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Extraccin de ADN a partir de sangre total e hisopado de la mucosa bucal mediante SALTING OUT.
Luis A. Colihuinca Llancapan RESUMEN: Se realiz la extraccin de ADN a partir de una muestra de sangre total y la otra de hisopado de la mucosa bucal. Para esto se trabajo con la tcnica de SALTING OUT (sacando con sal) en ambas muestras. Con la finalidad de poder evidenciar en ambos casos el ADN extrado mediante sta tcnica. Palabras claves. ADN, Salting Out, RNAasa y EDTA.

INTRODUCCIN En todas las clulas, a excepcin de las clulas de eritrocitos humanos, contienen ADN en sus ncleos. Tambin se puede encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares diferentes al ncleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. La cantidad de ADN presente en algunos tejidos es muy pequeo; por este motivo no representa una fuente conveniente de extraccin, aislamiento y purificacin, para luego ser aplicados en diferentes estudios de caracteres genticos, biolgicos y bioqumicos. Muchos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la macromolcula en pequeos fragmentos. Despus de ser extrado el ADN, ste suele ser rpidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remocin, aislamiento y purificacin con el fin de obtener un
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producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la clula de la cual proviene. Una importante consideracin a tener en cuenta al momento de realizar la tcnica, es que el estrs o tensin mecnica o fsico qumica, que acompaan los procesos de purificacin de las molculas de ADN deben ser evitadas al mximo y las nucleasas inhibidas para obtener una molcula ADN puro y sin sustancias interferentes. El ADN es extrado de la clula por diferencia de presin osmtica entre la clula y el medio. Del mismo modo los detergentes inicos y no inicos, destruyen los lpidos al nivel de la membrana plasmtica y exponen al ADN en un medio de altas concentraciones de sal que nos permita separar al ADN del resto de los componentes con ayuda de agentes qumicos. Esto permite la precipitacin de restos de la membrana y las protenas que contiene el ADN, nos permite
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obtener biomolculas disueltas, entre ellas al ADN libre de protenas Histonas y no Histonas. La tcnica del salting-out funciona en presencia de altas concentraciones de sales del medio, aumentando la fuerza inica del medio, y la solubilidad de las protenas disminuye y finalmente terminan por precipitar (salting-out). El objetivo de este trabajo fue evaluar el mtodo del salting-out para la extraccin de ADN a partir de muestras de sangre total e hisopado de la mucosa bucal.

Con trula se obtuvo la muestra de clulas epiteliales de la mucosa bucal frotando la trula por la cara interna de la mejilla. Se corta la trula y se introduce en un tubo eppendorf de 1,5ml y se agrego 800ul de suero fisiolgico, luego se vorteo por 1 minuto. Desde ahora todos los pasos para ambas muestras fueron iguales: Se agregaron 800 l de solucin de lisis celular a 2 tubo eppendorf de 1.5 ml. Luego agrego 300 l de sangre total con EDTA a uno de los tubos y al otro se agrego la muestra de clulas epiteliales de mucosa bucal. Se incubaron por 10 minutos a TA, invirtiendo el tubo 2 a 3 veces durante la incubacin. Esto con el fin de que se produzca una buena lisis de clulas rojas. Se centrifugaron a 14000 rpm por 30 segundos. Luego descartamos el mximo de sobrenadante cuidando de no remover el pellet que se ha formado en el fondo del tubo. Se vortearon vigorosamente hasta resuspender el pellet formado (el pellet contiene las clulas blancas). Se aadieron 300 l de solucin de lisis nuclear al tubo con el pellet resuspendido y mezcle con la pipeta de 5 a 6 veces. La solucin se volvi viscosa. Se incubaron los tubos a 37C por 15 minutos.

Materiales Sangre total con EDTA, Hisopado de mucosa bucal, Reactivo de lisis celular (R1), Reactivo de lisis nuclear (R2), Reactivo de precipitacin de protenas (R3), Trulas, Suero fisiolgico 0,9%, Gradilla, Tubos eppendorf, Micropipetas, 1 centrifuga, 1 timer, Etanol al 70%. Mtodos Hisopado de mucosa bucal.

