Determinacin de Bacillus cereus en alimentos OBJETIVOS: Desarrollar y/o implementar una tcnica para la deteccin del Bacillus cereus.

s. Desarrollar el mtodo de enumeracin en placa de Bacillus cereus.

FUNDAMENTO: Para llevar a cabo la determinacin presuntiva de B. cereus se utilizan medios que contengan yema de huevo en su composicin, para poner de manifiesto la lecitinasa, produciendo una zona opaca que rodea la colonia, mientras que otras bacterias formadoras de esporas como por ejemplo, B. thuringiensis, por lo general no producen la zona opaca, o si la producen, es muy restringida. En los medios que contienen manitol y rojo de fenol como indicador, el B. cereus no fermenta el carbohidrato y por lo tanto las colonias se presentan rodeadas por zonas de color rojo. Los medios de cultivo recomendados para su determinacin son, el agar selectivo para Bacillus cereus segn MOSSEL, agar yema de huevo-polimixina-rojo de fenol, agar yema de huevo piruvato, agar selectivo segn REUTER y agar sangre de caballo en el cual se puede observar la hemlisis provocar por cepas de B cereus. Y es aplicable a cualquier alimento en el cual Este procedimiento analtico especifica el mtodo de enumeracin en placa de B. cereus y es aplicable a cualquier alimento en el cual B cereus est viable y presente.

MEDIOS DE CULTIVO, SOLUCIONES Y BIOLGICOS 5 placas ( 10 placas si se desea efectuar las siembras por duplicado) de agar MYP estril su equivalente segn fabricante (p. ejemplo selectivo para B cereus de OXID) a. 1 matraz de 500 mL con450 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estril a. 4 matraces de 250 mL con 90 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estril 4 tubos de 16x150 mm con 9 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estril b. 2 tubos de 13x100 mm con 3.5 mL de agar nutritivo c 2 tiras API 50 CH para Bacillus * (o bioqumicas tradicionales en tubo) c. 2 tiras API 20E, * (o bioqumicas tradicionales en tubo) c. * 2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de caldo glucosa ms rojo de fenol c. * 2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de caldo nitratos c. * 2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de RMVP c. * 2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de agar tirosina inclinado c. 26

2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de medio SIM c. 2 placas de agar soya tripticasena-sangre d. 2 placas de agar tirosina d. 2 placas de agar nutritivo completamente secas d. Reactivos para tincin de Gram b, c, d, e Reactivos para deteccin de nitratos A (cido sulfnico) y B (N-(1, naftil) etilndiamina) e. Reactivo para la pruebe de Voges Proskauere. Creatinina. MATERIAL Equipo usual en los laboratorios de microbiologa a, b, c, d, e Incubadora a 30 + 2C y 35+ 2C a, b, c, d, e Cuenta colonias b Licuadora o Stomacher a 3 pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL estriles a , b, c, d, e 1 varilla de vidrio doblada en L a. Agitador de tubos tipo vrtex a. Microscopio, cubre y portaobjetos b, c, d Jarra de anaerobios con catalizador y generadores con H2+CO2 Bao de agua con control de temperatura de 45+ 2C a Gradillas a. NOTAS: a Material necesario al inicio de la prctica. b Material necesario a las 24 horas de iniciada la prctica. c Material necesario a las 48 horas de iniciada la prctica. d Material necesario a las 72 horas de iniciada la prctica. e Material necesario a las 96 horas de iniciada la prctica.

PROCEDIMIENTO Este procedimiento tiene como fundamento inocular diluciones decimales de la muestra en agar MYP (o su equivalente segn fabricante), mediante mtodo de extensin en superficie, e incubar a 30+ 2C/24 horas. A) Preparacin de la muestra. En condiciones aspticas, pesar 50g de muestra y depositarla en 450mL de buffer de fosfatos (dilucin1:10) y licuar durante 2 minutos. B) Enumeracin en placa de B. cereus. 27

