con Fleming (1986), y Avila et al ( 1993) para Anopheles, exceso, se desarrolla una pelcula de respiracin y alimento se agrega en muerte de las larvas. y en si el la Cefalina y la Lecitina son los 10 aminocidos esenciales siguientes: Arginina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina,

grasa en la causa la

superficie del agua de cra , la cual puede impedir la

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Las larvas tambin necesitan vitaminas, y el orden de las esenciales,es Biotina, Colina, cido Nicotnico, cido Pantotnico, Riboflavina, Piridoxina y Tiamina. El cido flico es importante en la pupacin ( Lea and De Long, 1958). Los alimentos se esterilizan para evitar contaminaciones con microorganismos patgenos a las larvas como son hongos y bacterias, esta ltima Bacillus. Preparacin del alimento. Para la alimentacin de las larvas, se debe conocer la fisiologa de las distintas especies, as como sus hbitos, lo que determinar la forma en que se les deben proporcionar las partculas de alimentos; por ejemplo: Para las especies Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus se humedece el alimento con agua, con el propsito de que las partculas vayan al fondo de la bandeja de cra; este procedimiento no se aplica para el gnero Anopheles, debido a que obtiene el alimento en la superficie por la ausencia de sifn, entonces las partculas secas y pulverizadas se esparcen en la superficie del agua de cra. Pasos a seguir en la preparacin del alimento. 1- El alimento ya pasado por un tamiz 1 mm 2 ( para eliminar partculas gruesas) se esteriliza , en autoclave 121 0 C a 2 atmsfera 15 20 min. 2- Se calcula la cantidad de alimento en dependencia del estadio, nmero de individuos por bandeja y dosis ( esquema 1,2,3; Pg. 24 y 25 ) 3- Saturar la cantidad calculada con agua declorinada o potable, durante alrededor de 5 minutos. del gnero

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4- Para la especie que estamos analizando Aedes aegypti , se debe pasar el alimento saturado por otro tamiz, de orificio ms pequeo (0.5 mm 2) y el se aplicaran los tres primeros pasos resultado de este paso se coloca en la bandeja de cra. 5- En el caso de Culex quinquefasciatus, mencionados anteriormente. En nuestro Insectario, nutritivos del mismo: Aportes nutritivos de la harina de pescado. Principios nutritivos Valores M.S % 92.00 P.B % 60.00 G.B % 12.00 F:B % 1.00 E.M Kcal / g 3.24 Ca % 4.00 P% 2.20 Ca/ P 1.81/ 1.81 NaCl % 2.50 Metionina % 0.50 Lisina % 1.73 Arginina % 1.61 Triptofano % 0.31 Cistina % 0.30 Treonina % 1.06 Tirosina % 0.55 Leucina % 1.86 Metionina + Lisina % 2.23 El 8 % restante que falta es agua (92.00 % M.S) para llegar al 100% Fuente: (CENPALAB) Centro Nacional para la Produccin de Animales de Laboratorio. Forte C, 2001.
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se han obtenido buenos resultados con alimento

concentrado de harina de pescado. A continuacin se relacionan los aportes

Dosificacin del alimento Han sido propuestos diferentes esquemas de cantidades de alimento para el periodo larvario (Esquema 1,2,3) .(Ref Pg. 25 y 26). En nuestro laboratorio se ha trabajado con el esquema 3 para la especie Aedes aegypti, resultados; para Culex duplica el alimento a partir del segundo estadio. con buenos quinquefasciatus se sigue el mismo esquema, pero se

Dosis de alimentos segn el periodo larval de los culcidos.

Esquema 1. Perodo (da ) Cantidad de alimento/ larva (mg) 0 0.2 1 0.3 2 0.4 3-7 0.6 Fuente ( Morlan y col, 1963 ) . Para Aedes aegypti y otras especies.

Esquema 2. Perodo(da) Cantidad ( mg ) Cantidad de larvas 1 100 150- 160 2 0 3 100 igual 4 100 igual 5 100 igual Fuente: Van Handel (1986) utilizada para la cra de Aedes aegypti

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Esquema 3 Perodo Da de eclosin 1 2 3 4 5 6 7 Fuente: Consoli e De Oliveira (1994) Cantidad ( mg ) 0.2 0.2 0.3 0.4 mas 0.45 de levadura seca /1000 larvas 0.6 0.6 0.6 0.6

Perodo pupal. Prez Vigueras, 1956, establece valores de 2 das para el desarrollo pupal de Aedes aegypti y Aedes mediovittatus. Otros autores plantean aegypti vara de 1-3 das, a una temperatura de 27.8 32.2 Toda , 1985. El perodo de pupa no requiere alimentacin, slo se describe como un periodo de reposo en el cual la pupa se mantiene respirando y con movimientos en forma de saltos (Gadelha e Toda, 1985). Soekiman et al (1986) comparan esta etapa 1.45 0.08 das respectivamente. para Aedes aegypti y Aedes que para Aedes
0

