T.C.

SAKARYA NVERSTES

FEN BLMLER ENSTTS

OKLU LA KARIIMLARINDA ETKEN MADDELERN KANTTATF TAYNLER N METOD GELTRME

YKSEK LSANS TEZ

Kimyager Ayenur KORKMAZ

Enstit Anabilim Dal Tez Danman

: :

KMYA Yrd. Do. Dr. Abdil ZDEMR

Aralk 2006

T.C. SAKARYA NVERSTES

FEN BLMLER ENSTTS

OKLU LA KARIIMLARINDA ETKEN MADDELERN KANTTATF TAYNLER N METOD GELTRME

YKSEK LSANS TEZ

Kimyager Ayenur KORKMAZ

Enstit Anabilim Dal

KMYA

Bu tez .. / .. /2007 tarihinde aadaki jri tarafndan Oybirlii ile kabul edilmitir.

Jri Bakan

ye

ye

TEEKKR

Tezin hazrlanmas aamasnda bana her trl destei veren, gsterdii iyi niyet ve sabrdan dolay danman hocam sayn Yrd. Do. Dr. Abdil ZDEMR `e ve laboratuar almalarmda yardmn esirgemeyen Sakarya niversitesi Fen Edebiyat Fakltesi Kimya Blm retim yeleri ve aratrma grevlilerine teekkr bir bor bilirim. Hayatmda yaptm her eye ve bana destek olduklar iin ok sevgili aileme; annem Havva KORKMAZ ve babam aduman KORKMAZ a candan teekkr ederim.

Ayenur KORKMAZ Aralk 2006, ADAPAZARI

ii

NDEKLER

TEEKKR... NDEKLER.. SMGELER VE KISALTMALAR LSTES EKLLER LSTES. TABLOLAR LSTES... ZET. SUMMARY... BLM 1. GR. BLM 2. ETKEN MADDELERN YAPISI VE ZELLKLER 2.1. Amoksisilinin Yaps Ve zellikleri 2.2. Klavulanik Asitin Yaps Ve zellikleri.. BLM 3. SPEKTROSKOPK YNTEMLERLE MKTAR TAYN. 3.1. la Etken Maddelerinin UV Spektroskopisi ile Miktar Tayini .. 3.1.1. Beer Kanununda Sapmalar. 3.1.2. Karmlarn Analizi... 3.2. la Etken Maddelerinin Grnr Blgede Miktar Tayini... BLM 4. TREV SPEKTROFOTOMETRS 4.1. Trev Tekniinin Geliimi.. 4.2. Teorik nemi...

ii iii vi viii ix x xi

3 3 4

5 6 7 8 11

13 13 14

iii

4.2.1. Optik metot. 4.2.2. Dk scaklk spektroskopisi 4.2.3. Hesaplama metotlar 4.2.3.1. Eriye uydurma metodu 4.2.3.2. Saysal ok bileenli analiz... 4.2.3.3. Fourier yntemi. 4.3. Trev Alma ve Trev Spektrumu 4.4. Analitik Bandlarn Trevleri 4.5. Trev ve ift Dalga Boylu Spektrofotometri... 4.5.1. Trev Spektrumlarnn Uygulamalar BLM 5. ESI-MS (ELEKTROSPREY YONZASYON-KTLE SPEKTROMETRS). BLM 6. HPLC (YKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFS) 6.1. HPLC Cihaznn alma Prensibi... 6.2. Kromatografide Kantitatif almalar. 6.2.1. Kolondaki madde kayb.. 6.2.2. Dedektr cevab.. 6.3. HPLCde alma Koullarnn Saptanmas 6.4. Kantitatif Analiz... 6.4.1. nternal standart yntemi... 6.4.2. Eksternal standart yntemi. 6.4.3. Standart ekleme yntemi 6.5. HPLC ile Yaplan la Analizi. BLM 7. DENEYSEL KISIM... 7.1. Enstrumentasyon Ve Mobil Faz... 7.2. Ticari Tablet Formlasyonu.

15 15 16 16 16 18 19 23 26 27

28

31 31 32 32 33 33 35 37 38 38 40

41 41 41

iv

7.3. Standart zeltiler 7.4. Tablet Analizi... BLM 8. SONULAR VE TARTIMA.. 8.1. Birinci Trev Metodu... 8.2. ESI-MS Metot.. 8.3. HPLC Metodu.. 8.4. Metot Validasyonu... 8.5. Sonular... KAYNAKLAR...... ZGEM...

42 42

43 48 49 50 51 56 57 60

SMGELER VE KISATMALAR LSTES

: Santigrad Derece : Milimetre : Mikrometre : Nanometre : Miligram : Mikrogram : Mililitre : Mikrolitre : Absorbans : Maksimum Absorbans : Maksimum Dalga Boyu : Molar Absorptivite : Dalga Boyu : Sigma : Transmitans : Giren In iddeti : kan In iddeti : Konsantrasyon : Absorptivite : Absorptivite oran : Yol Uzunluu : Eim : Dorunun y Eksenini Kestii Nokta : Birinci Trev : kinci Trev : Hassasiyet : Resistans-Sa Devresi : Amoksisilin

mm m nm mg g mL L A Amax max T I0 I C a Q l m b d d2 S RC AMX

vi

KLV CLN ASP ESI-MS HPLC ESI UV UV-VIS IR SNR Sc Sm Sy Sb N L DAD IS LOD LOQ CL SE ANOVA

: Klavulanik Asit : Klindamisin : Aspirin : Elektrosprey yonizasyon Ktle Spektrometrisi : Yksek Performans sv Kromatografisi : Elektrosprey yonizasyon : Ultraviyole : Ultraviyole Grnr : nfrared (Kzltesi) : Sinyal Grlt Oran : Konsantrasyonun Standart Sapmas : Eimin Standart Sapmas : Regresyon Oran : Regresyon Denkleminin Eimi : Kalibrasyon in Yaplan lm Says : rnek in Yaplan lm Says : Diyot Array Dedektr : nternal Standart : Tayin Limitleri : Kuantifikasyon Limitleri : Gvenlik Limiti : Standart Hata : Varyansn Analizi

vii

EKLLER LSTES

ekil 2.1. Amoksisilin trihidrat ;C16H19N3O5S3H2O. ekil 2.2. Potasyum klavulanat; C8H8NO5K. ekil 3.1. Dalga boyu - absorptivite grafii... ekil 4.1. pikin st ste gelmesi...

3 4 9 17

ekil 4.2. Fourier iin bir eri zerinde noktalar 18 ekil 4.3.Belirtilen noktalarda erinin noktalar. 19 ekil 4.4. In bir rnekten geerken iddetindeki azalma.. 20 ekil 4.5. ve FWHMnin sistematik izimi. 24 ekil 4.6. Analitik bandn Gauss olarak hesaplanmas.. 25 ekil 4.7. ki bileenli bir karmn absorpsiyon spektrumu.. 26 ekil 4.8. Bir trev spektrumunun standart bir geirgenlik spektrumuyla kyaslanmas 27 ekil 5.1. Pozitif iyon modunda elektrosprey oluumu.. 28 ekil 5.2. Elektrosprey tekniinde bir protein ve ligandn gaz fazna tanmasndaki basamaklar... ekil 6.1. Standart ilave erisi... ekil 8.1. Suda AMX (---) ve KLV (__ ) absorpsiyon spektrumlar... ekil 8.3. Suda AMX 35 g/mL, KLV 5 g/mL ve IS 30 g/mL tablet formlasyonunun negatif iyon ESI-MS spektrumlar ekil 8.4. Suda AMX 35 g/mL, KLV 5 g/mL ve IS 30 g/mL tablet formlasyonunun pozitif iyon ESI-MS spektrumlar ekil 8.5. Suda AMX ve KLV HPLC kromatogram 29 40 44

ekil 5.3.Bir elektrosprey aletinin ktle ile birleimi ve iyon yolu kademeleri. 30

ekil 8.2. Suda AMX (---) ve KLV (__ ) birinci trev spektrumlar... 45 46 48 49

viii

TABLOLAR LSTES

Tablo 8.1. farkl metottan elde edilen kalibrasyon grafiklerinin istatistiksel sonular Tablo 8.2. Uygulanan kalibrasyon teknikleri ile farkl sentetik karmlarda AMX ve KLV tayini iin elde edilen geri kazanmlar. Tablo 8.3. nerilen kalibrasyon teknikleri tarafndan ticari tablete uygulanan standart ekleme metodunun sonular.

52 53 54

Tablo 8.4. nerilen kalibrasyon metotlar tarafndan farmakolojik dozaj formlarnda elde edilen sonular 55

ix

ZET

Anahtar kelimeler: Amoksisilin, Potasyum klavulanat, Birinci trev, Elektrosprey ktle spektrofotometrisi, HPLC. Sentetik karmlarda ve farmokolojik tabletlerde amoksisilin trihidrat (AMX) ve potasyum klavulanatn (KLV) e zamanl tayini iin deiik metot tanmlanmaktadr. lk metot; zero-crossing lme metodu ile birinci trev ultraviyole spektrofotometrisine dayanr. kinci metot; elektrosprey iyonizasyon kullanlarak ktle spektrofotometri metodunu esas alr. Elektrosprey almalar iin internal standart olarak negatif ve pozitif iyon modlarnda srasyla aspirin (ASP) ve klindamisin (CLN) kullanld. Kalibrasyon fonksiyonu birinci trev metodunda kullanlan konsantrasyon aralklarnda kuruldu. AMX ve KLV analizi iin (=220nm) ultraviyole dedektr ieren ters faz yksek performans sv kromatografik bir metot gelitirildi. Kromatografi 0,8 mL/min ak hznda pompalanan fosfat tampon-asetonitrilden (40:60, v/v) oluan mobil fazn C-18 kolonun zerinden yrtlmesi ile gerekletirildi. Uygulanan metotlar seicilik, tayin limiti, geri kazanm, kesinlik ve doruluk gz nnde tutularak deerlendirildi. Her iki ila iin metotlar; AMX iin 2149 g/mL ve KLV iin 3-7 g/mL aralklarnda seici, linear (R 0,99), kesin (geri kazanm=100105%) ve doru (<3% R.S.D.) bulundu. Her metot iin de tayin ve kuantifikasyon limitleri belirlendi.

