UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE HONDURAS FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA

LABORATORIO DE TOXICOLOGIA

LTF 510

Prctica N 3: Determinacin de carboxihemoglobina en sangre por colorimetra

DETERMINACIN DE CARBOXIHEMOGLOBINA COLORIMETRA (MTODO KATSUMATA y COL.) 1. Objetivos

1.1. 1.2.

EN

SANGRE

POR

Aplicar herramientas espectrofotomtricas a estudios toxicolgicos Conocer sobre la evaluacin de intoxicaciones por monxido de carbono

2. Principios generales
El monxido de carbono es un gas incoloro, inodoro, inspido y no irritante que se origina de la combustin incompleta de la materia orgnica. Su afinidad a la hemoglobina es aproximadamente 240 veces mayor que el oxgeno, de manera que desplaza a este ltimo provocando hipoxia. Es un txico no especfico y se ha encontrado que inhibe la actividad de la enzima citocromo a 3 oxidasa, causando una peroxidacin lipdica. La magnitud de sus efectos est relacionada con las cantidades absorbidas y el tiempo de exposicin. El complejo monxido de carbono-hemoglobina, conocido como carboxihemoglobina (HbCO), es generalmente utilizado como bioindicador de intoxicacin por este gas, aunque no es 100% fidedigno para evaluar la dimensin del dao en el organismo. Las intoxicaciones por monxido de carbono (CO) ocupan un especial inters en la ciencia forense. Muchos incidentes de envenenamiento por CO se producen debido a la combustin incompleta, el fuego, los gases de escape de automviles entre otras causas. Cuando una vctima es encontrada en la escena de un incendio, el grado de saturacin HbCO puede ser til para juzgar si ha muerto por asfixia ante el humo generado durante el fuego en s o si fue asesinada antes del mismo (muchos homicidas incendian la escena del crimen para borrar cualquier evidencia). Dado que el CO tiene una vida media muy corta, rara vez se recomienda su determinacin en casos clnicos. Para las mediciones del porcentaje de saturacin de HbCO en la sangre, se disponen generalmente de mtodos espectrofotomtricos y la cromatografa de gases. La metahemoglobina (Met-Hb) aparece en muchas muestras de sangre y puede interferir en estas determinaciones, por tanto es importante utilizar mtodos que no sean influidos por la presencia de la misma. En esta prctica se llevar a cabo un mtodo espectrofotomtrico simple, fiable y selectivo para las mediciones de saturacin de HbCO.

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3. Equipo y materiales
3.1.

Muestra

La muestra de trabajo es sangre total, venosa, no hemolizada, recolectada en tubos con EDTA, heparina o con fluoruro de sodio y oxalato de potasio. Las muestras deben ser protegidas de la luz y el anlisis debe realizarse el anlisis lo antes posible. El CO puede ser liberado por efecto de la luz, e incluso en ausencia de la misma y a temperaturas de refrigeracin. Tambin pueden ocurrir algunos procesos de produccin de Met-Hb que interfiere en la medicin de HbCO para algunas metodologas. Se ha comprobado que los niveles de HbCO permanecen estables a -30C hasta por 60 das, por lo que la congelacin es recomendable si el anlisis se realizar en un perodo mayor a 24 horas despus de la extraccin de las muestras. Las muestras hemolizadas o extradas de fluidos sanguinolentos en las cavidades torcicas y abdominales no son adecuadas para estos anlisis, debido a la incidencia de falsos positivos por procesos de putrefaccin. 3.2.

Reactivos

3.2.1. Solucin de Na2CO3 0,1% Disuelva 0,1 g de Na2CO3 GR cantidad suficiente de agua destilada para 100 mL 3.2.2. Solucin de NaOH 5M Disuelva aproximadamente 20 g de NaOH GR en cantidad suficiente de agua destilada para 100 mL 3.2.3. Ditionito de sodio Hidrosulfito de sodio (Na2S2O4) GR, preferiblemente en porciones de 2 mg 3.3.