Transferir 10 mL de la dilucin 1:10 a 90mL de diluyente, mezclar bien y continuar hasta llegar a la dilucin 10-4. Inocular por duplicado placas de agar MYP (o de medios de cultivo equivalentes) con 0.1mL de cada una de las diluciones de la muestra y extender con varilla estril. Incubar las placas a 30C/24 horas. Observar si existe la presencia de colonias rodeadas por zonas claras que indican la presencia de la lecitinasa. Las colonias de B. cereus en agar MYP generalmente son de color rosa, el cual se intensifica conforme continua la incubacin. En agar selectivo para B. cereus (OXOID), las colonias presentes presentan un tamao aproximado de 5mm de dimetro con precipitacin en su entorno, debido a la hidrlisis de la lecitina. Al no utilizar manitol, las colonias se presentan de color azul turquesa rodeadas por un precipitado, debido a la yema de huevo. Si la reaccin no es clara, incubar las placas 24 horas ms antes de efectuar el cmputo. Seleccionar placas que tengan en promedio de 15-150 colonias productoras de lecitinasa y de coloracin rosa (MYP) o azules (agar selectivo para B. cereus, OXOID); esta ser la cuenta presuntiva de B. cereus en placa. Seleccionar 5 o ms colonias caractersticas de las placas y transferir a tubos con agar nutritivo para confirmar la presencia de B. cereus, siguiendo la tcnica que se describe en los puntos C y D. Calcular el nmero de B. cereus/g de muestra, basado en el porcentaje de colonias , probadas y confirmadas. Nota: el factor de dilucin es 10 veces mayor, debido a que solamente se inocul 0.1 mL de cada dilucin, en lugar de 1mL. C) Confirmacin de B. cereus Tomar 5 o ms colonias sospechosas provenientes de agar MYP (o su equivalente) y transferir a tubos con agar nutritivo. Incubar 24 horas a 30C. Preparar una tincin de Gram y observar microscpicamente. El B. cereus, en el microscopio se presenta como bacilo Grampositivo corto, forma cadenas, las esporas pueden ser elipsoidales, centrales o subterminales. Transferir 3 asa as de cada tubo de agar nutritivo a 0.5mL de buffer de fosfatos y mezclar en el vrtex. Utilizar esta suspensin e inocular los siguientes medios confirmatorios, (tambin se puede utilizar el inculo del tubo de agar nutritivo sin diluir en buffer). C.1. Caldo glucosa + rojo de fenol Inocular 3 mL de caldo glucosa rojo de fenol con 1 asada del cultivo descrito en el punto anterior. Incubar anaerbicamente 24 horas a 35C en jarra de anaerobiosis. Agitar los tubos despus de la incubacin y observar si se presenta un vire de color que va de rojo al amarillo, lo que indica la produccin de cido, en condiciones anaerbicas a partir de la glucosa. C.2. Caldo nitratos Inocular 5 mL de caldo nitratos con 1 asada de cultivo descrito en el inciso C. incubar 24 horas a 35C. Para probar los nitratos, aadir 1.25 mL de los reactivos A y B a cada cultivo. El desarrollo de un color rojo-naranja en 10 minutos indica la reduccin de nitratos a nitritos.

28

C. 3. Medio VP Inocular 5 mL del medio VP con una asada de cultivo descrito en el inciso C. incubar 48+ 2 horas a 35C. A cada mL de cultivo aadir 0.6 mL de -naftol y 0.2 mL de KOH. Agitar y observar el resultado despus de 1 hora a temperatura ambiente. La prueba es positiva de produccin de acetil metil carbinol, si se desarrolla un color rosa o violeta. C.4. Agar tirosina Inocular toda la superficie del agar con una asada del cultivo. Incubar a 35C por 48 horas. Observar aclaracin de las zonas cercanas al desarrollo, que indica la descomposicin de la tirosina, examinar las placas negativas con signos obvios de desarrollo e incubar hasta por un total de 7 das antes de considerar la prueba como negativa. C.5. Agar MYP (o medio de cultivo equivalente) Inocular las placas de agar MYP, con el cultivo descrito en el inciso C, con la finalidad de confirmar pureza, lecitinasa y manitol de la cepa aislada. Incubar 24 horas a 35C. Observar la produccin de lecitinasa alrededor de las colonias (halo transparente). El B. cereus no fermenta el manitol en el agar MYP ni tampoco en el agar para B. cereus (OXOID). C.6. Resultados de las diferentes pruebas confirmatorias 1) Bacilo Gram-positivo largo esporulado que no deforma el esporangio 2) Productor de lecitinasa y no fermenta el manitol 3) Crece y produce cido a partir de la glucosa 4) Reduce los nitratos a nitritos (unos cuantos tipos pueden ser negativos) 5) Produce acetil-metil-carbinol (VP positivo) 6) Descompone la L-tirosina D. pruebas para diferenciar a tres miembros del grupo B. cereus, incluyendo B. cereus variedad mycoides, B thuringiensis, B. anthracis. D.1. prueba de movilidad Inocular por puncin en el medio de SIM para movilidad, a partir de un cultivo de 24 horas. Incubar 18-24 horas a 30C y observar el crecimiento a lo largo de la puncin. La mayora de los biotipos de B. cereus y B. thuringiensis son mviles mediante flagelos peritricos, la variedad mycoides es inmvil, unos cuantos biotipos de B. cereus no son mviles.

D.2. crecimiento rizoide Inocular con asa recta, en el centro de las placas de agar nutritivo que estn completamente secas, con el cultivo bacteriano (inciso C). Incubar a 30C por 48-72 horas. Observar el crecimiento rizoideo caracterstico de colonias con estructura tipo raz, que se pueden extender a partir del sitio donde se inoculo. Esta caracterstica es tpica de la variedad mycoides, en tanto que B. cereus presenta colonias en forma de galaxia.

29

D.3. Actividad hemoltica Inocular palcas de agar soya tripticasena con sangre. Incubar 24 horas a 35C. Posteriormente se observa que B. cereus, es fuertemente hemoltico, la mayora de los biotipos de B. thuringiensis y B. cereus variedad mycoides son -hemolticos, en contraste con B anthracis generalmente no presenta hemlisis despus de 24 horas. Nota: se puede utilizar API 50CHB Y API 20E en la caracterizacin bioqumica de los cultivos sospechosos. E. Limitaciones del mtodo Las pruebas confirmatorias recomendadas pueden ser inadecuadas para distinguir al B. cereus de microorganismos similares encontrados en alimentos. Los resultados de los biotipos de B. cereus son variables y requieren adems de otras pruebas para identificarlos. F. Informe de resultados Reportar el nmero de B. cereus/g de muestra basado en el porcentaje de colonias probadas y confirmadas, tomando en cuenta que el factor de dilucin es 10 veces mayor debido a que el mtodo de inoculacin utilizado es el de extensin de superficie.