COMPARATIVE STUDY OF ELECTROSPRAY MASS SPECTROMETRY AND FIRST DERIVATIVE METHOD AND VALIDATION BY HPLC METHOD

SUMMARY

Keywords: Amoxicillin; Potassium klavulanate; First derivative; Electrospray mass spectrometry; HPLC. Three different methods are described for the simultaneous determination of amoxicillin trihydrate (AMX) and potassium klavulanate (KLV) in synthetic mixtures and pharmaceutical tablets. The first method depends on first-derivative ultraviolet spectrophotometry with zero-crossing measurement method. The second method is based on mass spectrometric method utilizing electropspray ionization. For the electrospray studies in negative and positive ion modes, aspirin (ASP) and clindamycin (CLN) were used, respectively as internal standards for quantification. The calibration function was established in the same concentration ranges that were used for the first derivative method. A reversed-phase high performance liquid chromatographic (RP-HPLC) method involving ultraviolet detection ( = 220 nm) was developed for analysis of AMX and KLV. Chromatography was carried out on C-18 column with mobile phase comprising of phosphate buffer-acetonitrile (40:60, v/v) pumped at flow rate of 0,8 mL/min. The proposed methods have been validated with regard to selectivity, detection limit, recovery, accuracy and precision. For both drugs, methods were found to be selective, linear (R 0,99), accurate (recovery = 100105%) and precise (<3% R.S.D.) in the range of 2149 g/mL for AMX and 37 g/mL for KLV. The limit-of-detection and limit-of-quantification of the method were determined for three methods.

xi

BLM 1. GR

oklu karmlarn ayrm yaplmadan analizi farmakolojik, gda, adli ve dier birok deiik alanda ok byk bir neme sahiptir. Kemometrik metotlar n ayrma ilemini gerektirmeden bileiklerin oklu karmlarnn analizine olanak veren saysal metotlardr [1-6]. Saysal metotlarn uygulanmas ileri derecede matematiksel teorinin bilinmesini gerektirir ve birok kimyager bunlarn detaylarna inmek istemez. Kolay ve hzl veri analizi iin; karmlarn akan spektrumlar zerinde trev metotlar [7-12] olarak adlandrlan grafik metotlar kullanlr. Grafik metotlar karmlar iin n ayrma gerektirmemesine ramen ilave olarak her bir spektrumun trevini alma gibi matematiksel hesaplamalar gerektirir. Son zamanlarda farmakoloji alannda, ktle spektrometresi zellikle ilalarn kantitatif almalar iin sklkla kullanlmaya balanmtr [13-18]. Ktle spektrometrisi zellikle HPLC ile birleince kantitatif almalar iin iyi sonular vermektedir. HPLCnin ktle spektrometrisi ile birlikte kullanlmas elektrosprey iyonlama tekniini kullanmay gerektirir. Elektrosprey iyonlama ktle spektrometresi (ESI-MS) olarak adlandrlan bu teknik yumuak bir iyonlama teknii olarak bilinir ve uygulanan voltaja bal olarak molekl paralanmalar minimum miktara indirilebilmektedir. ESI-MS teknii hibir ayrma teknii gerektirmez. yonlama metoduna bal olarak, ktle spektrometresi ile yaplan kantitatif almalarda deiik yollar izlenmek zorundadr. rnein; elektron arpma iyonlama metodu ok fazla molekler paralanmaya yol aar ve hesaplamalar zorlatrr, ama molekler paralanma sonucu oluan belirgin iyonlar kantitatif almalar iin kullanlabilir. Elektrosprey gibi daha yumuak iyonlama metotlar kullanlarak hibir ayrmaya gerek olmakszn bir internal standart kullanarak karmlarn veya tekli bileiklerin miktar tayinini yapmak daha mmkndr. Kromatografik metotlar farmakolojide kalitatif ve kantitatif almalarda ska kullanlmaktadr. HPLC bu alanda kullanlan en temel metottur. Bu metodun dezavantajlar ok pahal olmas, ekstra alma gerektirmesi, zaman alc olmas ve bazen karmlarn ayrlmasnn mmkn olmamasdr.

Bu almada AMX ve KLVnin sentetik karmlarda ve ila formlasyonlarndaki ikili karmlarnn kantitatif olarak zmlenmesi iin farkl metot gelitirildi. AMX ve KLVnin tabletlerdeki miktarlar arasndaki fark bu bileiklerin farmakolojik preperatlarda spektrofotometrik metotlarla kantitatif olarak tayin edilmesini zorlatrr. nerilen metotlar bu gibi problemleri zerek olumsuz etkileri ortadan kaldrmaktadr. Spektrofotometrik ve kromatografik metotlar farmakolojide ok iyi bilinen metotlardr ama ESI-MS metodu bu alanda tam olarak bilinip kullanlmamaktadr. Bu almann ana amac; spektrofotometrik ve ESI-MS metot gelitirmek, ayn bileikler iin elde edilen sonular karlatrmak ve metotlarn avantajlarn ve eksiklerini tartmak, son olarak ta bu metotlar HPLC kullanarak dorulamaktr.

BLM 2.ETKEN MADDELERN YAPILARI VE GENEL ZELLKLER

2.1. Amoksisilinin yaps ve genel zelikleri

ekil 2.1. Amoksisilin trihidrat; C16H19N3O5S3H2O

Ampisilin, penisilin ailesinin bir yesi olan yar sentetik bir antibiyotiktir. Gram negatif bakterilerin sebep olduu enfeksiyonlara kar tedavilerde kullanlan penisilinlerin kullanlabilirliini ve faydalarn geniletmek iin yaygn spektrumlu penisilinler (ampisilin, amoksisilin, karbenisilin ve trikarsillin) gelitirildi. Bu 6aminopenisillanik asitin merkez yapsna asit radikalleri balanarak yaplr. Kimyasal olarak penisilin olan D-(-)-6-(2-amino-2-fenilasetamido)-3,3-dimetil-7-oxo-4-thia-1penisilin Gye benzer bir etkiyle ampisilin (veya alfaazabicyclo[3.2.0]heptan-2-karboksilikasit trihidrattr. En sk kullanlan doal aminobenzilpenisilin) mide asitlerine kar daha dayankldr ve bundan dolay az yoluyla kullanlabilir; ayrca bu bakterilerin belirgin rklarna kar daha aktiftir. Dzenli olarak yaygn bilinen riner enfeksiyonlarn tedavisinde, baz solunum yolu enfeksiyonlarnn ve Hemophilus influenzaenn (bakteriyel menenjitlerin bilinen en yaygn sebebi) birok rknn ampisiline kar direnli olmasna ve dier birok ilala birlikte kullanlmasna ramen ocuklardaki bakteriyel menenjitlerin tedavisinde kullanlr. Ampisilinin ciltte tahrie neden olan alerjik reaksiyonlar gibi yan etkileri dier penisilinlerinkiyle benzerdir. Bu gruptaki dier ilalara alerjisi olan insanlar ampisiline de reaksiyon verir. Derideki tahriin tekrar oran dierlerine gre ampisilinde daha yksektir. Amoksisilin ise ampisiline benzeyen, birok gram pozitif ve gram negatif mikroorganizmaya kar bakteriyel etkisi olan geni spektrumlu bir antibiyotiktir. Kimyasal olarak; (2S,5R,6R)-6-[(R)-(-)-2-amino-2-(p-

hidroksifenil)asetamido]-3,3-dimetil-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2karboksilik asit trihidrattr. Amoksisilin de tifoid ve enterik atete olduu gibi gram negatif ubuk bakterilerin sebep olduu riner enfeksiyonlarn tedavisinde kullanlr. 2.2. Klavulanik Asidin Yaps ve Genel zelikleri

ekil 2.2. Potasyum klavulanat; C8H8NO5K

Antibiyotiklerin etkisini arttran beta laktamaz inhibitrdr ve beta laktamaz organizmalarn sebep olduu enfeksiyonlarn tedavisinde penislinlerle (daha ok amoksisilinle) kombinasyon olarak kullanlr. Beta laktamaz enzimler baz bakteriler tarafndan retilir ve beta laktam antibiyotiklere diren yeteneine sahiptir. Bu enzimler beta laktam halkasn aarak antibiyotiklerin antibakteriyel zelliklerini deaktive ederler. Beta laktamaz inhibitrleri kendi kendilerine dk antimikrobiyel fonksiyonlara sahiptir ve gerek bir beta laktam antibiyotik ile birleirler. Beta laktam inhibitrlerin fonksiyonlar; aktif olmayan bir molekl oluturmak zere beta laktamaz enzimlerine balamaktr, bylece gerek beta laktam antibiyotik ykt bakteri duvarndan girer. Beta laktamaz inhibitrleri klavulanik asit, sulbaktam ve tazobaktam kapsar.