Equipo

3.3.1. Micropipetas de 100 L de capacidad, con puntas descartables 3.3.2. Espectrofotmetro con rango visible (500 nm 600 nm) 3.3.3. Celdas para espectrofotmetro de al menos 3 mL de capacidad 3.3.4. Pipeta graduada de 5 mL o dispensador con 0,1 mL de sensibilidad

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4. Procedimiento
Efecte el siguiente procedimiento con un blanco de muestra (muestra negativa), un control positivo y una muestra problema (muestra desconocida) 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. Transfiera a una celda espectrofotomtrica 2,5 mL de Na2CO3 0,1% Adicione 2 mg de ditionito de sodio y mezcle Adicione 10 L de sangre total y 200 L de NaOH 5M y mezcle Espere que la reaccin se complete durante 5 minutos

4.5. Registre un barrido espectral de 500 nm hasta 600 nm, utilizando agua destilada como blanco, posteriormente grafique el espectro resultante 4.6. 4.7. Determine las absorbancias a 532 nm y 558 nm (A 532 y A558) Anlisis cualitativo

4.7.1. Registre las absorbancias y longitudes de onda ledos 4.7.2. Grafique la absorbancia contra longitud de onda para obtener un espectro 4.7.3. Compare el espectro con otros correspondientes a una muestra de sangre negativa y otra positiva respectivamente 4.7.4. Identifique y describa las diferencias espectrales entre la oxihemoglobina y la carboxihemoglobina reducidas. 4.8. Anlisis cuantitativo

4.8.1. Calcule el %HbCO del blanco de muestra y la muestra desconocida por la siguiente ecuacin: % HbCO = (2,44 A558/A532)X67 4.8.2. Reste el % HbCO del blanco a la muestra desconocida 4.8.3. Se consideran valores normales en personas sanas, no fumadores, aquellos menores a un 10% de HbCO

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5. Investigaciones
Cules son las principales fuentes de intoxicacin por CO Describa la toxicodinamia y toxicocintica del CO Cules son las manifestaciones txicas esperadas del CO segn su grado de saturacin (%HbCO)? Describa como pueden presentarse falsos positivos en esta prueba Describa el protocolo de manipulacin preanaltica de las muestras para el ensayo de carboxihemoglobina Indique al menos otro mtodo, incluso colorimtrico, para determinar CO en sangre.

4. Lecturas recomendadas
Penney, David G., Carbon monoxide poisoning. CRC Press. Boca Raton, Florida, U.S.A. 2008 Dix, Jay; Graham, Michael; Hanzlick, Randy. Asphyxia and Drowning, An Atlas. CRC, Boca Ratn, Florida U.S.A. 2000. Pginas 15-17 Suzuki O., Watanabe K., [editors] (traduced 2005) Drugs and Poisons in Human, A Handbook of Practical Analysis, cap. Carbon monoxide by Keizo Sato. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Deutschland.

5. Bibliografa
Suzuki O., Watanabe K., [editors] (traduced 2005) Drugs and Poisons in Human, A Handbook of Practical Analysis, cap. Carbon monoxide by Keizo Sato. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Deutschland. Penney D. G. (editor), (2008) Carbon Monoxide Poisoning. CRC press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, Florida, U.S.A. Flanagan R. J., et al. (2007) Fundamentals of Analytical Toxicology. John Wiley & Sons. West Sussex, England. Prez, T. y Patio N. Curso Taller Toxicologa Analtica, Gua de Laboratorio de Urgencias Toxicolgicas Departamento de Toxicologa, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogot. 2006. Bogot, Colombia.

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6. Anexos HOJA DE TRABAJO

ANLISIS ESPECTROSCPICO Blanco de Control muestra positivo nm Absorbancia Absorbancia 500 505 510 515 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550 Muestra desconocida Absorbancia nm 551 552 553 554 555 556 557 558 559 560 561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 577 578 579 580 585 590 595 600 Blanco de muestra Absorbancia Control positivo Absorbancia Muestra desconocida Absorbancia

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HOJA DE TRABAJO
ANLISIS CUANTITATIVO
ID Muestra Control positivo Blanco de muestra A558 Resultados cuantitativos A532 %HbCO* %HbCO corregido

Valor de referencia: %HbCO < 10%

*% HbCO = (2,44 A558/A532)X67

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