indekiler

BYOTEKNOLOJ ................................................................................................................................................... 3 BTK BYOTEKNOLOJS .................................................................................................................................... 3 KLONLAMA ............................................................................................................................................................ 5 KLONLAMANIN TARHES ............................................................................................................................... 6 KLONLAMA TEKNOLOJSNN GELM ........................................................................................................ 7 REKOMBNANT DNA TEKNOLOJS ............................................................................................................... 9 VEKTRLER KLONLANACAK DNA PARALARI ........................................................................................ 13 PROKARYOTK VEKTRLER............................................................................................................................ 13 RESTRKSYON ENZMLER LE KLONLAMA ............................................................................................... 16 HBRT VEKTRLER N SEM ................................................................................................................... 18 KR ULU EKLENME......................................................................................................................................... 19 BELRL BR GENN KLONLANMASI .............................................................................................................. 21 GENOM KTPHANES OLUTURMA............................................................................................................ 24 KLONLANMI GEN N SONDA ..................................................................................................................... 28 WESTERN BLOTTING ......................................................................................................................................... 29 KROMOZOM YRY, KOMUU GENLERN TANIMLANMASI.......................................................... 31 HETERODUPLEX ANALZ.................................................................................................................................. 32 EUKARYOTK VEKTRLER .............................................................................................................................. 34 MAYA VEKTR................................................................................................................................................. 34 HAYVAN VEKTRLER...................................................................................................................................... 35 BTK VEKTRLER ............................................................................................................................................ 37 YABANCI DNANIN EUKARYOTK HCREDE FAALYETNN SALANMASI ...................................... 38 NAKAUT (KNOCKOUT) FARE ........................................................................................................................... 39 BLDRC SSTEMLER........................................................................................................................................ 40 RESTRKSYON HARTALAMA ........................................................................................................................ 41 RESTRKSYON HARTALARININ YAPIMI .................................................................................................... 43 FT KESNT ........................................................................................................................................................ 47 RESTRKSYON PARACIK UZUNLUU POLMORFZM .......................................................................... 47 POLMERAZ ZNCR REAKSYONU ................................................................................................................. 49 DNA DZL SIRASI BELRLENMES .............................................................................................................. 52 D DEOKS METODU LE DZL SIRASI BELRLEME ................................................................................ 52 DZL SIRASI ANALZNDE GEREKL OLAN PRMER (BASLAMA YER) ............................................. 58 KONFIGURASYONU OLUUMUNUN MEYDANA GETRLMES ............................................................... 58 GEN KLONLAMANIN PRATK SONULARI................................................................................................... 60 1

2- REME AMALI KLONLAMA ...................................................................................................................... 62 3- YLETRME AMALI KLONLAMA ........................................................................................................... 63 KLONLAMANIN SPER STARI DOLLYNN KOPYALANMA AAMALARI VE SONRASI .................... 64 KLON CANLILARIN SALII ........................................................................................................................... 68 BEDEN HCRELERNNKROMOZOMLARI NASIL OLUYOR DA AKTARILDII YUMURTA HCRESNN KROMOZOMLARI GB DAVRANMAYA BALIYOR? ......................................................... 69 KLONLANMI CANLILAR VERC HCRENN ALDII CANLININ TAM BR KOPYASI MI? ............... 69 NSAN KLONLAMA ............................................................................................................................................. 70 KEND ORGANINI KENDN YAP ...................................................................................................................... 72 NSAN KLONLANMASINDA BR ADIM DAHA .............................................................................................. 73 KLONLAMANIN TEHLKELER ........................................................................................................................ 73 KLONLAMA LE LGL YAPILMI NEML ALIMALAR ....................................................................... 74 DONMU FAREDEN KOPYA ............................................................................................................................. 74 KLONLANMI 3 BEBEK YAIYOR ................................................................................................................... 75 KAYNAKLAR: ...................................................................................................................................................... 76

BYOTEKNOLOJ

Biyoteknoloji; Hcre, doku ve organ kltr, molekler biyoloji, fizyoloji, biyokimya, mikrobiyoloji, molekler genetik gibi doa bilimleri ile temel mhendislik ve bilgisayar bilimlerinden yararlanarak, genetik ve molekler DNA teknikleriyle bitki, canllarn genetik haritalarn kartmak, oaltmak, slah etmek, deitirmek, gelitirmek, yeni ve az bulunan rnleri yine canllara (organizma, hcre ve dokulara) rettirmek veya bunlarn daha fazla elde etmek iin kullanlan teknolojilerin tmdr. Doku kltr ve Genetik mhendislii olmak zere 2 ana kola ayrlr. Biyoteknoloji ve genetik mhendislii, biyoteknoloji ve molekler biyoloji, biyoteknoloji ve doku kltr gibi ifadeler bu nedenle doru ifadeler olmayp biyoteknoloji hem doku kltr hem de genetik mhendisliini kapsamaktadr. niversitelerde eitli lisans programlar veya derslerin benzer isimlerde olmas da yanltr. Biyoteknoloji geleneksel ve modern olmak zere grupta deerlendirilir. Mikroorganizmalarca stn yourt ve peynir,e dntrlmesi, sirke yapm geleneksel gda biyoteknolojisi konusu, yine genetik mhendislii ilemeleriyle zellikleri gelitirilmi mikroorganizmalarca daha nitelikli (rnek: Enzimler, proteinler vb.) ile eitli etken maddeler (ila hammaddesi, alar vb.) veya rnler (biyoetanol vb.) gelitirmek modern gda, tbbi veya mikrobiyal biyoteknoloji konulardr. Bu nedenle biyoteknolojinin bitki, hayvan, gda, tbbi, mikrobiyal, endstriyel (beyaz biyoteknoloji) ve evre biyoteknolojileri olarak uygulama dallar gelimitir. Bu sitede arlkl olarak Bitki Biyoteknolojisi zerinde durulmaktadr. Aslnda sistem tm dallarda benzer almaktadr. Doku kltrne hcre doku ve organlar, genetik mhendisliinde ise DNA temel hedeftir. Tm canllarn DNA'nn ileyii ve temel mekanizmalar bakmndan birbirine hemen hemen benzer olduu dnlrse temel genetik mhendislii tekniklerini iyi bilmek her trl biyolojik materyal ile alabilmeye imkan verirken doku kltr uzmanl daha geni bir alan istemektedir. nk insan, hayvan, bitki ve mikroorganizmalarda hcre, doku ve organ ileyii ve mekanizmalar bakmndan derin farklar olabilmektedir. Oysaki bu canllarn herhangi birisinin DNA's bir dierine uyum gsterebilmektedir. Dolaysyla, canllar hatta bir trn bireyleri arasnda bile doku, hcre, organ vb. uyumazlklar grld halde canllar arasnda DNA bakmndan uyumazlk grlmemektedir. Bu da DNA'nn temel molekl olduunu gstermektedir.

BTK BYOTEKNOLOJS
Biyoteknolojik tekniklerin bitkilere uygulanmasna bitki biyoteknolojisi denir. Bitkilerin ve hcrelerin oaltm doku kltryle, bunlarn genetik zelliklerinin aratrlmas genetik mhendislii, zelliklerin deitirilmesi veya gelitirilmesi de her iki tekniin birlikte uygulanmas ve/veya bitki slah teknikleriyle yaplmaktadr. Klonlama (kopyalama) terimi insan ve hayvanlar (Dolly) iin daha 10 yl nce kullanlmaya balanmasna karn bitkiler (rnek: Havu, ttn) 1950'li yllardan itibaren klonal olarak oaltlmaya yani kopyalanmaya balanmtr. Buna rejenerasyon (organogenesis, somatik 3

embriyogenesis, meristemlerden srgn) veya klonal oaltm denilmektedir. Bir ok bitki tr hi bir eeysel reme hcresi iermeyen vcut (somatik) hcrelerinden (rnek: yaprak, sap vb. doku ve organlar) ok rahatlkla oaltlabilmektedir. Rejenerasyon bir hcreden balayabilecei gibi (somatik embriyogenesis, protoplast-callus-bitki), birden fazla hcrenin birlikte oluturduu bir faaliyet sonucu (organogenesis) veya bir ok hcrenin organize olarak bir doku ve organlar ve sonuta bitkiyi oluturmasyla da ortaya kabilmektedir. Bitkilerin bir ounda uygun doku kltr artlarnda (besin, byme dzenleyicileri, scaklk, k vb.) rejenerasyon ortaya kabilmektedir. Tek bir vcut hcrenin kendisinin alnd ana bitkiye benzer bitkiler retebilme yeteneine totipotensi denilmektedir. Genetik mhendislii teknikleriyle bir ok bitki trnn genom haritas karlm ve genleri tespit edilmeye balanmtr. Arabidopsis adl ilkel bir ot olan bitkinin hemen hemen tm genetik zellikleri halen ortaya konulmutur. Bir ok nemli bitki trnn genom haritas karlmak zeredir.

Genetii/Genetik olarak Deitirilmi Organizmalar (GDO veya GMO) (bitki, hayvan, insan veya mikroorganizmalar) eitli biyoteknolojik metotlarla genetik yaplar bir veya daha fazla zellik (gen) bakmndan deitirilmi organizmalar, bunlardan elde edilen rnlere ise Genetii Deitirilmi (GD) rnler veya gdalar, ierisinde belirli snrn zerinde GD ieren rnlere ise GDli rnler ad verilmektedir. Genetii deitirilmi bir canlya gen transferi yaplm anlamnda 'transgenik' de denilir. Biyoteknoloji sadece GD veya GM demek deildir. GDO, GDli rnler eitli soru iaretleri olmasna karn Trkiyede eitli kampanyalar nedeniyle ok tehlikeli rnler gibi anlalmaktadr. Benzer bir tartma hormonlar konusunda da mevcuttur. Bu konuda detayl tartma ve bilgilere sitenin GDO-GMO tartmas ksmndan ulalabilir. Sunularda biyoteknoloji ve GDO'lar bakmndan Trkiye ve Anadolu Blgesi iin neriler ve deerlendirmeler de bulunmaktadr. nsanlarda etik konular nedeniyle byk tartmalarn yaand genetik mhendislii alannda bitkilerde olduka baarl sonular retilmitir. Doku kltr ve genetik mhendislii teknikleri tek bana veya birlikte uygulanabilmektedir. Tm dnya lkelerinde biyoteknolojik almalar ncelikli desteklenmektedir. ABD bu alanda dnyada nc konumdadr. Aada bitki biyoteknolojisinin faydalar ve baz uygulamalar verilmitir. Biyoteknolojinin faydalar ve uygulama alanlar

Biyoteknoloji ile yksek besin ierii, hasat sonras dayankllk, hastalk, zararl, kuraklk ve ot ilacna genetik dayanklln artrlmas, yenilebilir alar (elma, muz), bitkilerce biyolojik olarak ayrabilir plastik retimi vb. gibi transgenik (GDO) retimi yannda; Hcre, doku ve organ kltr ile tohum (sentetik), fide, fidan, yumru, miniyumru, soan retimi (klonal oaltm veya mikrooaltm)

* Sentetik tohum retimi * Somaklonal varyasyonlarn oluturulmas * In vitro tozlanma * Protoplast izolasyonu ve somatik melezlemeler * Hcre seleksiyonu 4

* Apomiktik bitkilerin oluturulmas * Haploit bitkilerin oluturulmas ve embriyo kltr ve kurtarmas * Biyoteknolojik germplazm muhafazas (zelikle Trkiye endemik bitki trlerinin korunmas amacyla ok gereklidir) * Tbbi amal protein ve sekonder metabolit retimi * Molekler markrlerin gelitirilmesi yoluyla seleksiyon ve slahta klasik slaha destek salanmas * Yabani ve kltr bitkilerinde genom sekanslamas ve genetik-molekler zelliklerinin ortaya konulmas * Sinyal iletim mekanizmalarnn belirlenmesi * Endstriyel rnlerin (proteinler, ya, vitaminler, enzimler vb.) retilmesi * Biyoyaktlarn retilmesi * Molekler test, tan ve tedavilerin yaplmas gibi bir ok ilem yaplabilmektedir.

KLONLAMA
Bir memeli hayvan yumurtasndan, vcut hcresinin ekirdeinin yeniden programlanabilecei ve onu btn bir birey oluturabilme potansiyeline sahip klabilecei gereine dayanan bir sre olduu belirtilmektedir. Yani Klonlama (kopyalama), tek bir hcre ekirdeindeki genetik malzemeden, birbirinin zdei ok hcreli canllarn retilmesidir. Klonlama terimi, biyolojide birok farkl anlamda kullanlabiliyor. Bedenimizdeki her hcre, tek bir hcrenin, balangtaki dllenmi bir yumurta hcresinin klonudur. Baz bitkiler ve az sayda hayvan tr, partenogenez yoluyla kendilerini klonlayarak reyebilirler. Molekler klonlamaysa, bir DNA parasndan daha fazla genetik malzeme elde etmek zere kullanlan laboratuar yntemlerine verilen ad; DNAnn protein kodlayan blmlerinin yaltlarak oaltlmasdr. Tek yumurta ikizleri de birbirlerinin, tek bir embriyonun ikiye blnmesiyle olumu klonlardr. Bir yetikin hcresinden yeni bir canl oluturmak iin kullanlan yntemse, bedensel hcre ekirdei aktarm dr.

KLONLAMANIN TARHES
lk defa, Leipzig niversitesinden Hans Adolph Eduard Dreisch deniz kirpikleriyle yapt deneylerde erken dnemdeki bir deniz kirpisi embriyosunun blastomerlerini bir birinden ayrarak Blastomere Separation yntemini buldu. Blastomere Seperation ynteminde dllenmi yumurtann besi ortamnda 4-8 hcreli blastomer aamasna kadar blnmesine izin verilmektedir. Daha sonralar, blastomer aamasna gelen bu 8 hcreli yapdaki her bir hcre alnarak bir blastosit oluturulmakta ve sanki yeni dllenmi zigot gibi tayc anneye aktarlarak genetik olarak birbirinin ayns klonlar meydana getirilmektedir. *1902 de Hans Speamann ayn yntemi kullanarak semender blastomerlerini ayrd ve her blastomerden yeni bir semender olutu. Bu yntemin kefiyle klonlamann temeli atlm oldu. *1938- Hans Speamann, fantastik bir deney olarak tanmlad halbuki klonlama diyebileceimiz bir deneyde ge evredeki bir embriyonun ekirdei karlarak ekirdei olmayan bir yumurtaya aktaryordu. Speamann 1938 ylnda yaynlad Embrionic Development and Induction adl kitabnda bu deneyi fantastik olarak nitelendiriyordu. Halbuki bu deney 1952 ylnda gerekletirilmitir. *1952- Robert Briggs ve T. J. King ilk klonlama deneyini gerekletirdiler. leri aamadaki bir kurbaa yumurtasnn ekirdei karld ve baka bir kurbaa yumurtas iine aktarld. Ancak deney sonunda yumurta gelimedi. Briggs ve King bu ynteme Nklear Transfer ismini verdiler. *1970- Ayn deney yine kurbaalar zerinde John Gordon tarafndan denendi. Daha iyi bir sonu alnd. Kurbaa yumurtalar, iriba olana kadar geliti ama daha sonra ldler. *1984- Steen Willadsen, Nklear Transfer yntemini kullanarak olgunlamam koyun embriyo hcrelerinden yaayan bir kuzu klonladn aklad. Daha sonra Willadsen, inek, domuz, kei, tavan ve rhesus maymunu da klonlad. Bu deneylerde ok hcreli koyun embriyosundan ekirdek alnp yumurta hcresine aktarlyordu. Daha sonra hcre blnmesi balyor, fetus oluuyor ve gelime devam ediyordu. *1994- Daha gelikin embriyo hcrelerinin ilk klonlamasn Neal First gerekletirdi. En az 120 hcrelik buza embriyosu klonland. Bu ok hcreli inek embriyosunun ekirdei karld ve ekirdek yumurta hcresine aktarld. *1996- Ian Wilmut, Neal First"in deneyini koyunlar zerinde yapt. Ancak embriyo hcrelerinin ekirdeini almak iin hcrelerin duraklama dnemine gelmesini bekledi. Sonra ekirdekleri karp yumurta hcresine aktard. *1997- Dr. Wilmut, 6 yandaki bir koyunun meme hcresinden klon retti. Bu defa ekirdek erikin bir hcreden yani meme hcresinden alnp yumurta hcresine aktarlmt. Bu olaya Somatik Nklear Transfer ad verilmitir. Dolly 277 yumurta iinde tek hayatta kalan kuzuydu. Dolly"nin olutuu hcre Ocak 1996"da birletirilmiti. *1998- Tp doktoru G. Richard Seed, o gnlerde anne rahminden ald insan embriyosunu baka bir annenin rahmine aktaryordu. nsan klonlamaya kar duyduu ilgiyi ilan etti. Bu konudaki hassas denge, ahlak tartmalara yol at. Tartmalar sonucu Amerika Birleik Devletlerinde insan klonlamaya kar yasalar konuldu.

*1999- 19 Avrupa lkesi insann genetik olarak kopyalanmasn yasaklayan szlemeyi Paris"te imzalad.

KLONLAMA TEKNOLOJSNN GELM

Bu teknolojinin geliim aamalarn yle zetleyebiliriz;

1. Transgenik Teknolojisi
Gen veya gen paralarnn bir fertten alnp bir baka ferdin DNAsna transferi eklinde dnlebilir. Bu teknolojide gen veya genler dllenmi yumurtaya aktarlr. Mesela kanser oluturan insan genleri fare embriyolarna aktarlarak ila sanayinde tedavilerin testinde kullanlabilmektedir. Bu teknoloji ile insandan koyuna, domuza, sra ve keiye gen aktarm yaplmakta, stlerinde insan proteini retilmesi yan sra organ, doku ve kan retme imkn da bulunmaktadr. Bu protein ile emphysema ve cystic fibrosis gibi hastalklar tedavi edilebilmektedir.

2. ekirdek Transfer Teknolojisi

Bu teknoloji bir hcredeki btn genomu yani somatik kromozomlarn bir hcreden dierine naklini ifade eder. ekirdek, dllenmi yumurta hcresinden alnmakta ve ekirdei alnm fakat dllenmemi yumurta hcresine yerletirilmektedir. Bu sistemle uygulanan byle bir teknik klonlama olarak deerlendirilmemektedir. Zira bir duplikasyon ilemi bulunmamaktadr. Ancak burada sitoplzmada bulunan mitokondri DNAlar farkldr.

ekirdek Teknolojisini Kullanarak Yaplan Klonlama ki ekilde yaplmaktadr;

a) Embriyo Klonlama: Alnan rnek, dllenmi bir embriyodan alnp yine ayn annenin yumurtasnda ekirdek transferi yaplrsa bu durumda mitokondri DNAlar ayn olacaktr. Bu teknoloji benzer ikizlerin oluturulmasnda kullanlmakta ve embriyo klonlama olarak bilinmektedir. Sr, kurbaa ve farede de baarl ekilde denenmitir. nsanlarda da bu tip klonlama yaplm ancak bu ikizler yaatlamamtr. Bununla beraber basnda klonlama olarak isimlendirilmesine ramen bu uygulamada farkl ekirdekler kullanld iin bunlar gerek klonlar deillerdir. 7

b) Normal Canl Klonlama (Somatik Nkleer Transfer): Dolly douncaya kadar, normal bir canly klonlamak mmkn deildi. Organizma dllenmi bir yumurtadan meydana gelmekte ve her bir hcre dllenme sonucunda oluan tm bir genomu iermektedir. Her bir hcre birbirinin tamamen aynsdr. Ancak, byme ve gelime olaylar hcrelerde farkllama meydana getirmekte ve beyin dokusu, kalp dokusu, deri, kemik vs olumaktadr. Baz genler somatik hcrelerde bu ekilde zel grevlere ayrld zaman almasn durdurmakta ve sadece ilgili deri, kemik gibi genleri almaktadr. Embriyonik klonlamada farkllamaya balamam dllenmi yumurta hcresinin ekirdei (genom) kullanlmaktadr. Dollynin oluumunda ise somatik bir dokudan alnan hcreyle bu ilem baarlmtr. Bu transfer sonunda, somatik dokudaki almayan genler tekrar almaya balam ve genlerin almas organlarn olumasyla durmutur. Genlerin gerektii zamanda almas veya almasn durdurmas klonlamann esasn oluturmaktadr. Bu uygulamada dllenmemi yumurtann ekirdei karlarak, somatik hcre ekirdei bu yumurtann iine yerletirilmitir. Oluan zigot, herhangi bir koyuna nakledilerek gelimeye braklmtr. Bu uygulamann embriyonik klonlamadan fark, mitokondriyal DNAnn farkl olmasndan kaynaklanmaktadr. Burada ilgin olan dier nokta, Dolly bir babaya sahip deildir, fakat 3 anneye sahip olabilir. Mesela, annesi; - Genomu kullanlan bir dii olabilir - Yumurta hcresini veren dii olabilir - Gameti tayan bir dii olabilir

Genetik kizlik

kizlik kavram iki veya daha fazla benzer kardelerin olumas anlamndadr. kizlik, seksel bir retim sonucudur. Hcredeki btn DNA iki farkl ferdin DNAlarnn yarsn tamaktadr. Dllenmi yumurta iki ya da daha fazla paraya tekrar blnecek ve ayn cinsiyette fertler meydana getirecektir. Bu olayn ekirdek transferi ile ilgisi yoktur. Klonlama ise aseksel bir retimle ilgilidir. Klonlamada mitokondri DNAlar farl olabilir ancak ikizlikte hepsi ayn olmak zorundadr.

Klonlamayla IVF (In Vitro Fertilizasyon) Arasndaki Fark

IVF, yumurta hcresinin (ans artrmak iin birka tanesi) sperm tarafndan tpte dllendirilmesi ve daha sonra rahime implante edilmesi olaydr. Klonlamada ise yumurta hcresinin ekirdei tpte karlyor ve klonlanacak canlnn ekirdei bu hcreye veriliyor. Dolaysyla, yumurta hcresi artk byyeceini salayan ekirdee sahip oluyor. Bundan sonra bu yeni hcre rahime implante ediliyor ve normal embriyolar gibi bymeye devam ediyor. Klon embriyolar, normal ve IVF (in vitro fertilizasyon) embriyolar birbirlerine ok fazla benzemezler. Roslin Enstitsndeki aratrmaclar, klon embriyolarnn normal embriyolardan daha byk olduunu ve hamileliklerin baarszlnn ve fets lmyle sonulanmasnn daha ok rastlandn veya sezeryan ameliyatlara ihtiya duyulduunu saptamlar. 8

REKOMBINANT DNA TEKNOLOJS

1970 ortalarnda molekler genetik alan sadece genetikiler iin deil tplar bitkisel retimciler; hayvansal retimciler yatrmclar genel olarak kamu iin olduka nemli gelimelere maruz kalmtr.