BLM 3. SPEKTROSKOPK YNTEMLERLE MKTAR TAYN

Tm spektroskopik analizler, madde zeltisinden geen enerji miktar ile madde iermeyen zcden geen enerji miktarnn karlatrlmasna dayanr ve bylece tayin edilen T deeri,

T =

I I0

(3.1)

sonrasndaki hesaplamalarda kullanlr [20].

1 =A T
I0 =A I

log
log

(3.2) (3.3)

Bir spektrofotometrenin geen n alan genlikle 100 eit birime blnm olup % geirgenlii onda birine kadar okuma olana vardr; bununla beraber konsantrasyon tm skala zerinde ayn dorulukla tayin edilemez. Analizlerde T deeri 0,6 ile 0,2 arasnda yer almal, ancak konsantrasyondaki % hatann minimuma inebilmesi iin ideal absorbans deeri 0,434 olmal ve bunun iin de zeltiler, absorbans deeri yaklak 0,45 olacak eklide hazrlanmal, pratikte ise bu deer 0,3den az 0,6dan ok olmamaldr [20].

3.1. la Etken Maddelerinin Ultraviyole Spektroskopisi Yardm le Miktar Tayini

la preparatlarnn ounda, etken maddenin miktar tayini iin yaplan ilemler genel olarak yle sralanabilir [20]; 1. Analiz yaplacak ila etken maddesi, billurlandrma ya da baka bir yolla saflatrlmaldr. la etken maddelerinin ou iin aranan standartlar, farmakopeler, ila formlerleri ya da literatrde bulunabilir. 2. UV absorplamayan, spektral saflkta bir zc seilir. Aletin bir kveti bu zc ile doldurulup spektrofotometreye yerletirilir ve alet % 100 T okumak zere ayarlanr. 3. la etken maddesi, seilen zcde zlr ve bu zeltinin bir ksm spektrofotometrenin ikinci kvetine doldurulduktan sonra aletteki yerine yerletirilir. Maddenin absorpsiyon spektrumu ya elle ya da varsa aletin yazcs ile izilir. Genel bir kural olarak zeltinin nihai konsantrasyonu, 10 mg/L olmaldr. Eer absorptivite (a) deeri iin ilgili literatr ya da farmakopelerde bir kayt varsa, o da dikkate alnarak elde edilen spektrum incelenir ve maddenin maksimum enerjiyi absorbe ettii dalga boyu saptanr; sonraki tm tayinler bu dalga boyunda yaplr. rnein pH 8 olan 10 mg/L konsantrasyondaki fenilbutazon zeltisinin 265 nmdeki absorptivite deeri (a) ~66, absorbans (A) ise 0,64tr. 4. Analizde zcnn etkisi dikkate alnmaldr. rnein fenilbutazon iin absorbans deeri, pH 3 6 arasnda sratle deiir; pH 1 veya 2de tayin yaplabilir ama fenilbutazon asidik bir madde olduundan znrl alkali ortamda daha fazladr. Bu nedenle zeltinin pH 7 ya da 7den byk olursa 265 nmde okunan absorptivite deeri nispeten sabit kalr. zc seimi, ila preparatnda absorpsiyonu etkileyen dier maddelerin varl da gz nne alnarak yaplr. rnein fenilefrin HCl, pH 6 tamponunda zndrlp 272 nmde absorptivitesi tayin edildiinde bulunan deer dk olacaktr. nk vasokonstrktor madde ieren baz sulu preparatlara ilave edilen metilparaben, bu dalga boyunda biraz k enerjisi absorbe etmekte, yani okunan absorbans (A) hem metilparaben hem de fenilefrin hidroklorre ait olmaktadr. Bu koullar altnda fenilefrin HClin

konsantrasyonu hesaplanmayacandan pH 13e getirmek suretiyle 272 nmdeki absorpsiyon maksimumu yksek dalga boylarna kaydrlrken 237 nmde absorbans daha byk olan yeni bir maksimum ortaya kar ve metilparabenin bu yeni dalga boyunda absorpsiyonu ok az olduundan, fenilefrin HClin konsantrasyonu (C), 237 nmde hassas olarak tayin edilebilir. 5. Maksimum absorpsiyonun grld dalga boyunda ila etkin maddesinin farkl konsantrasyonlardaki zeltilerin absorbans (A) deerini lmek suretiyle absorptivite (a) tayin edilir. Eer absorbans ve konsantrasyon arasndaki dorusal bir orant varsa, yani Beer kanuna uyuyorsa, bir grafik kad zerinde absorbansa kar konsantrasyon iaretlenerek grafik izildiinde dz bir izgi elde edilir. Tayinlerde genellikle literatrde verilmi olan absorptivite deerleri kullanlr. Bu deerler hassas olarak tayin edilmi olmakla beraber, aletler arasnda farklar olduu iin genellikle bunlarn bizzat tayin edilmesi uygun olur: bu amala farmakopelerdeki spektrofotometrik tehis ve miktar tayinlerinin ou, uygun referans standartlarla karlatrmak suretiyle yaplr. 6. Bir preparattaki belirli bir aktif maddenin miktar tayin edilirken, absorpsiyonu etkileyecek baka maddeler ya da kirlilikler de bulunabileceinden, zeltiyi hazrlamadan nce bu yan maddelerin (ekstraksiyon, kromatograf, destilasyon vb. yntemlerle) aktif maddeden ayrlmas ve ancak bundan sonra aktif maddenin uygun bir zcye alnarak absorpsiyonunun llmesi gerekir. 3.1.1. Beer kanunundan sapmalar Bir zeltinin konsantrasyonu ile absorbans arasndaki orant her zaman dorusal olmayabilir ya da ikisi arasnda orantl bir durum bulunmayabilir. Genellikle miktar tayini dorusal orantnn var olduu snrl bir alan iinde yaplabilir, yani ancak bu alan iinde Beer kanuna uyma sz konusudur. Beer kanunundan sapmalar ise zeltinin tabiatndan ileri gelebildii gibi, zeltideki kimyasal deimelerden de ileri gelebilir [19].

3.1.2. Karmlarn analizi Birden ok ila ham maddesi ieren bir karmn herhangi bir dalga boyundaki absorbansn lmek suretiyle karmdaki maddelerin miktarn tayin etmeye olanak yoktur. nk okunan absorbans deeri maddelerden herhangi birinin deil, karmdaki tm maddelerin ortak absorpsiyon deeridir. Bununla beraber, rnein eer ikili bir karmdaki maddeler birbirleri ile reaksiyon vermiyorsa ve maddelerin her biri ayr ayr Beer kanuna uyuyorsa, bunlarn absorbansn, kendilerine ait dalga boylarnda ayr ayr lmek suretiyle, miktar tayinleri yaplabilir [20]. Karmdaki maddeler x ve y, absorbanslarn lld dalga boylar ise 2 ve 4; 2deki absorbans A2; 4 deki absorbans da A4 olsun. 2deki toplam absorbans (A2), x ve ynin absorbanslarnn toplamna eittir; bundan dolay
A2 = a 5 C y + a 2 C x

(3.4)

benzer ekilde 4deki toplam absorbans

A4 = a1C y + a 6 C x

(3.5)

olacaktr [19]. Bu denklemlerde Cx ve Cy bilinmeyenler olduuna gre iki bilinmeyenli denklemin zm uygulanp, (3.4) a1,(3.5) a5 ile arplr:
a 1 A 2 = a 1a 5 C y + a 1a 2 C x a 5 A 4 = a 1a 5 C y a 5 a 6 C x a 1 A 2 a 5 A 4 = C x (a 1a 2 a 5 a 6 ) a 1 A 2 a 5 A 4 = a 1a 2 C x a 5 a 6 C x

(3.6)

Sonuta;

Cx =

a1 A2 a5 A4 a1 a 2 a5 a 6

(3.7)

bulunur [19].

a6 a5 a4 a3 a2 a1 1 2 3 4

Dalga boyu
ekil 3.1.Dalga boyu - absorptivite grafii

Cyyi bulmak iin Cxler gtrlr, ancak bu kez (3.4) x a6nn iareti deitirilir: a 6 A2 = a5 a 6 C y a 2 a 6 C x a 2 A4 = a1 a 2 C y + a 2 a 6 C x a 2 A4 a 6 A2 = a1 a 2 C y a5 a 6 C y (3.8)

Karmn analizi yaplmadan nce 2 ve 4de x ve y iin absorptivite deerleri tayin edilmelidir. Bulunan bu deerler eitliklerde yerine konur. Karmn 2 ve 4deki absorbans okunduktan sonra Cx ve Cy hesaplanr [19].