Galdelha e

albopictus, y obtienen un valor mayor para la primera especie: 1.63 0.07 y

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Mortalidad de larvas y pupas. Segn Moreno S, 1999, a una temperatura de 26 0 C, la mortalidad de las larvas fue baja y pudiera estar asociada a la muda, tanto la cercana a la pupacin como la de pupa a adulto. Es importante recalcar que las larvas no sobreviven a temperaturas mantenidas inferiores a 10 0 C ni superiores a 44 Fase de adulto. Para la cra de mosquitos adultos, para una poblacin de se requieren de la utilizan jaulas de en CICVECETV(
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C ( Gadelha e Toda, 1985)

diferentes medidas; dentro de las ms utilizadas est la de Volumen 30.5 cm3 aproximadamente 500 ejemplares, 1982); Consoli e De Oliveira(1994) y Naksathit and Scout (1998) recomiendan medidas de un pie cbico (30 cm3). La poblacin de mosquitos debe ajustarse a la medida de la jaula; por ejemplo para una de 30.5 cm3 , la poblacin total debe ser de 500, con una proporcin de 250 machos para 250 hembras, lo que asegura una adecuada reproduccin( con un mantenimiento optimo para la colonia ), y buena produccin de huevos, a fin de perpetuar la especie. Ponencias en mayores densidades inadecuada de las hembras. La tela metlica que cubre a la jaula, debe estar insertada en un esqueleto que puede ser de hierro galvanizado o madera. Uno de los lados de la misma, debe CICVECETV (1982), plantean que una fertilizacin provocan mortalidad y menores,

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tener una manga de 20 cm. de dimetro y 30 cm. de largo, por donde se realiza el manejo interno. Segn se muestra en la Foto 6.

Foto 6. Jaula para adultos de mosquitos Aedes aegypti . Para que emerjan los adultos, se coloca dentro de la jaula un recipiente que contiene las pupas, y se cubre con un cono de 16 cm. de dimetro por 19 cm de largo, elaborado de cartn o zinc y perforado con un orificio de una pulgada de dimetro en su pice, esto permitir que los adultos salgan fuera del cono una vez que emerjan las pupas, y no puedan volver a l, adems previene que los mosquitos caigan al agua y que las hembras grvidas pongan huevos en estos recipientes. Este mismo efecto se puede lograr utilizando recipientes denominados Breeding (Catlogo BioQuip, 2003). Al otro recipiente, mismo tiempo se coloca

con agua, que en dependencia de la especie, debe estar ms o

menos limpia, para recoger la ovipuesta de las hembras grvidas. Para el caso de

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Ae aegypti, que oviponen en superficies slidas y hmedas, se coloca un papel como el descrito en la fase de huevo (Pg. 17 y 18). Naksathit and Scout (1998) sealan que, como fuente de energa y parte de la alimentacin, se pueden usar soluciones azucaradas al 10 %, de la demanda de la especie de mosquito a colonizar. Fleming (1986) por su parte sugiere soluciones azucaradas al 5 - 15 % e las cuales contienen Glucosa y Sacarosa, las concentraciones de las soluciones dependern

incluye miel de abeja a la misma concentracin, puestas en mechas o torundas elaboradas de algodn y gasa, que deben ser cambiadas dos veces a la semana y pueden ser recuperadas, excepto para adultos de Aedes aegypti, debido a que las hembras grvidas ponen huevos en las mismas, y constituiran una fuente de contaminacin si se utilizaran en otras jaulas. Avila et al (1993), en su Metodologa para la longevidad, cra de Anopheles nueztovari, y

proponen el uso de miel al 50 % con la que ellos obtuvieron elevados valores de debido a que la miel contiene: Glucosa, Fructuosa, Sacarosa Carbohidratos de alto valor nutritivo, los cuales se utilizan para la conversin rpida en energa y como elemento precursor de la sntesis de cidos grasos, Glucgeno y sustancias indispensables para la supervivencia de los culcidos (Nayar and Sauerman, 1975 b). Hematofagia. El conocimiento de los hbitos de alimentacin de los insectos, es muy para definir qu hospedero utilizar; es decir, si son zooflicos o importante

antropoflicos. Los primeros son especficos de otros animales, entre los que se encuentran las aves y mamferos.

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Los mosquitos de los gneros Aedes y Anopheles, prefieren a los mamferos, por lo que se pueden utilizar: Curieles, ratones y conejos de piel de capa oscura, estos ltimos solamente para Anopheles y para ambos en caso en que peligre la especie, el husped puede ser el hombre. (Actividades del Insectario. Laboratorio Investigaciones Ciudad de Guatemala, 1997. El gnero Culex es ornitoflico, o sea prefiere las aves especficamente las de corral, que pueden ser pollitos de pocos das o hasta de 1 Kg de peso, co dornices la mas utilizada en nuestro laboratorio fue la especie Coturnix coturnix japonica (Prez y Prez F, 1994, y otras. La foto 7, muestra animales utilizados para estos fines. A: Curiel y B Ave. (Ref Pg. 30).

A: Curiel.