Tplar bakmndan yeni hastalk tedavi stratejleri hizmete sunulmutur. Bitkisel retimciler iin verimi arttrlm bitkiler retilmitir. Hayvansal retimciler iin evcil hayvanlarda verim arttrlmas sz konusu olmutur. Genetikiler ve Molekler biyologlar gen faaliyetleri ve kontrol iin yeni grler oluturmulardr. DNA ile ilgili ilemler onun izolasyonu, oaltlmas dizili srasnn analizi belli yabanc DNA nn plazmid ya da faj gibi tayc (=vektr) aracl ile prokoryot ya da eukoryot konuku hcreye sokulmas ve faaliyetinin temini (yani transkripsiyon ve translasyon srecinden sonra proteine dnme eklinde gruplanabilir. Yaygn kullanlan konuku hcre E.colidir Yabanc DNA oaltlp saflatrlr ve DNA dizili sras belirlenir. Yabanc DNAnn gen rn byk llerde protein olarak retilmek suretiyle saladnda ilem tamamlanm olur. Bu yeni teknoloji Gen klonlama, Rekombinant DNA teknolojisi, Genetik Mhendislii gibi eitli adlarda ifade edilir. Bu bakmdan rekombnant DNA teknolojs dogal olarak br arada bulunmas mumkun olmayan DNA molekullernn yapay yolla br araya getrlmes(kombne edlmesdir).bu teknoloj 7 temel safay ierir

1. Doku yada hucrelerden DNA zole edlmes 2. Bu DNA molekullernn RE (Restriksyon Endonkleozlar) denlen ozel enzmlerle eklenp aktarlablecek ierikde kesilmesi 3. RE le ilem grm DNA molekullernn vektor ad verlen tayc molekuller yklenmesi 4. Vektor ve tasdg molekul(Bu brlktelk art rekombnant DNA molekuludur) un faalyet gostereceg konak hcreye nakl 5. Konak hucre ve kend genomu ogalrken bu arada aktarlan DNA da ogalacagndan DNA molekulunun klonlanmasnn saglans. 6. Klonlanms DNA nn konak hucreden zole edlp ncelenmes 7. Klonlanms DNA nn gen rnnn elde edilmesi yani klonlanm DNA transripsiyona ugrayabiilir mRNAs translasyona ynlendirilebilir gen rn izole edebilir ve aratrma, ticari maksat iin kullanlr. Bu basmaklarn her biri ayr balk altnda bundan sonraki ksmlar da sunulacaktr.

ekil 1. Rekombinant DNA tekniinin zeti. nce bir hibrit vektr oluturulur. Bu vektrierisindekalan yabanc DNAy da ierir. Vektr konuku organizmaya sokulur.Konukunun replikasyonu ile yabanc DNA da oalr. Eer gen faaliyeti salanrsa, bu genin rn ok miktarda elde edilmi olur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

REKOMBNANT DNA TEKNOLOJISININ ARALARI Restriksiyon Endonkleaz Enzimleri 1978de Fzyoloji Tp Nobel dl W.Arben ,H.Smth ,D.Nathannn Restiriksyon endonkleaz enzimleri hakkndaki almalarndan dolay verilmitir. Bu oluumlar bakterinin sahip olduu yabanc DNAlar yok eden enzimlerdir. Normaldeki ilevi bakteri hcresini igal eden igalci virslerin DNAsn nkleotd zincirini sadece belli baz zel yerlerden tanyarak kesmektedir. Bu zel tanma yerlerine Restriksiyon (snrlama=kesme)blgeleri ad verilir.Bu yerler DNA molekl zerinde

10

bulunan ve genellikle 4-8 baz ifti uzunlukta yerlerdir. Bu enzimlerin faaliyeti sonucu DNA bu yerlerden kopar. Balangta bu enzimlere Restriksiyon enzim ad verilmesinin ana sebebi udur. Fajlar baz bakterilerde yaayabilirlerken farkl restrksyon enzimlere sahip baka bakterilerde de yaayabilememektedir. Bu yzden bakteri soylar arasnda faj infeksiyonu bakmndan snrllk vardr. tip Restrksyon enzimi bilinmektedir. Bu gruplama enzimi (DNA) daki kestii blgenin yapsna ve enzim yapsna gredir. 1.ve 3.tip Restriksiyon enzimleri gen klonlamada kullanlmaz. nk bunlar DNAy tanma blgeleri dnda keser ve kesim yeri tesadf olup nceden tahmin edilmeyen bir yerde kesim yapar, oysa 2. Tip Restrksyon enzimi ise belli zel yerlerden keser.Ayrca kesim yerleri belli bir simetri gsterir. Mesela (Bam I )isimli ikinci tip enzim [5-GGA/TTC3] [3-CCT/AGG-5] blgesinde kesim yapar.Eer okuma dey yaplrsa merkezden alttaki zincirin AGGs ile (soldan saa okunur) ve stteki zincirin GGAs sadan sola okununca (AGG) ayndr. Byle bir tersinir elenik yapya POLINDROM ( polndrom yunanca polndrom =geriye kesmek demektir) denir. Her iki ynde okunuu ayn olan yaplar tanmlar.Mesala (1238321) her iki ynde de ayndr. Aadaki ekilde byle iki tip Restrksyon Enzimi (RE) verilmitir. Hemen hemen (100) u akn 2. Tip R.E.bilinir. Konuku hcreler kendi DNA larn bu enzim yerlerine sahip olmamalar yansra kend (DNA) sn bu blgelerde metilletirme nedeniyle korurlar.

ekil 2. Deiik Restriksiyon Endonkleaz ile yaplan dizili sralar. Pu Purinleri, Py purimidinleri gstersin. Oklarn yerleri Endonkleazlarn DNA kesim yerlerini gsterir. 1971 ylnda K.Danna ve D.Nathan Restriksiyon Endonkleazlarn DNAy hemen hemen ayn boyutlarda paralara bldkleri,Enzim aksiyonunun tekrarlanabilirlii ve kesinlii bunlar ilerde yaplacak aratrmalar iin faydal klacag gorusu ifade edilmitir..Aslnda Btn resriksiyon endonkleazlar 3 ve 5 ular retmez, bazlar kr ular retir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

11

ekil 3. Sitozine Metilaz enzimi yardm ile Metil grubu katlmas sonucunda 5-Metilsitozine dnr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

ekil 4. Konuku DNA (Hpa II ) Restriksiyon yerinde metilleme ile kendi DNA sn R.E. den korur . Yldzlar sitozindeki Metil grubunu gsterirler. (DNA) Replikasyonundan sonra DNA yarm metillenir. Yeni kol metile sahip deildir. Yarm metillenmi DNA, daha sonra hcre enzimlerle metillenir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

12

Endonkleazlarn hcumuna maruz kalan ayn dizili sras metillemi durumda ise metillenmemie nazaran korunmu haldedir. Yani enzim etki yapamaz. Konuku (DNA) oalmasndan sonra yeni ift sarmal hemimetil (yarm metilli) konumdadr. Yani eski kol metilli yeni kol metilsizdir. Byle bir durumda yeni kol kolayca metillenebilir. Hangi kolda olursa olsun metil iermeyen yabanc DNA lar .RE lerce parcalanablr, Restriksiyon enzimleri izole edildii canlya gre isimlendirilir. Mesela Bam HI isimli enzim Bacillius amlio Liqufeciens (H) soyundan elde edilmitir. Eco R1 ise E.col (RY-13) soyundan elde edilmitir. Hind II ise Haemophylus influence (Rd) soyundan Bgl 1 ise bacillus grobigiden elde edilir. Bunlarn genel adlar Restrksyon enzimleridir. (R.E)ler DNAy iki biimde keser.Mesela Hnd II ve tanma blgeleri iki zincirde ayn hizada olup kesimden sonra (DNA)nn iki kt u oluur. Bu durum ekildede gsterilmitir. Ayn ekilde mesela Bam HIn kesikleri yapkan u olarak adlandrlr(5u asl durur.)Bu durumda kendiliinden komplementer bazlarla hidrojen balar ile yeniden eklenebilir. Byle yapkan ularn byle yeniden eklenme (Reanneaal) yetenei S.Cohen,L.. Boyer ve ark.ca 1971de ortaya konmutur. VEKTRLER KLONLANACAK DNA PARALARI Tama Srecinde Kullanlan Tayclardr Vektr molekllerin kunukudan kolay izole edilebilen kendi ve tad DNA molekln bamsz replike edebilen, sadece bir (RE) ile krlma (kesilme) blgesi oluturabilen bu surette tanacak (DNA) parasnda ayn enzimle kesilerek ekleme salanabilecek nitelikte olmaldr. Vektr moleklleri zerinde antibiyotik diren gen gibi bir iaretleyici tamaldr. Bu surette vektr tayan ve tamayan hcrelerin ayrm mmkn olur. Mevcut teknolojilerde in vitro olarak eitli kaynaklardan gelen DNAlarn birbirine eklenmesi mmkndr. ekilde bu durum gsterilmitir. Halka DNA molekl zel(R.E.)lerle kesilir. Bylece yeniden halkalar balanr. Eer farkl molekller ayn serbest ulara sahipse bunlar kaynaarak hibrit molekl oluur.Burada DNA ligaz enzimi molekllerin eklenmesinde kullanlr.Oneml br prokaryotk vektor plazmddr.Bir konak hucreye br plazmd grmesne karsn kendn br hucrede bnlerce kez bulunacak seklde ogaltr PROKARYOTK VEKTRLER Prokaryotlarda Plazmid vektor yansra LAMBDA ve M 13 BAKTERYOFAJ VEKTORLER, COZMIT ve MEKIK vektorler. Bakter yapay kromozomlar, bulunur . EUKARYOTLARDA se MAYA PLAZMITLERI ILE olusturulan vektorler, MAYA YAPAY KROMOZOMLARI kullanlablr. Prokaryotlarda konukcu hucre olarak E.Col hucreler Eukaryotlarda se bitkiler iin A.Tumofacens le nfekte olmus btk hucreler, hayvanlar cn se Esey yada yumurta hucreler kullanlr. Sz edilen vektrler aktarlacak materyalin byklne gre seilir.

13

ekil 5. Halka plazmid DNAs EcoRI aracl ile tannr. DNA endonkleaz ile kesildikten sonra ayni ileme maruz kalm olan ve halkalanarak yada ayn restriksiyon enzimleri ile kesilen iki yada daha fazla,daha dorusal moleklleri birletirir. Bunun sonucunda elde edilen aklklar DNA ligaz ile kapatlr.S.Cohen, H.Boyer ve arkadalar bu teknik ile 1971de ilk kez plazmidleri eklemilerdir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

ekil 5.a. Rekombinant DNA almalarnn ilem basamaklar(Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) 14

ekil 6. Rekombinant plazmidin ekillenmesi. Ayn restriksiyon enzimleri kullanlarak bu rnek de olduu gibi EcoRI kullanlarak hem konuku hemde yerleik DNA keslr. Ayn anda kesilen uclar biraraya getirilerek yabanc DNA araya sokulmu plazmid oluturulur. Ligaz DNAy klonlayan ilk bilim adamdr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

15

Ekleme ileminde yer alan bir DNA paras plazmid olabilir. Plazmidler bakteri hcresinde yer alan bamsz oalabilen DNA parasdr. Rekombinant plazmid molekl oluturulup hcreye eklenebilir. Rekombinant plazmid de Hibrit plazmid,hibrit tayc (vektr) yada Kimerik plazmid adda verilebilir Rekombinant plazmidin konukuya konulmas iin eitli metodlar vardr. Mesela bakteri hcresi bu yap iin geirgen (permeable) klnr. Bu ilem Kalsiyum kloritin seyreltilmi solsyonu katlarak salanr. Bu ilem salandnda hcre ii plazmid DNA oalrken aktarlan DNAdada oalma gerekleir. Konuku hcre iine yabanc DNA katlma ileminde,kesme(ekleme) yerlerinde kovalent baglar olumadndan bu ilem Ligaz enzm le saglanr.Ayrca plazmdn aktarldg hucredek varlgnn saptanablmes cn antbyotk drenc genler gb ozel tanma unsurlarda plazmde eklenr. M 13 faj lar da tek kollu DNA ieren faj lar olup vektor slevi grebilirler RESTRKSYON ENZMLER LE KLONLAMA Prokaryotlarda vektor olarak aktarlacak molekulun buyuklugune gore plazmd ,cozmt,faj.bakter yapay kromozomu mekk vektor gb tasiyici unsurlar kullanlablr. Farkl kaynaklardan gelen DNAlarn klonlanmasnda eitli koullar vardr.nce plazmid aygt (R.E)lerle bir noktadan kesilir. Eer birden fazla yerde kesim olursa deneme srasnda molekl paralanr. Lamda fajlarndan treyen Charon fajlarnda genomlarnn orta de birlik ksm faj iin cok gerekl bolge degldr Eco R I yardm le aktarlacak yabanc DNA bu de birlik ksma konulablr. Bu yzden Lamda nemli bir tayc aygttr.15000 baz ifti (15 kilo baz 15kb) byklnde faj grevleri iin hayati olmayan ksmn yabanc DNA ile deitirilmi olan lamda faj iyi bir hibrit tayc aygt olarak ilev grebilir. nk fajn bu ksm E.Coli kromozomuna eklenmek iin gereklidir. Bu ksm faj bakteriyi enfekte ettiinde bakteri iinde oalr ve sonuta ekleme blgesi olmakszn hcre lisise olur (patlar). Genetik mhendisleri Lamda zorunlu olmayan blgesi eksik ve Eco R1 kesme blgesi ieren DNA molekl oluturmulardr. Olusturulan recombnant molekuller ya yuksek verml transfecton meteodu ile konak bakteriye transfer edilir yada nfektif faj bcmnde infeksiyon ile aktarm saglanr. Normal E.Coli plazmiti ile klonlamada yabanc DNA (15kb) dan daha byk bir ekilde ok byk olduunda duraan yap kaybolmaktadr. Bu dezavantaj yan buyuk molekullerle alsma gerektgnde olusan zorluk lamda fajlar ile gderelr Yani byk kromozomal segmentler klonlandnda plazmid oaldka plazmid klonu baz ksmlarn kaybetme eilimde olmaktadr. Balca bu nedenle genetikiler Lamda fajn tayc olarak kullanmlardr. Bu fajlar (24 kb)lk byklkleride baaryla tarlar.Faj kromozomlar yaklak (50kb) DNA ierir. Faj ba ksm iinde Lineer biimde hcre iinde halka formundadr. Faj ban dolduran DNA infeksiyon esnasnda tannr.

16

nk her iki ucunda bir kollu kk bir segment vardr. Bu ular Cos yeri olarak anlr. Cos terimi cohesive u (Co hesive Ends) kavramn ierir. Cos yeri (12) bazlk uzunluktadr. Cos yerinin yeniden eklenmesi Lamda kromozomlarnn konukuya girdiinde halka yap almasna neden olur. DNAy (Cos) yerinden kesince halka alr,Lineer molekl oluur.Genetikiler (Cos) yerinin bu avantajn kullanarak (24 kb) dan daha uzun segmentleri bile klonlayabilir. Birok Eukaryotik genler intronlar ve transkripsiyon kontrol segmentleri nedeniyle daha uzundur. Eer (CoS) segmentleri her iki ucu plazmid orijinli (DNA)ya eklenmi ise oalma ilemi seii antibiyotik genlerle salanarak (50 kb) kadar DNAyla klonlaabilir. Bu cos yeri ieren plazmidlere cosmid ad verilir. Bu nedenle bu molekller lambda kromozomunun cos ksm le bakteryel plazmdn melez hbrt molekullerdr. Bu cosmidler byk DNAlar klonlamak yansra DNAs byk segmentlerin seiminde kullanlr. Kosmidler lambda fajnn faj protein klfna paketlenmesi iin gerekli (cos) yeri ile plazmid replikasyonu iin gerekli dizileri ve antibiyotik diren genleri ierir. nk kk cosmidler faj bana birleemez. Bylece 2.5-50 kb uzunlua kadar yabanc (DNA)lar plazmidleri choron fajlar yada cosmidler kullanarak klonlanr. Bira mayasnda milyon baz uzunlua kadar yabanc DNAy klonlamakta mmkn olmutur.

ekil 7. Bir kozmidin grn :Kosmdler (cos) ad verilen blgeler ieren plazmid olup lambda faj balarnda bakteriye aktarlr.nfeksiyon srecinde etkili bir metoddur. (cos) yerleri tek kollu olup konuku iinde kaynaarak halka formuna evrilir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

17

HBRT VEKTRLER N SEM Yukardaki aklamalarda aklanan metotda (R.E)lerin ayr ayr hem vektr hem yabanc (DNA)y kesmesi sz konusudur. Daha sonra bu iki unsur ligazn mevcut olduu ortamda kartrlr. Neticede birok rn meydana gelir. Bu rnler guruba ayrlr. Yabanc DNAl vektrler, yabanc DNAsz vektrler ve paracklar. Daha sonraki blmlerde vektrdeki zel yabanc (DNA) paralarnn bulunmas incelenecektir. Burada herhangi bir (DNA) paras ieren vektrlerin seilmesi aklanacaktr. Choron fajlar basit olarak E.coli hcrelerini infekte etme kabiliyetlerine gre seilir. Bilindii gibi Lamda virs ba ksmnda paketlenme iin gerekli byklk ihtiyac yznden sadece Lamda faj DNAs ve yabanc DNA birlikte paketlenebilir. Bu yzden yabanc DNA ieren plasmid antibiyotik dayankllk zelliinin incelenmesi ile ayrt edilebilir. Mesela yaygn olarak kullanlan PBR 322 plasmid bu maksatla kullanlabilir. Plasmitler ilk inceleyenlerin isimlerini ba harfleri ile incelenir. Buna gre bu plasmid (P) F.Bolivar (B) ve R.Rodriges (R ) tarafndan incelenmi ve (1977)de bu konu ile ilgili yayn yaplmtr.Bu plasmidin Tetrasikline ve Ampisiline dayankllk genleri bulunur. Ayrca bu plasmid de eitli enzim kesme yerleri bulunur. Mesela Tetrasiklin dayankllk geni iinde (Bam H) enzimi kesim yeride bulunur. Ligasyon ilemi sonucunda yabanc (DNA) bulunduran ve bulundurmayan plasmidler oluacaktr. E.Coli hcrelerinin kalsiyum kloritli ortamda bu (DNA) karm ile birliktelii salandnda antibiyotik iermeyen ortamda DNA y iine alm E.Coli hcreleri elde edilmi olacaktr. Daha sonra bu ortama ilikin plakalardan Replika yntemi ile bir veya iki antibiyotiin ikisini yada birini ieren ortamlara nakil kopya alnr. Her iki antibiyotie dayankl kolonilerdeki hcreler yabanc DNA iermeyen plazmidli hcrelerden olumu olmaldr. Sadece Ampiciline dayankl koloniler ise yabanc DNA ieren plazmidli hcrelere ait olacaktr. Her bir antibiyotie dayankl olmayanlar ise plazmid iermeyen hcreleri temsil eder.

18

ekil 8. E.coli PBR 322 plazmidleri. Bu plazmidi (amp ) ve (tet ) sembolleri ile belrlenen amplisilin ve tetrasiline dayankllk, danda sorumlu iki gen yeri tar. (tet ) geni iinde (BamHI) kesici enzim yeri vardr.(tet ) geni iinde clonlanm paralar tetrasiline dayankll ortadan kaldrr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) KR ULU EKLENME Kr ya da kt ulu ekleme (Blunt end ligasyon) ad verilen yntem (R:E) ile muamelenin klonlamada uygun olmad hallerde kullanlr.(R:E) ile kesme ilemi le klonlamann mumkun olamadg mesela kesim yerlernn istenen genin ortasnda oldugu durumlarda gerek duyulan yontem se Kor uclu ekleme(blunt end lgaton) yontemdr. Yabanc DNA nn fiziksel krlma gibi metotlarda elde edildii durumlarda da eitli clonlama metotlar bulunur. Bu metotlardan en populer olan kr uclu ekleme (blunt-end-ligasyon) denir. Bu metotta da yabanc DNA nn tayc aygtla eklenmesinin salanmas sz konusudur. Ancak birbirine bal olmak dolaysyla gerek ular (sticky ends) yada yapkan ular bulunmayan molekllerin birbirine eklenmesi sz konusudur.Mesela faj enzimi olan T4 DNA ligaz isimli enzim kr ulu DNA lar ekler. Kr ular DNA segmentleri klonlanaca zaman fiziksel olarak DNA larn krlmas ile Hnd III gibi kr u oluturan (R.E) ler ile salana bilir. Ligaz hangi kr ucun ekleneceine gre zel olmadndan bunun ilemi sonucunda birok istenmeyen rn neticeleri oluabilir. 19

(R.E) leri kullanarak klonlama yapmada yapkan ular metodu tercih edilir. Kr ulu ligasyonun deiik halinde balayclar, eklemler (linker) kullanlmaktadr.Bunlar ksa yapay sentezlenmi DNA paralar olup (R:E) tanma yerleri ierirler. Bu balayclar DNA kr ularna eklenir uygun (RE) lerle muamele edilirse yapkan ular oluur. Bu durum ekil (9) da gsterilmitir. ekildeki balayclar ortasnda Eco R1 yeri olan 12 Baz ifti (Base pair=bp) uzunluktadr.Bunlar klonlanacak DNA ya (T4 DNA) ligazla beraber eklenir.Daha sonraki (EcoR 1) ile muamele (Eco 1) yapkan ular oluumuna yol aar.

ekil 9. Balayclar. Kk i Restriksiyon kesim yerlerine sahip ksa DNA segmentleridir. Bunlar T4 DNA Ligaz enzimi aracl ile kr ulu DNAlara katlabilir. Restriksiyon enzimleri ile muamele sonucu, ayn restriksiyon enzimi ile kesilmi her hangi bir (DNA) ile rekabet edebilen (DNA) larn olumasna yol aar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) KLONLANACAK (DNA) LAR K EKLDE ELDE EDLR. 1. Arzu edilen gen ya da (DNA) sentezlenir veya direk yada (mRNA) dan tersinir kopyalama ile izole edilir. 2. Organizmann genomu ansa bal kk paralara blnr Bu ikinci usule tfek samas benzeri anlamna (shot gun) rastgele at klonlama denir. Sonra istenen (DNA) segmenti oluturulan eitli klonlar arasndan yakalanr(seilir). imdi klonlamadan nce istenen genin izole edilmesi ya da sentezlenmesi sonrada klonlamadan sonra istenen genin yerletirilmesini inceleyelim 20