10

kili karmlar, ancak aada belirtilen nlemler alndktan sonra analiz edilebilir. 1. Saf maddelerin spektral verileri bilinmelidir. 2. Bileenlerin absorptivite deerleri doru olarak tayin edilmelidir. 3. Denklemlerin doru zm iin bileenlerin absorptivite deerleri, seilen dalga boylarnda birbirlerinden yeterince farkl olmaldr. 4. Karmn absorbans deeri doru olarak tayin edilmelidir. 1 ve 4te belirtilenlere 2 ve 3te belirtilenlerden daha kolaylkla uyulabilir. Eer analiz iin seilen dalga boylarndan birinde, maddelerden biri ok az k enerjisini absorpluyorsa absorptivite deerlerini tayin etmek gtr. Bundan baka eer bir bileenin spektral karakteristikleri dierininkine yakn ise, analiz iin seilen dalga boylarndaki absorptivite deerleri benzer olacak ve bu koullarda denklemler doru olarak zlemeyecektir [19]. Eer btn dalga boylarnda Beer kanununa uygunluk saptanrsa, iki dalga boyu iin tayin edilen absorbans deerlerinin oran sabit bir say olacak ve bu durum, x maddesi iin daha nce verilen spektral karakteristikler kullanldnda 4de A4 = a 6 bC x A3 = a 4 bC x (3.9) (3.10)

formlleri ile belirlenebilecektir. Bu rnekte iki absorbans deerinin oran

Q=

A4 a6 bC x a6 4 = = = A3 a 4 bC x a 4 3

(3.11)

iki deerin oranna (yani absorptivitelerin oranna ) eit olup sabit bir saydr ve bu Q ile gsterilir. Q deeri zeltinin konsantrasyonuna ve kalnlna baml olmadndan farmastik nemi olan maddelerin safln tayin iin kullanlabilir ve bu nedenle NF ve USP de birok ila etken maddesinin Q deerleri birer sabit olarak verilmitir (Aminosalisilik asit, noskapin, promazin HCl vb.) [19].

11

3.2. la Etken Maddelerinin Grnr Blgede Miktar Tayini Grnr blgede absorpsiyonu olan herhangi bir ila maddesinin (renkli ya da renklendirilmi madde zeltisi) miktar tayini, maddenin belli konsantrasyondaki zeltisinden, seilen uygun bir dalga boyunda (400 800 nm arasnda) k geirilerek yaplabilir. Bu tayinlerde Lambert-Beer kanunu geerlidir. Seilen dalga boyunda maddenin gsterdii absorbans lldkten sonra aada gsterilen yollardan biri izlenerek madde miktar hesaplanr [19]. 1. Eer maddenin E % 1,1cm deeri literatrde varsa;
Ax10 cb

E %1,1cm =

(3.12) (3.13)

c=

Ax10 E %1,1cmxb

A:Absorbans c: Konsantrasyon b: Tabaka Kalnl formlnden yararlanlr ve bulunan madde miktarndan yzde saflk miktarna geilir. 2. Referans standart yardm ile madde miktar iki ekilde hesaplanabilir: a) Miktar tayini yaplacak madde, yani istenen koullarda (dalga boyu, slit akl, tabaka kalnl ve zc) referans standart ile karlatrlr. Her ikisinden hazrlanan zeltilerin absorbanslar bolua kar llr ve aadaki formlden yararlanlarak madde miktarna geilir.

12

C x Ax = Cs As Cx = Ax xC s As

(3.14) (3.15)

Cx: Miktar bilinmeyen maddenin konsantrasyonu Cs: Standart maddenin konsantrasyonu Ax: Miktar bilinmeyen maddenin absorbans As: Standart maddenin absorbans b) Referans standardn deiik konsantrasyonlu zeltileri hazrlanr ve bunlarn seilen dalga boyuna absorbanslar okunur. Absorbans ordinat olmak zere l erisi (kalibrasyon erisi) izilir. Sonra bilinmeyen rnekten hazrlanan zeltinin absorbans llr ve ordinatta iaretlenir. Bu noktadan kalibrasyon erisine bir dik klr. Dikin eriyi kestii noktadan apsise dik inilerek madde miktar bulunur. Yzde saflk miktar hesaplanr [19].

BLM 4. TREV SPEKTROFOTOMETRS

4.1. Trev Tekniinin Geliimi Trevleme ile elektrik sinyallerinin zmlenmesi metodu yaklak yetmi yllk bir gemie sahiptir. 1920lerin balarnda Lord Rutherford gazuyarma potansiyellerinin ktle spektrometrik almalarndaki sreksizliklerinin tayini iin birinci trev tekniini nerdi. Bu metod 1953te Singleton ve Collier elektronikteki gelimelerin avantajlarn kullanp IR trev spektrofotometresini kurana kadar unutulmutu. Onlar bir IR spektrofotometresini ikinci derece spektrumlar reten analog bir cihazla modifiye edip bu fikir iin patent aldlar. Ayn zamanda, Hammond ve Price dalga boyumodlasyon prensibini ileri srd ve Giese ve French bunu fotosentetik sistemlerin birinci derece grnr spektrumlarn almak iin adapte ettiler. Ayrca, 1953te Morrison diferansiyel erileri (i (V) / V ) kullanarak birinci ve ikinci derece trevleri hesaplad. Bunlar kk aralklarda (V=0,05V) karma ile elde edildi ve gerek trevlere en iyi yaklamlard. Enstrumentasyonun karmakl ve elektronik cihazlarn yetersiz sinyal grlt oran (SNR) btn bunlara neden oldu ama birka bilim adam bu metodu reddetti. 1966da Meister ikinci trev (d2) iin pratik bir resistans-sa devresi (RC) gelitirdi ki dier fotokimyaclar, gibi bitki fotokimyasnda problemleri baar ile aratrd. 1953te Singleton ve Collier halen ikinci ve daha yksek trevlerin daha dar band genilikleri vermesi gerektiini nermilerdi; ayn zamanda; onlar deneysel ispat salamakta yetersizdiler nk o zamanlarda ekipmanlar bu taslak iin yeterince gelimi deildi. Martin hesaplanan Lorentzian bandlar iin teorik temeli dorulad ve 1968de Morrey dijital bir bilgisayarla Gaussian, Student T3 ve Lorentzian dalm

14

fonksiyonlarnn birinci dereceden drdnc dereceye kadar trevlerini elde etti. Morrey bunun yan sra sentetik karmlardaki rten bandlarn drdnc derece trevinin ikinciye gre daha yksek znrlk verdiini gsterebildi. Savitzky ve Golay dalgalanan verilerin trevlenmesi ve dzeltilmesi iin en kk kareler prosedrlerini kulland. Butler ve Hopkins fotosentetik karmlar almak iin bilgisayar destekli yaklam rutin ikinci ve drdnc derece trev spektrumlarnn oluturulmas eklinde gelitirdi. Daha yksek dereceli trevler spektrumlarn (n>2;HODS) sistematik ve youn olarak laboratuarnda inceledi. 1978de yksek kalitede UV-VIS trev spektrumlarn online lm yaparak henz yeni gelitirilmi, dk grltl RC devresi olan, dk geirgen filtreli ve dzleme modl olan cihaz araclyla dokuzuncu dereceye kadar reten ilklerdendi. Fell ikinci derece trevleri retmek amacyla online balanm analog cihazlarn kulland. Butler dijital metodlarla altnc ve sekizinci derece spektrumlar hesaplad ve Sasaki on nc dereceye kadar boyalarn st dml trev spektrumlarn dijital metotlar kullanarak alt. Yllar getike ticari olarak elde edilebilir trev cihazlar gelitirildi. u anda pratik olarak btn yeni spektrofotometreler en az ikinci derece trev sistemine uyumlu, birou en ok drdnc derece ve bazlar alt hatta dokuzuncu dereceye kadar kabilmektedir. 4.2. Teorik nemi Sarmal spektrumlarn ak zmlenmesi iin birok metot vardr. En nemli olanlar ksaca bu blmde ilenmitir.

15

4.2.1. Optik metot Monokromatr sliti k kaynann band geniliini snrlayan bir faktrdr. Bu yzden slit aralnn daraltlmas dorusal olarak spektral znrl arttrr, fakat k enerjisi stel ikinci derece ile azalr. Optik blgedeki aralk uzamas ayn zamanda znrl arttrmaktadr. Tersinir olarak k enerjisi k kayna ile oaltc arasndaki uzakln karesi ile azalr. phesiz optik ada mm bana ne kadar ok izgi varsa znrlk o kadar fazla yksek olacak ve optik a znrlk snrna 2000-2400 izgi snrlarnda ulalacaktr. Belirli bir sre nce ok dar band geniliine sahip lazerler gelitirildi. Daha nceleri belirli bir noktaya odaklanm lazer odaklanm noktadaki maddelerin bozunmasna neden olmakta bundan da te lazer tarafndan yaylan nn dalga boyu ok kk bir aralkta deitirilebilmekteydi (50100 nm) [48]. 4.2.2. Dk scaklk spektroskopisi Dk scaklklar, komu molekller arasndaki enerji alveriini azaltr. Baz maddelerin absorpsiyon bandlar sv halde oda scaklnda lldnde gaz fazndaki gibi keskin bandlar elde edilir. Buna ilave olarak absorpsiyon band ykseklii soutularak bir kat buz kristal yapsna yerletirildiinde debilir. Bu durum zayf bandlarn gzlemlenmesinde yararl bir durumdur. Band yksekliindeki art ise n getii yoldaki uzamadan kaynaklanr ve ayn zamanda kat yap ierisindeki mikro kristal yaplar yansma yoluyla bu art etkileyen sebeplerdendir [21]. Eer band genilii dk scaklklarda drlrse analiz iin birbiriyle rtmeyen uygun bandlar elde edilir. Pratik lmlerde, maddelerin spektrumlarnn alnmas iin zel aletlerin kullanlmas gerekir. Bir Dewar kab iki dzlemsel silika diski etrafna yerletirilebilir. Kuru azot gaz akm bu pencereler zerinde oluacak younlamay nleyebilir. Dier bir yntemde ise fiber optik kablolar kullanlarak, vakum altnda yine iki silika disk arasnda lmler gerekletirilebilir. Temel olarak sv azot ve helyum soutucu maddeler olarak kullanlr [21].

