CENTRFUGAS

La centrifugacin es un procedimiento fsico que permite la separacin de partculas, bien sean clulas, orgnulos, molculas, etc. en base a la diferente velocidad a la que sedimentan en un medio acuoso bajo la accin de un campo centrfugo. Este campo se aplica en unos aparatos denominados: centrfugas por medio de la rotacin de una de las piezas, llamada rotor, a gran velocidad dentro de una cmara acorazada en la que puede estar la temperatura controlada (para evitar la degradacin de muestras termosensibles) y en ocasiones bajo vaco (para evitar el calentamiento del rotor por el rozamiento con el aire). Como ya sabis (Ver Fig.2.1), todo cuerpo sometido a un movimiento giratorio segn una trayectoria circular de radio R con una velocidad angular w experimenta una fuerza (Fc.) que tiende a alejar al cuerpo del centro de giro.

Esta fuerza se conoce como Fuerza Centrfuga y su valor vendr expresado por:

donde: m = masa del cuerpo. El nmero de veces que la fuerza centrfuga supera a la fuerza de gravedad se denomina Factor Centrfugo, el cual nos permite evaluar la eficiencia de una centrfuga operada bajo estas condiciones al compararla con el proceso regulado solo por la gravedad. El Factor Centrfugo se expresa como:

donde: C = RCF = Factor centrfugo. Fc = Fuerza centrfuga (Kg.). p = Peso del objeto o partcula (Kg.). m = masa del cuerpo (Kg.). g = aceleracin de la gravedad (9.81 m/s2). w = velocidad angular (radianes/s). R = Radio de giro (m). N = Revoluciones por minuto (rpm) Para un clculo aproximado puede utilizarse la expresin:

Debemos destacar que el Factor Centrfugo se denomina tambin como "G" o "Z", planteando que determinada centrfuga

genera un campo centrfugo de tantas "g". Las rpm, las g y el radio se pueden relacionar entre s por medio de unos diagramas denominados: Nomogramas. As, podemos trabajar indistintamente con unos valores u otros o realizar ciclos de centrifugaciones idnticos con rotores o centrfugas distintas entre s. En la siguiente pgina se presenta uno de ellos. Trazando una lnea recta entre 2 valores de los 3 que tenemos presentados podemos despejar el valor restante que no conocamos.

En todos los tipos de rotores existentes es fundamental colocar siempre bien equilibradas las cargas (en forma simtrica) para evitar desgastes anormales de rodamientos y vibraciones excesivas en las subidas y bajadas de velocidad.

Existen 2 tipos de rotores:

+De ngulo fijo: Los tubos se alojan con un ngulo fijo respecto al eje de giro. Se usan habitualmente para volmenes grandes. El caso extremo es el de los rotores verticales en que los tubos se sitan paralelos al eje de giro. Los rotores de ngulo fijo se emplean principalmente para sedimentar materiales hasta que formen una masa muy compacta en el fondo del tubo (pellet) y despus por decantacin, separar fcilmente el sobrenadante del sedimento. Resultan muy eficaces para este propsito debido a que el material se mueve nicamente un corto trecho hasta la pared del tubo de la centrfuga, aqu se acumula y resbala rpidamente hasta el fondo del tubo.

+Basculantes: Los tubos se hallan dentro de unos cestillos que cuelgan. Estos cestillos estn unidos al rotor con un eje y cuando la centrfuga gira, se quedan suspendidos en direccin perpendicular a la del rotor.

Se usan en la centrifugacin zonal (o en bandas) a travs de gradientes de densidad preformados (normalmente de sacarosa o glicerol) o bien para separar partculas con coeficientes de sedimentacin muy similares. La sacarosa es el material ms comnmente usado debido a su pureza, bajo coste y su no interferencia con la mayora de las mediciones qumicas, pticas o enzimticas. Si la macromolcula en estudio es un enzima o una protena inestable, se usa con frecuencia el glicerol puesto que muchas protenas son ms estables y se desnaturalizan ms difcilmente en presencia de glicerol.