1. BELRL BR GENN KLONLANMASI 1.1.Klonlanacak DNA nn oluturulmas. Belli bir geni ya da DNA parasnn klonlanmasndan nce ilgili geni ieren ift kollu (DNA) parasnn saflam halde mevcut olmas gerekir.(DNA) elde etmek iin eitli yollar vardr. eitli glk iermeyen oluumlar bir kollu (m RNA) elde edip onu ift kollu DNA ya evirmek byle bir usuldr. Bu durumda sorun istenen m RNA y elde etmektir. Belli bir zel gen iin m RNA zel genin niteliine gre elde edilebilir. Eer belli bir zel hcrede ok miktarda RNA mevcut ise direk olarak izole edilir.

bolca bulunur. Ayrca Ribozomal RNA ve birok t RNA y uygun bir klonlama iin bolca ve kolayca elde etmek mmkndr. RNA tmr viruslarndan elde edilen tersinir kopyalanma (Reverse transcription) yardm ile saflam (RNA) dan klonlanacak ift kollu (DNA) elde edilebilir. Burada (3 poly-A) kuyruuna sahip Eukaryotlardan elde edilen m-RNA kullanlarak (RNA) nn (DNA) ya dnm aklanacaktr.

ekil 10. (a) mRNA enzimi iki kollu DNAya evrilerek revers transkriptisekullanlarak klonlamayaplr. (b)Eukaryotik RNAnn Poly-A ucuna komplementer (PolyT)segmenti katlr. (c)RNA ablonundan bir primerin dizili sras kullanlarak DNA sentezlenmesi iin Revers Transkriptize kullanlr. NaOH kullanlarak RNA uzaklatrlr. polimeraz 1 iin primer yeri de denir. Bundan ift kollu DNA oluur. (d-e) S1 Nkleaz enzimi sa tokasn uzaklatrr. (f) Sonuta komplementer DNA (cDNA) oluur. (Robert H. TamarininPrinciplesof Genetics(Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndanmodifiye edilerek alnmtr.) 21

ekil (10)da grld gibi nce Poly-T, ad verilen primer kendine uygun Poly-Al kuyrua sahip m-RNA ya katlr. Bu eit ift kollu blgeler serbest [3-OH] ierdiinden polimeraz aktivitesi iin primer olarak balama unsuru olarak ilem grr. Bilindii gibi primer terimi (DNA) replikasyonunda (3-5)ci istikamete tek kollu olarak devam eden ift kollu ksa (DNA) parasn tanmlar. Daha sonra primer (RNA) tersinir kopyalama muamele edildii zaman ,(RNA)y kalp olarak kullanarak (DNA) nkleotidleri polimerize eder(Bir araya getirir yani zincir haline getirir).Sonuta (DNA-RNA) hibrid moleklleri oluur. Daha sonra m-RNAnn uzaklatrlmas iin (NAOH) ile muamele salanr. Bu unsur DNAy etkilemez. RNA uzaklatrldktan sonra DNAnn (3)ucu genellikle dier uca katlanr ve sa tokas biiminde lop oluturur. Meydana gelen ift kollu DNAya komplementer DNA (c DNA)ad verilir. Burada tek kollu m-RNAdan balanarak ift kollu DNA retilmitir. Bu (DNA) kr ulu ekleme metodu ile klonlanabilir. Eer (RNA) ok miktarda ortamda mevcut deilse eer belli bir gene ilikin proteinin aminoasit dizili sras biliniyorsa invitro olarak (DNA) sentezlenebilir. Bir genin protein unsuru yardmyla aminoasit dizili sras buna ilikin muhtemel nkleotid dizili sras ise kod szlnden elde edilir. Bu metod genetik kodda okluk (ayn aminoasidin birden ok kodla belirlenmesi) olduundan orjinal DNA tam yeniden oluumu salanmayabilir. Dier bir deile bir proteinde yer alan Leucinne ilikin (6) farkl kodon vardr. Btn bunlara ramen yeni tahmin her zaman gereklememekle birlikte belli bir protein kodlayan (DNA) sentezlenebilir. Gnmzde ekil (11)deki gibi her zaman birimde bir (baz) (100) baz uzunlukta DNA sentezleyicisi makineler gelitirilmitir. Aklanan bu metod ile genetik kod szln kullanarak komplementer, btnler (cDNA) yada sentetik DNA yapm da genin promotor blgesi ve (DNA) Protein evrimine urayan ksm (intron) Transkripsiyon Kontrol sralar gibi ksmlar eksik kalaca hususu aklda tutulmaldr. Eer bir geni promotor ve intronlar ile birlikte klonlamak istiyorsak klonlanan genomun tesadfi seilmi paralarn oluturduktan sonra yaplmas gerekir. lgi duyulan gen klonlamadan nce yada sonra bulunabilir. mRNA araclg le elde edlen cDNA eitli ekillerde kullanlablr.Soz gelimi uclarna ift zncrl ksa RE tanma yerler ceren DNAlar taklarak ardndan RE le kesp yapskan uclar olusturarak bell baz teknklerle faj yada plazmide aktarlarak klonlanr.Sadece bell br hucre tpnde(embroda.yada dokuda) aktf olan aktf olan dzler(mRNA) iceren kolleksyona cDNA kutuphanes denr. Bu term GENOMIK KUTUPHANEDEN farkldr. unku cDNA sadece o safada o hucrede mevcut mRNA larn karslg olan DNAlar ierir. Dger br deysle cDNA genomda yeralan DNA nn dzeneleyici bolgelerni Transkrpsyona ugramayan bolgeler ni iermez. Genomk DNA genomdak tum dzlerden enaz br kopya ieren klonlanm DNA kolleksyonudur.

22

nsan genomunu klonlamak cn faj vektoru kullanlrsa 4-5 milyon faj vektoru gerekr. Genomun br parcasndan ornegn tek kromozomdan olusan kutuphaneler kromozom-ozgul kutuphane dye adlandrlr. Br genomk kutuphane yuzbnler varan klon iereblir.

ekil 11. lk otomatize edilmi dng ile solid fazdaki DNA sentezi.Birinci nkleotid silica n maddesine (substrata)balanr.kinci nkleotid (aDMT=Dimetoksitrily) trevi ilk nkleotidle fosfodiester ba oluturur.DMT ikinci nkleotidin (5) ucunu korur.DMT uzaklatrlmadndan nkleotid katlamaz.DMT uzaklatrldktan sonra dinkleotid yeni dngye hazr hale gelir.(R1) ve (R2) koruyucu gruplar sre tamamlandnda uzaklatrlr.Ve oligonkleotidler silica n maddesinden ayrlr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Promotor terimi (RNA) polimerazn transkripsiyon balatmak zere (DNA)da baland yeri tanmlar. ntron terimi ise (DNA) iinde transcribe olan fakat translasyondan nce uzaklatrlan ksmlar tanmlar.

23

GENOM KTPHANES OLUTURMA C-DNA veya sentetik DNA ile ilgili klonlama alsmalarnda genomun tumu buyukluk nedenyle kullanlmas mmkn olmadnda, organizmann toplam DNAs daha kk paralara blnr. Bu kk paralardan da arzu edilen gen yada DNA paralar izole edilir. Bir genomik kutuplarda genomdaki tm dizilerden en az bir kopya iereek ekilde hcrelerden DNA drstirileri (Rejler ile kesilir para vektrlere taklr. Her vektr sadece birka bin baz DNA iierir. Arzu edilen gen klonlamadan nce yada sonra elde edilebilir.Byle (DNA) genomik DNA olarak adlandrlr ve c(DNA)dan farkldr. Eer (DNA) klonlamadan nce elde edilmi ise o zaman sadece ihtiya duyulan DNA klonlanr. Dier bir yolda tfek samas benzeri (shotgun) ad verilen yaklam kullanmaktadr. Bu usulde genomunun bir rnei (kk para) kullanlarak klonlama yaplr.Bylece bir trn orjinal genomunun klonlanm paralarnn seti elde edilmi olur. Bu sete genom ktphanesi denir(ekil.12). cDNA kutuphanes tum gernomu degl sadece mRNA lar karslg olan DNA larn kutuphanesidir. O yzden (cDNA) ktphaneside denir.

ekil 12. Rastgele at(Tfek samas ats) yaklamn kullanarak oluturulmu,araya sokulmu unsurlar kullanarak Genomik ktphane oluturulur.Genom ksmlarna paralanr.Paracklar daha sonra vektrlerde ansa bal biimde klonlanr.Bu vektrlerin toplam genomik ktphanesi adyla bilinir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

24

Genom ktphanesi olgusunda arzu edilen gen klonlandktan sonra kutuphaneye yerletirilmi olur. SOUTHERN BLOTTING Genellikle Endonkleaz enzm le Sindirim aracl ile tesadf olarak retilen DNA segmentleri sz konusu ise bunlarn cnden arzu edilen genin yerini belirlemeye gerek vardr. Daha nce belirtildii gibi klonlamadan nce yada sonra gen aranabilir. nce (DNA)daki zel bir genin yerini (DNA) klonlamadan nce nasl olduunu inceleyelim DNA paralarnn ortasndaki zel bir genin yerini anlamak iin nce zel sonda (probe) ihtiya duyulur.Klonlanan genn karakterzasyonu,pekok DNA parcalar cnde stenlen parcanon varlgn gosterme,ilgili genn farkl turlerde karslgn bulma, gb slemler cn SOUTHERN BLOTLAMA yaplr Sondalar genellikle nkleik asid yapsnda olup dizili sras hibridizasyon sonucu ile varlg arastrlan hedef molekule(c-DNA)ya butunler olan ona uyan dizili srasn tanmlar. Sondalar daha sonra otoradyografi ile yada cemilmunuskent teknikler ile (ultraviyole yada laser nlar altnda varlklarn ortaya koyan iaretlerdir)iaretlerinden dolay belrlenebilmektedir. radyoaktif olarak -DNA yada DNA-DNA hibritleri zel gen ile radyoaktif sonda arasnda oluacaktr. Otoradyografi yada cemilmunuskent teknii radyoaktif sondann yerini gsterir. -globin geninin klonlamak istediimizi varsayalm. nce tavan (DNA)snda Restriksiyon enzimleri ile kesintiler oluturmak gerekir. Daha sonra bu kesintiler agaroz jelde elekeroforeze tabi tutulur. Ve bylece byklklerine gre eitli ebatlarda paracklara ayrlr. Agoroz ok eitli byklkte (DNA) paracklarn ayrmak iin iyi bir ortamdr.Bu eit bir kesme ileminde ok sayda fragment sz konusu olup sonuta ok kkden ok bye olmak zere oligonkleotid lekeleri (band yaplar)oluur. Daha ileri ilem iin elekroforez fragmentleri dier ortama transfer edilerek sonda ilemi yrtlr.Bunun icin dogru DNA paralarnn agoroz jelden da dogru ntro seluloz fltreye dfze olmas salanr. Nitroselloz filtre yada naylon membranlar hibridizasyonda en iyi neticeyi verir.

25

ekil 13. Southern blotting tekniini kullanarak bir (DNA) Kitlesi iinde tavan -globin geninin varlg belirlemitir. Tava DNAs restriksiyon enzimler ile ksmlara ayrlr Agaroz jel ortamnda elektroforez yaplr Southern Blotting yaplr (Bantlar gorulur klmak cn -globin haberci RNA eklindeki -globin geni ieren DNA fregmentinin yerini saptar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

26

Bu teknikte Agoraz jeldeki ift kollu DNA nce genellikle (NaOH) ile tek kollu (DNA)ya denatre edilir. Daha sonra Agoraz jeli filtre paras dikkatlice Nitroselloz filtre altna gelecek ekilde yerletirilir. Neticede Sandvi gibi Agoroz taraf aada slak snger stne gelecek ekilde yerletirilir. Sonra nitroselloz filtre tarafna kuru filtre kd konur. Bylece tpk fitil gibi agorozlardaki (DNA) segmentini tayan ksm Nitroselloz filtreye geirilir.

ekil 14. Southern blotting tekniinde jel ve filtrelerin dzenlenmesi (NaOH) Buffer solsyonu kuru filtre aracl ile yukar ekilir ve DNAy agarose jelden nitro seluloz filtreye transfer eder. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Burada (NaOH) tepside yer alarak nakledici solsyon olarak ilem grr.(DNA) kesintili paralar ise stma ilemi ile Nitroselloz filtreye kalc olarak balanr. Filtre zerinde DNA-DNA) hibridizasyonu gereklemi olur.

Eer ayn teknik RNA zerinde salanrsa Northern blotting olarak adlandrlr.Northern blotlama belrl br genn farkl hucrelerde,dokuda organzmada transkrpsyon aktvtesn(mRNAlar araclg le) kullanlr . Nkleotid komplementaritesini olgusu iermeyen immunolojik tekniklerde ise proteinler iin sonda kullanlabilir. Bu teknie Western blotting denir. Yani antibodylerin sonda gibi kullanlarak belli bir proteinin aranmas ilemine Western blotting denir. aretlenmi sondalarda eitli ekillerde elde edilebilir. Bu rnekte radyoaktif sonda tersinir kopyalama kullanarak (cDNA) oluturmaktr.

27

Tersinir kopyalamadade kullanlan Dideoksinkleotidler sentezlenirken Radyoaktif Fosfor [32P] ierirler. Bu durum ekil (13)de gsterilmitir. ieren DNA segmentinin yerini gsterir.Doal olarak (mRNA)dan treyen cDNA gende mevcut intronu iermeyecektir. Ancak nkleotid kolunda komplementer kollar olduu srece sondalama baarl olacaktr. kesintisi rneini kullanarak ikinci bir Agoroz jel uygulanr. (DNA-DNA) hibridasyonuna maruz braklmayan jel ayn yerde B globin segmentini ierir. Autoradyografi ile yeri bilinen bant agoroz jelden kesilip karlarak (DNA) izole edilir. Bylece bu DNA klonlama teknii ile klonlanr. DNA Sondalar Bir Klon ktphanesinden zgl klonlarn seciminde kullanlan mototlar DNA prok kullanm ierir. Bir genomik ktphanede yz binlerce klon vardr. Bir ktphaneden alacak geni elde etmek iin yalnzca ilili geni ierir. Klona yada klonlarn belirlenmesi gelitirilmesi gerekir. Ayrca klonlar genini tutumunun btnn belirledii tesbiti gerekir. DNA gruplar tek zincirli yada cift zincirli molekller olarak hazrlanabilir. Sondaki genellikle radyoaktif polinoleotidlerdir. zgl polipeptidler belirlere de renk, kimyasal reaksiyonlar ieren sondalarda kullanlr. Bu maksatla palazmit ktphanesi taramas sa sz konusu olabilir. Bu ilem iin klonlar tayan bakteriler besleyici plaklarda retilip binlerce koloni oluturular. Koloni bakterileri plakdan nitroseller yapda kagt filitreye mhr replika yntemi ile hafifce bastrlarak filtre zerine aktarlr. Filtredeki kullanlan tek zincirli sonda ile muamele edilerek (DNA-DNA) hibritleri oluturulams salanr. Sonra filitre ykanr balanmam (hibrit oluumu) molekl hibridasyonu olup olmad anlanabilir. Fotorgraf filmi zerine konup sonra sondann radyoaktif olmas yada olmamasna gre film zerinde koyu lekeler yada kimyasal snma le ayr edilir. Bu maksatla Plaka hibridasyonu gibi baka yntemler de kullanlabilir. KLONLANMI GEN N SONDA DOT BLOTTING: Daha nce aklanan metodlar mesela Genom ktphanesi oluturulduktan sonra zaten plasmid iinde klonlanan genlerin yerini belirlemek iinde kullanlabilir. Bu durumda elektroforez ve Southern blotting gerekmeyecektir. nk belli bir kesinti iindeki DNA segmentinin yerinden ziyade zaten klonlanm DNAnn belli zel dizili sras klonlanacaktr. Dot blotting elektroforetik ayrm safhasn gerektirmeyen zaten klonlanm DNAnn Blotting (lekeler) ile ekillenen bantlar biiminde grlrlgn saglama tekniidir. Mesela insan-fare hibrit hcre hatt DNAs insan DNAsnn yerini belirlemek iin klonlanabilir.

28

Bu durumda hibrit hcre hatl sadece 20 nolu kromozomu olan bir tane insan kromozomu ierir. Bu kromozomdan gelen DNAnn yerini belirlemek iin insan kromozomundan izole edilmi sonda (prob) kullanlr. Sondalar radyoaktif olarak iaretlenir. Ayn anda her biri hibrit plasmid ieren (288) E. coli kolonisi yerletirilir ve direkt nitroselloz filtreye dhil edilir. Prob (sonda) ilemine hazrlk iin hcreler lisise edilir ve DNAlarn denatre olmalar salanr. Her klonun hcreleri iindeki plasmid DNAs radyo aktif bir sonda ile hibridize edilir. Yani insana zel dizili sras ieren prob(sonda)un radyoaktivtes kullanlr. Ayn anda ayr bir ilem olarakta (288) adet insan-fare hibrit hcre hatt DNA klonlar ile nitroselloz filtre zerinde (288) ayr yerde lisise edilir. Sonra prob (sonda) lisise edilen rneklere tadbik edilir. te bu (288) klon rneklerinden insan 20 nolu kromozom DNAs tayanlar koyu renk alr. Bu ekilde elektroforez ayrmn gerektirmeyen klonlarn (DNA) hibritlenmesi tekniine Dot Blotting denir.

ekil 15. Fare-insan hibrit hcre hatt ieren (DNA)ya ilikin (288) clonun Dot Blot otoradyagrafisi. Clonlar insana zg dizili sras iin sondalarla hibridize edilmitir. Sonda ilemi her clonun nitro seluloz filtre dolu rneklerinin Lisizi ile yaplmtr.ki koyu karanlk nokta,insan (DNA)s tayan clonlarn yerini gsterir.Bir ok dier noktalardaki silik radyasyon aratrcnn yerleimin biimini anlamasna yardmc olmak iin oluturulmutur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) WESTERN BLOTTING Bu teknik belli bir klonlanm zel genin yerini belirlemek iin farkl bir metod olarak bilinir. Plasmid ieren hcrelerdeki klonlanm genlerin gerek aklamasnn yaplmasndan yararlanlr. Eer eukaryotik genler E. coli plasmidlerinde klonlan-dnda aktif bir promotor uygun akm ynnde yer alm ise bu durumda gen faaliyeti (Transcripsiyon>Translasyon>Protein) elde edilmi olabilir.

29

Bilindii gibi Aag yn(Down stream) (akm yn) terimi (RNA) polimeraz enzimi ile lgl olagan,yonu tanmlar. DNA transcipsiyonun yn ve pozisyonuna dair olaan durum (5) ucundan (3) uc ynne dorudur. Bu durumda ters akm yn (up stream) (5) uca doru normal akm ynnu (Down stream) ise(3) uca doru polimerazn geliimini tanmlar. Promotor ise (RNA) polimeraz balanma yerini tanmlar. te yabanc DNAnn aklanmasna olanak veren plasmide expresion vektr ad verilir. Normal olarak bakteriler eukaryotik genleri aklamayacandan bu teknikte birok zorluk olduu hatrlanmaldr. Ancak genede klonlama yeri promotorun akm ynnde olan eitli zel plasmidler gelitirilmitir. Bu durumda eukaryotik gen prokaryotik genin bir ksm haline gelir ve bu ekilde genellikle prokaryotlar bir ka aminoasit ieren fusyon protein oluturur. phesiz eukaryotik genin uygun yerleimde yer almas ve uygun translasyon iin tam doru kodon ereve okunmasna maruz kalmas gerekir. Doal olarak byle bir olaslk dktr.Belli bir protein rnnn yeri Southern blottng yada Dot Blottnge benzer ekilde belirlenebilir. Bu teknie Western Blotting ad verilir. Yani burada antibiyotik kullanarak belli zel proteinin sonda teknii ile anlalmas amalanr.

ekil 16. Western Blot tekniiyle birok Klon arasndan belli bir proteini aklayan klonun yeri belirlenir. Aklanan proteini tayan Klonlar lisize adilir. Antibodi uygulanarak protein yeri saptanr.kinci bir antibadi,birinci antibadinin yerini saptar.Bu ilem florosent renklendirici ile yada otoradyografi ile yaplr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) 30

Bu teknikte sondalama radyoaktif oligonkleotid sondadan ziyade belli zel proteine zg antibodi ile yaplr. Birinci antibodiye zg ikinci bir antibodide iaretleyici olarak genellikle floresans nitelikli olur ve birincinin yerini belirler. Mesela ekil (15)deki clonda yer alan belli zel proteinin aklanmasn aryor olalm. Clonlar nitroselloz membrana aktarlr ve orada genellikle kloroform buhar ile lisize edilir. Sonra belli zel proteine zg antibody tatbik edilir. Ayn ekilde birinciye zel ikinci antibodi florescens iaretleyici ile iaretlenir ve filtreye uygulanr. kinci antibodinin florescens mas birinci antibodinin yerini gsterir. Bu da hangi klonun belli bir zel geni akladn gsterir. ekil 16da bu durum gsterilmitir. KROMOZOM YRY, KOMUU GENLERN TANIMLANMASI Bu terim bireysel olarak klonlanabilecekten daha uzun (DNA) segmentlerinin st ste akan sondalar kullanlarak incelenmesini aklar. Br genn yer yaklask blnyorsa once komsu dzler klonlayarak suret le o gende klonlamak mumkundur. Aktarlan yabanc (DNA) boyu snrl olmasna karn bazen daha uzun (DNA) segmentlerini st ste akan clonlar incelemek suretiyle kromozom yry adl teknikle inceleyebiliriz. Kromozom yry metodunda klonlarn ve DNAnn u ksm tekrar klonlanr ve Genomik ktphaneden baz dizileri rten dier klonlarn aratrlmasnda sonda (prob) olarak kullanlr. Sonu rtme dzeyi iin analiz edilir. kinci kez klonlanan rten blgenin ucu alnr tekrar baka rten klonalarn seimi iin sonda olarak kullanlr. Bylece kromozom boyunca yrm olunur.

ekil 17. Kromozom yry teknii ile blgeyi kapsayan araya sokulmu ksmn klonlarnda st ste akan ksmn yerini belirlemek eklinde uzun kromozom yry yaplr.(A)Araya sokulmu ksm olarak tanmladmz belli zel (DNA) paras ile balanr. Daha sonra bu ksmlarna blnerek dier klonlar iin,(A) blgesiyle akan blgeyi ieren genom ktphanesi iindeki dier klonlar iin sonda elde edilir.(aada dier blge (B) ile belirtlmitir.) (A-B)klonunun kendisi ksmlara ayrlr ve ilemi tekrarlayarak sonde elde edilir. Bylece kromozom zerinde srekli ilerlenir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) 31

Mesela (A) blgesi ad verdiimiz belli bir gen (1) no lu klonda yer alsn. Bu blgenin bu klonda yer ald sonda aracl ile anlalmtr. Klonlanm ksm ayn (R.E)yi kullanarak balang vektr ile yapld gibi alnp uzaklatrlr ve sonda (Prob) larn kendilerinin kullanm gibi paralara ayrlabilir. Burada ama birinci ile st ste akan klonlanan ksm ieren dier bir klonun yerini belirlemektir. kinci klonda ayn ekilde muamele grr. Bylece segmentleri kromozomda daha aa ksmlardaki dier st ste akan ksmlarda sonda olarak kullanlr. Bu ekilde nisbeten kromozomun uzun segmentleri akan klonlar yardm ile incelenebilir. Kromozom yrynn ak bir kullanm alan eukaryotik kromozomlarda hangi genlerin birbiriyle yan yana olduunu anlamay salar. Kstk fbroz ve kas dstrofs gennn yer boyle belrlenmstr. Bu teknik ok bktrc ilemleri gerektirir. Belli baz alanlarla snrl uygulamas vardr. Mesela Eukaryot DNA larda tekrarlanan dizili sralar gibi konular zel glkler oluturur. akan sonda birok ortak tekrarlanan dizili sras ierir bitiik segment iermeyen birok klonla hibritleir. Bu ekilde apraz iliki tekniin deerini azaltr. Yakn zamanda kromozom sramas (kromozom jumping) teknikler gelitirilmitir. Bu teknikler yry iin uygun olmayan blgeleri atlayan onlar (bypass) yapan tekniklerdir. Bu teknikler segmentler iki ucunun ortasnda yrme ilemi yaplmadan iki ularn yerlerinin belirleme kabiliyetlerine bamldr. Segmentlerin ular eer blge invert edilmi ise (ters evrilmi)yada byk bir blge klonlanp orta ksm sonra uzaklatrlarak sadece ular kalm ise segmentlerin ularnn yeri belirlenebilir. ki ucun sondas aratrcnn birinci ucu ve dierlerini etkili olarak clonlamasna ve e aradaki blgelerin zerinden atlanlmasn mmkn klar. Ksaca kromozom jumping terimi genomik kromozom zerindeki birbirini takip etmeyen fakat bilinen noktalar arasnda o blgeyi atlayan klonlarn izolasyonu salayan tekniktir. Bu i genellikle ilgili olmad dnlen blgeler zerinde ilem yapmak yada (yry) uzun olduunda by-pass blgelerinde yaplr. HETERODUPLEX ANALZ Genellikle eklenen parann boyutunu tahmin etmek iin clonlama tecrbelerinin sonularn grmek arzu edilir. Bu teknik heteroduplex analizi yada heteroduplex haritalama olarak anlr. Duplex DNA farkl kaynaklardan gelen tek kollarn (DNA) lar farkl olan yerlerde Loop yada knt yapacak ekilde oluumu ile elde edilir. Bu heterojen DNAya heteroduplex ad verilir. Elektron mikroskobu gzlemi ile analizi ile bu eit DNA analizlerinde rekombinans DNA aralarndaki nemli bilgiler salanr.