16

4.2.3. Hesaplama metotlar 4.2.3.1. Eriye uydurma metodu Eriye uydurma metodu grsel pik tannmasna en uygun yaklam vermektedir. Fakat bu ak bir ekilde bilinen bir profil fonksiyonunu gerektirir. Bunun iin en yksek nokta bulunur. Daha sonra spektrum profil fonksiyonu yardm ile ana bileenlerin teorik spektrumlar hesaplanr. Daha sonra en kk kareler metodunun baarsz olduu noktalarda belirli deerlere ulamak iin spektruma ilave pikler eklenir. Eer en kk kareler toplam yeterince kkse hesaplamalara devam edilir. Byk belirsizlikleri ortadan kaldrmak iin pik profilleri ve pik says kesin olmaldr. Piklerin birbiri zerine rtmesi halinde pik ekline, yksekliine ve geniliine bal olarak pik saysn deitirir. 4.2.3.2. Saysal ok bileenli analiz Eer birbiri zerine rtm pik dnlrse ve her nn ayr ayr saf standart absorpsiyon spektrumu bilinirse Lambert-Beer yasasna gre herhangi bir dalga boyundaki absorpsiyon (A) her bir maddenin ayr absorpsiyonlar toplamna eittir. Bu durum matematiksel olarak ifade edilirse;

A 1 = c A 1, A + c B 1,B + c C 1,C

(4.1)

cA, cB ve cB parametreleri aranan deerlerdir, bu yzden problemin zm iin denklem gereklidir;

A 2 = c A 2, A + c B 2, B + c C 2,C

(4.2)

A 3 = c A 3, A + c B 3, B + c C 3,C

(4.3)

17

Pratikte ok bileenli analiz iin genel olarak iki yol vardr. a) llen dalga boyu says ve denklem says madde saysna eittir. b) Tersi durumda ise llen dalga boyu says ve kullanlan denklemlerin says madde saysn geebilir. Her iki durumda, eer en uygun nokta seilirse bilinmeyen madde ve aklanamayan bir zemin sinyali bulunmamas durumunda ok kesin sonular elde edilir. Kark spektrumlar doru bir ekilde zmenin bir yolu trev hesaplamalar kullanmaktr. Her bir standart spektrum zc spektrumu ile birlikte birinci, ikinci ve daha yksek derecedeki bir treve dntrlr.

ekil 4.1. pikin st ste gelmesi a)Tek pik A (---), B (___),ve C (-.-.) b)Toplu ekilde kullanlan denklem says (denklem says madde saysn belirtir), eer doru nokta alnrsa bilinmeyen madde veya karm her iki durumdan da bulunabilinir

18

4.2.3.3. Fourier yntemi Kark sinyallerin zm iin alternatif bir saysal metot da, erilerin frekans spektrumlarn analiz eder. Fourier transform analizi olarak adlandrlan bu metot deneysel olarak oluturulmu sinyallerin sins ve kosins fonksiyonlarn kullanr. lk olarak eit aralklarla yerlemi 2m noktalar seilir.

ekil 4.2. Fourier iin bir eri zerinde noktalar; simetriden sins ve cosins bulunur

Bu durum sins ve kosins fonksiyonlarnn simetrik oluunu salayacandan zm iin avantaj salayacaktr. Fourier analizinde en kark operasyon:

f(x) = a (a n cosnx + b n sinnx) , n = 1

n =1

(4.4)

Bu denklem Fourier katsaylar olan a ve b nin hesaplanmasnda kullanlr;

1 2m 1 ni y i cos m m i =0 1 2m 1 ni y i sin m m i =0

an =

, n=1,2,.,m

(4.5)

bn =

, n=1,2,.,(m-1)

(4.6)

19

4.3. Trev Alma ve Trev Spektrumu Spektrumlarn birden fazla trevlerinin alnmas spektrumlarn daha iyi analizini ve izgileri dzelterek daha da belirginletirmesini ve zemin spektrumundan gelen grltlerin giderilmesini salamaktadr. Bu teknik ya dorudan ya da saysal algoritmalarla elde edilen erilere uygun fonksiyonlar elde edildikten sonra uygulanr. Bir erinin veya onun matematiksel fonksiyonunun trevinin alnmas basit bir btn blgeye ait eim hesabdr. Ayn yolla, ekil 4.3 teki spektrumun trevini almak mmkndr. Spektroskopide llen deer, bir nceki rnein k iddetinin (I) bir sonraki rnein k iddetine (Io) olan orandr.

ekil 4.3. Belirtilen deerlerde erinin noktalar

Bu oran aktarm oran olup I/Io=T olarak gsterilir. Homojen saydam bir rnekten geen n iddetindeki d lineer deildir (ekil 4.4).

20

ekil 4.4. In bir rnekten geerken iddetindeki azalma; LTH: izgi kalnl (=yol uzunluu l); I:k iddeti; Io:Balangtaki k iddeti

I ile znm saydam sv konsantrasyonu ve I ile bir kat arasndaki iliki BauguerLambert-Beer kanunuyla verilmitir.

I = e cll = T I 0,
c : zelti konsantrasyonu l : yol uzunluu : molar absorbsiyon katsays ( dalga boyunda ) T : dalga boyunda aktarm

(4.7)

Genellikle dalga boylar aralna uygun Io iddeti, bir otomatik kontrol dzeneiyle veya otomatik elektronik ykseltme ayaryla veya k kaynann geriliminin otomatik kontrolyle sabit tutulur. Eitlik (4.7)nin doal logaritmasnn alnmasyla;
lnI I 0, = cl

(4.8)

21

Bu ifadenin diferansiyeli alnrsa;

d(lnI) d = cl d d

(4.9)

Io sabit ise :

d(lnI 0 ) =0 d
Ve
dlnI 1 = d I

(4.10)

(4.11)

Eitlik (4.7)nin birinci trevi aadaki gibi elde edilir.

dI 1 d = cl d d I

(4.12)

Birinci trev direkt olarak her dalga boyundaki konsantrasyona orantldr. lmn duyarll ekme noktalar yaknnda yksektir ve d/d deeri en utadr. kinci trev alndnda aadaki denklem bulunur.
2

d2I 1 d 2 d = c 2 l 2 cl 2 d 2 I d d

(4.13)

nin ilk trevi (d/d) sfra eittir. kinci trev lineer olarak konsantrasyonla orantl olacaktr. Aksi halde hibir lineer iliki bulunmaz ve zel kalibrasyon erisi gerekli olur. Ek olarak, d2/d2 nin u deerleri iin lm duyarll yksek olur [21]. Lineer oransallk sadece d/d ve d2/d2 deerleri sfr olarak alnrsa kullanlr. Bu sebepten, aktarm spektrofotometri ile llebilen fiziksel bir byklk olmasna

22

ramen, aktarmn trevleri daha az kullanlr. Dier byklkler mesela absorpsiyon A, logA veya konsantrasyon (c) trevli byklklerdir. Bunlar temel byklk (T)den hesaplanrlar. Daha yksek trevler ayn yolla bulunabilir. Yukarda geen absorpsiyon (A), aadaki gibi tanmlanr.
1 = cl ' T

A = log 10 I 0 /I = log 10

(4.14)

' zeltinin absorpsiyon molar katsaysdr.

' = / 2,303

(4.15)

Io sabit tutulursa birinci trev iin;

dA d ' = cl d d ve ikinci trev iin; d2A d 2 ' = cl 2 d 2 d n. derece trev iin; dnA dn' = cl n d n d

(4.16)

(4.17)

(4.18)

Her durumda Ann btn trevleri c konsantrasyonuna lineer oransal olur. Bu trevsel spektrumlarn aklanmas ve hesaplanmas iin byk bir avantajdr. Bu

23

yzden pratikte Ann trevleri yaygn olarak retilir; ama Tnin trevleri daha seyrektir. Bazen Ann trevinin alnmas trevlerin konsantrasyona lineer olmayan bamlln verebilir. Bu Beer kanununa uyulmadnda uygulanabilir. rnek olarak, madde moleklleri arasnda veya maddeyle zc arasnda etkileim olumas veya ortak pik ya da tam tersi durumlarn olmas ana sinyalleri etkiler, bu durumda daha dk veya daha yksek derece trev alma hesaplanr [21]. 4.4. Analitik Bandlarn Trevleri Analitik band olarak bilinen bir absorpsiyon band yaklam formlleri ile daha doru tanmlanr. Bandn absorpsiyonu A, dalga boyunda aadaki gibidir.
2

= A max e cx

(4.19)

maxdaki absorbans Amax c: konsantrasyon x: (-max) xe gre 1. ve 2. trev alnrsa:

dA = d 1 = (2)Cx A d
d2A = d 2 = 2C(2Cx 2 1) A 2 d

(4.20)

(4.21)

c sabit iken iki farkl bandn yar genilii dikkate alnr. ekil 4.5 te yar genilik iin iki farkl yol izlenir.