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B. Ave de corral Foto 7. Animales utilizados para la hematfagia. A: Curiel, B: Ave corral, cepo que la contiene. Adems se debe conocer la periodicidad en la actividad del mosquito, que en el caso de Aedes es diurna, mientras que para Anopheles y Culex es nocturna. En Anopheles se observan varios picos, al amanecer y en el crepsculo. Segn Briegel (1985, 1990), el aminocido esencial Isoleucina es fundamental para la reproduccin de los mosquitos. La sangre humana contiene cantidades ms bajas de este aminocido que la de otros animales , sin embargo es la de ms nutrientes en general. La sangre de roedores y aves tiene comparativamente mayores niveles de Isoleucina que la del hombre. Cuando Aedes aegypti se alimenta de hospederos que tienen mayor Isoleucina en sangre que el hombre, para completar la vitalognesis puede requerir nutrientes

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en la alimentacin y la movilizacin de la reserva materna; sin embargo, con los nutrientes que aporta la sangre humana dichas reservas no se necesitan para completar el desarrollo de los huevos, ya que una parte de los nutrientes ingeridos puede ser empleada en acumular reservas como para la vitalognesis ( Briegel,1985 ). Day et al (1994), en experimentos sobre fecundidad de Aedes aegypti, cual atribuyeron usaron la

sangre de pollo ( en vez de sangre humana ) para alimentar a los mosquitos, a la el reducido tiempo de supervivencia de estos, debido a composicin ligeramente alta de Isoleucina, y baja en nutrientes. Nayar y Sauerman (1975 a) encontraron mayor fecundidad en mosquitos alimentados con azcar y sangre que en estos, alimentados solamente con sangre. En nuestras condiciones, se alimentan tambin con azcar. Despus que emergen los adultos, y antes de alimentar a las hembras, con el

objetivo de lograr cada ciclo gonadotrfico (proceso fisiolgico que consiste en la digestin del alimento, el desarrollo de los ovarios por un periodo de 72 horas y la consiguiente puesta de los huevos) se debe garantizar el contacto entre hembras y machos, al menos por un periodo de 48 horas, para que se efecte la fecundacin. Esto se debe cumplir tanto para una poblacin nueva como para cualquier ciclo gonadotrfico de la vida de las hembras. Ponencias del CICVECETV (1982). De acuerdo con nuestras experiencias, hematofagia. cuando las hembras dejan de poner

huevos dos das consecutivos, es el momento en que se debe repetir otra

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La alimentacin siempre debe realizarse con animales muy tranquilos, lo que se logra con anestsicos o con cepos (aditamentos que los inmovilizan) que se pueden producir de forma artesanal, como se hace en nuestro laboratorio, lo cual se expone en la Foto 7 , B: Ave de corral ( Ref Pg 30). En el caso de mamferos, veterinario (Carrillo et se pueden al 1981; emplear anestsicos generales de uso CICVECETV (1982), administrados que

intraperitonialmente. Se debe tener un nmero suficiente de animales, alimentacin, una vez cada dos o tres semanas.

permita rotarlos de manera que los mismos sean inyectados y utilizados para la

Los animales se rasuran en la regin abdominal cuando se colocan en la zona externa cncava de la jaula,y dorsalmente si se colocan dentro de ella en un cepo de inmovilizacin. El animal se mantiene 15 min, o hora para que se efectu la hematofagia aegypti se asegura la alimentacin repitindose a las 24 horas. En el caso de las aves, se despluman en la regin que va desde el cuello hasta la regios dorsal y en las alas. Los animales se depositan en cepos rectangulares para su inmovilizacin y se debe colocar externamente en la zona cncava de la jaula( La parte desplumada se ubicara en la misma forma que la rasurada para los mamferos)o dentro de la misma, de modo que se asegure bien que no se salga el ave del cepo. Se debe tener en cuenta que las aves son insectvoras por lo que cuando se en una jaula y despus puede pasar a otra. Para Aedes

encienda la luz, para colocarlas o retirarlas, se debe realizar de forma rpida, para evitar que se alimenten de los mosquitos adultos que estn volando alrededor de ellas.

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Culex quinquefasciatus. Say,1823 Este mosquito se caracteriza por depositar sus huevos directamente en agua, y tiene forma de balsa. De acuerdo con su bioecologa, los recipientes de ovipuesta deben ser de color oscuro, atrayentes para las hembras ( Jobling, 1935), y el agua contenido en ellos debe ser poluda y coexistirn huevos, larvas y pupas ( Consoli e Espinola, 1973; Bruno and Laurence 1979). Como se muestra en la foto 8.

Foto 8.