32

ekil 18. ki lambda faj kromozomunun iki blgede farkllam hetero dubleks haritas. Her ikiside hem uzunluk, hemde bir blgenin dizili sras bakmndan farkllar.(soldaki ok).Ayrca biri dierinde bulunmayan biraraya sokulmu ksm ierir.(sadaki ok).(a)Elektron Mikrografik (b)-Aklayc diyagram araya sokulmu blge ieren kromozom farkl izimle gsterilmitir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

33

Heteroduplex analizi kullanlarak eitli yabanc DNA ilave yerler, delesyonlar yada (DNA) paracklarndaki heterojenite ile belirlenebilir. Bu yntemte klonlanan rnlerin clon genellikle kendi sondas yada clonsuz plasmidi olmak zere dier nkleik asit ile hibritletiinde heteoduplex DNA oluur. Bu ekilde clonlanan rn elektron mikroskobu ile grlebilir. Metot bu ekilde elektron mikroskobik incelemeye dayanr. Mesela bir canlda lamda fajlarnn iki klonlama vektr arasndaki farkll haritalamak iin Heteroduplex analiz kullanlabilir. Bu durum ekil 18de gsterilmitir. ekilde iki farkl blgede farkllaan iki faj kromozomunun hibridizasyonu gsterilmitir. ekilde okla iaretli yerde iki faj kromozomu ebat ve dizili sras farkldr. Bu durum heteroduplex kromozomdaki tek kollu lop halinde gzlenir. Oysa bunun her iki tarafnda eit kollu molekl yer alr. ki blge farkl dizili sras ile gzlenir. nk bunlar hibrit hibridize olmaz. Bunun nedeni blgeler ebat bakmndan farkldr. ki tek kollu zincir llerek akar olarak farkl olduu gsterilebilir. kinci farkl blgede ise tek kolu (DNA)nn gzlendii araya sokulmu loop gze arpar. Bu durum bir kromozomun ilave iine alnm kazanlm blge ierirken deerinin byle olmadn gsterir. Lamda kromozomu ebatn bilirsek iki vektrn ebat farkll yan sra farklln tam u noktasn belirlemek mmkn olur. Bu lmler aratrcya iki vektrn nelere maruz kaldn gsterir. EUKARYOTK VEKTRLER Yaplan eitli almalarda kimerik plazmidlerin balca E.Coli olmak zere bakterilere sokulmas sz konusudur. Ancak bu tekniklerin eukaryotlarda uygulanmas iin E.Coli gibi prokaryotlar, fajlar eukaryot genlerinin tmn aklamaya muktedir deildir. nk bunlar genetik baz transcripsiyon sonras yada translasyon sonras, ilemler, intron uzaklatrlmas, baz proteinlerin modifikasyonu gibi ilemler iin gerekli enzimler bakmndan eksiktir. canl Eukaryotik genomun in vivo (canl ii) organizasyon ve aklanmas konusunda da eitli konular arastrma alanlarn olusturmaktadr. Bunlar anlayabilmek iin Eukaryotik plazmidler ve eukaryotik genomun invivo ilemesi konular incelenmelidir. MAYA VEKTR Bira mayas kk bir eukoryatik olup, laboratuvarda tpk prokaryatik gibi genetk slemlere uygun alabilir ntelktedr.. Ekmek mayas (saccharomyces cerevisia ) da byle doal olarak mevcut 2 mikron ebadnda plazmitler vardr. Bu tp plazmt vektor olarak kullanlablr. Ayrca bakteriyel plazmitler maya hcresine konulabilir. Maalesef byle plazmitler hcreden kaybedilebilme eilimindedir.Bu glk maya sentromeri (cen) ve bakteriyal plazmitler birlestrlerek iinde maya DNA replikasyon orijini blgesinide (autonomously replication sequences ARS) ieren bakteriyel plasmitler oluturularak giderilmitir. Daha sonra plasmitler bir generasyondan generasyona maya aracl ile aktarlr.

34

Plazmitler ilerine konan telomerik dizili srasna sahiptir. Ancak endonkleazlarla telomerik sralarda kesilerek dorusal hale getirebilir. Yada plazmitler nce dorusal klnp ularna telomerik dizili sras eklenebilir. Bu plazmitler sonra maya suni kromozomu ( yeast articifical chomoromozom = Y.A.C.) olarak adlandrlr. YACnin zel avantaj ilerine konan byk (DNA) paralarn tama kapasiteleridir. Cosmitlerin 50 kb tadklar hatrlanrsa YACler 800 kb yada daha byk tayabilir. YAClar Eukaryotlarda insan genom prosesinde olduu gibi ok miktarda DNAnn klonlanmas sz konusu olduunda nem kazanmaktadr. MayadaRekombinantDNA almalar, Eukaryotlarda gen regulasyonu, sentromer alma biimi eukaryotik, Linear, kromozom replikasyonunun ayrntlar anlaldka artacaktr.

ekil 19. E.Colide PBR 232 plazmidi. Bira mayasnda kullanm iin modifiye edilmitir. Bu plazmid hem bira mayasnda ve hemde E.Colide yaamakta ve replike olmaktadr. nk her iki durum iinde replikasyon orjin iermenin yan sra, bira mayas sentromerik blgesi(CEN) bulundurur. Bunlar dorusal hale getirildiinde telomerler de katldnda bira mayas, suni kromozomu(YAC) byk (DNA) paralarn klonlamak iin uygun hale gelmi olacaktr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) HAYVAN VEKTRLER Taksonomik bakmdan yksek hayvanlarda yaygn kullanlan aygt DNA tmor virs (SV40)dr.(S.V.sembol sgman vacuolotng virusu tanmlar. lk olarak maymunlarda izole edilmi olup normal fareye tavana hamster hcresinede transforme olabilir. Transformasyon kelimesinin bakterilerde kullanmnn aksine eukaryotlarda normal hcrenin hzl byyen kanserli hale dnmn tanmlar.

35

SV40 bu bakmdan ok kk ntelkte partkl olup kok az (5224 baz ifti ) kromozom ierir. Kaltsal ierii ift kollu halka DNA molekl halindedir. Lambde vektr gibi (SV40) virionlar kendi DNAlarnn bir ksmn yabanc DNA ile deiebilir. Rekombinant DNA almalarnda kullanlan viruslar iki eit yol izlerler. Bunlar kendi hayat sikluslarn rekombinant olmayan viruslar yardmyla tamamlar replike olur yada konuku hcrede mevcut stoplazmadaki halka plazmidler aracl ile aktif virus partiklleri yapmakszn(Yan hucrey lsze etmeden) yada konuku kromozomuna eklenerek hayat sikluslarn tamamlar(lsogen). (SV40)memeli hayvanlar genetik almalarnda nemli bir ara olmaktadr. Mesela -Globun geni (SV40)de klonlanmtr.SV40da enhancer( kuvvetlendrc zenginletirici) dizili sras kefedilmitir. Onkogenler gibi transformasyon konusunda yeni bilgilerin ou DNA tmr viruslarn tayc aygt olarak kullanlan almalardan salanmtr. Enhancer ise eukaryotik DNA dizili srasnda transkribe edilen blgeden belli bir uzaklkta bile olsa transkribe olan blgenin transcipsiyonunu arttran DNA dizili srasna verilen addr.

ekil 20. SV40 bir klonlama aygt olarak kullanlabilir. Klonlama esnasnda sokulan (DNA) ile virsn bir ksm yer deitirir. Beraber normal helper (yardmc) virs yardm ile hala replike olur.(Rekombinant olmayan SV40). Helper virs yardm olmakszn, ya plazmt gibi oalr yada konuku kromozomuna eklenir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

36

BTK VEKTRLER Yabanc genlerin bitki hcrelerine konulmasnda en iyi allan sistem doal olarak mevcut Krown genleri tumor sistemidir. Toprak bakterisi Agrobacterium tumofaciens birok dikotiledon bitkilerde Krown galerileri ad verilen tmre neden olur. Esas olarak Krown galerileri ise transforme olmu bitki hcresidir. Bu hcreler bakteri iinde bulunan tmr zendirici ad verilen Tumor Inducng (Ti) plasmidler araclg transformeolmus btk hucrelerdr. Plazmidin belli bir blgesine T-DNA (transfer edilen DNA) paras ad verilir. Eer plasmidin T-DNA ksm konuku bitki hcre kromozomuna integre olursa transformasyon oluur. Krown galeri hcreleri opn ad verilen bir cins aminoasit trevi retir. Bu unsur A. tumofacensin ihtiya duyduu bir unsurdur. Bu sistem kullanlarak genetikiler transformasyon ileminin nasl olduunu anlamlardr. Bu sreci bitkilerde gen aktarm iin kullanmlardr. Genetikilerin almas byk oranda E. coli maya ve meyva sinekleri gibi model bireyleri bitkilerde belirledikten sonra almalar hz kazanmtr. Bu konuda en byk ilgiyi ayr otlarndan Arabdopss thalana almtr. Bu kk bitki bitki genetii almalar iin idealdir. nk genomu ok kk olup (5) kromozomda 100 milyon baz ifti (2 nkleosu) bulunur. Bu miktar mayalarn (5) kat E. colinin (20) katdr. Dolaysyla bu genom byklnde ilem yapmak genomu tamamen analiz etmek mmkn olacaktr. Bitkiler ok sayda yetitirilerek her bitkinin binlerce tohumunu almak mmkn olduu dnlrse bu organizma genellikle almak iin olduka uygundur.

ekil 21. Arabidopsis thaliana bitkisinin cce formu. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

37

YABANCI DNANIN EUKARYOTK HCREDE FAALYETNN SALANMASI Yabanc DNA eukaryotik hcrelere bakteriyel transformasyona benzer tarzda konulur. Ancak bu durumda TRANSFECTION ad verilir. nk daha nce akland gibi eukaryotlarda transformasyon kanserli bymeyi ifade eder Eukaryotik organizmalar yabanc (DNA)y ald zaman Transgenik adn alr. Hayvan hcreleri yada hcre duvar uzaklatrlm bitki hcresi (protoplast) yabanc kromozomu yada (DNA)y direkt evreden Kalsiyuum bifosfat mevcudiyeti halinde dk etkinlikte kendi iine alr. ,Bu etkinlik DNAy direkt olarak injekte etmek suretiyle arttrlabilir. Mesela Transgenik fare imdilerde dii farelere uygun hormonal hazrlk uygulanarak salanan oosite yada bir yada iki hcreli emriyo halinde iken yabanc DNA injekte edilebilmektedir(ekil23).

ekil 22. Fare oositininn ekirdeine DNA njeksiyonu. Oosit pipet ierisine ekilirve daha sonra injekte edilir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Klonlanm DNAdan yaklak 2 picoliter (2x10-12 litre) hcreler alc konuku dii uterusuna reimplante edilir(yeniden yerletirilir.)Bu injesiyonlarn yaklak %15inde yabanc DNA embriyoya incorpore olur. Transgenik hayvanlar yabanc eukaryotik genlerin kontrol ve aklanmas iin faydaldr.1988de transgenik fare patenti alnan ilk genetik olarak dzenlenmi kansere eilimli patenti alnm ilk organizmadr. Transgenik fare kanser zerinde almalar iin idealdir. Farelerde kemirgen byme hormonu geni ile transfecte edilmi fare baar ile elde edilmitir. nsan phtlama faktr reten Transgenik koyun elde edilmitir. En son Rekombinant DNA uygulamas bilimsel tartma yaratan bir olgu olarak koyun klonlanmas ile 1997de elde edilmitir.

38

Transfeksiyon Retro virusler ile de yrtlebilir. Retroviruslar RNA ieren viruslar olup tersine kopyalama enzimini ierirler. Mesela insan akyuvar hcrelerinde Adenosndeamnaz enzimi eksiktir. Bu eksiklik Retrovirus vektr infeksiyonu ile giderilir. Kemirgenlerde lsemi ekillendirmekten sorumlu retrovirus olan Moloreu murin losemi virusu byle btn genler iin dzenlenmi virusun btn genleri karlm neomisin dayankllk antibiyotik iaretleyici ile yer deitirilmitir. Virus hcre yzeyine balanr ve hcre iine alnr. Bunun RNAs tersinir kopyalama ile DNAya evrilir ve DNA hcre kromozomlar ile birleip ona incorpore olur. Bu olduka yksek modifiye edilmi virusun bir yardmc Helper virusu olmadka hcrelere hcum edip bozmas mmkn deildir. ekil 20deki (SV40) virusu modifiye edilmi Moleney virusu nemli genler uzaklatrld iin Helper virus olmakszn baarl infeksiyon balatamaz. Dier eit teknikte eukaryotik hcrelere Rekombinant DNA konmasnda kullanlr. Bu teknikler elektroporasyon,Lpozom aracl ile tranfer. biolistik transferdir. Elektroporasyon d kaynakl eksojen DNAnn yksek voltajl elektrie maruz kalm hcreye alnmasdr. Bu elektrik alan mhtemelen hcre membranndan geici porlar oluturmakta ve eksojen DNA ieri girmektedir. Lipozom aracl ile transfer yontemnde ise yabanc DNA suni membranl bal lipozom ad verilen kesecikle kaplanr. Bu lipozomlar DNAy hedef hcreye aktarmada transfekte olmu neticede transfekte DNA ile kodlanan protein retilmitir. Bir ok nedenlerin yansra ift membranl hcre duvar rekombinant DNA aktarm iin uygun olmamas yansra DNAnn mitokondriye yada kloroplastlara konmas imdilik genetik mhendislii iin zor hedeftir. Yakn zamanlarda hem mitokondrial ve kloroplastlarla transfeksiyon iin biolistik (Biyolojik Balistik) yntemler gelitirilmitir. Bu yntemde rekombinant DNA Tungsten mikro projectle kaplanr. Sonra bu organizmalara gen tabancas ad verilen frlatc ile frlatlr. NAKAUT (KNOCKOUT) FARE Belli bir lokustaki belli bir fonksiyonu olmayan allel iin homozigot klnm transgenik fareyi tanmlar. Normal olarak bir fareyi transfekte etmek iin kullanlan gen fare genomunda ise tesadf bir yere inkorpore olur. (eklenir)Ancak bazen, eer yabanc gen Krossingover olmadan homologunun aksi ynnde yer alrsa yabanc gen orijinal genle yer deitirir. Bu avantaj dikkate alarak Knockout Fare (Nokaut Fare) teknii oluturulmutur. Bu teknik de normal fare oositi kusurlu genle transfekte edilir ve baz vakalarda bu normal kopyas ile yer deitirir ve sonuta fare bu gen iin heterozigot olur. Byle iki transfekte edilen genin fonksiyonlar gzlenmemi olacaktr. Bylece bilim adamlar bir genin fare yaam iin hayati olup olmadn, deilse kusurlu fenotipin ne olduunu anlam olacaklardr. Bu teknoloji gelime ve imminoloji almalar iin ok uygundur.

39

Klonlanm normal genn arasna antbyotk drenc gen gb marker katp fonksyonu bozulduktan sonra fare embronk koken hucrelerne verlrse baz hucrelerde bu gen normal genle yer degstrr.Daha sonra bu hucreler blastomer safasnda embrolara njekte edlerek homozgot mutant gen tasyan fareler elde edlms olur. Mesela Mulleran engelleyici unsuru iin gen knock out edilirse erkekler ksr olur. nk dii genital organlarna sahip olur. Bu deneyler cinsiyet belirlemesi genetik ynlere daha nem verilmesini salayacaktr. Halen her yl 150-200 knock out deneyi sergilenmektedir.Ayrca nakavt genler nsanlarda genetk hastalklar calslmasnda model hayvan olarak kullanlr. BLDRC SSTEMLER Bu sistemler bir genetik yap olup aratrcya belli bir l ilikili lokusun fenotipik aklamas suretiyle aktif olup olmadn belirtir. Mesela Luciferaz isiml bildirici(reporter) genn yada urununun varlg Luciferin ile ykandnda parltl kzark grn vermesi ile belrlenr. Ksaca bu sistemler transfeksiyon (Yabanc DNAnn eukaryotik hcreye sokulmas) deneyinin baarl olup olmadn belirleyen sistemlerdir. Bitkilerin Agro Bakterium Tumofaciensin (Ti) plazmidi ile transfekte edildiini dnelim. Eer bir bitki (Ti) plazmidi ieren A.Tumofaciens ile infekte edilmi ise konuku bitkiye T-DNA blgesini transfer ederek onu tranfekte eder. Bu ekilde T-DNAy alan hcreler T-DNA ile transfekte edilmi olan ve opin maddesi ad verilen bir eit aminoasit trevinin retimi zendirilir. Bu madde bakterinin gdasdr. (Ti) plazmidi hakknda yaplan deneylerin ou konuku bitkiye aktarlan dier genleride iermektedir. Bylece aktarlan genler iin transgenik bitkiler oluturulmu olur. Byle bir denemede de Ttn bitkisi ate bceinden alnan Luciferaza genini ieren (Ti) plazmidi ile transfekte edilmitir. Bu genin rn ATP baml Luciferin oksidasyonunu katalize eder ve darya k salar. Transfekte bitki Luciferin ile sulanrsa ate bcei gibi ldar. Byle denemelerin nemi ldayan bitkilerden ziyade, bu ldamann belli zel genin etkisini bildirmesini saladg hususudur. Daha ileri denemelerde belli zel genlerin promatr ve enhancer (zenginletirilmi) blgeleri Luciferaze genine ekleneblr. Sonuta Luciferaze sadece promatrler aktive edilince ilev grmtr, retilmitir. Bu durumda bitkinin ldayan blgesi transfekte genin aktif olduu yerleri gsterir. Daha yakn zamanlarda incelene bildirici sistemler Jle bal (Jelly Fish)den gelen geni kullanr. Bu gen yeil floresans proteinidir. Bu sistemin nemi Luciferazda olduu gibi bir ey katmaya gerek olmakszn ultraviole nda parlar. Yeil floresans protein geni incelenen gen ile kombine edilip transfeksiyon yaplr. Eer istenen gen baar ile geirildiyse ultraviole ile aktive edildiinde bildirilmesi yani sonucun grlmesi gerekir. 40

RESTRKSYON HARTALAMA Restriksiyon enzimlerinin bir ift kollu DNAda yaptklar kesik says bu DNA segmentinin uzunluuna, dizili srasna, belli enzimin tanma dizili srasnda baz ifti saysna baldr. Prokaryot ve eukaryotlarda gen faaliyetlerinin unsurlar aada ksaca zetlenmitir. Prokaryotlar ve eukaryotlarda transkripsiyon sonras (post transcription) ve translasyon sonras (post translasyon) modifikasyonlarda farkllklar olabilmektedir. Gen aklamasnn kontrolnde en nemli yer trankripsiyonun balad, RNA polimerazn bagland yer olan promotordur. DNA zincirinde transkripsiyonun biti yeri terminatr (sona erdirici) dizili sras ile belirlenir. Promotor yan sra eukaryotlarda DNA ularndaki enhancer blgesi promotorun ilem ynne ters ynde yer alr ve transkribe edilen yerden belli bir mesafede bile olsa ilgili blgenin transkripsiyonunu arttran ayarlayc blgedir. Klon DNAsn tanmlamann lk adm onun Rstrksyon hartasn yapmaktr.Restrksyon hartas klonlanms br DNA parcas uzernde RE kesme bolgelernn saysnn sralansnn ve aralarndak uzaklgn jel elektroforez le parca buyuklugu blnen br molekul le karslastrlarak belrlenmesdr. Dizili sras buyuklugunun ans etkisi oluma ihtimali ilgili sra uzunluunun r. Mesela Hnd II enzimi (SV40) tmr virs halka DNAsn iki paraya bler. Baz restriksiyon enzimleri E.Coli DNAsn yzlerce paraya bler Restriksiyon enzimlerinin DNA rnei zerine etkisinin rnlerine restriksiyon kesintileri (restriction digest) ad verilir. Elektroforez kullanarak bu restriksiyon kesintilerinin byklk srasna gre ayrabiliriz. Bu teknik aada anlatlacaktr. Bu teknik sayesinde orijinal gendeki yada DNA parasndaki restriksiyon yerlerinin yeri belirlenmi olur. Bylece restriksiyon tanma yerlerine gre bir harita yaplabilir. Sonuta bu tanma yerleri arasndaki fiziksel mesafe hesaplanr. Byle restriksiyon haritalar eitli nedenlerden olduka nemlidir. Sz gelimi (SV40) unsurunda (DNA) replikasyon balangcnda ksa srede radyoaktif nkleotid trifosfatl timidin katldnda radyoaktiflik sadece bir restriksiyon parasnda gzlenir. Bu durum (SV40) replikasyonunun bir zgn noktadan baladn ve bu noktann (SV40) belli yer kromozomunun, belli yerinde yer aldn gsterir. Ayrca bu ekilde restriksiyon haritalar aratrclara genetik haritalar ile kromozom fiziksel haritalarn ilikilendirme olana verir. DNAdaki Delasyon, inversiyon ve restriksiyon deiimleri gibi baz fiziksel deiimler genetik haritalardaki yeri bakmndan belirlenebilir.

