MEDIOS DE CULTIVO

Sustrato ptimo para el mantenimiento y crecimiento de microorganismos en el laboratorio

Condiciones generales de un medio de cultivo: - Presentar elementos necesarios en proporciones y cantidades adecuadas - pH ptimo - Condiciones osmticas idneas - Debe ser estril y preservado de contaminacin

Medios de cultivo

Agua Fuente de energa Nutrientes

Macronutrientes
Micronutrientes Factores de crecimiento

COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Agua Extracto de levadura Fuente rica en vitaminas del complejo B Contiene nitrgeno orgnico y compuestos de carbono Peptonas Producto resultante de digestin de materiales proteicos Fuente principal de nitrgeno orgnico Contiene tambin vitaminas, y a veces carbohidratos

Existen 2 tipos, dependiendo del tipo de digestin que hayan sufrido: Hidrlisis qumica (cida o alcalina) Hidrlisis enzimtica

Infusiones y extractos Contienen las sustancias solubles en agua de tejidos animales (carbohidratos, compuestos orgnicos nitrogenados, vitaminas solubles en agua y sales) Un caldo se obtiene por ebullicin de los tejidos, una infusin implica un "colado" del lquido obtenido. Un extracto es un concentrado de un caldo.

Azcares Fuente de energa (cuando su proporcin es de 1 g/L) o como sustrato de prueba (1-2%) Sales minerales Se distinguen 2 tipos, de acuerdo a la funcin que desempean: 1- Sales para el mantenimiento de la presin osmtica (NaCl) 2- Tampones: carbonatos y fosfatos

Indicadores de pH Sustancias que cambian de color cuando el medio alcanza algn valor determinado de pH Ejemplos: - Azul de timol - Prpura bromocresol - Azul de bromotimol - Rojo fenol - Rojo neutro - Azul de bromofenol, rojo de metilo, rojo de cresol, fenolftalena, etc...

Indicadores REDOX Sustancias que cambian de color cuando se producen este tipo de reacciones Ejemplos: Azul de metileno (azul-incoloro) Cloruro de trifenilo (incoloro-rojo)

Agentes selectivos Sustancias que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos y favorecen el de otros Ejemplos: - Colorantes (antimetabolitos): cristal violeta, verde brillante, etc. - Azida sdica: Inhibe el metabolismo aerobio (inhibe cadena respiratoria); afecta principalmente a bacterias Gram (-) - Sales biliares y detergentes: Agentes tensoactivos, depresores de la tensin superficial. Gram (-) resisten ms su accin - NaCl: Elevadas concentraciones son perjudiciales para microorganismos no halfilos - pH: Cada tipo de microorganismo tiene su rango de pH ptimo y sus valores crticos - Antimicrobianos: Sustancias capaces de matar a microorganismos

Suplementos (factores de crecimiento) Compuestos orgnicos que un microorganismo requiere como precursor o como constituyente de su material orgnico celular, pero que no puede sintetizar a partir de fuentes de carbono ms sencillas, y debe ser administrado como nutriente

Hay 3 clases: Aminocidos Pirimidinas Vitaminas

Agentes solidificantes Permiten solidificar un medio previamente lquido Ejemplos: - Agar-agar - Gel de slice - Geles poliacrlicos

Agentes reductores Disminuyen el contenido de O2, se obtiene un ambiente de anaerobiosis

Ejemplos: - cido ascrbico - Tioglicolato sdico - cido tiomlico - Cistena

Agentes quelantes Agentes que forman complejos solubles con los metales, impidiendo as que estos formen un complejo insoluble con los fosfatos El ms utilizado: EDTA

CLASIFICACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Segn la composicin Definidos o sintticos: Composicin qumica conocida

No definidos o complejos: Composicin qumica no definida, enriquecidos con peptonas, extracto de carne, de levadura, sangre

Segn la naturaleza fsica

Lquidos ------ Caldos Slidos: Llevan un agente solidificante (Agar). Se utiliza a una concentracin del 1.5% Semislidos: Contienen agar en concentracin del 0.7%

Segn sus caractersticas Medios nutritivos o de propagacin: Permiten el crecimiento de cualquier tipo de bacteria
Ejemplos: Agar nutritivo
Composicin por Litro: Extracto de Carne de buey 3g Peptona trpsica de gelatina 5g Agar 15 g Peq cant cloruro sdico y glucosa Agua destilada hasta 1000 mL

Agar TSA (tripticasa-soya-agar)

Composicin por litro: Peptona de casena 15.0 g Peptona de soja 5.0 g Cloruro sdico 5.0 g Agar-Agar 15.0 g pH del medio al utilizarse: 7.3 aprox.