Diferentes estadios inmaduros ( larvas y pupas ) de Culex

quinquefasciatus. Los huevos se transfieren a bandejas donde se desarrollan las larvas. La eclosion se produce de 24 -30 Horas mas tarde . El agua a utilizar debe ser declorinada, a temperatura de 26 27
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C. Es importante tener en cuenta el espacio vital

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Al cual se hizo referencia en el captulo que trata de la fase larval o inmadura para la especie (Ref Pg 19, 1er prrafo y Pg 20, 2do respectivamente) nmero de balsas (huevos) a eclosionar (una contiene de 100-150 larvas). La alimentacin para el periodo larval es similar a la descrita ( Ref Pg. 22, 4to prrafo y los primeros tres prrafos de Pg. 23 ) para Aedes aegypti, con la diferencia de que, como se dijo all, se duplica la cantidad despus del primer da de eclosin. En la etapa de adulto, se mantienen las fuentes energticas en base a las soluciones azucaradas, y a la sangre prefirindose aves de corral y otras como la codorniz (Cotournix cotournix japonica ). La hematofagia se debe realizar nocturna, como se describi en la Pg. 30, 1er prrafo. Segn Consoli e De Oliveira (1994), algunos autores recomiendan que para mejores resultados, se debe retirar la solucin azucarada 24 horas antes de la hematofagia.

Medidas de seguridad biolgica para la cra de culcidos. En este acpite se establece una serie de indicaciones o medidas encaminadas a evitar la fuga de los mosquitos fuera de las instalaciones de cra. A pesar de que para todas las especies de culcidos se deben tomar medidas de seguridad biolgica, stas deben de ser extremas en aquellas especies que constituyen vectores de importancia medico epidemiolgica. A continuacin se mencionan algunas medidas generales: El responsable del insectario debe supervisar el manejo correcto de la cepa por parte de los especialistas o los investigadores responsables; en caso de detectar escapes de adultos o bandejas con pupas, debe notificarlo de

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inmediato al responsable de la cra, y de persistir el incumplimiento, se tomarn medidas ms severa. Se deben utilizar capturadores manuales o trampas adecuadas para la captura de los insectos, cuando se escapen. Se deben mantener cerradas las puertas para evitar el escape hacia el exterior. Se deben utilizar materiales de proteccin adecuados al riesgo de la especie que se est colonizando. Fase inmadura. Para la cra de Aedes aegypti, se debe seguir una serie de indicaciones que tengan en cuenta el hecho de que constituye este un vector de enfermedades del hombre y los animales: Los huevos identificados, se almacenan a locales con prohibicin de departamento. Estos locales deben temperatura ambiente, en

acceso para el personal ajeno al tener seguridad fsica, es decir,

puertas habilitadas con cerraduras y llaves. Despus de que las tiras de huevos se someten a eclosin, Incineracin, Autoclavear 20 min. y ebullicin a 100 min. Las larvas o pupas de cualquier estadio se deben resumir por un tamiz de orificios muy finos y el lquido debe colectarse en una bandeja, para
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y antes de

eliminarlas al medio exterior, deben ser destruidas por varios mtodos: C por 15 20

filtrarse al 100
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terminar la operacin. Este contenido se destruir a

temperaturas de - 20 a 29 0 C; en autoclave 20 min o por ebullicin, a C por 15 20 min, como se muestra algunos de estos pasos en la Foto 9.

Foto 9. Eliminacin de larvas o pupas y el liquido de cra con tamiz. Los tragantes de los fregaderos en las instalaciones donde se cra esta especie, deben estar protegidos por una malla fina, para evitar su salida a las aguas residuales. Todo material biolgico que proceda de esta especie, debe ser manipulado desde el inicio hasta el final por el mismo investigador, con el objetivo de que se le d continuidad a cada fase del mosquito y que se cumplan las medidas previstas para su eliminacin. En cada laboratorio donde se trabaje con esta especie, deber habilitarse un registro en el que aparezcan los datos relativos a: El investigador

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principal que trabaja con la misma, la fecha de comienzo y el objetivo del trabajo, as como la cepa. Al finalizar la actividad, las bandejas donde se cran las larvas se deben examinar bien y limpiar con agua potable, con el propsito de hacer una limpieza mecnica y de detectar larvas que hayan quedado, consecuente destruccin. Fase Adulta Los adultos de esta especie, se mantendrn en instalaciones para su

hermticamente cerradas, y si no, al menos que posean varias puertas, como barreras fsicas, antes de la que se comunica con el pasillo interno del insectario. Las jaulas donde se cran, deben tener doble malla y una manga pequea lateral, para disminuir el riesgo de escape de los insectos, como medida de seguridad. Cuando se vaya a realizar cualquier actividad en el interior de la jaula, primero se deben hacer algunos movimientos con la manga, para que los mosquitos se alejen de la entrada. Antes de sacar de la jaula los recipientes de ovipuesta, se deben golpear sobre el piso para que los mosquitos que reposan en ellos los abandonen. Una vez concluida la alimentacin, y antes de retirar los animales, se debe golpear el cepo sobre el piso de la jaula, para evitar que se escapen hembras alimentadas.
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las

Al finalizar cada actividad con esta fase, se deben capturar los mosquitos que hayan escapado de la jaula.

Otros materiales en contacto con el material biolgico como son torundas empleadas en soluciones de azcar, deben procesarse para desechar al exterior. Utilizando mtodos fsicos como: autoclave 20 min o por ebullicin a 100 0 C , de 15- 20 min. Se expone en la foto 10.