30

Determinacin de Clostridium perfringens en alimentos OBJETIVOS: Desarrollar y/o implementar una tcnica para la deteccin de Clostridium perfringens. Conocer la importancia en salud pblica de este microorganismo patgeno causante de intoxicacin por la ingesta de alimentos contaminados. FUNDAMENTO: Actualmente existen 2 mtodos diferentes para el aislamiento, numeracin e identificacin de C. perfringens: a) Aislamiento y numeracin presuntiva en agar sangre neomicina y confirmacin por la reaccin de Naegler y la neutralizacin de la reaccin antitoxina de C. perfringens tipo A . b) Aislamiento y numeracin en placas de tipo agar triptosa sulfito cicloserina y fermentacin de carbohidratos.- sta tcnica analtica tienen como principio el de inocular diluciones decimales de en placas de agar TSC ,agar triptosa-sulfito cicloserina, en donde el Clostridium perfringens se manifiesta por la reduccin de sulfitos a sulfuros, los cuales reaccionan con las sales de hierro, produciendo color negro de sulfuro ferroso. -ste mtodo especifica el mtodo de recuperacin de C. perfringens mediante el mtodo de cultivo convencional y es aplicable a cualquier alimento en el cual C. perfringens est viable y presente. MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL con 225 mL de agua peptonada al 0.1% a 3 tubos 16x150mm con 9mL de agua peptonada al 0.1%a 8 cajas petri con agar triptosa-sulfito-cicloserina TSC con yema de huevo.a 8 tubos 22X175 mm con 8 mL de agar triptosa-sulfito-cicloserina TSC sin yema de huevo a 3 tubos de 22x175 mm con 15 mL de caldo hgado cocido o medio de carne cocido -solo en caso de tener colonias sospechosas en agar TSC- b 10 tubos de 16x150mm con 9 mL de medio fluido de tioglicolatob c 10 placas de de agar TSC sin yema de huevo slo en caso de que exista evidencia de contaminacin-c d 10 tubos 16x150 mm con 5 mL de medio acidificado de leche-fierro c d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de agar gelatina lactosa c d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL con agar movilidad-nitratos c d 10 tubos 16x150 mm con 8 mL de caldo para esporulacin c d 10 tubos 13x100 mL con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de salicina, con campana Durham c d 10 tubos 13x100mL con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de rafinosa, con campana Durham c d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de glucosa c d 31

10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de sacarosa c d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de arabinosa c d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de manitol c d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de lactosa c d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de agar esculina inclinado c d Reactivos para la prueba de nitratos cido sulfanlico y diclorhidrato de N-1 naftil etiln diamina-d oe Zinc en polvo d oe Reactivos para la tincin de Gramb,c MATERIAL -Pipetas de 1.5 y 10 mLa -cuenta coloniasb, c -licuadora con vaso o Stomacher con bolsas estriles.a -jarras de anaerobiosisd -incubadora de 35+ 1 C a, b, c, d -cajas petri estrilesa, b, c -asa microbiolgicab, c , d -bao de agua a 45 + 1 Cd -gradillas a, b, c, d NOTAS: a Material necesario al inicio de la prctica. b Material necesario a las 24 horas de iniciada la prctica. c Material necesario a las 48 horas de iniciada la prctica. d Material necesario a las 72 horas de iniciada la prctica. e Material necesario a las 96 horas de iniciada la prctica. PROCEDIMIENTO A.-PREPARACIN DE LA MUESTRA Pesar en condiciones de asepsia , 25 g del alimento y aadir 225mL de diluyente, en este caso de agua peptonada al 0.1% dilucin 1:10 Homogeneizar durante 1-2 minutos a velocidad baja y efectuar diluciones decimales hasta 10-4 con la menor aireacin posible, en caso de no tener colonias sospechosas en agar TSC, guardar en refrigeracin especficamente la dilucin 1:10B.- CULTIVO Y AISLAMIENTO Por duplicado, colocar en las cajas de TSC con yema de huevo 1mL de cada dilucin , agitar