24

ekil 4.5. ve FWHMnin sistematik izimi a) FWHM (yar max. genilii), maximum yar ykseklikte b) , artp azalan noktalar arasndaki band genilii analitik band iin orijine simetrik koordinat izilir

Artan azalan noktada; d1 = d2 = 0

(4.22) (4.23)

x =

1 2C

FWHM noktas iin, A =0,5.Amax

x FWHM =

ln2 C

(4.24)

Sabit c iin xFWHM=0,5.FWHM ve x=0,5. olmak zere; 4ln2 (FWHM)

C FWHM =

(4.25)

Ve
2 2

C =

(4.26)

25

FWHM her zaman dan byktr.

FWHM = 2.ln2 = 1,177

(4.27)

Sonu olarak;

ekil 4.6. Analitik bandn Gauss olarak hesaplanmas a)Birinci eri drdnc treve kadar b)Birinci erinin drdnc trevinin iki gauss bandnda sten grn [21]

26

4.5. Trev ve ift Dalga Boylu Spektrofotometri Trev spektrofotometride, absorbans ya da geirgenliin dalga boyuna gre birinci veya daha yksek dereceden trevi dalga boyuna kar kaydedilerek spektrum izilir. ou kez bu eriler, normal bir spektrumda grlmeyen spektral ayrntlar ortaya karrlar. Buna ek olarak, bazen bozucu maddeler varlnda bir analitin deriiminin lm daha kolay ya da daha doru olarak yaplabilir. Ne yazk ki, spektrumunun stnlkleri, trev eldesine elik eden sinyal/grlt orann drlmesi ile en azndan ksmen ortadan kalkar ancak, ultraviyole ve grnr blgenin ou ksmnda sinyal /grlt oran, ciddi bir snrlandrc faktr deildir; trev spektrumlarndan ite burada en fazla yararlanlr. Trev spektrofotometresinin bir dier dezavantaj ise gerekli cihazn daha pahal oluudur. Trev spektrumlarn elde etmek iin eitli yntemler kullanlr. Mikroilemci kontroll dijital spektrofotometreler iin trev alma ilemi saysal olarak, analog cihazlarla spektral verilerin trevleri, uygun bir ilemsel ynetici devresiyle elde edilebilir. l bir ilem, dalga boyu modlasyonuyla gerekletirilir [22].

ekil 4.7. ki bileenli bir karmn absorpsiyon spektrumu; dey kesikli izgilerle, iki bileenin tayininde en uygun dalga boylar olan ve gsterilmektedir

27

4.5.1. Trev Spektrumlarnn Uygulamalar Ultraviyole ve grnr blgelerde trev spektroskopinin en nemli uygulamalarndan pek ou, spektrumlar birbiriyle akan bileiklerin farkllandrlmasn mmkn klan trev spektrumunun kullanld kalitatif tayinlerle ilgilidir. ekil 4.8 adet akan absorpsiyon pikinden oluan bir spektrumun ayrntlarn bir trev erisinin nasl ortaya koyabildiini gstermektedir. ift-dalga boylu spektrofotometri, zellikle n salmas ile bir absorpsiyon spektrumunun ayrntlarnn karmak hale geldii durumlarda, bulank zeltilerdeki analitlerin ultraviyole/grnr alan absopsiyon spektrumlarnn eldesinde belirgin yarar salamtr. ift dalga boylu spektrofotometri ayn zamanda spektral bir giriim varlnda bir analitin tayin edilmesinde de yararn kantlamtr. Burada, cihaz tarayc olmayan modda altrarak, giriim yapan trn ayn molar absorptivite deerlerini gsterdii iki dalga boyunda absorbans lm yaplr. Bunun tersine, analit bu dalga boylarndan birinde, dierindekine nazaran daha kuvvetli absorpsiyon yapmaldr. Bu durumda fark absorbans, analit deriimi ile doru orantldr [22].

ekil 4.8.(a) Bir trev spektrumunun, (b) standart bir geirgenlik spektrumuyla kyaslanmas

BLM 5. ELEKTROSPREY YONLAMA KTLE SPEKTROMETRES METODU

Metal ine 2- 5 kV

Elektrosprey damlacklar Taylor konisi

Ktle spektrometresi

zelti

Oksitlenme blgesi

Yzeyde bulunan fazla ykler

indirgenme

zc ve ntralize olmu iyonlar

Sprey akm (i) 1- 5 kV G kayna

ekil 5.1. Pozitif iyon modunda elektrosprey oluumu

Elektrosprey iyonlama (ESI) teknii ktle spektrometrelerinde iyon oluturmak iin kullanlan bir tekniktir. Genellikle byk polar molekllerin iyonlatrlmasnda molekler paralanmann nne geebilmek iin kullanlan yumuak bir iyonlama tekniidir. Bu teknikte zelti, zerine potansiyel uygulanm ok kk bir metal kapilerden sabit bir hacim orannda gemesi salanr. lgilenilen molekl ieren zcnn uuculuunun fazla olmas gerekir. Eer zelti herhangi bir tampon ieriyorsa veya herhangi bir asit ya da baz ilavesi gerekiyorsa onlarnda uucu olanlardan seilmesi gerekir. zelti ierisinde molekller iyon halinde ya proton kazanm ya da proton kaybetmi olarak bulunurlar. Metal kapiler herhangi bir ykle yklendiinde zelti ierisindeki ayn ykl iyonlar hzla darya doru itilecektir. Bu kuvvetle itme sonucu ap 10 m olan aerosoller oluacaktr. Bu aerosollerin kendilerine kar

29

gelen stlm azot gazi ile karlamas sonucu solvent buharlaacak ve klen taneciklerdeki yk younluu artmas kolombik itmelerin artmasna neden olacak ve daha kk taneciklerin olumasn salayacaktr. Bu ilem solventin taneciklerden tamamen uzaklamasna kadar devam edecektir. Oluan iyonlar ktle analizrleri ierisinde seildikten sonra dedektrlere gnderilecektir.

ekil 5.2. Elektrosprey tekniinde bir protein ve ligandn gaz fazna tanmasndaki basamaklar

Elektrosprey iyonlama prosesinde elde edilecek iyon trne gre pozitif veya negatif voltaj uygulanr. Pozitif iyonlamada, ilgi duyulan molekl yapsna bir veya birden fazla proton balanmasyla spektrum elde edilmesini salarken, negatif iyonlama modunda, ilgi duyulan molekl bir veya daha fazla proton kaybederek spektrumlar elde edilir. ESI ounlukla tek bana kullanlmaz, HPLC ile bir birine bal halde kullanlan bir iyonlama tekniidir. HPLC ile kullanlmasnda ortaya kan olumsuz durumlardan biri, HPLC de karm ieriklerinin birbirinden ayrlmas iin uzun bir sre ve fazladan kimyasal kullanm gerektirmesidir. Fazla miktarda zc ve znen maddelerin ktle spektrometresi ierisine gitmesi istenmeyen durumlardan biridir.

30

Elektrostatik lensler Silindir yapl elektrot Kapiler ne Sv zelti Skimer Kurutma Birinci vakum blgesi gaz kinci vakum blgesi
Drt kutuplu ktle

spektrometresi

ekil 5.3. Bir elektrosprey aletinin ktle ile birleimi ve iyon yolu kademeleri

ESI-MS son yllarda kantitatif analizlerde bavurulan metotlardan biridir. Tm iyonlama metotlar kantitatif analizlerde olumlu sonu vermese de, ESI metodu numunenin srekli olarak sisteme gnderildii bir metot olduundan kullanlacak bir internal standart ile kantitatif almalara olanak salamaktadr. Birden fazla deiik iyon ayn anda analiz edilmesi gerektiinde bu tr almalarda bu iyonlarn iyonlama yzdelerinin bir birini etkilememesi gerekmektedir. Yeterince dk konsantrasyonlarda yaplacak almalar ile bu tr problemlerin nne geme imkan vardr. ESI-MS metodu ile yaplacak almalarda HPLC de izlenen yntem izlenir. Hazrlanan kalibrasyon zeltileri ierisine internal standart ilave edildikten sonra spektrumlar alnr ve her bir spektrum iin maddelerin pik ykseklikleri internal standart pik yksekliine blnerek normalize edilmi pikler elde edilir. Bu elde edilen deerlerle konsantrasyonlar grafie geirildiinde elde edilen doru denklemi bilinmeyen madde miktarlarn bulmak iin kullanlacaktr.

BLM 6. YKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFS (HPLC)

Yksek performans sv kromatografisi bir rnekte bulunan bileiklerin analitik veya preparatif olarak ayrlmasna ve ayrca bileiklerin kalitatif ve kantitatif tayinine, izolasyonuna imkan veren hzl, hassas ve gvenilir bir tekniktir. Yksek performans sv kromatografisi, btn ayrma metotlar arasnda en ok kullanlandr. Bunun nedeni, bu metodun: 1) Hassas olmas, 2) Scakla hassas olan maddelere de uygulanabilmesi, 3) Doruluk dereceleri ve kesinlikleri yksek sonular vermesidir [23]. 6.1. HPLC Cihaznn alma Prensibi Yksek performans sv kromatografisi, alma prensibi temel olarak rnek uygun zc (mobil faz) iinde zlmesi ve bu karmn yksek basn altnda dolgulu (sabit faz) elik kolondan geirilmesi esasna dayanr. Hareketli faz, sisteme ak kontrol edilebilen bir piston pompas vastasyla bir rezervuardan pompalanr. Pompa ile kolon arasnda yer alan enjeksiyon valf analizi yaplacak rnein kolana verilmesini salar. rnek, ykleme durumunda enjekte edildikten sonra valf, enjeksiyon pozisyonuna evrilir. Bileikler, kullanlan kromatografik ynteme gre polarite farkllklarndan dolay kolonun farkl hzlarda terk ederler. Kolondan kan hareketli faz bir dedektre gelir ve yazcda pik eklinde kromatogram halinde kaydedilir. Bileiin kolondan kt zaman alkonma zamandr [23].