Foto 10. Tratamiento para desechar torundas con azcar utilizados en la fase adulta de culcidos.

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Mtodo de cra y mantenimiento de Triatoma flavida (Hemiptera: Reduviidae) Neiva, 1911 en el laboratorio.

Los triatomneos son insectos chupadores de sangre, que estn

ampliamente

distribuidos en Amrica Latina vectores de Tripanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas. Aunque en nuestro pas no existe esta enfermedad, se han reportado 4 especies: Triatoma flavida (Neiva, 1911), T. bruneri (Usinger, 1944), T. rubrofasciata (De Geer, 1773) y Bolbodera scabrosa (Valdes, 1910). Por tal motivo, estudiar: La biologa, la morfologa y la gentica de los mismos. En este manual se enfoca particularmente la cra de T. flavida, por ser la nica que ha sido obtenida en condiciones de insectario. Lent y Wygodzinsky (1979) reportaron un mtodo para la cra masiva de triatomneos, mediante el cual, y con un simple equipamiento, se obtienen resultados satisfactorios, pero como sealan Da Silva et al (1997), cada especie presenta diferentes comportamientos y adaptaciones cuando se somete a condiciones artificiales y, solamente estudios especficos pueden esclarecer la dinmica biolgica de cada una, necesaria para conocer detalles que podran utilizarse para optimizar la cra de los mismos. Los ejemplares colectados se colocan en recipientes de vidrio, metal o plstico, preferiblemente grandes para que no exista competencia por el espacio, y se tapan con una malla de tela, metal o plstico, de huecos lo suficientemente pequeos como para prevenir que los huevos y las pequeas ninfas se escapen. Dentro debe colocarse un papel de filtro doblado en forma de abanico, con el objetivo de que provea un refugio para los triatomas y, al mismo tiempo, absorba se hace necesaria su cra en condiciones de insectario, para

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la humedad generada por los mismos. Cada recipiente de cra se identifica con el lugar de origen, la fecha de colecta y el nombre del colector. Como estos insectos son hematfagos obligados en todos sus estadios, y se alimentan con pollos, ratones y roedores, cuando se traigan individuos salvajes al laboratorio, es importante hacerles un anlisis de las heces, para determinar si estn infestados con Trypanosoma cruzi, y si esto sucede, es conveniente basar su alimentacin en aves, cuya sangre es refractaria al parsito; es de esta forma que se evita la contaminacin del hospedero. Dentro de la variedad de mtodos de alimentacin para estos insectos, nosotros utilizamos la tcnica de introducir al husped, colocado en un cepo, dentro del recipiente de cra o dentro de otro recipiente habilitado para esto, debidamente tapado para evitar el escape de los triatomineos. En el caso de utilizar otro recipiente que no sea el de la cra, se introduce igualmente papel de filtro doblado para el refugio de los triatomas despus de la alimentacin y tambin con el objetivo de absorber el exceso de humedad provocado por las heces y orina del hospedero. En el caso de que la alimentacin se efecte dentro del recipiente de cra, al terminar la misma, se debe de proceder a la limpieza de este. Segn Jimnez (1981), el tiempo de ingesta de sangre para T. flavida oscila, en condiciones de laboratorio, entre 5 y 30 minutos, sobre aves o roedores, por lo que 1 hora ser suficiente para la replecin total de esta especie. Al completar la alimentacin, el insecto no vuelve a tomar ms hasta pasados 5-7 das como mnimo y hasta dos meses y medio como mximo, en adultos. Los ejemplares adultos deben ser alimentados todas las semanas o cada 15 das, en dependencia si se quiere acelerar o retardar el ciclo de vida. Como se muestra en la Foto 11 ( Ref Pg. 41). 40

Foto 11. Alimentacin de Triatoma flavida, utilizando curiel. Esto fue demostrado por Mac Ewen and Lehane (1993) para ninfas de quinto estadio de T. infestans: las alimentadas con ms frecuencia, tuvieron un desarrollo ms acelerado. Igualmente, Cabello et al (1988) demostraron que para adultos de Rhodnius neivai, el periodo de desarrollo fue ms corto en los alimentados semanalmente que en los alimentados quincenalmente. Como los triatomneos son ovovivparos, los huevos puestos se colectan diariamente, y se colocan en recipientes independientes identificados con la fecha de colecta, los cuales pueden ser del tipo mencionado en la pg. 39, ltimo prrafo, o pequeos frascos, en dependencia de los propsitos de la cra. Cada recipiente adems se identifica como la F1, o sea la primera generacin bajo condiciones controladas. La eclosin ocurre a los 28.70.3 das en los meses de verano (a 30C) y en invierno (24C) a los 21.0 0.4 das, segn Jimnez