32

perfectamente y dejar que se basorba por completo la muestra. Verter 8mL de agar TSC sin yema de huevo a cada placa. Incubar a 35+ 2 C por 24h C.- MTODO DE CULTIVO ALTERNATIVO Inocular 0.1mL de cada dilucin sobre placas de agar TSC con yema de huevo y distribuir con varilla. Despus de que el inculo se ha absorbido, aadir una sobrecapa de 8mL de agar TSC sin emulsin con yema de huevo. Dejar solidificar. Colocar las placas sin invertir dentro de una jarra para anaerobios con generador y catalizador para incubar de 20-24 h a 35 C Selecciona las placas que contengan entre 20-200 colonias negras. C. perfringens presenta colonias negras en el agar TSC con yema de huevo, con dimetro aproximado de 2 a 4 mm opacas con una zona blanca alrededor de la colonia debido a la actividad de la lecitinasa. Contar y calcular el nmero de colonias de clostridios por g de alimento- verificar la manera de efectuar los clculos en la tcnica analtica de S. aureus tomando en cuenta el volumen inoculado en cada placa TSC el cual puede ser de 1mL 0.1 mL-. D.-PROCEDIMIENTO COMPLEMENTO ste inciso no se realiza cuando existan colonias sospechosas en el agar TSC. En caso contrario: Preparar caldo hgado o bien medio carne, previamente calentado durante 10 minutos en agua hirviente y enfriado rpidamente. Inocular en los medios antes mencionados , 3 tubos con 2mL de la dilucin 1:10, e incubar los tubos durante 24-48 horas a 35 + 2 C E.-PRUEBAS CONFIRMATORIAS PRESUNTIVAS E.1 ENRIQUECIMIENTO Seleccionar 10 colonias tpicas e inocular en medio fluido del tioglicolato desaireado y enfriado. Incubar de 15-24 horas a 35 + 2 C . Despus examinar el desarrollo microbiano de cada cultivo mediante tincin de Gram y comprobar la pureza de las colonias

33

desarrolladas. Si existe evidencia de contaminacin, seleccionar colonias caractersticas y sembrarlas nuevamente sobre placas de agar TSC con yema de huevo e incubar anaerbicamente durante 24 horas a 35 + 2 C. La colonias sobre la superficie del agar TSC , son de color amarillo grisceo, con zonas opacas de 2-4mm de dimetro , por la actividad de la lecitinasa. Este procedimiento tambin es usado para aislar C. perfringens de los tubos de cakdo hgado cocido o medio de carne. E.2 PRUEBA PRESUNTIVA DE LECHE FIERRO Inocular medio de leche-fierro con 1 mL del cultivo del tioglicolato fluido-del paso anterior-, e incubar a 46+ 1 C durante 2 horas. La fermentacin tormentosa se caracteriza por la rpida coagulacin de la leche y la fractura del cogulo, provocada por la formacin de gas que generlmente se eleva a la superficie del medio.Es recomendable utilizar tubos largos para esta prueba , con el fin de evitar derramamientos accidentales. Los cultivos que no presentan la reaccin descrita anteriormente, al cabo de 5 horas, difcilmente ser c. perfringens ; la rapidez de esta prueba tambin depende de la cepa y de la poblacin inicial. Esta prueba es suficiente para casos de prueba presuntiva. F.-PRUEBAS CONFIRMATORIAS COMPLETAS F.1. Gelatina-lactosa, movilidad nitratos y caldo de esporulacin. Inocular por picadura los tubos con medio gelatina lactosa y medio movilidad nitratos, a partir de cultivos puros de caldo tioglicolato fluido o colonias aisladas en el agar TSC. Incubar durante 24horas a 35 + 2 C ; posteriormente en el caso especfico de la gelatina lactosa, examinar el desarrollo, y observar si se presenta cambio de color de rojo a amarillo y produccin de gas, adems enfriar el tubo 1 hora a 5 y observar si hubo licuefaccin de la C gelatina; si el medio de gelatina lactosa permanece slido, incubar adicionalmente 24 horas a 35 + 2 C y observar. Como C. perfringens no es mvil, observar los tubos de movilidad-nitratos, para ver si el crecimiento solamente est a lo largo de la picadura .Por otra parte C. perfringens reduce nitratos a nitritos; para lo cual se aaden 0.5 mL de reactivo A y 0.2 mL del reactivo B. La formacin de un color violeta desarrollada en 5 minutos indica presencia de nitritos. Si no hay desarrollo de color, aadir polvo de zinc, si nuevamente no hay desarrollo de colorvioleta-, indica que los nitratos se redujeron por completo hasta nitrgeno molecular.

34

Inocular caldo para esporulacin, 1 mL de caldo tioglicolato fluido. Incubar 24 horas a 35 + 2 C al trmino establecido preparar una tincin de Gram , en el caso de existir desarrollo microbiano y observar microscpicamente las esporas. Refrigerar los cultivos esporulados por si se requieren pruebas adicionales. F.2 FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS F.2.1 FERMENTACIN DE SALICINA Y RAFINOSA Inocular el caldo tioglicolato que contiene salicina o rafinosa con una asada del cultivo de caldo tioglicolato enriquecido. Incubar durante 24 horas a 35 + 1 C y concluido este tiempo examinar el medio para observar si hubo produccin de cido y gas ; C. perfringens no fermenta la salicina, sin embargo s produce cido y gas a partir de la rafinosa. F.2.2 FERMENTACIN DE OTROS CARBOHIDRATOS E HIDRLISIS DE ESCULINA Inocular el caldo tioglicolato adicionado del carbohidrato seleccionado, con una asada del cultivo de caldo tioglicolato enriquecido. Incubar durante 24 horas a 38 + 1 C y posteriormente examinar el medio despus de adicionar un indicador cido-base, como por ejemplo, rojo de fenol, para observar la produccin de cido. Tomar una asada de caldo tioglicolato enriquecido e inocular por estra nicamente la pendiente del tubo de agar esculina, incubar durante 24 horas a 38 + 1 C y examinar el medio despus de la incubacin. Nota: En el cuadro 1 se resumen la mayora de las pruebas bioqumicas para identificar al C. perfringens. Cuadro 1 Reacciones Bioqumicas de C. perfringens PRUEBA Movilidad Reduccin de nitratos Licuefaccin de la gelatina a 22 C Fermentacin de la glucosa Fermentacin de la rafinosa Fermentacin de la sacarosa Fermentacin de la arabinosa Fermentacin del manitol Fermentacin de la salicina COMPORTAMIENTO _ + + + + gas y acidez + _ _ _