41

Restrksyon hartalar klonlanan parcann uzunlugu hakknda fkr verdg gb RE kesm bolgelernde belrtr. Bu bilgiler DNA deiikliliklerini anlamamz salar. Ayrca trlerin farkllamasnn anlalmas bu almalarla anlalmas daha iyi anlalr. Parack boyutundaki farkllklar, restriksiyon parack ebat polimorfizmi (R.F.L.PRestriksiyon Fragment Length Polimorfizim) olarak adlandrlr ve genlerin tam yerlerinin belirlemesinde nemli bilgiler salar. Ayrca bireylerin akrabal yada benzerliini anlamaya yardmc olur. Restriksiyon kesintileri ksa DNA segmentlerinin izole edilmesi ve dizili srasnn analiz edilmesi bakmndan mmkn olur.

ekil 23. Restriksiyon endonkleazlar ile sindirilmi paralarn elektroforesi le restriksiyon haritalar. (a)- (A) ile gsterilen restriksiyon yerlerini gsteren orjinal DNA paras. (b) ksmi ve toplam sindirilmi ksmlarn bandlarn gsteren agaroz jel bandlar. Yldzlar ise ular iaretlenmi segmentler araclyla retilen radyoaktif bandlar gsterir. Soldaki skala, baz iftleri iin molekl agrl deerlerini gsterir.(rnein: 800bp,700bp). Toplam sindirilmi(keslms) ksmlar 400.200.100 ve 50bplik fregmentler retir. Ayrca 200 ve 100bplik fregmentler iaretlenmitir ksmi sindirilmi unsurlar alt ilave bant verir. NOT; Ksm kesim (RE) yerlerinin tm deil bir ksm kesilmis olmay tanmlar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

42

(R.E.)ler ile kesmeden nce DNAnn (5 ) ucu polinkleotitkinaz enzimi kullanlarak radyoaktiflenerek (32P) ile iaretleyecektir. Bu enzim ift kollu DNAya etki ederek iaretleneceklerdir.

DNAlarn kesiminden sonra uygulanan elektroforezi sonucu 200 baz ifti ve 100 baz ifti (bp) uzunlukta bantlar radyoaktif iaretlenmi olacaktr. Bu durum bu segmentlerin (DNA) paralarnn termini (ucu) olduunu gsterir. Ancak ortalardaki paralarn dizili sras hakknda hibirey bilinmemektedir. Dier segmentlerin dizili sras bu paralanma srecini yavalatr.Ksmi kesim ilemi yaplarak bunlarda belirlenebilir. (RE) ile kesim tamamlanmasna izin vermeden (RE) kesim yerleri henz ayrlmam paralardan oluuyorsa buna ksmi (partial) kesim (Digest) ad verilir. Eer reaksiyon soutulur yada ksa sre srdrlrse btn restriksiyon yerlerinin kesilmemesi salanm olur. Baz DNA paralar btn yerlerinden kesilmez iken bazlar bir, bazlar iki, bazlar yerde olmak zere restriksiyon yerlerinden kesilmi olacaktr. Byle bir ksmi kesimin sonucu 24. eklin sanda gsterilmitir. RESTRKSYON HARTALARININ YAPIMI Bu maksatla bircok usul bulunur .Ancak prensp sozgelm 2 RE enzm kullanlyorsa bunlarn her ksn ayr ayr ve her ksn brlkte kullanarak elde edlen kesklerin buyuklukler yorumlanarak enzm kesme yerlernn sralamas(hartas)eklindedr. Yukardaki ekil 24de gsterildii gibi Hipotetik bir DNA parasn, (A) isimli restriksiyon enzimi ile keselim. Bu kesilme paralarn Agaroz jelde elektroforeze tabi tutalm. Agaroz jel zellikle nispeten byk DNA paracklarnda hareket etmesini salayacak poroziteye sahiptir.(R.E) DNAy yerden keser ve 200,50,400,100 baz ifti uzunlukta paracklar oluur. eklin solunda grlen band deiimi modeli sz edilen paralarn elektroforezi sonucu oluan grnmdr. Burada daha kk paracklarn daha byk olanlardan daha hzl hareket ettiine dikkat edilmelidir. Segmentlerin bykl, ebad bilinen standartlarla karlatrlarak tayin edilir. ekilde solda bir skala kolu verilmitir. Ancak bykl bilinen standartlarn bantlar ekilde gsterilmemitir. Kromozom zerinde bu segmentlerin dizili sras jelden aka belirlenerek, eitli metodlar kullanlarak orjnal DNA paras zerindeki restriksiyon segmentlerinin sralar saptanr. Bu jelden segmentlerin dizili sras belirlenebilir. Bu jel (4) orjinal segment ile beraber (6) yeni segment ierir ve her biri en azndan kesilmemi restriksiyon yeri ierecektir. Toplam kesinti jelinden dolay biliyoruzki 200 ve 100bplik segmentler dar taraflardadr. Bunlar radyoaktif iaretlidir. Ayrca 50 ve 400 bplik i taraflardadr.

43

ekil 24.ekil 23teki ekiller yeniden yaplanmalarn basamaklarn gsteriyor. Bunlar toplam ve ksmi restriksiyon kesiklerinden oluur. Yldzlar (32p )u iaretlerini gsterir. Toplam kesiklerden 100 ve 200 bplik ve u segmentler oluur.(a)- 50 ve 400 bplik segmentlerde olduundan toplam kesiklerden elde edilen DNA iinde sadece baz bandlar (fragmentler) ksmi kesiklerden oluur. Bunlarda 200 bplik fregmentlere bitiik,50(Birlkte,200+50=250) ve 100 bpye bitiik, 400 bp(brlkte,400+100= 500) fregmentleri oluturur. (b) ve (c) basama ksmi kesiklerde iaretlenmemi 450 bplik ksmlarn varl, 50 ve 400 bplik(birlikte,50+400=450lk ksmlar izole eder.(d) Nihai yap oluur.(e)-Btn fregmentler bu dzenlemeye uyar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

44

ekil 25. Ayn DNA paras zerinde iki farkl restriksiyon endonkleaz ile (A ve B) ile oluturulan tanma yerlerinin yaylm. (a)-Gerek dzenleme, (b)-Hipotetik alternatif dzenleme, (c )-Sadece (a) veya sadece (b) den oluan veya her ikisinden oluan toplam restriksiyon kesikleri (digest)nin elektro forezi. Yldz iareti radyoaktivite iaretlenmesine ilikin bandlar gsterir.(a)-Buradaki sralar, btn kesiklerde bulunan tm bandlara uyumludur. (b)-Buradaki dzende uyum yoktur. Szgelimi (b) nin sralanma dzeninde ve iaretlemede 150bp paracklar anlalr. Oysa bu ksm toplam kesikte yoktur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) ekil 25 de bu durum gsterilmektedir. Ksmi kesimde 250 bplik segment deil 150 bplik segment bulunur. Bu durum bize 50 bplik segmentin biraz ieride yer aldn ve 200 bplik uca bitiik olduunu syler.

45

Burada 500 bplik segmentlerde vardr ancak 600 bplik segment yoktur. Bu durum bize 400 bplik segmentin 100 bplik uca bitiik olduunu syler. aretlenmemi 450 bplik segment ise 400 ve 50 bplik segmenlere bitiik olduunu , DNAnn iinde yer aldn gsterir. Bu durumda ak anlam olan orijinal DNAnn sralamas belirlemi oluruz. Neticede belirli bilinen DNA uzunluklar ile ayrlm restriksiyon enzimlerin tanma yerlerini gsteren bir harita yaplm olur. ekil 24 ile 25i karlatrdmzda durum daha ak olarak belli olmaktadr.

ekil 26: 7 kb byklndeki bir DNA parasnn restriksiyon haritasnn elde edilmesi. Bir DNA rnei HindIII, dier bir DNA rnei SalI ile ve bir dieri de hem HindIII, hem de SalI ile beraber kesilir. Sonuta oluan paralar jel elektroforezi ile birbirinden ayrlr. Ayrlan paralarn byklkleri bitiik hatta yrtlen ve para byklkleri bilinen bir DNA markeri ile karlatrarak saptanr. HindIII, ve SalI ile oluabilecek kesim paralarnn byklklerinden yararlanarak iki tane restriksiyon kesim modeli nerilir. nerilen para byklkleri ile jelde gzlenen byklkler karlatrldnda, Model 1 in doru olduu grlr. (William S. Klug, Prof Dr. Cihan ner. Genetik Kavramlar, Palme Yaynclk, 2003ten modifiye edilerek alnmtr.)

46

FT KESNT Pratikte restriksiyon haritalar birok farkl restriksiyon enzimi ile yaplr. ekil 26da ekil 24teki kullanarak baka bir alma sonularn gsteriyor. Burada ikinci olarak endonkleaz (B) enzimi kullanlmtr. Biraz nce belirtilen metodu kullanarak, endonkleaz kullanlarak iki kesimden (B) segmentinin 350,250,150 baz ifti ebadnda segmentler elde edilir. Bu iki haritann nasl bir arada inceleneceini anlamak iin (B) segmentinin (A)ya gre solda yada sada yer alp almadna baklmaldr. Eer orijinal DNAy her iki enzimle ayn anda muamele edersek, ift kesinti oluturursak dizili sras aka belirlenmi olur. Bu iki sra ekil 30da gsterilmitir. Burada ift kesimle farkl bir tahmin yaplmtr. lk dizili srasnda (a) 200bplik radyoaktif iaretlenmi segment olduu tahmin edilmitir. kinci dizili sras (b) ise iaretlenmi 200 bplik segment. 150 baz ifti geriden kaslm olup 200 bplik iaretlenmi segment deildir. ift kesim ise iaretlenmi 200 bplik segmentler (a)da belirtilen sray gsterdii anlalr.(a)daki btn dier hususlar ift kesim sonular ile ilgilidir. Restriksiyon haritalar bize DNA paralarnn fiziksel haritalarn verir ve belli baz bilinen DNA uzunluklar ile ayrlm (R.E.)lerin etkiledii yerleri gsterir. Bu teknik bilinen bir pozisyondaki ksa DNA segmentlerinin dizili sralarnn bilinmesini salar. Ayrca DNAnn fiziksel haritalanmasnn genetik harita ile karlatrlmasn ve mutasyon gibi baz dier zel iaretleyicilerin yerlerinin anlalmasn salar. RESTRKSYON PARACIK UZUNLUU POLMORFZM Ksaca R.F.L.P.( Restriksiyon Fragment Length Polimorfizim) olarak bilinen teknik restriksiyonun enzimleri ile oluturulmu kesintilerin elktroforezi ile elde edilmi bant modelini tanmlar.

47

ekil 27. Restriksiyon fregmentlerinin uzunluklar polimorfizmi (RFLP) denilen analiz. A1 alleli(kromozomu) 750 bplik ksma balanma ile anlalan bir gen segmentidir. Allel (kromozom) ikide (A2) , allelin (A1) solundaki restriksiyon yeri deimitir. Bu sonda ile hbrdze olma dolaysyla 750 bp yerine, 1400 bp uzunlukta paralar tannr. Southern Blotting (Southern isimli aratrmacnn gelitirdii bant aktarm) srecinde bu iki allelden iki farkl band grlr. Oklar restriksiyon yerlerini gsterir. Buna gore heterozgot br brey soz konusu se her k bandda gorulur(Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) ekil28.DNAparmakizinin (adli)kullanm. Bir cinayet ileminde, bir madur(kurbann) (v), savunmacnn (D) Southern Blotting teknii ile elktroforez DNA bantlar oluturulmu. Savunmacnn gmlek ve pantolon yapsndan alnan(shrt ile gosterlen sutundak bantlr) kan rneklerini gsterir. Bu model aka kurbann kanna uyar. Savunmacnn ise kendi kanna uymaz .Btn dier lekeli kanlar dalm eritleri , kontrol ve ebat bykltayinstandartlarn ierir.Pantoldaki Kan lekesnn kurbandan olmama ihtimaliotuz milyonda birdir.Bu da yeryzndeki bir insana tekabl eder. Ancak bu olaslk rklar ii ve etnik alt populasyonun deikenlii hakknda, varsaymlara bal olarak zt uyumludur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

48

Bu teknik zellikle insan gen haritalar ve Adli Tpta nemli kolaylklar salar. nsann tm genomunu restriksiyon enzimi ile kesilmi kesikleri oluturduu bir restriksiyon enziminden binlerce parack oluur. Bu kesintilerin Southern isimli aratrmacn gelitiri Blottingi ve ( DNA-RNA yada DNA-DNA birlemesi iin DNAy agaroz jelden nitrselloze aktarp bantlar halnde gormek) iin eitli zgn sonda (probe)lar gelitirilmitir. Genetik varyasyon genellikle ikinci bir allel formundan kaynaklanr. Herhangi bir mutasyon sonucu Restriksiyon yeri eksildiinde DNAnn byk bir paras eksilmi olur. Baz problar birok alleli olan Hyper Varyabl (deiken) lokuslar ortaya koymutur(herhangi bir kii bu birok mmkn allelden ikisini tar).Bylece populasyon iinde bu lokuslar bakmndan varyasyon sz konusu olacaktr. Byle Hyper deiken lokuslar birok ksa, 10 ile 60 arasnda deien baz ift sayda ikili tekrarlar ierir. zellikle eit olmayan Krossing-over dolaysyla bu lokuslardan biri araclyla ok varyasyon gzlenir. Bu lokuslara ksaca VNTR sembolu le gosterlerek (Variable Number Tandem Repeat) Deiken sayda ikili tekrarl lokus ad verilir. Yani ksaca ikili tekrarlar nedeniyle Hyper deiken lokus. s z konusudur. Muhtemelen deikenlik eit olmayan krosingoverden kaynaklanr. Bu eit deikenlik sonucu, bu VNTR lokuslarndan birini sondalama birok adan varln ortaya koyacaktr. Byle kesintilerin Southern Blotting ileme maruz braklmas DNA parmak izi elde edilmesine yol aar. Bu olgu adli tpta nemli kullanm alan bulur. Bir cinayet ardnda braklan semen (ersuyu) yada kan rneinin DNA modeli ile karlatrlabilir. Baz vakalarda ayn prob (sonda) ile ok sayda farkl doku belirlenir. Bunlarn herbiri Southern Blottda birok bant verirken insanlarn ou zgn bant modeli gsterir. A.Jeffrey gelitirdii bir sistemde bir probe her kiide 50 yada daha ok band oluturur. Eer Jeffreyin sonraki bant modelini kesinletirmek iin kullanlrsa iki modelin tam tamna benzer olma olasl neredeyse son derecede kktr. Bu teknik kanda parmak izinden elde edilen bilgiye gre daha byk tanmlama gcne sahiptir. POLMERAZ ZNCR REAKSYONU Mze rnekleri, kurumu rnekler, cinayet yeri kalntlar, fosil gibi birok vakalar, mevcut DNA rnekleri ok kk miktarlarda yani laboratuvar almasnn gerektirdii minimum miktardan azdr. Kary Mulin 1983 te Polimeraz Zincir Reaksiyon (P.C.R.= Polimeraz Chain Reaksion) ad verilen yntemle bu ok kk miktarlar oaltma tekniini bulmutur.

49

Burada tek ihtiya duyulan, ilgi duyulan ksmn hangi yannda olursa olsun nkleotid dizili srasdr. Bu bilgi bir primer oluturmak iin gereklidir. Primer oluturulduktan sonra primerler arasndaki dizili sras oaltlr. Primer deyimi DNA replikasyonunda 3-5 ynnde tek kollu ula devam eden ift kollu DNA uzunluunu tanmlar. Bu teknikte, rnee baz primerler ve eitli maddeler katlr.

C ye drlerek primerlerin kendi btnler dizili salanr. Daha sonra replikasyon yeni bir dngs tekrar balatlr. Bu durum ekil 29ta gsterilmitir. Bu dngnn eitli safhalar scaklk ile kontrol edilir. nk denatrasyonda primer eklemesi, DNA replikasyonu farkl scaklklarda gerekleir. Yaklak yirmi dngde bir milyar kopya yaplr. Bu teknik kaplca bakterisi olarak bilinen Thermophylus Aguaticusden elde edilir. Scakla dayankl DNA polimeraz yardm ile daha da etkin yrtlebilmektedir. Bu yzden her dng sonunda reaksiyon ortamna yeni unsur katlmaz. Bunun yerine dng (PCR) aygtna mdahale edilmeksizin balca su banyosunu programlayarak bylece isabetli bir ekilde reaksiyon karmn saran su scakln hzla deitirerek dng devam ettirilir. Baz zel PCR aygtlar ayn anda 96 rnekle alabilir. (P.C.R) teknii mikrosatellit DNA ad verilen yaplar oaltlarak, DNA fingerprint (parmak izi) oluturmada kullanlabilir. DNA parmak izi eitli deiken lokuslar iin sondalanm DNA kesintilerine uygulanr. (Jel) elektroforezi ile oluturulan band modeli tanmlanr. Mikrosatellit DNA ise genom boyunca dalm ksa DNA dizili sras tekrarlar demektir. Mesela Sitozin-Adenin (CA) eukaryotlarda onbinlerce kere tekrarlanr. VNTR lokuslarnda insanlar arasnda bu eit tekrarlarn says bakmndan temel crossingover hatalarndan ileri gelen saysz lde varyasyon vardr. VNTR lokuslarndan farkl olarak, bu lokuslardan birinin (PCR) ile oaltlmas Restriksiyon kesimi, Southern Blotting sondalama olmakszn salanabilir. P.C.R. direk elektroforez sonularn verir. Gerekli olan tek ey, herhangi bir mikro satellit lokusunu saran primer dizilie sahip olmaktr. P.C.R. halen molekl genetiinin nemli bir laboratuvar arac olmutur.Bylece aratrc yada adli tp iin ihtiya duyulan DNA bulgularnn oaltlmas mmkn olur. RekombinantDNA tekniinin en nemli sonucu DNA dizili sras belirlenmesidir.Rekombinant DNA teknolojisi,le kk iyi tanmlanan, kromozom blgelerinin izole edebilme yetenei DNA dizili sras tekniklerinin gelimesine neden olmutur.

50

ekil 29. Polimeraz zincir reaksiyonu.(DNA) denatre edilir.Her iki kolon ucundaki dizili sra sra btnler,primer ad verilen oligonkleotitler katlarakreplikasyon srdrlr.Bu basamaklar (DNA)denatrasyonu veya primer balama ya da (DNA)replikasyonuna uygunscaklklar oluturularaksalanr. Replikasyondansonra yeni bir dng balar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGrawHill),isimlikitabndan modifiyeedilerek alnmtr.)

51

DNA DZL SIRASI BELRLENMES Harvard niversitesinden Walter Gilbert ve Stansford niversitesinden Paul Berg, Kambri (ngiltere) Tp Aratrma Konseyinden Frederik Senger, 1980 kimya dln Lamda Fajna (SV40) genomuna sokarak oluturduklar ilk klonlama (DNA) molekl nedeniyle paylamlardr. Gilbert ve Senger DNA dizili sras belirtmek iin, bamsz bir metod gelitirdikleri iin dllendirildiler. W. Gilbret ve A.Maxam Kimyasal Metod (chemiqual degiadation) ad verdikleri DNA dizili sras tayini metodunu ortaya koydular. Kimyasal metot halen neredeyse hi kullanmamaktadr. Bu metod DNAnn belirli bazlarda kimyasal olarak krlmasn ierir. nslin protein unsur dizili srasndan tr, 1950 Nobel dl sahibi Senger, daha sonra RNA dizili sras belirlemesi zerine almtr. Bu ekilde Sengerin isimli aratrmac, Alan Coulson isimli aratrmac ile gelitirdii DNA dizili sras metodu, DNA sentezini ierir ve art-eksi (plus-minus) yeya zincir sonlandrma metodu olarak bilinir. Daha sonra Senger ve Coulsen sonlandrc nkleotid kullanarak plus-minus metodu modifiye etmilerdir. Bu metod dideoksi metodu diye bilinir. Aada bu metodnu aklanmtr. D DEOKS METODU LE DZL SIRASI BELRLEME Enzimatk dizi analz metodu adda verilen bu metodla dizili sras analizi DNA sentez ilemleri ile salanr. Hatrlanaca zere DNA sentezi primer ad verilen, ift kollu olup, tek kollu (3-OH) ile nihayetlenen yapdan balar. Dier tek kol ise tek kollu DNA ile devam eder. Dideoksi metodunda dizili sras bulunacak DNAnn bir primer yaps oluturulur ve replikasyonun ilerlemesi salanr. Zincir sonlandrc bir nkleotid kullanarak yaplan bir yanltma mdahalesi ile DNA sentezi bilinen pozisyonda durdurulur. Bu zincir sonlandrc nkleotidler (2) ve (3) karbon atomlarnn ikisinde de (OH) eksik olan ekerler ile oluturulur. Bu sebeple di deoksi ad verilir (ki kere deokside). (3-OH) grubu olmayan dideoksi nkleotidler DNA polimerizasyonunda kullanlamaz. Yani oluan klon eklenir fakat kendisine yeni nkleotid eklenemediinden zincir oluumu sonlanr. Zincir sonlandrcnn varlg nkleotid sentezinin istenen bazda durmasn salar. Dizili sras belirlenen rnek (4) ayr reaksiyon karmnda ayr ayr yerletirilir. Her bir karm (4) nkleotidi ve bunun yan sra zincir sonlandrc dideoksi nkleotidi de belli bir oranda ierir.