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(1981). Cabello y Lizano (2001) por otra parte, obtuvieron un perodo medio de incubacin de 27.2 3.3 das, a una temperatura de 28 2C, para la misma especie. Las ninfas de primer estadio se alimentan diariamente hasta que ocurra la primera ingestin de sangre, a partir de la cual pasa a ser semanal o quincenal. En el caso de T. flavida, segn Jimnez (1981), la larva recin eclosionada no toma alimentos hasta pasados 4-5 das de su nacimiento, y puede sobrevivir por perodos de hasta 36 das sin ingesta de sangre, mientras la humedad relativa sea de 85%. Jimnez (1981) realiza observaciones sobre la biologa de T. flavida en condiciones de laboratorio a temperatura ambiente (entre 25 y 32C) y a una humedad relativa de 85%, asimismo Cabello y Lizano (2001), obtienen condiciones ptimas para la cra de T. flavida a una temperatura de 28 2C y a 80 10% de humedad relativa. Una vez que se quieran eliminar los ejemplares que ya no sean tiles, se pueden colocar a bajas temperaturas (por debajo de 0C) o en un recipiente tapado con algodn embebido con cloroformo.

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METODO DE CRIA Y MANTENIMIENTO DE Blattella germanica (L.) 1767 (DICTYOPTERA: BLATTELLIDAE). Desde que Heal (1948) report un mtodo estandarizado para la cra masiva de cucarachas, pocos cambios se han realizado en este sentido. Los ejemplares colectados se colocan en recipientes lo suficientemente amplios como para que no exista competencia por el espacio; dichos recipientes deben ser preferiblemente circulares y de cristal. En el borde interior superior de cada uno se aplicar una capa fina de vaselina semislida, con el objetivo de evitar que se escapen. Cada recipiente se identificar debidamente con: nombre de la especie, lugar de origen, fecha de colecta y nombre del colector, como se expone en la Foto 12.

Foto 12 . Recipiente de mantenimiento de Blattella germnica.

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Las cucarachas, al igual que otros insectos, requieren comida seca y una fuente de agua separada, por lo que en el interior del recipiente se coloca una placa petri con algodn embebido en agua, el cual debe humedecerse diariamente (el agua se suministra ad libitum) y otra que contiene el alimento. Para Blattella germanica, conocida vulgarmente como la cucarachita alemana, el alimento ms utilizado en el laboratorio es el pienso para ratn pulverizado y seco, con 20.45 % de protenas, ya que para esta especie, el alimento debe tener entre 20-24 % de protenas (Mc Cay, 1938), pues por encima de este rango, disminuye su longevidad (Haydak, 1953) y por debajo, disminuye su reproduccin y se retarda su perodo de desarrollo (Aguilera et al, 1998). El alimento debe pulverizarse o granularse, porque cuando se alimentan con pellets completos el desarrollo ninfal es ms lento, lo que impone una barrera mecnica para la alimentacin (Cooper and Schal, 1992). Esta es una labor extremadamente intensa, sobre todo cuando se necesitan cras masivas, por lo que los autores como Wileyto and continuamente desde un reservorio suministrador automtico. En cada recipiente se deben colocar papeles doblados en forma de acorden o abanico (para aumentar el rea de superficie de contacto y proporcionarles refugio). B. germanica se debe mantener en un ambiente a 29 2C, una humedad relativa mayor del 70% y un foto perodo de 12:12 (L:O), ya que sus 3 requerimientos ecolgicos fundamentales son: los ambientes clidos, hmedos y oscuros. B. germanica es una especie ovovivpara, por lo que una vez fecundadas las hembras, stas portan las ootecas que contienen los embriones hasta el momento de su eclosin, la cual ocurre luego de 15 das aproximadamente, bajo las Boush (1983) disearon un mtodo de cra basado en el uso de viales que reciben agua

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condiciones descritas anteriormente. Las ninfas que nacen, se separan en otro recipiente de igual tipo, que se identifica como la F1, o sea, la primera generacin de esa cepa nacida bajo condiciones controladas, y as, sucesivamente, se procede con las prximas generaciones si se requiere. La dieta puede afectar la habilidad reproductiva de los bltidos (Roth and Willis, 1954), al igual que su crecimiento y desarrollo (Hamilton et al, 1988 y 1990; Cooper and Schal, 1992 y Aguilera et al, 1998). La cucaracha alemana es altamente sensible a la privacin de alimentos y a las limitaciones de nutrientes especficos, en particular de las protenas (Roth and Stay, 1962 y Kunkel, 1981). Entre las dietas ms utilizadas de forma rutinaria en muchos laboratorios de investigacin, para mantener colonias de esta especie, est el alimento de laboratorio (pienso) para perro, conejo y ratn; el ltimo es recomendado por varios autores como el ms apropiado para B. germanica (Cooper and Schal, 1992; Koehler and Castner, 1994 y Aguilera et al, 1998), seguido por el de conejo y por ltimo el de perro (Koehler et al, 1994). Las hembras de esta especie que han sido alimentadas con pienso de ratn, y bajo las condiciones ambientales descritas al inicio, son capaces de ovipositar hasta 5 ootecas durante su vida, y el nmero de ninfas nacidas de cada una puede estar entre 15 y 37 (Aguilera et al, 1998). Los recipientes donde se mantienen las colonias de esta especie, deben limpiarse al menos una vez al mes, ya que no se deben mantener muchos insectos muertos en el fondo de los mismos. Una vez que se quieran eliminar los ejemplares que ya no sean tiles, se pueden colocar a bajas temperaturas (por debajo de 0C) o sumergirlos en agua con detergente por 5-10 minutos.
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Este mtodo de cra puede utilizarse con otras especies de cucarachas domiciliarias de hbitos semejantes, como por ejemplo: Periplaneta americana, Periplaneta australasiae, Supella longipalpa, etctera. A las Panchloras, se les debe suministrar alimento natural basado en hojas, ramas, frutos, etc colocarlas en recipientes de cra muy amplios. MTODO DE CRA Y MANTENIMIENTO DE Musca domestica Linnaeus 1758. Musca domestica es un insecto que posee metamorfosis completa es decir pasa a travs de su vida por las fases de: Huevo, 4 estados larvales, pupa y finalmente el adulto. Pertenecen al orden Dptera. Su cuerpo se divide en: cabeza, trax y abdomen. En la cabeza, se encuentran: Las piezas bucales para chupar; los ojos, los cuales son compuestos, importantes, y las antenas receptoras, entre las partes mas en el trax se ubican dos pares de alas y tres de patas y en el y