35

Fementacin de la lactosa Fermentacin tormentosa de la leche Hidrlisis dela esculina

+ + _

G.-INFORME DE RESULTADOS Calcular el nmero de clulas C. perfringens en la muestra sobre la base del porcentaje de colonias probadas y confirmadas. EJEMPLO: En el caso de haber inoculado 0.1mL de cada una de las diluciones: El cmputo promedio de la placa para la dilucin 10-4 es de 85 colonias y 8 de 10 colonias se confirmaron para C. perfringens, el nmero de microorganismo por g de alimento es: 85x (810)x 100,000 x 0.1------- 6800000UFC _g alimento--------------68x105UFC_g alimento En el caso de haber inoculado 1mL de cada una de las diluciones: 85x(810)x 10,000 ------- 680000UFC _g alimento--------------68x104 UFC_g alimento

Nota: El factor de dilucin en las placas que contienen yema de huevo y que solamente se sembr 0.1mL de las siluciones, es diez veces mayor como se observa en el ejemplo previamente descrito.

36

Determinacin de Campylobacter jejuni en alimentos. OBJETIVOS: Desarrollar y/o implementar una tcnica para la deteccin de Campylobacter jejuni.

FUNDAMENTO: La presente tcnica para la deteccin de Campylobacter en alimentos, describe un esquema general que consiste en los siguientes pasos: Aislamiento en medios slidos, se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Campylobacter y que permita el reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas. Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los cultivos de Campylobacter y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos. MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES. 1 matraz Erlenmeyer de 250mL con 90 mL de agua peptonada al 0.1%a 4 cajas Petri estril con 20.0 mL de agar selectivo para Campylobactera 3 tubos 16X150 mm con 9 mL de agua peptonada al 0.1%a 2 tubos de 13x100 mm con 3.5 mL de caldo nitratosb 2 tubos de 13x100 mm con 3.5 mL de medio SIMb Reactivo para la prueba de oxidasab Reactivos para tincin Gramb MATERIAL 1 bolsa para Stomacher o vaso de licuadora estril.a Cucharas estriles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos.a Stomacher o motor para licuadora.a Mechero Bunsen.a 2 pipeta estril con algodn de 1 mL.a 1 varilla de vidrio esterila 1 balanza granataraa 1 jarra de anaerobiosisa

37

Propipeta.a Asas bacteriolgicas de 3 mm de dimetrob Tijeras y pinzas estrilesb Microscopiob Incubadora a 42 con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1 a C C NOTAS: a Material necesario al inicio de la prctica. b Material necesario a las 24 horas de iniciada la prctica. c Material necesario a las 48 horas de iniciada la prctica. d Material necesario a las 72 horas de iniciada la prctica. e Material necesario a las 96 horas de iniciada la prctica.

PROCEDIMIENTO. Aislamiento selectivo. 1.- Para el caso de muestras solidas colocar 25 g de la muestra, para muestras liquidas 25 mL de la muestra 2.- Transferir la muestra pesada o medida a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estril. 3.- Adicionar 90.0 mL de diluyente estril al 0.1% a la licuadora o bolsa Stomacher. 4.- Homogenizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora o velocidad mnima. 5.-Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el numero de diluciones est en funcin de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 X 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente. 6.- Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1,10-2, 10-3 y 10-4 a cajas petri con agar selectivo para Campylobacter. 7.- Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estril, en forma de L, iniciando a partir de la mayor dilucin (Mtodo de inoculacin por extensin en superficie). 8.- Mantener las placas en su posicin hasta que el inoculo sea absorbido por el agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente. 9.- Invertir las placas e incubar en condiciones microaeroflicas 42-43 durante 24 a 48 C, horas. 10.- Despus de incubar observar las colonias caractersticas de este microorganismo en el agar selectivo para Campylobacter. Estas se presentan como gotas de agua extendidas a lo largo de la estra.