Hay diferentes tipos de centrfugas segn el rango de velocidades de giro: A. Centrfugas de baja velocidad, de sobremesa o clnicas. De pequeo tamao y normalmente sin refrigeracin. Alcanzan una velocidad mxima de 6.000 rpm. tiles para la separacin de partculas grandes como clulas o precipitados de sales insolubles.

Las centrfugas microfuge o biofuge seran una variante de las anteriores que permiten llegar a velocidades de hasta 13.000 rpm, siendo los volmenes de trabajo muy pequeos (microtubos) y pudiendo ser refrigeradas o no. Son tiles en el campo de la biologa molecular.

B. Centrfugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades mximas entre 18.000 y 25.000 rpm (pueden generar alrededor de 60.000 g). Son refrigeradas y normalmente tienen sistema de vaco para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Este mismo sistema de vaco permite que puedan tener un control ms exacto de la temperatura que aquellas que no hacen vaco. Son tiles en la separacin de fracciones celulares, pero insuficientes para la separacin de ribosomas, virus o macromolculas en general.

C. Ultracentrfugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de refrigeracin para refrigerar no slo la cmara del rotor donde estn las muestras sino tambin el motor y adems sistemas auxiliares de vaco para alcanzar un altsimo nivel de vaco. Pueden generar ms de 600.000 g, las cuales son suficientes para separar protenas pequeas. Las ultracentrfugas se dividen en: analticas y preparativas. La diferencia ms importante entre ellas es que la analtica cuenta con un sistema ptico para visualizar la sedimentacin de la muestra en tiempo real lo que permite la obtencin de datos precisos de propiedades de sedimentacin (coeficientes de sedimentacin, pesos moleculares) siendo ste el objetivo primordial y no la purificacin de la muestra para un uso posterior, que s sera el objetivo de la preparativa, til para aislar partculas de bajo coeficiente de sedimentacin (microsomas, virus, macromolculas), siendo este tipo el inmensamente mayoritario de ultracentrfuga.

En este esquema de una ultracentrfuga preparativa de sobremesa se puede apreciar como existe una barrera de proteccin primaria de acero (19 mm de grosor) rodeada a su vez por otra capa de acero (13 mm de grosor) que acta como una barrera secundaria para dar plena proteccin al operador. En cualquier centrfuga la parte ms dbil siempre es la tapa superior.

RUTINAS DE MANTENIMIENTO
Las rutinas de mantenimiento que requiere una centrfuga dependen de mltiples factores tales como de la tecnologa incorporada, la intensidad de uso, la capacitacin de los usuarios y las condiciones del ambiente donde se encuentra instalada.

Para los rotores:

+ Registrar la fecha de compra de cada uno de los rotores as como los datos relativos a modelo y nmero de serie, cumpliendo las especificaciones que d el fabricante. + No sobrepasar las indicaciones de velocidad mxima ni de densidad de muestras recomendadas por el fabricante. Cada rotor est diseado para soportar un mximo nivel de esfuerzo que nunca se debe sobrepasar por seguridad. + Utilizar los rotores nicamente en las centrfugas para las que han sido fabricados. No intercambiar rotores sin antes verificar su completa compatibilidad. + Acatar las recomendaciones relativas a reducir la velocidad de operacin cuando se trabaja con soluciones de alta densidad, tubos de acero inoxidable o adaptadores plsticos. + Utilizar rotores de titanio si se trabaja frecuentemente con soluciones salinas. + Para el caso de rotores de aluminio proteger la capa de aluminio anodizado de la que estn recubiertos no utilizando detergentes alcalinos o soluciones que pudieran retirar dicha pelcula protectora. + Utilizar cepillos plsticos en las actividades de limpieza de los rotores y detergentes suaves en baja concentracin. Los cepillos