Placa con Agar TSA sin inocular

Medios de enriquecimiento: Medios complejos con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos
Agar sangre
Medio rico en nutrientes, con adicin de sangre de cordero desfibrinada al 5% Formulado especialmente para diferenciacin de cepas por la hemolisis producida

Placa con Agar Sangre sin inocular

- hemlisis en Agar sangre

- hemlisis en Agar sangre

 Medios selectivos o inhibitorios: Contienen sustancias que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros o cuya composicin permite el desarrollo de un grupo determinado

Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios

Ejemplos:
Agar MacConkey Utilizado para diferenciar entre coliformes (fermentadores de lactosa) y Enterobacterias (no fermentadoras de lactosa)

Inhibe Gram (+) por contener sales biliares Bacterias fermentadoras de lactosa liberarn productos cidos que producirn un cambio de pH que se detectar gracias al rojo neutro

Agar EMB (Eosina-Azul de Metileno) Para aislamiento selectivo de bacilos Gram (-) Permite desarrollo de las Enterobacterias

Eosina y Azul de metileno ----- Son colorantes indicadores e inhibidores Permiten diferenciar colonias lactosa (+) de (-)

E. coli y Citrobacter spp.

No fermentadores de lactosa en Agar EMB A) Salmonella typhi B) Proteus vulgaris C) Pseudomona aeruginosa

A)

B)

C)

Fermentadores de lactosa en Agar EMB A) E. coli B) Enterobacter cloacae C) Klebsiella pneumoniae

A)

B)

C)

Agar Chromocult Medio selectivo para Enterobacterias Permite diferenciar entre coliformes totales y E. coli Tergitol inhibe Gram (+) y algunas Gram (-). No afecta crecimiento de coliformes

Deteccin simultnea de coliformes totales y E. coli por Salmon-Gal y X-glucurnido (sustratos cromognicos)

Identficacin de coliformes Enzima caract. de coliformes: -D-galactosidasa, sta se une a Salmon-Gal produciendo colonias color salmn-rojo Identificacin E. coli enzima caract. de E. coli: -D-glucuronidasa se une con X-glucurnido y Salmon-Gal, produciendo colonias color azul oscuro-violeta

CRECIMIENTO EN CHROMOCULT

Agar Salmonella-Shigella (SS) Medio de cultivo selectivo y diferencial

Selectividad por sales biliares y verde brillante --- Inhiben desarrollo de Gram (+), mayora coliformes y Proteus sp.

Diferencial por fermentacin de lactosa y formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio

Salmonella, Shigella y otros microorganismos son no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo

Colonias lactosa (-) son incoloras

Colonias lactosa (+) son rosadas-rojo Colonias de MOS productores de H2S presentan un centro negro

Apariencia de las colonias Incoloras y translcidas Translcidas con centro negro Rosadas-rojo Colonias ms grandes que las de E. coli, rosadas o beige opaco (crema), mucoides

MOS Shigella y algunas especies de Salmonella Proteus y mayora de sp de Salmonella E. coli, Klebsiella Enterobacter aergenes

Agar cetrimide Medio selectivo para aislamiento de Pseudomona aeruginosa Cetrimide inhibe el crecimiento bacteriano excepto Pseudomona aeruginosa y aumenta la produccin de fluorescena y piocianina

Agar bismuto-sulfito Agar selectivo para el aislamiento de Salmonella typhi y otras Salmonellas
Bismuto y verde brillante inhiben flora acompaante H2S (+) ennegrecen el medio por formacin de sulfuro de hierro Reduccin de iones bismuto a bismuto metlico produce brillo metlico alrededor de colonias despus de 24 h de incubacin
Microorganismos Apariencia de las colonias

Salmonellas

Colonias centro negro, bordes claros. Medio precipitado negro y lustre metlico
Colonias pequeas amarillas o marrn. Medio circundante claro sin alteraciones

Bacterias coliformes, Serratia, Proteus y otros

Agar Baird-Parker Aislamiento selectivo de Staphylococcus aureus Cloruro de litio y telurito inhiben el crecimiento de de flora acompaante Piruvato y glicina estimulan selectivamente el desarrollo de Staphylococcus

Medio Staphylococcus 110

Medio selectivo para aislamiento y diferenciacin presuntiva de Staphylococcus Se base en produccin de pigmentos, fermentacin de manitol y la hidrlisis de gelatina En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la triptena aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos

Gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa

Lactosa y manitol son los hidratos de carbono fermentables Cloruro de sodio, se encuentra en alta concentracin, para inhibir desarrollo de flora acompaante excepto Staphylococcus spp. Ventajas de este medio: Permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificacin presuntiva (desarrollo de pigmentos, fermentacin de manitol e hidrlisis de gelatina)

Pigmento Microorganismo S. aureus ATCC 25923 S. aureus ATCC 6538 S. epidermidis ATCC 14990 + + -

Fermentacin de manitol + + -

Hidrlisis de la gelatina + + +

Prueba de la coagulasa + + -