52

ekil 30. Dideoksi nkleotidler DNA replikasyonuna zarar verilmesine(durmasna) yol aar. Dideoksi primer konfigrasyonu 3-OH grubu eksiklikleri gsterir. Primer konfigrasyonunda 3-OH vardr ve zincir uzatma iin ihtiya duyulur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Mesela Timin ieren Trifosfat nkleotid havuzunda bir ksm dideoksi Timidin Trifosfat var ise byyen tek koldaki sentez bir sre sonra, Jablonda Adenin belirdiinde (Adenin Timinin btnleridir) sentez sona erer. Bylece sonu Timin olan deiik uzunlukta deiik uzunlukta birok parac meydana gelmi olur. Benzer reaksiyonlar ayr test tplerinde her nkleotid iin yaplr ve neticede ilgili btnler nkleotidi ieren uca sahip paracklar oluur. Anak reaksiyon her zaman bu Timin sr olduu pozisyonda kesilemez. nk ddATPden baksa ortamda d ATPdebulunur. Bu edenle yeni zincir sentezi tm Timinlerin bulunduu pozisyonlarda sonlanarak kalp zerinde her Timin nkleotidi bulunduu 53

pozisyonlar uzunluunda DNA paralar altornekler(tapier) de de oluur.

sentezlenir. Benzer reaksiyonlar dier

Her karmda sonuta elde edilen paracklar elektroforeze tabi tutulursa meydana gelen band modeli yeni sentezlenen DNAya gre (Jel) den okuyabilir. ekil 31te bu durum gsterilmitir. Dizili sras belirlenecek DNAnn kk bir blmesi (9) baz ifti uzunluktadr. Bu dizili srasn belirlemek iin bu ift kolun bir kolu ekilde gsterilen yapya getirilmelidir. Dizili sras belirlenecek (DNA), yeni (DNA) sentezi iin model olmaldr. Bu yapya Primer Konfigirasyonu oluturma denir.

ekil 31. Dideoksi metodla DNA dizili sras analizinin balang basamaklar.Yldzlar dideoksi nkleotidleri gsterir.Sras saptanacak primer konfigrasyon iine yerletirilir.(a,b) drt reaksiyon karm oluturulur.Her biri btn (4) normal nkleotidin yansra dideoksi dideoksi nkleotidlere btnler yaplar oluma annda durdurulur.(c). (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

54

Bu ilem ayrca aklanacaktr. Gerekli primer yap oluturulduktan sonra her biri (4) nkleosid Trifosfat ile birlikte DNA polimeraz I ieren (4) alt rnek alnr. Bu nkleosit trifosfatlarn biri radyoaktif iaretlidir. Bu ilem genellikle (32P Radyoaktif fosfat) ile salanr. Bu iaret bize yeni sentezlenen DNAnn otoradyoaktivite ile grlmesini salar. (4) alt rnein her birine dideoksit nkleotidlerden (dd) sadece biri az miktarda katlr. Yani mesela her hangi bir rnekde sz gelimi 4 deoksi NTP de olmak zere hangisi radyoaktif ise o nkleotiden dideok formu karma katlr. Mesela 4 alt rneklerden biri ddTTPyi, aldysa dieri dd ATPalr, dier nc ddCTPyi, dier drdnc ddGTPyi alr. Bu dideoksi nkleotidler, olaan deoksi nkleotidlerle birlikte katlarak zincir sona erdirme, ileminin her uygun pozisyonda oluturulma olasl dikkate alnm olur. Bu olgu da ddNTPleri ok az miktarda olduundan zinci sentezi rasgele sonlandrarak deiik uzunlukta bir ok DNA paras oluur. Eer zincir oluumunda Deoksi nkleotidlarn yerine dideoksi nkleotid katlnca, nce bu bazn btnleri ablon kolda belirince zincir sona erdirilir. Dideoksi nkleotidin ve deoksi nkleosidleri kartrarak sona erdirmenin her uygun pozisyonda olumas salanr. ekil 35te Jablonun iki Adenine sahip olduu grlmektedir. Bu yzden ddTTP reaksiyonu karm iin Adeninin btnlerine de iki misli ihtiya duyulur. Bylece ddTTP iin iki mhtemel nokta vardr. Ayn ekilde iki mmkn zincir sona erdirme ve dolaysyla dideoksi Timidinle sona erecek iki mmkn fragment vardr. Bunlarda iki ve yedinci bazlarda benzer ekilde ve adeninle sona eren mmkn parack vardr. Bunlar bir, ve sekizinci bazlardr. Ayn ekilde Sitozinle biten parack vardr. Bunlar drdnc, beinci ve dokuzuncu bazlardr. Guaninle sona eren bir parack vardr, o da altnc bazdr. Bu durum ekil 32de gsterilmitir.

ekil 32. Dideoksit metodu ile DNA dizili sras tespiti ile retilmi segmentlerin elektroforezi.Byle bir elektroforez sra lamann direk oluumunu mmkn klar. Yldz iareti dideoksi nkleotidi gsterir.(Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) 55

Yeni sentezlenen rnler ekil 31 de gsterilen reaksiyon rnleri olup primer ve jablon uzaklatrlarak elde edilmitir. Her reaksiyon karm (mesela ddTTP) dideoksitidine trifosfat ieren karm olup zel ve belirli uzunlukta, elektroforezde anlalabilen zel unsurlar retir. Yan tuplerde uzunluklar brbrden br nukleotd farkl degsk uzunlukta DNA molekuller brkr. (ddTTP) reaksiyon karm dizili sras Timinle neticelenen iki eit oluum ierir. Bunlardan biri iki bazlk uzunlukta ,dieri yedi bazlk uzunluktadr.Bylece Timin ve Adeninin btnleri orijinal DNA parasnn 2. ve 7. pozisyonunda belirir. Ancak hem orijinal kol , hemde btnler kol (yeni sentez)orijinal dizili srasn verir.nk (DNA) iki sral olup bir koldaki dizili sras btnler koldaki dizili sras ile belirlenir. Okuma islem bandlar aagdan yukar dogru okuyarak mesela en alttak band (A) dr cuku ust hzasndak o bandn bulundugu tupler (A) tasyor eklnde yaplr. DNA sentezi bittikten sonra eski primer daha sonra anlatlacak olan bir metoda gre uzaklatrlr ve sadece yeni sentezlenen DNA paras kalr. Yeni replike olacak segment her reaksiyon karm iin deiik boyutlarda olup poliakrilamid Jel zerinde elektroforeze tabi tutularak mevcut segmentin boyutu belirlenir. Sadece yeni sentezlenen (DNA) segmenti radyoaktif iaretli olduundan otoradyografi yeni sentezlenen DNAnn izini gsterecektir. Jelin otoradyografisinde bu durum grlecei gibi her alt rnek primer yaplanma (sentez balama yeri) da balayan, zincir bitirici dideoksi baz ise neticelenen uzunlukta paracklar retir. Bylece aadan balayarak yukar ve geriye doru Jel okunmak suretiyle (DNA) parasnn dizili sras olarak belirlenir. nk bunlar, ekil 33de gsterildii gibi her biri merdiveni andrdndan bu Jellere genellikle Merdiven Basama Jeli yada Merdiven Jel denir.

56

ekil 33. Dideoksit metoduna gre DNA dizili srasnn tespiti. (Dideoksi dizilim jelinin autoradyografisi). Altta yer alan G, A, T ve C harfleri srasyla ddGTP, ddATP, ddTTP ve ddCTP reaksiyon karmlarmlarn gstermektedir. Ayn karm birden fala yrtlerek (mesela solal ve suter6) bant tanmlama kolayl amaclar. dorulama iin btnler kolur dizi aralklarda yapar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Bu teknik orijinal Plusanalizinde kullanlmtr. Bu yap Faj klf iinde bir kollu DNAya sahiptir. Bakteri iine girdikten sonra DNA ift kollu hale gelir. Bu Jel yapsnda primer yap (balama yeri) oluturulmas nisbeten daha kolaydr. Konukuda ift kollu halka form restriksiyon endonkleazle muamele edilerek, ift kollu paracklar oluturulur. Bu paracklar denatre edilir. Bu karmdan belki zel fragment elektroforezle izole edilir. zole edilen kol Faj bandan alnan, tek kollu DNA ile birleir ve yeni byme iin primer oluumu salanm olur.

57

(5387) Baz ifti uzunlukta X174 Fajnn ddeoksi metodunu kullanarak dzlmnn belrlenmes nisbeten kolay olmutur.

ekil 34. x176 fajnn genomu dideoksi dizili sras analizine maruz kalr. nk faj hem bir, hem de iki kollu ekilde olabilir.Bylece dizili sras analizi iin ilem grebilir. ift kollu form endonkleazlar ile fregmentlere ayrlr. Bir fregment elektroforezle izole edilir ve hibrize edilerek yeni DNA sentezi iin, primer oluturmak iin bir kol ile hibridize edilir. Bylece dideoksi dizili sras yaplm olur. Yeni sentezlenen DNA ayn restriksiyon enzimi ile muamele edilerek izole edilebilir.Bylece orjinal ile ayn kesik uc olumu olur.Yeni izole edilen paralar ekil 33deki gibi elektroforeze tabi tutulur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) DZL SIRASI ANALZNDE GEREKL OLAN PRMER (BASLAMA YER) KONFIGURASYONU OLUUMUNUN MEYDANA GETRLMES Dideoksi metodunu etkili bir biimde uygulamak iin genel nitelikte bir primerin oluturulmas gerekir. Bu ama E. Coli vektrnn tek kollu Faj (M)-13 DNAsn kullanarak uygulanan rekombinant DNA ilemleri ile saglanr. (M)na benzer. Her ikisi de bir kollu DNA biiminde kaltsal ierie sahip olup, her ikisi de konuku iinde ift kollu sarmal biiminde oalr. Bu yzden konuku iinde ift kollu forma replike olma formu (R.F)denir. Bu form standart metotlarda dzenlenebilir. Bir kollu form ise dizili sras analizinde kullanlr. Bu sistem aada belirtilen ekilde alr.

58

J.Messir ve arkadalarnn ok dikkatli dzenlenmi almalar ile Lac(Z) isimli bakteriyel genlerde (R.E) iin birok kesm yeri oluturulmutur. Klonlanan unsur (Mlaktozu paralar. -galaktsidoz enziminden sorumlu gen

Bu enzim ayn zamanda enzimin suni substrat (etkilenen madde) olan X-gali de paralar. X-gal mavi renkli olur. Bu yzden fonksiyonel (Lac Z) geni mevcut ise (M-13) plakalar mavidir. Eer gen iine klonlanan yabanc ierik ile engellenmi ise (X-gal) paralanmaz ve plakalar renksiz olur. nk (M-13) gerek plakalar oluturmaz ve E.Coli hcrelerini lisize edemez. Bylece bakterinin azalm bymesi nedeniyle bulank, amurlu yerler oluur. Faj DNAsnn klonlama yerinin ters akm ynndeki Faj DNAs blgesinde btnler oligonkleotid primerler sentezlenebilir. Klonlanm yabanc ksm ieren, bir kollu Faj DNAs izole edilir. Sentetik oligonklotidler ile hibridize edilebilir.

ekil 35. (M13) Faj ,hem bir kollu ve hemde iki kollu formlar olduundan Dideoksi Metodu ile klonlanm (DNA) paralarnn dizili sras analizi iin yararl bir vektr (tayc) dr. Ayrca (lacZ) geni iinde restrksyon enzimleri iin tanma yerleri ierir. Bu zellik yabanc (DNA) paralar ile araya sokulmu ksmlar ieren klonlarn seilmesini salar. Klonlarn yerine bitiii ile hibritleecek oligonkleotitler yeni sentez iin, ihtiya olan primerleri salar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

59

Bu ilem klonlanm DNAnn dideoksi sra analizi iin primer oluumunu (balama yeri) oluturur. Hemen hemen klonlanabilen btn DNA segmentleri bu genel metodu kullanarak dizili sras analizine tabi tutulabilir. Merdiven basama jel ilemi sadece 400 baz ifti uzunluuna kadar etkilidir. Bunlar daha byk blgelere sra analizleri st ste akan segmentlere aminoasit dizili sras analizne benzer ekilde st ste akan modellerin sra analizi ve yeniden yaplmas suretiyle belirlenir. st ste akan DNA segmentlerinin dizili sras analizinde iki yada daha fazla R.E kullanlr. DNA sra analizi konusundaki yakn zaman keifleri drt florosens boyay ierir. Her boyann dalga boyu farkldr. (505, 512, 519, 526 nanometre). Her bir 4 dideoksinkleotidler farkl boya balama yerine sahiptir. Yeni sentezlenen fregmentler izole edildikten sonra drt replikasyondan elde edilen rnler birlikte ayn poliakrilamid jelde elektroforeze tabi tutulur. Sonra jel argon lazerde taranarak boya moleklnn yerleri kesilip karlr. Bir aygt da renk zayflama yerlerini belirler ve direk olarak, dizili srasn otomatik olarak okur. Bu metod byk lde dizili analizini basitletirir. Bu yntem radyoaktif iaretleyici ihtiyacn hafifletir ve azaltr. ster dideoksi metodu, ister kimyasal metodla dizili sras analizi yaplr. Her iki yntem bir jelde yzlerce nkleotidi okumamz salar. Tm viral prokaryotik ve eukaryotik virus genomunun bylece analizi ve dizili sras belirtilebilir. Gilbertin Nobel dlnde dedii gibi, DNA molekl yaps zldke btn canl hcrelerin tm hcrelerinde esas olan unsurlar anlam olacaz. GEN KLONLAMANIN PRATK SONULARI TIP: Tpta genetik mhendislii ile nemli ilerlemeler salanmtr. te yandan genlerin nasl altna dair bilgiler, bu almalarla artmtr. te yandan rekombinant DNA metodolojisi gelitirilmi, daha nce eksiklii ekilen nemli unsurlarn bolca elde edilmesi salanmtr. Mesela inslin interforez byme hormonu, byme faktrleri, kan phtlama faktrleri, hepatit-B Herpes, kuduz gibi hastalklara kar alar gelitirilmitir. Genetik mhendislii hastalklarn tehis ve tedavisi iin Anti body retimini mmkn klmtr. nsan genomunun dizili sras analizi ile daha ileri dzeyde genlerin, eitli hastalklardan sorumlu genlerin yerlerinin belirlenmesi iin daha ayrntl bilgileri salayacaktr. Bugne kadar nemli genlerin yeri klonlanm ve dizili sras analizi yaplmtr. Ayrca R.F.L.P. tekrar ve P.C.R. ile eitli bireylerin yapsnn almalar yaplmtr. te yandan transgenik fare, klonlanm koyun olgusunun sonular taksonomik bakmdan yksek canllarnda klonlanabileceini gstermitir.

60

Bu teknolojinin insan hastalklarna uygulanma sreci henz balang halindedir. 1990da Milli Salk Enstits insanlarda gen terapisi fikrini onaylamtr. Agr combne bagsklk eksklg(SCID) hastalg adenozn deamnaz(ADA) enzm eksklgndendr. Normal ADA gen klonlanms plazmt tasyan etks retrovrus lar araclg le SCID hastasnn T hucrelerne verlerek bir ocuk infzyona maruz braklmtr. Daha sonraki tedavi baarl olmu ve ADA deer dzeyi arttrlmtr. Tedavilerileeksikliindeimmunsistemifonksiyonbozukluu, Adenosindeaminazdan sorumlu hcreler AIDS, hemofili, Sistik Fibrosis, eker gibi dier hastalklar belkide yakn gelecekte gen terapisi ile tedavi edilebilecektir. TARIM: Tarmda Pseudomonas syrngae adl bakteri modifiye edilerek bitkilerin dondan ar olmas maksad ile buz kristal formasyonunda ekirdek rol gren proteinle ilgili genetik bakmdan delasyon gsteren bitkiler zerinde allmtr. Bu dzenlenmi bakteriler baar ile normal olarak mevcut olanlar ile deitirilirse, s donma noktasna dtnde bitkide kolayca buz kristalleri ekillenmeyecektir. Dier bakteriyel projelerde Rhizobium melliloti de azot tespit yeteneinin arttrlmas bitki kklerini korumak iin Pseudomores fluoreker bcek toksininin sokulmas gibi uygulamalar biimindedir. Bu almalarda pamuk yuvarlak kurdu Dougles gvesi gibi deiik zararl eitleri ldrecek viral ve bakterial soylar gelitirmek amalanr. Bitki ve hayvanlar direk olarak genetik mhendislii ile dzenlenebilir. Bitkiler kuraklk ve virse dayankllk iin daha iyi kaliteli rnler genetik olarak dzenlenebilir. Mesela paralanan hcre duvarnn Polygalaktorinaz enzimi aktiviteleri azalm. Mesela domateste olgunlama ile Polygalaktorinaz enzim aktivitesi azalr ve hcre duvar krlr. Dolaysyla raf mr azalr. Byle domateslerde 1994de sata sunulmu, genetik olarak dzenlenmi domates olarak ilgi grmtr. Federal Gda ve la Dairesi 1994 sonbaharna kadar piyasaya sunulan yedi deitirilmi rn onaylamtr. Ayn ekilde eitli unsurlar bitki virslerine dayankl (sar bal kaba) olarak 1995de pazara girmitir. Halen genetik mhendislii ile dzenlenmi soya faslyesi ile msr pazara intikal etmitir. Evcil hayvanlarda hastalklara dayankllk ve byme iin genetik olarak dzenlenebilir. ENDSTR: Biyoteknolojinin endstriyel uygulamalar. Bakterilerin genetik olarak dzenlenmesi, toksik artklar paralayan bakterilerin oluturulmas. Ayn ekilde selloz enzimi ile mayalarn glikoz ve alkol retmesini, bu suretle yakt retimi, Alglerin mari kltrde (deniz organizmalar doal evrelerinde kltre alnmas) kullanm ile nemli gda ve dier unsurlar elde edilmesi. Gda endstrisinin daha iyi rn ve artk evrimi iin kullanmn kapsar. Sonda dizilim ile e btnler yapdaki paralar eleir. Eslenii olmayanlar ykama ile ayrlr. Lazer tarayc ipi okur ve yap belirlenir.

61

2- REME AMALI KLONLAMA

Bireyin klonlanmas tekniinden farkl olarak reprodktif (reme amal) klonlama tekniinde ama reme hcresine sahip olmayan bir bireyin ocuk sahibi olmasna yardmc olmaktr. reme hcresine sahip olmayan bir bireyden kast; ileri ya veya cerrahi mdahaleler sebebiyle yumurtalk rezervi tkenen, ila uyarsna kar yumurtalklardan yumurta elde edilemeyen veya cerrahi yol ile yumurtalklar alnm kadnlardr. Yardmc reme tekniklerinde gerekletirilen ilemler, ifte ait reme hcrelerinin laboratuar ortamnda bir araya getirilerek bir embriyo oluturulmasn hedefler. Eer iftten herhangi birisinden reme hcresi yani yumurta veya sperm elde edilemez ise, iftin yardmc reme teknikleri ile ocuk sahibi olmasna imkan kalmamaktadr. reme amal klonlama teknii de bu aamada devreye girmektedir. Kadndan yumurta elde edilemediine gre bir baka hcrenin kullanlmas gerekmektedir. Ancak yumurta hcresi, vcuttaki tm dier hcrelerden farkl olarak yar kromozom yaps (23) tamaktadr. Tm dier hcrelerde ise ift kromozom yaps (23 ift yani 46 kromozom) bulunmaktadr. Bu durumda byle bir hcrenin yardmc reme teknikleri amac ile kullanm mmkn olmayacaktr. Bu problemi zm u ekilde gerekletirilmektedir. Bir baka kadndan elde edilen bir yumurtann hcre ekirdei kartlr ve bu yumurta artk vericinin genetik zelliklerini kaybeder. Bu hcrenin meta faz II ad verilen blnme aamasnda olmas gerekmektedir. nk bu aamada hcre ierisine yerletirilecek bir ekirdein blnmesini salayacak potansiyeli tamaktadr. Tedavide olan kadndan elde edilecek herhangi bir hcrenin (cilt hcresi gibi) ekirdei kartlarak, meta faz II aamasndaki bo yumurta hcresine nakledilir. Meta faz II aamasndaki yumurta hcresi, ekirdein blnmesini ve sahip olduu ift kromozom yapsn yarya indirmesini salar. Ayn yumurta hcresinin geliimindeki gibi fazla kromozom yaps polar cisim ad verilen bir yapya dntrlerek hcre dna atlr. Sonuta bir cilt hcresi kullanlarak, istenilen ekildeki kromozom yapsna sahip bir yumurta hcresi elde edilir. Yeni oluturulan yumurta hcresi ve einin spermleri kullanlarak mikroenjeksiyon ilemi ile embriyo elde edilir. Bu embriyonun yar klonlanm bir embriyo olduu kabul edilebilir. Yumurta hcresinin ierisine yerletirilecek olan vcut hcresi erkekten de alnabilir. Byle bir durumda, erkekten elde edilecek hcre ekirdei kullanlarak bir baka eit reme hcresi oluturulur. Bu hcre kadna ait yumurta hcresine mikro enjekte edilerek ve baz uyarlar gerekletirilerek embriyo geliimi salanabilir. Bu yntem de henz sadece deneysel amalarla gerekletirilmektedir. eitli trde hayvan almalar srdrlmektedir.

62

3- YLETRME AMALI KLONLAMA

Klonlama zerinde alan aratrmaclarn bazlarnn amac da, kk hcre aratrmalarnda kullanlmak zere kk hcre kayna salamak. Klonlama yoluyla oluturulan embriyolardaki kk hcreler alndktan sonra bu embriyolarn yok edildii bu almalara iyiletirme amal klonlama ad veriliyor. yiletirme amal klonlamada ekirdek transferi yntemiyle klonlanm embriyolardaki kk hcreler yaltlarak, doku ve organ nakillerinde kullanlmak zere malzeme salanacak. Ancak kk hcrelerin aktarlaca blgelerdeki hcrelere nasl dnecei konusunda daha pek ok almaya gereksinim var. Belli blgelerdeki zellemeleri oluturacak kk hcrelerin nasl tetiklenecei ya da belli ilevleri gerekletirmelerinin nasl salanaca heniz tam anlalm deil. Aratrmaclara gre klonlama teknolojisinin iyiletirme amal olarak kullanlmasnn olumlu yn, insanlarn kendi hcrelerinden dokular yada organlar elde edilmesini salayacak olmas. Bylece aktarlan dokularn yada organlarn reddedilmesi sorunu ortadan kalkcak.