abdomen, el sistema reproductivo. Durante su vida adulta, necesita de agua y de alimento preferiblemente lquido, para que pueda ser solubilizado fcilmente por las secreciones salivales y del buche. Puede regurgitar lquidos del buche produciendo manchas claras , las ms oscuras suelen ser heces. Puede volar un radio de 10 km. en 24 horas. Su longevidad est en dependencia de la disponibilidad de comida y los factores ambientales, ya que a altas temperaturas acelera sus procesos pero acorta su vida, mientras que a bajas se prolonga su longevidad. (OPS, 1964)

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Los huevos son blancos y pequeos algo difciles de ver a simple vista, miden aproximadamente 1mm de longitud. Cada hembra puede llegar a poner grupos de 75 a 150 huevos, los que son colocados lejos de la luz directa. En menos de 24 horas la larva rompe el huevo y penetra en el medio de cra usando dos ganchos que tiene en la boca para rasgar y aflojar la materia alimenticia, para regular la temperatura del medio se trasladan a diferentes niveles del mismo donde oscilen entre 30 y 35 C. Las larvas comienzan a mudar hasta que llegan a 4to estadio, pasado este tiempo comienzan a emigrar a un medio seco para pupar. Cuando se encuentra lista se contrae hasta formar una vaina o pupario en la cual se encierra y no toma alimento. En este perodo se mantiene durante 4 5 das si existen temperaturas bajas o 3 das si son altas . Cuando se rompe el pupario ya est lista la mosca para salir, comienza a caminar hasta que las alas y su cuerpo endurezca, esto requiere de 1 hora en se sequen y abran

condiciones de verano y con temperaturas bajas hasta 15 horas. El apareamiento puede ocurrir en cualquier momento despus que ocurra esta actividad. Pasado el perodo de copula, la mosca hembra toma algn tipo de alimento que le permita madurar los huevos, para despus de 2 3 das ovipositar y comenzar el ciclo nuevamente (OPS, 1964). Desde los comienzos de este siglo, la especie Musca domstica Linnaeus 1758 es considerada un vector mecnico de importantes grmenes responsables de infecciones entricas tales como: disentera amebiana, shigellosis, salmonellosis, clera, infecciones helmnticas, infecciones virales y ricketsiales, etc. Contemplando tambin las molestias que provocan durante el trabajo y el

descanso en las comunidades con altas densidades de las mismas (Greenberg 1973 y Keiding 1986). Sus vas de transmisin son por las piezas bucales, pelos del cuerpo, heces, vmitos y almohadillas de las patas.

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En nuestro laboratorio es necesaria la cra masiva de adultos, principalmente hembras para realizar pruebas biolgicas con nuevos insecticidas de resistencia a plaguicidas ya utilizados. En estudios realizados por Tang et al (1984 ) y (1988) se ensayaron diferentes mtodo de cra para larvas con el fin de determinar cual era el mejor en cuanto a rendimiento, costo y fortaleza de los adultos obtenidos para la realizacin de pruebas de laboratorio ya que la Musca domstica es utilizada ampliamente en investigaciones genticas por ser el insecto que ha mostrado mayor habilidad en desarrollar resistencia a los insecticidas (Keiding 1976). En el grupo de Control qumico , del Departamento Control de Vectores IPK, realizo un estudio para comparar un medio (I) recomendado por la OMS en 1974 y los otros dos ensayados por primera vez. Los medios fueron esterilizados en beakers de 2000 ml durante 30 minutos, a media atmsfera y 110 grados centgrados. Se utilizaron pupas del pie de cra del laboratorio las cuales fueron distribuidas equitativamente en jaulas de 30 cm
3

,con armazn y base de madera cubierta con tela de malla de 38 GG ( dimetro de orificio, 0.1mm ) para evitar contaminacin con otros dpteros. Cuando emergieron los adultos estos copularon y la puesta de huevos se recogi 3 das despus. Los huevos fueron extrados con agujas enmangadas (Agujas para uso entomolgico), se tomaron 100 huevos por cada frasco que se utiliz con medio. Se hicieron 16 rplicas por cada medio ensayado en total. A continuacin, en la siguiente Tabla 1 se muestran los medios utilizados en el estudio descrito anteriormente.(Ref Pg 49 ) El medio I fue recomendado.