32

6.2. Kromatografide Kantitatif almalar

Kromatografide kantitatif almalar ok hassas bir ekilde yaplabilir. i standartlarla 0,1% mertebesinde hassasiyete ulalabilir. ada kromatografi cihazlar hem ayrma ilemi yapar, hem de ayn zamanda bileenlerin kantitatif analizlerini mmkn klar [24]. 6.2.1. Kolondaki madde kayb Band oluturan malzemeler ne ekilde tayin edilirse edilsin, burada ortaya baka bir kkl sorun kar. Arya kaan durumlarda karmn iindeki baz maddelerin tamamyla syrlmalar mmkn olamaz. Baka bir deyimle madde analiz srasnda yksek oranda kayba urar. Bunun analiz srasnda geri kazanlmas oran %0 dr. Olaanst durumlarda kalitatif analizi de madde kaybndan dolay yapmak mmkn olamaz. Birka istisna dnda kaybedilen maddenin deneysel olarak tayinin yapmak ta mmkn olamaz (Bunun bir istisnas radyoaktif etiketli bir bileiin kolon zerinde llebildii hallerdir). Geriye dntrlemez bir absorpsiyonu tayin etmenin yolu rnein syrlan bileenlerinin oklu rnek durumunda tutulma karakteristiklerindeki ilerleyen deimeleri gzlemektir. Geri dnmsz olarak balanan bileenler kolonun st tarafndaki yzeysel blgeleri igal ederler ve bunun neticesinde kolonun karakteristii deiime urar. Her rnek enjeksiyonu kolon karakteristiini deitirir ve syrlan bileenlerin tutulma sreleri uygulanan her enjeksiyonla birlikte deiime urar. Kalitatif ve kantitatif analizin baka bir yoldan yaplmas, ayrma ilemi srasnda kimyasal deiime urayan bileikler iin hatal sonulara neden olabilir. Bunlara rnek olarak ayrma katalizleri, izomerizasyon ve yapsal deiiklikler gsterilebilir. Bu blme son verirken tm bileenlerin %100 verimle tayin edilebilmeleri iin kimyasal adan deiiklie uramamalar gerektiini belirtmek gerekir [24].

33

6.2.2. Dedektr cevab Kromatografi ynteminin hassasiyeti ve tayin limitleri tamamen kullanlan dedektrn karakteristiklerine baldr. Dedektrn seimi yalnz kromatografi artlarna deil, analizi yaplacak bileiklerin kimyasal ve fiziksel karakteristiklerine, konsantrasyonlarna ve kullanlacak rnein ebadna baldr. Kantitatif analizin en kolay yolu, dedektrn her bileik iin verecei ve her bileik iin lineer olan k verilerinin bir diyagrama tanmasdr. Matematiksel olarak bu aadaki basit eitlikle ifade edilebilir. Dedektr cevab = SBileik .[Bileik] S hassasiyeti ifade eder. rnein iki bileik ayn hassasiyette ise ve enjekte edilen rnekte eit konsantrasyonlarda bulunuyorlarsa, syrma band sonradan genilemeye balar (daha fazla seyreltme) ve mteakip bandn pik cevab daha nce syrlm olandan daha kk olur [24]. 6.3. HPLCde alma Koullarnn Saptanmas HPLCde analiz yapabilmek iin ayrlacak bileiin polar ya da nonpolar zclerde znebilmesi gerekmekte; bileiin yapsna uyan bir kolon, dedektr ve mobil faz seilmekte, ayrca mobil faz seiminde kolonun dolgu materyali de dikkate alnmaktadr. HPLCde kullanlacak zclerin ve inorganik tuzlarn safl da ok nemlidir; nk zcler iindeki safszlklar, dzgn bir baseline elde edilememesine ve istenmeyen piklerin kmasna, ayrca dolgu materyalinin yzeyinde tutulup kromatografik alkonmann deimesine, pompa filtresinin gzeneklerinin ve borularn tkanmasna neden olmaktadr.

34

Mobil fazda znm havada problem oluturan etmenlerden biridir. Bu hava, pompa banda bir kabarck oluturursa mobil fazn akn azaltacak ya da durduracaktr; dedektrde oluan kabarck ise sahte pikler meydana getirecektir. Mobil fazn uucu zclerden ibaret bir karm olmas durumunda havay kovarken zc oranlarnn deimemesine dikkat edilmelidir. Mobil faz hazrlandktan, manyetik bir kartrc yardm ile 5-10 dakika kartrldktan ve ultrasonik banyoda havas kovulduktan sonra uygun filtrelerden vakum uygulanarak szlmesi gereklidir. Sulu karmlar hazrlamak iin kullanlan suda ayrmay etkileyecei iin bu su zel bir itina ile cam kaplarda iki kez destile edilmek suretiyle hazrlanm olmal ve 48 saat iinde tketilmelidir. Mobil faz olarak tampon zelti kullanlmas halinde, bu zeltilerin taze hazrlanm olmas, o gnlk almann sonunda kolonun destile su ile ykanmas ve sonra kolondan organik zc geirilmesi gerekmektedir. Tampon zeltiler iinde kf ve bakteri remesi, dier mobil fazlara gre ok daha hzl olduundan ve ayrca tampon zelti iindeki maddeler kolon iinde kristallenerek kolonu tkayacaklarndan bu zeltilerin kolon iinde braklmamasna zel bir dikkat gstermek yerinde olur. zeltilerin enjeksiyon iin hazrlanmasnda kullanlacak zclerin seimi de nem arz etmekte ve ayrlacak analiz rneinin mobil fazda znebilmesi iin ideal durum olmaktadr. Eer ayrlacak rnek mobil fazda iyi znmyorsa, bu takdirde mobil fazla karabilen ve dedektr cevab kk olan bir zcde zldkten sonra sisteme enjekte edilmektedir. Bu ikinci durum sz konusu ise omuzlu ve geni piklerin oluumunu nlemek iin enjeksiyon hacmi kk tutulmaldr. n hazrlklar tamamlandktan sonra alma iin seilmi kolon, doldurulduu ynde cihaza taklr; pompa, dedektr ve kaydedici, alma koullarnn gerektirdii biimde ayarlanr, kolon iinden 5-10 mL mobil faz geirildikten sonra ideal hacim olan 20L solt sisteme enjekte edilir ve kromatogram alnr. Alnan bu ilk kromatogram incelenerek daha iyi bir kromatogram elde edebilmek iin ak hznda, hassasiyette ya da enjeksiyon hacminde gerekli deiiklikler yaplr. Bu deiikliklere karn pik ya da pikler gerek ekil gerekse zmlenme bakmndan

35

istenen nitelikte deilse mobil fazda deiiklik yapmak, bununla da istenen sonu alnamyorsa kullanlan kolonda bozunma olup olmadna bakmak, ayrca en uygun kolonun seildiinden emin olmak gerekir. HPLC almalarnda kolon, aletin beyni olduundan, mrn uzatmak zere baz nlemler alnmakta ve bu nlemler arasnda uygun bir mobil faz ile uygun pHn seimi en nemli yeri almaktadr [25]. 6.4. Kantitatif Analiz Bir maddenin tm bileenleri birbirinden ayrlmlarsa, bunlarn miktar analizleri iin muhtelif teknikler kullanlabilir. Her bir bileen ayr bir fraksiyon alarak toplanabilir ve bu fraksiyonlarn her birinde tek tek kantitatif analiz yaplr. Kantitatif analiz titrasyon ilemi veya baka tr bir cihazla yaplabilir. Hangi analiz yntemi kullanlrsa kullanlsn, fraksiyondaki bir bileenin mutlak miktar, fraksiyon hacmi ile konsantrasyonlarn matematiksel arpmlarna eittir. Ancak bu ortalama konsantrasyon, genellikle daha kolay olarak fraksiyonlar toplamadan da llebilir. lm kk orandaki bir svnn dedektr iinden getii srada yaplr. k cevab lineerdir, maddenin konsantrasyonu zamana gre izilmi grafiin altndaki alanla orantldr [24]. Kantitatif analiz yaplrken lineer regresyon metodundan faydalanlr. Lineer regresyon veya en kk kareler yntemi, iki deikenin korelasyonunu belirlemek iin kullanlr. Verinin bir seti y ekseni zerinde dier seti x ekseni zerinde gsterilir ve en kk kareler metodu ile bir doru elde edilir. Spektrofotometrik analiz iin dorusal lineer iliki teorisi Lambert-Beer yasas olarak adlandrlr.

Bu yasa zeltideki znen trleri ile onlarn konsantrasyonlarn ve numune hcresinin k yolunu elektromanyetik nn absorbansna balar. Analizin yaplaca bir dalga boyu ile absorbans spektrumunda bir maksimum seilmesi genellikle iki nedenden dolay seilir:

36

En yksek tepe noktas molar absorptivitenin en yksek olduu deeri gsterir ve dolaysyla bu deer de analizin duyarllnn bir gstergesidir ve u ekilde gsterilir:

A=cl

A, znenin absorbansdr. A= - log T T, transmitans (geirgenlik ), , znenin molar absorptivitesi, l, hcrenin k yolu uzunluu, c, znenin konsantrasyonudur.