38

Pruebas bioqumicas Realizar la confirmacin bioqumica del microorganismo, haciendo las pruebas de presencia de las enzimas citocromo oxidasa, catalasa, produccin de H2S, reduccin de nitratos a nitritos, e hidrlisis de purato. Prueba de oxidasa. 1.- Colocar un crculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial. 2.- Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en agar Skirrow y depositarlo en el papel filtro anterior. NOTA Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se torna prpura oscuro o azul en pocos segundos. Prueba catalasa. 1.- Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solucin de perxido al 3%. 2.- la formacin inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. 3.- Precauciones, la emulsin debe realizarse con un asada platico o palillo de madera estril evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre, cualquier contaminacin con eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas. Reduccin de nitratos. 1.- Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35C por 5 das. Para la lectura se debe agregar 0.2 mL de reactivo A y 0.2 mL de reactivo B, un color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo despus de una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). 2.- en forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0.2 mL del reactivo B y 0.2 mL del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva ( presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar 0.2 mL del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa-naftilamina, que es carcinognica. Movilidad en agar. 1.- Inocular en medio SIM, incubar por 48 horas a una temperatura de 37 Observar si el C. microorganismo inoculado es mvil. Produccin de H2S 1.- Inocular en medio SIM, incubar por 48 horas a una temperatura de 37C. Observar si el microorganismo es productos de un precipitado negro. NOTA Para los microorganismos catalasa positivos en el medio se observa un burbujeo al rededor de la estra. 39

CUADRO 2. Caractersticas mnimas para la identificacin de Campylobacter jejuni Morfologa Citocromo oxidasa Catalasa Reduccin de nitratos a nitritos Produccin de H2S Hidrlisis de hipurato Crecimiento a 37 y 42 C C Crecimiento aerobio Movilidad Bacterias curvas Gram negativas no esporuladas. + + + +,+ + +,+ +

Resultados. Interpretacin de resultados. Consultar los resultados obtenidos en el cuadro de identificacin de Campylobacter jejuni y concluir acerca del tipo de microorganismos que se aisl. AGAR SELECTIVO PARA Campylobacter USO Para el aislamiento primario y cultivo de Campylobacter, a partir de muestras clnicas, alimentos, aguas, etc. PRINCIPIO La base y la sangre de carnero junto con la atmsfera deficiente en oxgeno producen un buen crecimiento de Campylobacter. El suplemento con agentes antimicrobianos inhibe marcadamente el crecimiento de las bacterias acompaantes y facilita la recuperacin de Campylobacter. Sembrar la muestra de prueba en la superficie del medio de cultivo por estra cruzada. Incubar 24 48 h en atmsfera de CO2. De acuerdo a la temperatura de incubacin, es posible hacer diferenciacin de especies: TEMPERATURA DE INCUBACION MICROORGANISMO 25C Campylobacter fetus ssp fetus + Campylobacter jejuni Campylobacter coli Campylobacter fetus ssp venerealis + 35C 42C + + + + + -

40

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA BASE Agar 15.0 Extracto de levadura 2.0 Bisulfito de sodio 0.1 Dextrosa 1.0 Cloruro de sodio 5.0 Polipeptona 20.0 SUPLEMENTO Anfotericina B 0.002 Vancomicina 0.010 Cefalotina 0.015 Polimixina B 2500 Unidades Trimetoprim 0.005 Sangre de carnero estril desfibrinada 100 mL PH 7.2 0.2 PREPARACION Rehidratar 43.1 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45C. Adicionar la sangre de carnero estril desfibrinada, homogeneizar perfectamente. Agregar los suplementos previamente hidratados, segn las especificaciones del fabricante en condiciones de esterilidad, mezclar sin producir burbujas. Vaciar en cajas de Petri estriles. Conservar en refrigeracin de 2 a 8C. CONTROL DE ACTIVIDAD MICROORGANISMO CEPA CRECIMIENTO Campylobacter jejuni ATCC 33291 Bueno Escherichia coli ATCC 25922 Parcial a completa inhibicin Enterococcus faecalis ATCC 29212 Parcial a completa inhibicin

41

Determinacin de Shigella spp. en alimentos. OBJETIVOS: Desarrollar y/o implementar una tcnica para la deteccin de Shigella spp.

FUNDAMENTO: Para demostrar la presencia de Shigellas, se usan muestras preparadas a partir de los alimentos o materia fecal de los pacientes o bien de individuos sospechosos de ser portadores. Las muestras se siembran directamente en placas con agar selectivo o se pasan primero a travs de un medio de enriquecimeinto en un caldo selectivo y se siembran luego en placas. Los cultivos cuyas colonias previemente se han observado en el microorcopio teidos al Gram y se caracterizan por ser bacilos Gram-negativos, se utilizan para realizar las pruebas bioquimicas, pruebas de aglutinacin (antigeno-anticuerpo). Este procedimiento analtico especifica el mtodo de recuperacin de Shigella mediante cultivo convencional especialmente formulado para Shigella, as como la adicin de novobiocina, incubando anaerbica y estriado en agar Mac-ConKey y es aplicable a cualquier alimento en el cual la Shigella est viable y presente. El principio de la tcnica de aislamineto consiste en: a) Enriquecimiento de Shigelle sonnei. Colocar 25 g de la muestra en 225mL de caldo GN adicionado de 0.5 mg/mL de novobiocina, seguido de incubacin anaerbica a 442 oC / 20 horas y despus es sembrado por estria en agar Mac ConKey b) Enriquecimiento de otras especies de Shigella. Proceder como en el inciso a) ,pero adicionar 3 mg/mL de novobiocina, incubar anaerbicamnete a 442 oC / 20 horas y despus es sembrado por estria en agar Mac ConKey. MEDIOS DE CULTIVO 1 matraz Erlenmeyer con 225 mL de caldo para Gram-negativos con 0.5 mg y/o 3 mg de novobiocina cuyo pH final sea 7.0 (caldo GN+novobiocina)a 2 cajas Petri con 20mL de agar Mac Conkey (MC)b 2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar Kligler (KIA) inclinadosc 2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar hierro lisina (LIA) inclinadosc 2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo rojo de metilo Voges Proskauer (RMVP)e 2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de medio sulfuro indol movilidad (SIM)e 2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo glucosa ms rojo de fenol y conteniendo campana de Durhame 2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo surraco o caldo ureae 2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo malonatoe 2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar citrato de Simmonse