metlicos rayan el recubrimiento protector y esto genera fuentes de futura corrosin que acortan la vida til del rotor. + Lavar el rotor inmediatamente en el caso que se hayan producido derrames de sustancias corrosivas, secndolo al aire y no en estufa. + Almacenar los rotores en ambientes secos y boca abajo, sin la tapa correspondiente. + Lubricar las roscas y anillos de goma (O-rings) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. + Nunca tratar de abrir una tapa de una centrfuga que est funcionando ni intentar parar el rotor con la mano. + En el caso de rotores de ultracentrfuga siempre que se usen hay que consignar el rotor y tiempo empleado porque los de aluminio o titanio sufren fatiga de material y hay que cambiarles el disco de sobrevelocidad a medida que cumplen el nmero de horas de uso establecido y desecharlos si se les ha acabado el perodo de vida til. Este tema ha sido resuelto con los ltimos rotores de fibra de carbono que presentan entre sus ventajas que son ms ligeros, ms rpidos (aceleran hasta la velocidad deseada y deceleran despus ms rpidamente que los convencionales) y tambin son ms duraderos y se pueden reparar.

Para los tubos (o botellas):

+ Verificar si los tubos son reutilizables o son de un nico uso. Siempre es preferible usarlos nuevos a que se nos puedan romper y perder las muestras, teniendo que limpiar despus todo el rotor. + Lavar los tubos, adaptadores y dems accesorios a mano usando un detergente suave diluido en agua y un cepillo de textura suave que no sea metlico. Evitar usar los lavavajillas para este tipo de tubos ya que pueden producir rayaduras.

+ Evitar el uso de alcohol y acetona puesto que dichos materiales afectan la estructura de los tubos. Los fabricantes recomiendan el tipo de solvente a emplear con cada tipo de material con que se fabrican los tubos de centrifugacin. + Evitar secar los tubos en estufa. Es mejor que se sequen al aire. + Almacenar los tubos o botellas en un lugar oscuro, seco y fresco y alejados de fuentes de vapores qumicos o de fuentes de luz ultravioleta. + Verificar no sobrepasar los niveles mximos de llenado para evitar su colapso o vertido dentro del rotor.

MANTENIMIENTO PREVENTIVO
Las rutinas de mantenimiento ms importantes que se le efectan a una centrfuga son:

Periodicidad mensual:
Revisar que el rotor no se haya visto afectado por derrames. Limpiar la cubeta de la centrfuga con etanol al 70% que acta tambin como desinfectante. Lubricar el eje con una grasa tipo Spinkote. Verificar el estado de las juntas de estanqueidad (sustituir si es necesario o bien solamente lubricar los anillos de goma con silicona de vaco). Para rotores de cestillos, lubricar los puntos de apoyo de los cubiletes con grasa adecuada. Quitar polvo y posibles manchas de la superficie externa de la centrfuga. Verificar el estado del mecanismo de cierre de la tapa para garantizar la seguridad de los operadores. Comprobar que en teclados de membrana no exista seal de que los estn manipulando con las uas en vez de con las

yemas de los dedos porque de lo contrario se acaba perforando la membrana de proteccin.

Periodicidad anual:
Verificar el estado de las escobillas del motor y sustituir si es necesario (normalmente solo para centrfugas bastante antiguas). Hoy en da casi todas llevan motores de induccin sin escobillas y rodamientos sin mantenimiento. Comprobar el estado de la toma de aire y limpiarlo o sustituir el filtro si dispone de l.

Para mquinas refrigeradas efectuar una limpieza del radiador para que haya un buen flujo de aire y no se pierda eficacia en el sistema de refrigeracin. En el caso de centrfugas que lleven bombas de vaco de aceite, cambiar los aceites tanto a la bomba de vaco como a la bomba difusora.

PARTE PRCTICA
Como parte prctica se proceder a desmontar, limpiar, engrasar y volver a montar un rotor de diversos tipos de centrfuga. Asimismo se ensearn los distintos tipos de centrfugas y rotores que poseemos en el primer piso del departamento para investigacin.