Tedavi amal klonlamada uygulanan teknoloji aslnda bireyin klonlanmas iin gerekletirilen sistemin aynsdr. Yine bir bireyden alnan hcre klonlanarak, birebir ayn genetik zelliklere sahip bir kopya yaratlmaktadr. Ancak burada nemli fark tekil eden nokta udur: elde edilen embriyo bir kadnn rahmine transfer edilmez. Aksine blastosist aamasna ulaana kadar laboratuar artlarnda geliimi salanr. Bu aamada embriyonun ierisinde kk hcrelerinin barndran, her trl farkl hcre ve dokuya dnebilme potansiyeline sahip, multipotent hcreler olumaktadr. te teraptik klonlamada hedef bu hcrelerin elde edilmesi ve bu hcrelerden farkl dokular gelitirilerek, tedavi amac ile kullanlmasdr. Kk hcreleri, blastokist aamasna ulaan bir embriyonun i hcre ktlesi (Internal cell mass ICM) bnyesinde yer alrlar. Aadaki ekillerde blastokist aamasndaki bir embriyo ve ICM yaps grlmektedir. Klonlama sonrasnda blastokist aamasna ulaan embriyonun ierisinde yer alan multipotent hcreler, genetik olarak klonlanan bireyle ayn zellikler tamaktadr. Bu hcrelerden gelitirilecek olan dokular, klonlanan kii iin bir yedek doku veya organ tekil edecektir. Bu klonlanm dokunun en nemli zellii, tamamen kiinin genetik yapsnn aynsn tad iin herhangi bir doku reaksiyonu, dokunun vcut tarafndan reddedilmesi (rejeksiyon) riskinin bulunmamasdr. Bu problem gnmzde organ veya doku naklinde karmza kan en nemli problemdir. Bu problemin zlmesi, tpta byk bir aama kaydedilmesi anlamna gelir. rnein bir Parkinson hastasna, kendisinden klonlanm bir sinir sistemi dokusu nakli yaplarak tedavisi salanabilir. Keza diyabet hastasna kendisinden klonlanm pankreas hcreleri transplantasyonu yaplabilir. Bu konudaki almalar byk bir hzla srdrlmektedir. Klonlanan kk hcrelerinden sinir, kas, kalp kas, pankreas, kemik ilii dokular retilebilmitir. Kk hcre teknolojisi gelecekte pek ok hastaln tedavisi iin bir mit oluturmaktadr.

Bu almalar ayn zamanda baz genetik hastalklarn tedavisi imkann da tanyabilir. Bilim adamlar klonladklar hcreleri istedikleri ekilde programladklar taktirde bu hcrelerde, vcutta eksik olan ve eksiklii sebebiyle hastalklarn ortaya kmasna neden olan baz maddelerin yapm salanabilir. 63

rnein bu ekilde talasemi (akdeniz anemisi) gibi kanda oksijenin tanmasnda problem yaratan bir hastalk iin salkl hemoglobin reten kemik ilii hcreleri oluturularak tedavi salanabilir. Klonlama teknikleri uzun sredir botanik ve veterinerlik sahasnda kullanlmaktadr. Klonlama teknii sayesinde soyu tkenmekte olan hayvanlarn oaltlmas veya biyo eitliliin korunmas mmkn olabilir. Benzer ekilde hayvanlarda grlen baz hastalklarn (Deli dana veya scarpie gibi) tedavisinde de klonlama tekniinden yararlanlmasna allmaktadr. Teraptik klonlama konusundaki en nemli tartma noktas, bir canlnn hayatn kurtarmak veya tedavi etmek iin bir baka canlnn (embriyonun) hayatna son vermenin ne kadar etik ve ahlaki olduu konusudur. Bir dier nemli nokta ise dier bilim dallarnda olduu gibi teraptik klonlamann da organ nakli amac ile suistimal edilmesi ve kt amal kullanmdr. Bu ve bunun gib i konular, k lonlamann daha zerinde konuulacak, tartlacak ve karara balanacak ok fazla soru ve kmazlar ierdiini gstermektedir. Bilim alanndaki her yeni gelime zaman ierisinde bu szgelerden gemitir. Ayn mekanizmann klonlama iinde ilemesi ve bu tekniin insan salna faydal ekilde kullanm iin dzenlenmesi kanlmazdr.

KLONLAMANIN SPER STARI DOLLYNN KOPYALANMA AAMALARI VE SONRASI

1997 ylnda ngilteredeki Roslin Ensttisinden lan Wilmut ve arkadalar klonlanm bir koyunun 1996 ylnda dnyaya gelmi olduunu akladlar. Aratrmaclar bunu aklamak iin, Dolly olarak 64

adlandrdklar koyunun salkl bir biimde gelitiinden emin olmak istemilerdi. Dolly, yetikin bir memeli canlnn kaltsal malzemesinin, yeni ve onunla e bir canl yaratmada kullanlmasnn ilk rneiydi. Bu gelimeden sonra bir daha hibir ey eskisi olmad. Dollyden bu yana, klonlama dnyasnda birok ilerleme gerekleti. Dnyann farkl yerlerindeki laboratuarlarda aratrmaclar koyunun yan sra fare, inek, kei, maymun, kesi gibi baka canllar da klonlamay baardlar. (biltek)

Son gelimelere imzasn atan ekip, genlerin laboratuar koullarnda biimlendirilmesinin ardndan gen transferi yntemi ile koyun bedeninde, istenilen zelliklerdeki genlerin (DNA molekl) retilebilmesini olaan bir hale getirdi. Sz konusu deneyde, ihtiya duyulan molekllerin koyunun tm hcrelerinde deil, sadece st bezlerinde sentezlenmesini hedef alyordu. Bu nedenle koyunun ila fabrikas olarak deerlendirilmesini beraberinde getirdi. Dolly baarsnn en nemli noktas bu gerekeye dayanmaktadr. Gen transfer yntemi, slah almalar sonucu elde edilen verimli rnn nitelii deimeksizin seri olarak retilmesi amacndadr. Dr, Wilmutun gerekletirdii deney; yetikin bir dii koyunun bedeninden alnan hcrenin (somatik bir hcrenin) ekirdeinin, mikron birimi inceliindeki bir enjektr inesi yardmyla vakumlanp, baka bir erkek koyuna ait, ekirdei alnm bir yumurtaya enjekte edilip oluturulan suni hcrenin, nc bir dii koyunun rahmine yerletirilmesidir. nc koyun, tp bebek ynteminde olduu gibi d ortamda zel olarak retilmi hcrenin geliimini salayabilecei biyolojik ortamdr. Adn, nl arkc Dolly Partondan alan kuzu Dolly, isim annesinin deilse de, DNA annesinin genetik ikizi. Dolly, sevimli grnyle kamuoyunun sempatisini kazanm ve tm bu sre ilgin bir bilimsel oyun olarak sunulmusa da, gerekte deney olduka iyi belirlenmi bilimsel ve maddi hedefleri olan sabrl bir almann rndr. Bu almalarn yanklar gerek gnlk gazete ve magazin dergilerinde ilk sayfadan bizlere ulatrlm, basit emalarla anlaymza sunulmutu. skoyal ekibin gerekletirdii klonlama deneyinin, dnyann pek ok blgesine dalm saysz standart biyoteknoloji laboratuarnda kolayca gerekletirilebilecei syleniyordu. Yine de uygulanan yntemin yeniden uygulanabilmesi pek de pratik ve kolay deildir. Ekibin baars ve nceki saysz benzeri deneylerin baarszl, Wilmutun verici koyundan alnan hcre ekirdeiyle, kullanlan embriyonik hcrenin frekanslarn ok hassas biimde aktrabilmesine dayanyor. Bu yntemle aratrmaclar, yetikin ekirdein genetik saatini sfrlamay, tm geliim srecini baa almay becerebilmilerdir. Milyarlarca sayda hcreden olumu bir bedenimiz var. Bu hcrelerin milyonlarcas her saniye blnmeyi srdrerek beden geliimini devam ettiriyor. Bunun yannda ypranm hcreleri de yeniliyor. Somatik hcre adn verdiimiz yapsal hcrelerde meydana gelen fizyolojik ve morfolojik deiimler genetik intikal ile bir sonraki nesile aktarlamamaktadr. Dolaysyla, biyolojik bedenimizde meydana gelebilecek mutasyonlarn etkileri populasyon havuzunda bir deiime neden olmaz. Ancak bu durum reme hcrelerinde farkl bir seyirde ilerler. Gerekleebilecek mutasyonlar, daha sonraki frekanslarda etkisini gsterecektir. Koyun ve insan hcrelerinin de dhil olduu gelimi hcreler (ekirdei olan hcreler = karyotik hcreler), farkl geliim evreleri ihtiva eden dngy takip etmektedirler. Bu dngy, interfaz evresi (blnmenin olmad hazrlk evresi) ve belirgin biimde blnmenin gerekletii mitoz evrelerine ayrmak mmkn. Hcre, yaam dngsnn % 90 kadarn interfaz evresinde geiriyor. Aslnda, bu duraklama evresi grnd kadar sakin deil. Hcre, tm bileenlerini blnmeye hazrlar. Hcrenin 65

yaam dngs ana evreye ayrabiliriz : G1 evresi, hcrenin DNA dndaki tm komponentlerinin (organel) oald bir dinlenme dnemi, S hcredeki birim DNAnn miktarnn ikiye katland (replikasyon) evre, G2 ise, hcre ii gelimenin tamamlanp, hcrenin bir zar yardmyla blnp, iki eit miktardaki hcreleri oluturduu evredir. Bu evre mitoz olarak da isimlendirilebilir. Hcrelerin hangi evreyi ne kadar srede tamamlayacaklar genetik program dhilindedir. Bu sre bir canldaki tm hcreler iin ayndr. Ani evresel koul deiiklikleri (besleyici maddelerin miktar birden bire minimum dzeye drldnde) hcreleri G1 evresinde belli bir kritik noktaya kadar indirgenebiliyor. Sz konusu kritik nokta alrsa, evresel koullar ne ynde gelise de artk DNA replikasyonunun n alnamyor. Bu noktann kontrol altna alnabilmesi, Wilmut ve ekibinin baarl bir klonlama gerekletirebilmelerinin altn anahtar olmutur. Burada bir parantez aarak G1, S, G2 ve M evrelerinin denetim altna alnmas, hcrenin yaam dngsn olduu kadar, zellemesini de dizginlemitir. Farkllama evresine giren hcreler geliim evrelerinde, genetik program gereince beyin, kas gibi hcrelere dnrler. Wilmut ve ekibi Dollyi klonlayncaya kadar bu srecin irreversible (geriye dnmsz) olduunu, bir baka deyile, bir defa kas hcresi olmaya karar vermi bir hcrenin yeniden programlanamayacan dnyorlard. te bu deneyi baarl klan unsur, genetik saati sfrlamak, yani farkllamann nne geebilmektir. Dier aratrclarn bunu baaramamalarnn nedeni, kullandklar somatik hcrelerin ekirdeklerini, S veya G2 evrelerindeki konak hcrelerle fzyona uratmalaryd. Eski teorik bilgilere gre, bu yntemin ie yaramas gerekiyordu, nk ekirdein mitoza yaklam olmas avantaj olarak grlyordu. Ancak bu denemelerde, iler bir trl yolunda gitmedi. Kaynatrmadan sonra, hcre fazladan bir para daha mitoz geiriyor ve yararsz, kopuk kromozom paralar meydana geliyordu. Bu korsan genler, geliimin normal seyrini srdrmesi iin ciddi bir engel oluturuyordu. Wilmut gerekletirdii deneyde; anneden ve babadan gelen gen setlerinin karm evresi olan G0 ( zigot oluma evresi) evresini askya alp, bu aamadaki ekirdei, fzyona uratt. Fzyon sonucu oluan yeni hcre, normal besin koullar ve hafif bir elektrik oku etkisiyle olaan oalma srecine girmiti. Zigot, anne koyunun rahmine yerletirilip, gerekli hormonlarla normal hamilelik sreci balatt. Bu deney hakknda bilinenler, yukarda kaba hatlaryla anlatlanlarla snrl. Srecin duyurulmayan kritik bir evresi varsa, bu ticari bir sr olarak kalacaa benziyor. Embriyolog Jonathan Slack, ok daha temel pheleri ne sryor aratrmaclar, yumurta hcresindeki DNAlar tmyle temizleyememi olabiliriler. Dolaysyla Dolly, sradan bir koyun olabilir. Slack, alnan meme hcresinin henz tamamen zellememi olabileceini, byle vakalara meme hcrelerinde, bedenin dier ksmlarna gre daha sk rastlanlabildiini de ekliyor. Zaten Wilmut da, bedenin dier ksmlarndan alnan hcrelerin ayn sonucu verebileceinden bizzat pheli. rnein, byk olaslkla kas veya beyin hcrelerinin asla bu amala kullanlamayacaklarn belirtiyor. stne stlk, koyun bu deneylerde kullanlabilecek canllar arasnda ayrcalkl bir rnek. Koyun embriyolarnda hcresel farkllama sreci zigot ancak 8- 16 hcreye blndkten sonra balyor. Geleneksel laboratuar canls farelerde ayn sre ilk blnmeden itibaren gzlenebiliyor. nsanlarda ise ikinci blnmeden itibaren balyor. Bu durum, ayn deneyin fare ve insanlarda baarl olamamas olasln beraberinde getiriyor.

66

Dile getirilen ak noktalardan bir de, hcrelerde DNA ieren tek organelin ekirdek olmay. Kendi DNA sna sahip organellerden mitokondrinin zellikle nem tad dnlyor. Memeli hayvanlarda mitokondriyal DNA, embriyo geliimi, srasnda sadece anneden alnyor. Her yumurta hcresi, farkl tipte DNAlara sahip yzlerce mitokondriyle donatlm durumda. Bu mitokondriler zigotun blnmesinin ileri evrelerinde, embriyo hcrelerine dengeli bir biimde dalyor. Ancak, canln daha ileri geliim evrelerinde, bu denge belli tipteki DNAlara doru kayabiliyor. Dolaysyla birim hcredeki mitokondri DNAs / ekirdek DNAs oranndaki sapmalar Parkinson, Alzheimer gibi hastalklara zemin hazrlar. Baz aratrclarda, Dollynin ilerleyen yalarda salk problemleri yaayabilecei dncesini yaratt.

KLONLAMANIN YARALARI
1. NESL TKENMEKTE OLAN TRLERN KLONLANMASI
Nesli tkenmekte olan trlerin klonlanmas herkese ok ekici gelmitir. Avustralyadan bir proje 153 yldr alkol iesinde kalan bir rnekten Tazmanya Kaplann klonlamay amalanmaktr. Bir baka aratrma grubu Sibirya buzullarnda bulunan 20 000 sene yal bir dokudan mamut klonlamay amalyor. Fakat bu rneklerde DNA paralar halindedir ve tam genomu tekrar bir araya getirmek imkanszdr. stelik ekirdek transferi teknii ta bir ekirdei ve fonksiyonel kromozomlar gerektirmektedir. Bundan dolay da sadece DNA yeterli olamamaktadr. Klonlama iin bariz gerekli dier nesnelerden uygun oositler ve implante edilecek ana rahmidir. Nesli tkenmekte olan trlerin klonlanmas akraba olan ve daha sk rastlanan hayvanlarn yumurta hcreleri ve rahimleri kullanlarak yaplabilir. Fakat bu durumlarda da yumurta hcrelerinin ve rahimlerin daha yakn akraba olan trlerden alnmas hamileliin sonuna kadar baarl olmas iin gereklidir. Mesela panday klonlamakla kurtarmak bu adan ok zor olacaktr, nk uygun yumurta hcreleri ve uygun rahim bulunabilmesi iin yakn akrabas yok.

2. FTLK HAVYALARI RETMNDE KLONLAMA

ekirdek transferi prensip olarak en iyi iftlik hayvanlarnn sonsuz miktarda kopyasn yapmak iin kullanlabilir. Pratikte sadece sr ve domuzlarn klonlanmas yaplacaktr nk sadece bu hayvanlarn klonlanmas karl olacaktr. Klonlanm elit inekler ABDde her biri 40 000den fazla fiyata alc bulmaktadrlar. Fakat bu onlarn gerek fiyatndan ziyade yenilik olduklar iin kan fiyattr. Etkili olabilmesi iin klonlamann retim programna entegre olmas gerekir ve genetik eitlilii korumaya gerekli dikkatin gsterilmesi de zorunludur. Klonlarn salkl olduunu ve hakikaten beklenen fayday ve baary gsterdiklerini ispatlamalar gerekir. Buna ilave olarak tekniin havyalarn refahnn bozmad gsterilmelidir.

3. NSAN TEDAV EDC PROTENLERNN RETM

nsan proteinlerine bir ok hastaln tedavisi iin ok byk gerek duyulmaktadr. Bazlar kandan izole edilebilirken bu ilem hem ok pahal hem de AIDS veya Hepatit C bulama riski de sz konusudur. Proteinler hcre kltr ortamnda retilebilir, fakat bu yntem de ok pahal ve verimi ok dktr. ok byk verimle proteinler bakteri veya mayada retilebilir. Fakat bunlarda da proteinlerin saflatrlmas ok zor, proteinlerin gerekli post-translasyon deiimleri de yoktur ve dolaysyla gerekli olan in vivo etkileri olmayabilir. 67

Bunlara karn dzgn post-translasyon deiimleri olan insan proteinleri transgenik koyun, kei ve ineklerin stnden 40gr/L miktarnda ve nispeten daha ucuz bir ekilde retilebilir. PPL Therapeutics firmas, alfa-1-antitripsini, sistik fibrosis ve amfisemann tedavi edilmesi iin 3 klinik deneme gerekletirmi ve sonunda retebilmilerdir. Alfa-1-antitripsin geni koyunun zigot hcresine aktarlarak transgenik koyun retilmitir. Daha sonra bu koyun ve dier transgenik st hayvanlar kopyalanarak genin yeni kopyalarda devam etmesi sonucu istenilen proteinin reten tek tip canllar yaratlabilmitir. ekirdek transferi teknii insan genlerinin genom anlam kazanmasn arttran spesifik bir noktaya sokulmasna izin verir. ekirdek transferiyle transgenik hayvan oluturulmasnn pronkleer enjeksiyonun zerinde dier byk avantaj, denek havyalarn yarsndan aznn kullanlmasdr. Ayrca, dln cinsiyetini de belirleyebilmek, retim stokunun oluturulmas iin gerekli zaman nemli derecede azaltmaktadr.

KLON CANLILARIN SALII

Doumdan nce Bedensel hcre ekirdei aktarm, Dolly den sonra baka memeliler zerinde de denendi; klonlamann tekrarlanabilir olduu gsterildi. Koyunlardan sonra domuzlarn, keilerin, fare, inek ve kedilerinde klonlanabildiini grdk. Ancak bilim adamlar hala bedensel hcre ekirdek aktarm srecini tam anlam deiller. Klonlama uygulamalarnda aratrmaclarn baarsz olma ans %97. Klonlanan her canl, yzlerce hatal denemeden sonra ortaya kyor. Klonlama almalarnda embriyolar genellikle, tayc anneye aktarldklar blastosit aamasna gelene kadar laboratuarda olgunlatrlyor. te bu srete klonlanm embriyonun iinde bulunduu kimyasal orba nn karm iyi tutturulamayabiliyor. Olaslklardan bir bakasysa laboratuardaki almalar srasnda embriyonun sarsnt geirmesi. Klon canllarda sk rastlanan byk bebek sendromu nun nedeninin bu olabilecei dnlyor.

Doumdan Sonra
Laboratuarda her ey yolunda gitse de klonlama uygulamasnn yolunda gitmemesine neden olan etkenler var. Normal bir eeyli reme srasnda, yumurta ve sperm hcreleri yepyeni bir canl oluturabilecek kaltsal donanma sahiptir. Klonlanm embriyolardaysa bu donanmn baz yerlerinin eksik olduu anlald. Salkl grnen klon canllarn bile genlerinin etkinliklerinde ciddi anormallikler olduu anlalm. Klon canllarn baz genlerinin etkinlemesi gereken zamanlarda etkinlemediini ve etkin olmamas gerektii zamanlarda etkinletiini gsteren aratrmalarda var. rnein Dollynin kk yata eklem iltihaplanmasna yakalanmas bununla aklanyor. Klon 68

canllarn erken yalanmas da baka bir sorun. 1999 ylnda Dolly nin biyolojik yann kronolojik yandan daha fazla olduu ortaya kmt. Bunun telomerlerinin uzunluundan kaynakland sanlyor. Aratrmaclara gre Dolly nin telomerleri kendisi gibi yandaki bir koyunun telomerlerinin olmas gerektii boydan ok daha ksa; hatta tam olarak, Dolly nin klonlanm olduu 6 yandaki koyununkiler kadar.

BEDEN HCRELERNNKROMOZOMLARI NASIL OLUYOR DA AKTARILDII YUMURTA HCRESNN KROMOZOMLARI GB DAVRANMAYA BALIYOR?
Bir hcrenin ekirdeini programlanmasn, hcre sitoplazmasyla ekirdekteki genlerin arasndaki etkileimli bir sretir. Sitoplazma ekirdee, hangi genlerin etkinleip hangilerinin etkinliinin biteceini, yani hcrenin hangi proteinleri retileceini belirleyen sinyaller gnderir. Hcre zelleip totipotent olma zelliini yitirince, birok proteini retemez duruma gelir. Bedendeki herhangi bir proteini retecek genetik donanma sahip olduu halde, yalnzca hcrenin gereksinim duyduu proteinleri retir. te bedensel hcre ekirdei aktarmnda hcrenin geliimsel srecinin embriyonun ilk aamasna alnabilmesinin nedeni, ekirdein aktarld hcrenin bir yumurta hcresi olmas.

KLONLANMI CANLILAR VERC HCRENN ALDII CANLININ TAM BR KOPYASI MI?