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Tabla 1. Medios ensayados para cra de Musca domestica. MEDIO I Componentes Salvado de trigo Harina de gramneas Levadura de pan Harina de soya Extracto de malta Aceite de higado de bacalao Agua Acido propinico 400 ml 2.5 ml 7.5 g 10 g 7.5 g Agua hasta completar Acido propinico 2.5 ml 500 ml Agua hasta completar Acido propinico 2.5 ml 500 ml 4g Agar 5g Agar 5g 30 g Cantidad 100 g MEDIO II Componentes Harina de pescado Levadura de pan 50 g Cantidad 50 g MEDIO III Componentes Harina de pescado Levadura de pan 50 g Cantidad 25 g

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Tabla 2. Tiempo de duracin de cada estadio por medio ensayado. Fase Huevo Larva Pupa MEDIO I <1 5 -13 das 4.1 - 5.8 das MEDIO II <1 4 - 9.5 das 2 - 6.5 das MEDIO III <1 5 -11 das 4.5 - 5.8 das

En este estudio se obtuvo que los resultados del medio 2 fueron superiores a los obtenidos en los otros medios. En la actualidad, en nuestro laboratorio utilizamos un mtodo de cra de ms fcil manipulacin y ms econmico, el que relacionamos a continuacin: MEDIO ACTUAL: Salvado de trigo Leche en polvo Agua (Potable) 500 g 40 g 500 ml aproximadamente

Se mezcla el salvado de trigo con los 40 gramos de leche en polvo, y luego se adiciona el agua, empapado. Para recoger las puestas de huevos, se prepara una cantidad ms pequea de este medio ( se mantiene la proporcin ) y se coloca en las jaulas que contienen adultos. Al otro da, se prepara la cantidad establecida anteriormente para cada jaula que se va ha sembrar, se colocan dentro las puestas de huevos y se tapan con tela y una liga. Despus, las larvas transitan por los cuatro estadios larvales hasta cuando vayan a pupar, entonces emigran hacia el borde del recipiente de cra, humedeciendo la tela con que se tap el recipiente. Ya entonces se puede verter el medio para una bandeja de esmalte o plstico, la cual se le coloca una poco a poco, hasta que quede humedecido, pero no

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debajo ms grande con aserrn, para que las larvas tengan un lugar oscuro y seco para pupar. Como aparece en las Fotos, 13 y 14 ( Ref. Pg 52).

Foto 13. Bandeja con medio contenida en la de aserrn Cuando todas las larvas han pasado al aserrn, se elimina la bandeja que

contena el medio, y la que contiene el aserrn con las larvas y las pupas, se deja secar por espacio de un da a temperatura ambiente. Se muestra en la Foto 14 ( Ref en Pg. 52).

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Foto 14. Larvas y pupas que migraron del medio al aserrn. Pasadas 24 horas, se tamizan para eliminar el aserrn y que quede solamente

las pupas. Terminado el proceso de tamizacin, las pupas se colocan en un recipiente y se introducen dentro de una jaula. Cuando emergen los adultos, se les coloca una solucin azucarada al 5 % en recipientes que contienen algodn o gasa, para que las moscas adultas puedan tomar el alimento sin ahogarse (la proporcin de solucin se debe ajustar para que el algodn quede embebido en dicha solucin, nunca seco o inundado) y un vaso con 40 g de leche en polvo y se dejan transcurrir alrededor de 3 das antes de colocarles medio para la puesta de huevos. Las jaulas deben ser debidamente rotuladas para evitar contaminacin de una cepa con otra.

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Para eliminar todo el material biolgico ( bandeja con medio , leche en polvo usada por los insectos, para la basura , los algodones que contuvieron el agua azucarada , bien con un nudo fuerte y se medio sobrante y pupas vacas ), se depositan en bolsas de nylon para eliminar cuyas bocas se cierran incineran ; si no se cuenta con incinerador se dejan por espacio de 2 das para que los gases producidos por la fermentacin provoquen la muerte de las larvas que puedan haber quedado vivas y de los adultos que puedan haber emergido de pupas atrasadas. En caso de los adultos que se vayan a desechar, pueden eliminarse tambin durante 1 hora. a bajas temperaturas, es decir por congelacin

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AGRADECIMIENTOS A todos los compaeros del Departamento Control de Vectores del IPK y en especial a la Lic Maria Magdalena Rodrguez Coto y el Dr. Ren Gato de Armas por sus valiosos aportes en el diseo del documento.

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