42

2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo KCN 2 tubos con caldo sacarosa ms rojo de fenole 2 tubos con caldo adonitol ms rojo de fenole 2 tubos con caldo inositol ms rojo de fenole 2 tubos con caldo salicina ms rojo de fenole 2 tubos con caldo mucato (slo en el aislamiento de otras especies diferentesa S. sonnei )e 2 tubos con agar acetato de sodio (slo en el aislamiento de otras especies diferentesa S. sonnei )e SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES. 1 frasco gotero con solucin salina isotnica estril (NaCl 0.85%)c 1 frasco gotero con reactivo de Kovacse 1 frasco gotero con solucin de rojo de metiloe. 1 frasco gotero con solucin reactivo de Voges-Proskauer No.1 (VP1; solucin etanlica de alfa-naftol al 5% p/V)e. 1 frasco gotero con solucin reactivo de Voges-Proskauer No.2 (VP2; hidrxido de potasio a 40% P/V)e. Juego de colorantes para la tincin de Grame BIOLGICOS Antisuero polivalente somtico O MATERIAL Y EQUIPO. Balanza granatariaa. 1 caja de Petri de vidrio estrila. 1 bolasa de Stomacher o un vaso de licuadora estrila. Utensilios necesarios para la manipulacin de la muestra: cucharas, cuchillos, tenedores, estrilesa. Stomacher o motor para licuadoraa. Pipetas de vidrio de 1.0 y 5 mL, estriles con filtro de algodnd. Pipetas Pasteur estrilesc. Asa microbiolgica b. Mechero de Bunsena, b, c,d,e Portaobjetosc. Microscpio pticod,e. Jarra para anaerobiosis a Incubadora a 35C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a +/-0.1C a,b,c, Incubadora a 42 y 44C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a +/-0.1C a. NOTAS. a b c d e Material necesario al inicio de la prctica. Material necesario a las 24 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 72 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica.

43

PROCEDIMIENTO: Mtodo convencional de cultivo. A) Enriquecimeinto de S. sonnei: 1. Pesar en una caja de Petri esterl, en rea asptica 25g de muestra. 2. Verter el contenido de la caja Petri en una bosa de Stomacher o vaso de licuadora estril. 3. Adicionar a la muestra, 225mL de caldo GN estril ms 0.5 mg de novobiocina. 4. Homogenizar la muestra con el diluyente durante 30 segundos a velcidad media en Stomacher o 10 segundos en la licuadora a la mas baja velocidad 5. Mantener la suspensin 10 min. A temperatura ambiente y agitar peridicamente. 6. Incubar en jarra de anaerobiosis con catalizador en incubadora a 442 oC durante 20 horas 7. Agitar y sembrar por estria en placas de agar Mac Conkey 8. Incubar a 352 oC durante 20 horas. B) Enriquecimiento de otras especies de Shigella 1. Proceder como en el inciso a utilizando 3 mg de novobiocina 2. Incubar la muestra homognea anaerbicamente a 422 oC durante 20 horas. C) Aislamiento de S. sonnei o cualquier otra especie de Shigella. 1. Examinar las placas de agar Mac Conkey (colonias ligeramente rosas y translcidas, con o sin bordes rugosos). 2. Inocular 2 colonias sospechosas en agar TSI y en agar LIA. 3. Incubar todos los medios a 352 oC durante 20 a 24 horas. 4. Descartar los cultivos que muestren motilidad, H2S, formacin de gas, descarboxilacin de la lisina y fermentacin de lalactosa o sacarosa. D) Caracterizacin fisiolgica. Realizar tincin de Gram e inocular los cultivos sospechosos en diferentes pruebas bioqumicas, en tiras de API 20 E. Las caractersticas de Shigella se resumen en: bacilos Gram-negativos, negativos para H2S, ureasa, glucosa (gas), mitilidad, descarboxilacin lisina, sacarosa, adnitol, inositol, lactosa (2 das), KCN (Caldo cianuro de potasio), malonato, citrato, salicina y acetato. Es positivo para rojo de metilo en RM/VP. Utiliar antisuero para identificar el serotipo. Las especies de Shigella tieneden a dar negativas las reacciones de acetato de sodio, citrato y mucato, mientras que la E. coli , anaergena tiende a dar positiva al menos una de estas 3 ltimas reacciones. E) Pruebas bioqumicas 1.Agar triple azcar hierro o agar Kligler hierro. Registrar las caractersticas del medio TSI o KIA antes de la inoculacin (color del medio). Por duplicado tomar suavemente una porcin del centro de la colonia con asa bacteriolgica recta y estril e inocular por picadura y estra en un tubo con agar triple azcar hierro (TSI) o