Bedensel hcre ekirdei aktarm ynetiminde, ortaya kan canlnn kromozomlar yalnzca verici hcreden geliyor. Hcredeki genetik malzemenin byk ounluu hcre ekirdeinde bulunuyor; kk bir blmyse, hcrede ekirdekten ayr bir yap olan mitokondride. Yani mitokondrinin kendi DNA s var. 1999 ylnda klonlanm 10 canl (Dolly le birlikte 10 koyun) zerinde yaplan bir aratrma bu canllarn mitokondrilerinin %99,5inin alc hcreden geldii sonucuna varmlar. rnein Dollynin mitokondrisindeki 37 gen, ekirden DNA snn alnd verici hcreden deil, DNA nn aktarlm olduu yumurta hcresinden geliyordu. Mitokondri, bedendeki tm hcrelerde nemli bir role sahip olduu iin, bu durum klonlarla, klonlanm olduklar canllar arasnda nemli fiziksel farkllklara yol aabilir. Aratrmaclara gre ortaya kacak fiziksel farkllk insanlarda szgelimi yetenekli bir atletle, spora hi yatknl olmayan baka bir insan arasndaki farkllklar kadar bile olabilir. Hayvanlarda denenen klonlama insanda da uygulanmaya allmaktadr. Ama bir ok lkede insan klonlamas yasaklanmtr. Yine de, klonlamadan elde edilen yeni bilgiler ile hcre ekirdeinin transferi gibi teknikler reme tbbnda bu gn karlatmz nemli problemlere bir zm olarak grlmektedir. Klonlamada esas olan, genetik materyalin yani kromozomlarn izolasyonu ve bununda nukleusu (ekirdei) karlm bir kadn yumurta hcresi (oositi) ierisine nakledilmesidir. Dii yumurta hcresinin ekirdei, bir cam mikropipet kullanlarak mikromaniplasyon ile ya da kimyasal 69

tedavi ile karlabilir. ekirdei karlm bu hcre ierisine daha sonra, kopyalanmas yaplacak kiinin bir hcresinin genetik materyali enjekte edilir ve elektrik stimlasyonu verilerek veya viral ajanlar kullanlarak, ekirdei karlm alc yumurtas ile bu genetik materyalin birlemesi, kaynamalar salanlabilir. Arkasndan, embriyo geliecek ve gelien embriyo da kadnn rahmi ierisine nakledilerek gebelik salanabilecektir. Btn bu ilemler teorik olup, henz hayvan deneyleri yaplmaktadr ve insanlarda pratik olarak uygulanmamaktadr.

NSAN KLONLAMA
Klonlama bilim tarihinde en ok tartlan almalardan biri olmay baard. Baz bilim adamlar klonlamann insanlk iin byk bir gelime olduunu ileri srerken, bazlar da bu almalar insanlk ayb olarak grp, kesinlikle engellenmesi gerektiini dnyor. Bu dncelere sahip klonlama kartlarnn yapt almalar ile bata Avrupa lkeleri olmak zere bir ok lke snrlar ierisinde klonlama ile ilgili almalarn yaplmasn yasaklad. Klonlama yanllar ise, klonlamann kanlmaz bir bilimsel gerek olduunu ve yaplan yasaklarn bilimi yavalatmaktan baka bir ey olmadn savunarak, her ne pahasna olursa olsun almalarna devam edeceklerini akladlar. Bu tartmalar tm bilim dnyasn sard ve bir ok bilimsel kurulu klonlama zellikle de insan klonlama almalarnn ahlaki ve bilimsel bir yanl olduu konusunda karara vard. Fakat insan olunun bitmez tkenmez merak duygusunu engellemek kolay deil. Baz firma ve bilim adamlar izinli yada izinsiz bu almalar srdryor. Klonlanm insan aslnda ok yabanc olduumuz bir terim deil. Tek yumurta ikizi olarak adlandrlan ikiz eitleri (duruma gre z ve drdz de olabilir) aslnda birbirlerinin doal yoldan klonlanm halleridir. Anne rahminde bir zigot blnmesinin ilk aamalarnda her hangi bir nedenle iki ayr hcre oluturursa, ayn DNA'ya sahip iki ayn canl dnyaya gelir ve dnyaya gelen bu iki canl birbirinin genetik kopyasdr yani klonlanm halidir. Normal doumlarn yaklak %1.3nde bu olaya rastlanr. Yapay klonlama ise dnyaya gelecek canlnn genetik zelliklerinin (DNA'snn) dardan mdahale ile kendi trnden baka bir canlnn DNA's ile ayn olmasnn salanmasdr. Daha detayl anlatacak olursak; normalde insanlar eeyli reme sonucunda dnyaya gelir. Eeyli remede anne ve babann reme hcrelerindeki DNA' lar birleerek yeni ve kendisine has zellikler tayan bir DNA olutururlar. Yani oluan yeni birey baz ufak benzerlikler dnda anne ve babannkinden bamsz bir genetik yapya sahip olur. Klonlama sonucunda ise eeyli reyen canl bir nevi eeysiz reme gerekletirmi olur. Yani oluacak birey sadece annenin yada sadece babann DNA'sn tar. Bu nedenle oluan birey, DNA's kullanlan bireyle ayn genetik zelliklere sahip olur, yani yeni birey anne yada babann kendisinden kk bir tek yumurta ikizi olarak dnyaya gelir ve normal tek yumurta ikizlerinde olduu gibi d grnleri birebir ayndr. Klonlama iin en ok kullanlan ynteme "ekirdek transferi yntemi" dir. Teoride basit gibi grnen bu yntem pratikte ok byk zorluklar kartmaktadr. Baar yzdesi ok dk olan bu yntem sonucunda doan bireyde bir ok salk sorunu ile karlalmaktadr. Klonlama iin kullanlan "partenogenez" gibi dier yntemlerin hibiri ile canl bir bireyin dnyaya gelmesi salanamamtr. Dier yntemlerle canl bir birey olumas teorik olarak da mmkn deildir.

70

Dollynin klonlanmasnda ekirdek transferi ynteminden yararlanlmtr. Deneyde kullanlan 277 yumurta hcresinden yalnzca 29 tanesi blnme aamasn tamamlayabildi ve bu yumurtalar farkl koyunlarn rahimlerine yerletirildi. Koyunlardan 13 tanesi gebe kald. Sonuta ise bir tek baarl doum gerekleti. Dnyaya gelen bu koyuna Dolly ad verildi. te klonlama tartmalar da bu noktada alevlendi. Dolly'nin doumunu klonlamada bir milat olarak gren baz bilim adamlarnn insan klonlama almalarna baladklarn aklamalar zerine klonlama kartlar da kar almalara balayarak klonlama almalar aleyhinde ciddi yaptrmlar getirilmesini saladlar. Tm bu engellemelere ramen 26 Kasm 2001'de Advanced Cell Technology (ACT) adl firmadan ilk klonlanm insan embriyosu haberi geldi. ACTnin yapt aklamaya gre, yaplan deneyde toplam 19 yumurta hcresi kullanld ve hcrelerden sadece 3 tanesi blnme aamasna gelebildi. Bu hcreden 2' si 4, 1i de 6 hcre oluturduktan sonra ld. nsan klonlama konusunda yaplan bu ilk resmi aklama byk ses getirdi. Fakat bir insan embriyosundaki genler ancak 4-8 hcre oluturduktan sonra kendisini gstermeye balyor. Bata ACT olmak zere klonlama yaptn duyuran hi bir firmann henz 8 hcreden byk bir embriyo elde edememi olmas, baz bilim adamlarna gre insan klonlama almalarnn henz baarya ulalamadn gsteriyor . Klonlama almalar yapan ve yapmaya devam eden bilim adamlarnn ou bu almalar yeni bir birey dnyaya getirmek iin deil de sadece tedavi amal kullanlacak kk hcreleri retmek iin srdrdklerini belirtiyorlar. Tedavi amal klonlama almalarda ama klonlama sonucunda kk hcre elde etmek. lk hcre blnmesinden yaklak 5 gn sonra yani embriyonun yaklak 100 hcre oluturacak kadar blnmesi ile oluan ve bakalaarak 200 deiik vcut hcresine dnebilen bu hcrelere kk hcre ad verilir. Bu hcrelerin bir ksm organlar bir ksm ise kan, sa, trnak ve deri gibi vcut blmlerini olutururlar. Klonlama ile kk hcre elde etmeyi amalayan bilim adamlar bu kk hcreler yardm ile birok hastala zm bulunacan ve daha ileriki dnemlerde yine bu hcreler yardm ile organ retimi ve nakli yaplabileceini iddia ediyorlar. Fakat burada gz ard edilmemesi gereken ey, kk hcre elde etmek iin embriyonun ldrlmesi gerektii gereidir, bir canlnn hayatn kurtarmak ya da salk sorununu gidermek iin baka bir canlnn hayatna son vermenin ne kadar ahlaki olduu tartma konusudur.

Klonlama konusunda iine dlen en byk yanl doacak canlnn klonlanan canl ile ayn kii olacann sanlmasdr. Bu cahilce ve ok byk bir yanlgdr. Klonlama yntemi sonucunda dnyaya gelen canl sadece fiziksel grn olarak genleri kullanlan canlya benzer ve bu benzerlik yukarda da anlattmz gibi doal bir klonlama ekli olan tek yumurta ikizliinde grlen benzerliktir. Yani doan yeni birey ile genleri kullanlan birey tek yumurta ikizlerinde olduu gibi dnce ve ruh olarak tamamen farkl kiilerdir. Bu nedenle klonlamann yaradl gerei ve kader ile ters den baz genetik faktrler ayn ekilde doacak yeni bireye aktarlm olur. Bu da klonlama kartlarnn tepki gsterdii noktalardan biridir.

Klonlama tedavi amal olarak dnldnde insanda iyi izlenimler braksa da ie insan ve insann iinde tad hrslar girdiinde ok tehlikeli boyutlara ulaabilir. rnein bir canlnn baz organlar (kalp,cier gibi) hasar grdnde baka bir canlnn organ o canlya taklamaz, DNAlar uyumad iin organ hasar grm canlnn antikor sistemi bu organ kabul etmez ve dolaysyla bu tr vakalarda sonu lmdr. Fakat organ hasar gren canlnn herhangi bir hcresi kullanlarak yaplan klonlama sonucunda dnyaya gelecek bebein DNAs organ zarar grm olan canl ile uyum gsterir ve organ 71

nakli gerekleebilir. te bu noktada insann iindeki para hrs gz nne alndnda, denen para karlnda birok hasta insann klonlarnn sadece organlar alnmak iin dnyaya getirebilecei gerei ortaya kar. Klonlama sonucunda doan ve organ alnan canl doal olarak lrken, organ hasarl olan birey paras sayesinde bir sre daha yaayabilir. Bu tr bir olay tam bir ahlak kntsdr ve ne kadar yasa karsa ksn ya da ne kadar nlem alnrsa alnsn bu olayn nne tam olarak geebilmek mmkn deildir. Gnmzde de birok bbrek kaak yollardan satlmaktadr. Fakat hibir kanun ya da yasa bu olay tam olarak ortadan kaldramamtr. te klonlamann dnlmesi gereken ve asla gz ard edilemeyecek bir yz de budur. Bu ve benzeri dncelerle yola kan bir ok bilim adam ve bilim kuruluu klonlama almalarnn kesinlikle durdurulmas gerektiini savunmaktadr. Ve yine ayn duyarllk ile yaklaan birok gelimi lke snrlar ierisinde her trl klonlama almasn yasaklamtr. Bu tartma daha ok uzayacaa benzer, ahlaki deerleri savunan bilim adamlar m yoksa klonlama kanlmaz bir bilimsel gerektir diyen bilim adamlar m galip gelecek, bunu zaman gsterecek.

KEND ORGANINI KENDN YAP

Bir hastann kendi dokularn kullanarak yeni organlar retmesi, kimsenin dleyemeyecei kadar kolay olabilir. Bilim adamlarna bu gveni veren, yetikin beyin hcrelerini kolaylkla kan haline dntrebilmeleri. imdiye kadar hcrenin kimliinde bylesine kkten bir deiikliin, ancak hcre ekirdei nakliyle gerekletirebilecei sanlyordu. Medyatik koyun Dolly, bu yolla kopyalanmt. Bu yntem, bir yumurta hcresinden kendi genetik malzemenin karlarak, yerine yetikin bir hcrenin ekirdeinin yerletirilmesini ieriyordu. Oysa imdi, bilim adamlar, bu i iin fare beyninden alnan sinir kk hcrelerinin hayvann kemik iliine naklinin yeterli olacan sylyorlar. Eer ayn ey insanlarda da gerekleirse, hibir doku uyumu sorunu olmakszn snrsz bir yedek organ deposuna kavumu olacaz. ki yl ncesine kadar, embryonik kk hcrelerinin biim deitirerek canl dokularndan birine (rnein gz, beyin ya da trnak) dnt uzmanlama srecini geriye dndrmenin olanakl olamad sanlyordu. Ancak skoyann Edinburgh kenti yaknlarndaki Roslin Enstitsnde Dollyi kopyalayan ekip, yetikin hcrelerdeki gelime potansiyelinin istenildii biimde kullanlabileceini kantlad. Bilim adamlar yumurtadaki birtakm unsurlarn hcre genlerini yeniden programlayarak embryonik (uzmanlama ncesi) duruma getirdiklerini ve bylelikle hcrenin herhangi bir dokuya dnmesine olanak saladn grrler. Ama talyann Milano kentindeki Ulusal Nroloji Enstits aratrmaclarndan Angelo Vescovi ve ekibi bu yeniden programlamann cerrahi bir mdahale (hcre nakli vs.) olmadan da gerekleebileceini dndler. talyan aratrmaclar, farelerin beyinlerinden aldklar sinir kk hcrelerini (neural stem cells NSC) hayvanlarn kemik iliklerine aladlar. Ancak daha nce, yeniden programlanma srecini tetikleyecei umuduyla kemik iliinin kan reten kendi hcrelerini nma tabi tutarak etkisizletirdiler. Gerekten de nakilden be ay sonra denek fareler yeni kan hcreleri retmeye balad. Yaplan genetik tahliller, bu hcrelerin NSClerden kaynaklandn kantlad. in daha ilgin yan, denek farelerde kan hcrelerinin, kendi kemik ilikleri nlandktan sonra ilik nakli yaplan ikinci bir grup fareden bir ay daha ge olumas. Vescovi, bu gecikmenin hcrelerin yeniden programlanma srecinden kaynaklandn sylyor. Bu da varsaymn doruluunu kantlyor: Hcreler yeni bir doku oluturmadan nce gelime srelerini geri vitese takarak uzmanlama ncesi durumlarna kadar geri dnyorlar ve yeni grevleri iin yeniden programlanyorlar.

72

Gelitirilen tekniin ufkunda insanlara sfr kilometrede yeni organlar salanmas var. ABDnin Maryland eyaleti Baltimore kentindeki John Hopkins niversitesinden bir ekip insan embryonik kk hcreleri elde etmeyi baarm bulunuyor. Ama talyan ekibinin lideri Vescovi, yeni dokunun kayna olarak baka dokulardan, rnein beyin yerine deriden alnan kk hcreler kullanlabileceine inanyor. Bu hcrelerin elde edilmesi ok daha kolay. Vescovi, bylelikle hastalar, kendilerini iyiletirecek hcreleri yabanc embriyolardan almak yerine kendi kendilerine retebilecekler diyor. (New Scientist, 30 Ocak 1999)

NSAN KLONLANMASINDA BR ADIM DAHA

Klonlanm (kopyalanm) kuzu Dollynin babas Ian Wilmut Amerikan firmas Geron ile birlikte, insan klon hcrelerini doku kltrlerinde tbbi amalarla oaltmaya balad. Dier yandan Amerikan Ulusal Salk Enstits de insan klonlamay zel sektr tekelinde brakmamak iin, bu aratrmalara balam bulunuyor. Klonlanm bir embriyonun farkllam hcreleri vcut dnda zel bir besleyici svda oaltlr; buna doku kltr denir. Bu hcreler kltrde sinir, kan, pankreas, kas vb. hcrelerine dnr; bu hcreler bunama (Alzheimer hastal), lsemi, eker hastal, kaltsal kas erimesi (Duchenne hastal) ve hatta AIDS tedavisinde kullanlabilecek. (Science et Vie, Nisan 1999)

KLONLAMANIN TEHLKELER
Metal, elektrot, implant gibi inorganik aralarn yerine, biyolojik aralarn uygulamal biyonik kullanm, insanlk iin geni ufuklar ayor. Belki bizim yarattmz makineler bizi geecek, ama yava da olsa milyarlarca yllk evrimin canllara kazandrd yaama, soyunu devam ettirme drtsn de yabana atmamak gerek. nsan-makine kavgasnda hemcinslerimiz, snrsz sayda bir yedekler ordusuna sahip olabilir. Yine bu kk hcrelerin maniplasyonu yoluna dayanan bir yntemle istediimiz sayda genetik kopyalarmz kartabiliriz. Bu alandaki ilk rnek tabii ki kuzu (imdi torun sahibi koyun) Dolly. Annesinin genetik kopyas. imdiye kadar pek ok hayvan klonland. Getirilen tm etik ve yasal snrlamalara karn, ilk insan klonlarnn da 21. yzyln ilk be yl iinde ortaya kmas bekleniyor. Ancak bu yntemin sorunlar da ufuklar kadar geni. Bir kere, alanan embriyonlarn ancak ok kk bir blm yaayabiliyor. Kopyalanm canllarn kromozomlar ularnda bulunan ve yalandka ksalan telomer adl uzantlarn boyu da model canldaki kadar oluyor. Bir baka deyile kuzu Dolly'nin hcreleri, doduunda annesindekiler kadar yalyd. Bu da kopyalarn erken lm demek. Baka bir sorun da bizim kopyalarmzn yalnzca fiziksel zelliklerimizi tamalar. Boy, deri, sa, gz, deri rengi gibi. Oysa baka zelliklerimiz, rnein zekmz ynelimlerimiz; yetitirilme biimimiz, aldmz gda, eitim, evre gibi d etmenlerin bir trevi. Dolaysyla makinelerle sava kanlmaz

73

olursa kopyalarmz, en azndan bazlar, cesur savalar yerine pekala ibirliine yatkn korkaklar da olabilirler. Kald ki insan kaynaklarmz snrsz yapmaya alrken kendi bindiimiz dal da kesebiliriz. nk oalmann doal yolu olan seks sayesinde ana ve babamzdan eit lde gen alyoruz. Bu da bizi ileride ortaya kabilecek salk tehditlerine kar direnli klacak yeni yeni gen bileimleri salyor. Klonlama uygulamasnn yaygnlamas, insan gen havuzundaki zengin eitlilii tehlikeli biimde daraltr.

KLONLAMA LE LGL YAPILMI NEML ALIMALAR

DONMU FAREDEN KOPYA

Japon bilim adamlar, 16 yldr donmu halde bulunan fareyi kopyalamay baard. Kopyalamada klasik hcre ekirdei transfer yntemi kullanld. Japonyann Yokohama kentindeki RIKEN aratrma enstitsne bal Geliimsel Biyoloji Merkezinden fare kopyalama uzman Teruhiko Wakayama ve meslektalar, farenin hcre zarlar, donmadan tr atlam olduu halde hayvan kopyalad.Wakayamann ekibi, kopya farelerin oluturulmas iin klasik hcre ekirdei transfer yntemini kulland. Yumurta hcresinden hcre ekirdei karld ve yumurtaya bunun yerine, kopyas yetitirilecek olan donmu hayvann normal bir hcresinden hcre ekirdei alnarak yerletirildi. Ardndan doru biimde kimyasal ve elektriksel tetikleme yaplarak, yumurta hcresinin, tpk bir sperm hcresiyle dllenmi gibi blnerek oalmaya balamas saland. almalarn, Proceedings of the National Academy of Sciences adl bilimsel dergide kaleme alan aratrmaclar, hcre ekirdei transfer tekniklerinin, hayvanlarn yeniden canlandrlmasnda kullanlabileceini belirttiler. Makalede, bu tekniin ayrca, genetik stoklar oluturularak korunmas gereken trlere ait genetik bilgilerin sonraki kuaklara aktarlmasn salayaca belirtildi. Aratrmaclar tekniin, organizma paralarnn dondurularak uzun sreler saklanmas yoluyla, deerli genetik stoklarn oluturulabilmesine ve ileride gerekli olduunda kullanlabilmesine imkan saladnn altn izdi. Aratrmaclar makalelerinde, Hcre ekirdei transferi yntemi bizlere, tr tkenme tehlikesi altnda olan memelileri koruma imkan salyor eklinde yazd. MAMUT YENDEN ORTAYA IKARILABLECEK M?

Ancak aratrmaclar, soyu tkenmi hayvanlarn yeniden yaratlmasnn, bunlara ait canl ve genetii deforme olmam hcrelere ulalmad srece mmkn olmadn da belirttiler. Aratrmaclar u ifadeyi kulland: Donmu durumda elde edilebilen, mamut gibi tr tkenmi hayvanlarn canl hcreleri elde edilemeyecei iin ve geriye kalan genetik maddeler deforme olmu olaca iin, kopyalanarak yeniden canlandrlmalar, uygulanabilir deildir. Rus bilim adamlar Sibiryada, 40.000 yl nce donarak lm bir mamut kalnts bulmulard. Wakayamann ekibi, bu tr kalntlardan klonlama yapmann kullanlabilir hcre ekirdei bulunmasna bal olduunu vurguladlar.

74

KLONLANMI 3 BEBEK YAIYOR

Kopya insan yntemiyle uraan ilk doktor olarak tannan talyan Severino Antinori, bu bebeklerin 9 yanda olduunu ve Dou Avrupa'da yaadklarn syledi. Dnyada kopya insan yntemiyle uraan ilk doktor olarak tannan talyan Severino Antinori, talya'da yaymlanan Oggi dergisinine verdii demecinde, ''nsan klonlama tekniiyle 3 ocuun domasna yardmc oldum. kisi erkek, biri kz ve bugn 9 yandalar. Salkl dodular ve u anki salk durumlar da ok iyi'' ifadesini kulland. Severino Antinori, Dou Avrupa lkelerinde yaayan ocuklarn ailelerinin zel yaamlarna sayg gstermek zorunda olduu iin ayrnt veremeyeceini, ancak sko Profesr Ian Wilmut'un ilk kopya hayvan Dolly'yi retirken kulland tekniin gelitirilmi halini kullandklarn belirtti. 64 yandaki Antinori, 5 yl nce dnyada klonlama yntemiyle 3 ocuun dnyaya geldiini sylemi, ancak ayrnt vermemiti.Severino Antinori, 1994'te 63 yandaki bir talyan kadnn doum yapmasn salayarak ne kavumutu.

75

KAYNAKLAR:
Ensari Y. Molekler biyoloji Baheci Z. Molekler Biyoloji Kayhan Y. Klonlama Uygulamalar Artur, c. ve Laurance, J. 1998. Clonning (http.www.independent.co.ok) http://www.medical-ethics.net/Files/Klon.html Okumus, 1997. Genetik Kopyalama ve Uygulamas. Prognoz. Cilt1, say2, S81-82 http://www.tubitak.gov.tr www.genbilim.com www.bilimteknik.com

Fikriye zkan Gazi niversitesi Fen ve Teknoloji retmenlii Biyolojide zel Konular Tezi

76