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Se aadieron 100 l de solucin de precipitacin de protenas al lisado nuclear (a cada tubo) y se vortea vigorosamente por 10 a 20 segundos. Se centrifugaron a 14000 rpm por 3 minutos. En unos nuevos tubos eppendorf de 1.5 ml se aadi 300 l de isopropanol a cada uno. Luego se transfiri 300 l del sobrenadante obtenido del paso 11 al tubo con isopropanol y mezclaron gentilmente por inversin hasta ver la hebra de ADN. Se centrifugaron a 14000 rpm por 3 minutos. El ADN deber verse como un pequeo pellet blanco en el fondo del tubo. Se descart el sobrenadante y se aadieron 300 l de etanol al 70% y se mezclaron por inversin para lavar el pellet. Se centrifugaron a 14000 rpm por 3 minutos. Se descart el sobrenadante con cuidado, se deja escurrir boca abajo sobre papel absorvente y se dejaron secar a TA al aire. Una vez seco el ADN se agregaron 100 l de solucin de rehidratacin e incubaron 60 minutos a 65C. Posteriormente se proceden a guardar las muestras.

total. Se pudo apreciar un pellet blanco flotando casi en el fondo del tubo. En cambio con la muestra que contena clulas epiteliales de la mucosa bucal, no se pudo observar el ADN.

Img.1.Tubos eppendorf

Discusione En cuanto a los resultados obtenidos en el procedimiento realizado, puedo sealar que el producto filamentoso obtenido de la extraccin no es ADN puro ya que, entremezclado con l, hay fragmentos de ARN. Para realizar una buena extraccin se debe realizar aadiendo enzimas que fragmentan las molculas de ARN e impiden que se unan al ADN o que estn en la mezcla. El mtodo empleado para trabajar Salting- out es uno de los mtodos de extraccin de ADN ms utilizados por su fcil implementacin, baja toxicidad de los reactivos y lo ms importante es que permite la visualizacin del ADN. Se incubo la muestra de ADN a 65C, para permitir que el calor suavice los fosfolpidos (grasas) en las membranas que rodean la clula y el ncleo. Tambin desnaturalizan a las enzimas
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Resultados En el momento de la observacin del ADN, este se pudo observar claramente en la muestra que perteneca a sangre
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desoxirribonucleicas (ADNasas) las cuales, si estn presentes junto al ADN, pueden cortar el ADN en pedazos tan pequeos que lo hara imposible de ver. Si las enzimas se desnaturalizan y el ADN se desenrolla, ste pierde su forma y se vuelve inactivo. Las enzimas se desnaturalizan a 60 Celsius y el ADN se desnaturaliza a 80 Celsius. Por lo tanto la incubacin se realizo con el fin de poder desnaturalizar las enzimas presentes juntos al ADN y de esta manera evitar que se dae el ADN por las emzimas DNasas. Al realizar el procedimiento adecuadamente, resulta que las fibrillas de ADN comenzaron a verse, de un color blanco precipitado por sobre el isopropanol (mezcla heterognea). Para conservar el ADN se procedi a realizar los pasos finales de la tcnica. La molcula de ADN se precipita en el alcohol fuera de la solucin, uniendose de tal forma que puede ser visto. Adems de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solucin acuosa. Para el caso de que el ADN de la muestra de clulas de la mucosa epitelial no se puedo apreciar muy claramente. Se debera agitar el tubo un poco ms tiempo para poderlo apreciarlo mejor. Segn lo realizado podemos saber cmo es el procedimiento del extraccin del ADN, as como si estructura de una forma fcil y sencilla pero de todas maneras se deben cumplir con los requerimientos bsicos que es la de trabajar rpido y ordenado y en los tiempos ptimos para evitar que las
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DNasas interfieran y destruyan nuestra muestra de ADN.

Referencia bibliogrfica jewtuchowicz*, j. l. finquelievich. Comparacin de mtodos de extraccin de ADN de sangre para detectar ADN fngico por PCR. Centro de Micologa, Departamento de Microbiologa, Parasitologa e Inmunologa, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. Revista Argentina de Microbiologa (2007). http://www.scielo.org.ar/pdf/ram /v39n1/v39n1a04.pdf Ral P. Ferreira. Extraccin de ADN micro escalado por salting out departamento biologa molecular y gentica. http://www.hospitalameijeiras.sl d.cu/hha/mpm/documentos/biolo gia%20molecular%20y%20gene tica/gp/extraccion%20de%20dna %20micro%20escalado%20por %20salting%20out.pdf Duina Posso Duque. Protocolos de extraccin de ADN total de animales mtodo de Salting Out. Protocolos de laboratorio UEG 2009. Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, Altos de Pipe- Venezuela. (http://www.ivic.gob.ve/ecologi a/ueg/).

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