44

agar Kligler (KIA) inclinado. Incubar el medio TSI o KIA a 35+/-2C durante 24 h. 2. Agar lisina hierro. Hacer la misma operacin que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.), tomando la asada de la misma colonia con la que se sembr en estos medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro. 3. Caldo urea (convencional). Con asa bacteriolgica recta estril, tomar del crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo con caldo urea o caldo Surraco. Incubar a 35+/-2C durante 24 h. Caldo urea (rpida). Con asa bacteriolgica estril, tomar dos asadas de crecimiento de l cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o LIA e inocular tubos de caldo urea (rpido). Incubar a 35+/-2C durante 24 h. 4. Agar citrato de Simmons. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e inocular por estra en el tubo con agar citrato de Simmons. Incubar a 35+/-2C durante 96 h. 5. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad). Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e inocular por puncin vertical en el tubo con medio SIM. Incubar a 35+/-2C durante 24 h. Para verificar la produccin de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento de 0.2 a 0.3mL de reactivo de Kovacs. 6. Caldo RM-VP (rojo de metilo- Voges Proskauer) . Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e inocular en tubo con caldo RM-VP. 6.1. Prueba de Voges Proskauer. Para la prueba de Voges Proskauer incubar a 35+/-2C durante 48 h. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estril un mililitro de cultivo. Adicionar a este cultivo, 0.6mL de reactivo de VP1 (alfa- naftol etanlico al 5%), agitar y agregar o.2mL de reactivo VP2 (Hidrxido de potasio al 40%). Adicionar algunos cristales de criatinina (opcional). Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto de que la 45

reaccin se lleve a cabo en presencia de oxgeno.

Prueba de Rojo de metilo. Para la prueba de Rojo de metilo (RM) incubar a 35+/-2C el resto del medio RMVP durante 48 h ms (96 h. de incubacin en total a partir de la incubacin del medio RMVP). Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solucin indicadora de rojo de metilo. 7. Caldo malonato (para confirmar la presencia de S.arizanae). Con asa bacteriolgica recta estril, tomar crecimiento del medio TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo que contiene caldo malonato. Incubar a 35+/-2C durante 40 h. 8. Caldo KCN y/o caldo mucato Con asa esterl tomar un inculo de Kliger, TSI o LIA y sembrar en los caldos antes mencionados (segn sea el caso), incubar a 35+/-2C durante 20 a 24 horas. 9. Agar acetato de sodio Con asa esterl tomar un inculo de Kliger, TSI o LIA y sembrar por estria en el agar acetato de sodio e incubar a 35+/-2C durante 20 a 24 horas. 10. Pruebas de fermentacin de carbohidratos ms rojo de fenol (indicador de pH) Con el asa, tomar inculo de los medios Kliger, TSI o LIA y sembrar en un tubo de ensayo que contenga el caldo con el carbohidrato ms rojo de fenol adems de una campana de Durham (segn sea el caso), para poder onservar la posible produccion de gas y cambio de pH. Incubar a 35+/-2C durante un lapso de 20 a 24 horas. Interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas consultando su carcaterizacin fisiolgica en el inciso D. En caso de no aislarse ninguna especie del gnero Shigella , es recomendable identificar el o los microorganismos coliformes que estn presntes en el alimento analizado. F) Identificacin serolgica: 1. Colocar con un asa bacteriolgica, 2 gotas separadas de solicin salina estril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos; en donde una gota ser el control. 2. Suspender en cada una de las gotas, una porcin de cultivo desarrollado en agar Kliger. 3. Agragar a una de ellas, una gota de antisuro polivalente somatico O y mezclar perfectamente bien. 4. Inclinar la lmina hacia atrs u hacia delante, durante aproximadamente un minuto para posteriormente observar bajo buena iluminacin y fondo obscuro los resultados de esta prueba. 5. Considerar el grado de aglutacin de acuerdo a:

46

0 = no aglutinacin 1+ = aglutinacin escasa 2+ = aglutinacin con un 50% de claridad 3+ = aglutinacin con 75% de claridad 4+ = aglutinacin total Notas: a) Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo, empleando antisueros especificos como son el A, B, C y D b) Si la aglutinacin con el antisuero O es negativa, calentar a ebullicin a bao Mara durante 30 min. para hidrolizar el antigeno capsular que interfiere en la reaccin. Despus repetir la prueba con el antisuero polivanete O. G) Informe de resultados Reportar presencia o ausencia de Shigella spp. (identificacin de especie) en 25 gramos de alimento.

Bibliografa: MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS; David A. A. Mossel; Editorial Acribia; 2a edicin; Zaragoza (Espaa); 2003; pp. 258, 440, 626. MICROBIOLOGIA MODERNA DE LOS ALIMENTOS; James M. Jay; Editorial Acribia; a 3 edicin; Zaragoza (Espaa); 1994; pp.217, 321-326, 407. FOOD MICROBIOLOGY FUNDAMENTALS AND FRONTIERS; Michael P. Doyle; ASM Press Washington D.C.; 1997; pp. 102, 110-111, 327-335, 704-705. TCNICAS MICROBIOLGICAS DE APLICACIN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS ALIMENTOS; Mercedes Palao, Aurora Ortegn, Martha Giles; Facultad de Qumica UNAM

47