HPLC analiz ynteminin ilk aamas bilinen analit konsantrasyonlar ieren standart zelti serileri hazrlamak, bu serilerin kromatogramlarn lmek ve kalibrasyon erisini izmektir. Elde edilen kalibrasyon denklemi y = m x + b eklinde yazlr. Bu eitlik Beer kuralnn deneysel versiyonudur.

A=mc+b

Burada m; eimi, b; dorunun y eksenini kestii noktay gstermektedir. Bilinmeyen konsantrasyonu bulmak normal olarak yeterli deildir. Sonucun ispatlanabilmesi iin baz deliller olmaldr. spatn genel lm standart sapmadr. Konsantrasyon, bilinmeyenin kalibrasyon erisine dayandndan, sonucun standart sapmas kalibrasyon erisinin ispatnn ayn parantez iine alnmasyla hesaplanr.

37

s 1 1 s m ( y c y) 2 sc= r + + m L N m 2s 2 r Kalibrasyon erisinden, (Sc) hesaplanan bilinmeyen bir konsantrasyonun standart sapmas eimin standart sapmasna (Sm), regresyon oranna (Sy), kalibrasyon erisi iin yaplan lmlerin saysna (N) ve rnein ka kere llm olduuna (L) baldr. Hassasiyet ayn zamanda kalibrasyon erisinin merkezinden yaplan ve (c y)2 olarak ifade edilen lm aralnn karesine de baldr [24]. Sv kromotografisinde, kromotogramdaki piklerin alan ya da ykseklii, miktar tayini yaplacak maddenin konsantrasyonu ile dorusal bir iliki iinde olduu zaman yani dedektr cevab ile konsantrasyon arasnda dorusal iliki olmas halinde yolla miktar tayini yaplmaktadr. Bunlar internal standart yntemi, eksternal standart yntemi ve standart ilavesi yntemidir.

6.4.1. nternal standart yntemi

Bu yntemde yap bakmndan analizi yaplacak rnee benzeyen, farkl alkonma zamanna sahip olan ve miktar bilinen bir standart, soltle birlikte sisteme enjekte edilmekte ve bu suretle rnek hazrlamadan, cihazdan, teknikten vb. gelen hatalar minimuma inmektedir. nternal standardn pik alan ( ya da pik ykseklii ) ile karmdaki analizi istenen maddenin pik alan ( ya da pik ykseklii ) kyaslanarak miktar tayini yaplmaktadr.

Bir internal standart iin gerekli koullar u ekilde sralanmaktadr: 1) Karmn ierdii maddelere ait tm pikler iin kullanlabilir olmaldr. 2) Karmdaki tek bir maddenin analizi yaplacaksa internal standardn alkonma zaman, bu maddenin alkonma zamanna yakn olmaldr. 3) Madde piki (ya da pikleri ) ile yakn konsantrasyona ve benzer dedektr cevabna sahip olmaldr.

38

4) rnekteki maddelerle reaksiyon vermemelidir. 5) ok saf olmal ve kolayca salanabilmelidir.

nternal standart ynteminde hem kalibrasyon erisi hazrlamak hem de cevap faktr elde etmek iin internal standart dnda analizi istenen madde veya maddelerin referans standartlarna da gerek vardr. Bu amala internal standart ve referans standart maddenin bilinen miktarn ieren bir karm hazrlanr ve cihaza enjekte edilir.

Kalibrasyon erisi izmeye yarayan dier bir yntemde ise, internal standart ile referans maddenin stok zeltilerinden seyreltme yaplmakta ve her birine ayn miktarda ( ortalama bir deerde ) internal standart ilavesinden sonra enjeksiyon yaplmakta; pik alanlar oran (Ax/Ais) ordinata, konsantrasyonlar absise yazlarak hazrlanan kalibrasyon erisi ile de miktar tayin edilmektedir [25].

6.4.2. Eksternal standart yntemi

Bu yntemde, ya miktar tayini yaplacak maddeye ait referans standardn belli miktarlar sisteme enjekte edilerek bir kromatogram elde edilip bilinmeyenin pik alan (ya da pik ykseklii) ile kyaslanr ya da referans standardn deiik konsantrasyonlardaki bir seri zeltisi hazrlanr ve her biri ayn hacimde olmak koulu ile sisteme enjekte edilir; pik alanlar (ya da pik ykseklikleri) kullanlmak suretiyle bir kalibrasyon erisi izilir ve bilinmeyenin pik alanndan (ya da pik yksekliinden) miktara geilir [25].

6.4.3. Standart ekleme yntemi

Kalibrasyon erileri ierii bilinen standartlarla analitin ktle, hacim veya konsantrasyonunun grafiidir. Gelen sinyaller neticesinde absorbans, elektromanyetik mann emilsiyon iddeti, elektrokimyasal hcrenin potansiyeli veya akm, kromatografik pik alan vb. deerler llebilir. Veriler genellikle

39

dorudan grafie aktarlr. Grafik zerinde dorusal bir izgi elde edilmi fakat baz noktalar darda kalyorsa lineer regresyon analizi ile en optimum doru elde edilebilir. Kalibrasyon grafiklerinin kullanm kolaydr. nk numune iindeki analit konsantrasyonu eriden kolayca okunabilir veya erinin dorusal olduu yerdeki faktr kullanlarak hesaplanabilir.

Kalibrasyon erisi ynteminde saf su iinde zndrlm saf bileiklerden elde edilen standart zeltiler kullanlr. Dier taraftan rnein iinde bulunan bilinmeyen dier maddeler ve dier bileik matrisleri analiz ilemi zerinde giriimlerde bulunarak byk sistematik hatalarn yaplmasna neden olurlar. Buna matris etkisi denir ve bunu nlemenin iki yolu vardr. Bunlardan bir tanesi standart zeltilerin iine bilinmeyen rnekte bulunduu tahmin edilen maddeleri katmaktr. Bu yntemin zorluu bilinmeyen zelti iindeki yabanc maddelerin ne olduklarn tahmin etmektir, zira matris bazen ok karmak bir karm olabilir. Daha genel bir yaklam da saf zc ve saf bileik yerine rnekten bir standart hazrlamaktr. Burada bilinmeyen zeltinin absorbans llr, iine belli miktarda bilinen bir bileik ilave edilir ve lm tekrarlanr. ki zelti ilave yaplmadan nce ve ilaveden sonra ayn ierie sahip olmaldrlar. Ayrca ierie uygunluk salamak iin bilinmeyen zeltiden pipetle birbirine eit miktarlar alnp, iki dereceli erlenmayer iesine aktarlr ve ikisine de su ilave edilerek ayn hacme getirilir. Analizi yaplacak zeltiye belirli miktarlarda konsantrasyonu bilinen bir madde ilave edilir ve bu ileme Standart Ekleme yntemi ad verilir.

Genel olarak kalibrasyon erisi ynteminde rnee muhtelif standart ilavesi ile oluturulan eride en dzgn doru elde edilir. X-ekseni ilave edilen standardn konsantrasyonu ise (Spike konsantrasyonu) Beer Kanununa gre erinin lineer olmas gerekir [24].

40

0.4 0.3 0.2 0.1 -20 0 20 40 60 80

ekil 6.1.Standart Ekleme Erisi Dorunun y eksenini kestii nokta bilinmeyen rnein standart ilavesi yaplmadan verdii absorbanstr. Bilinmeyen rnein konsantrasyonu x-kesintisinden hesaplanabilir

6.5. HPLC ile Yaplan la Analizi Yksek basnl sv kromatografisi, deiik alanlarda karlalan birok analiz sorununa zm getirmek zere son 20 yldr baaryla kullanlmakta; farmstik endstrideki nemi ise, ila etken maddesinin tek halde ya da preparat iindeki analizini hzl, duyarl ve gvenilir bir ekilde yapabilmesinden kaynaklanmaktadr. Bu analizler saflk, kalite kontrol, stabilite tayini ve reaksiyona girmemi sentez ilkel maddelerinin saptanmas alanlarn kapsamakta, rnein izoniyazid ve hidralazin iindeki hidrazin, aspirin iindeki salisilik asit ve dier safszlklar vb. HPLC yardm ile kolayca saptanabilmektedir.

Yksek basnl sv kromatografisi, biyolojik materyaldeki ila ve ila metabolitlerinin analizine de olanak salamakta ve bu balamda plazmadaki ila dzeyinin saptanmas, doz ayarlanmas, biyoyararllk gibi konulara ait almalar yaplmaktadr. Bu tr almalarda kullanlacak rnek, dier metotlara gre daha kolay hazrlanabilmekte ve proteinler ktrldkten, partikller szldkten sonra cihaza verilebilmekte, baz durumlarda rnein idrarla alrken sadece szme ilemi bile rnei cihaza enjekte etmek iin genellikle yeterli olmaktadr.

BLM 7. DENEYSEL KISIM

7.1. Enstrumentasyon ve Mobil Faz Absorpsiyon lmleri iin Shimadzu UVPC yazlm yklenmi bir Shimadzu UV240 ift nl UV-VIS spektrofotometresi kullanld. lmlerde 1 nm slit aral kullanld ve spektrumlar 0,1 nm aralklarla elde edildi. Verilerin dzenlenmeleri, regresyonlar ve istatistiksel analizler iin UVPC ve EXCEL yazlmlar kullanld. ESI-MS lmleri Finnigan LCQ iyon trap MS (San Jose, CA, USA) cihazyla yapld ve Xcalibur (v. 1.2) yazlm ile elde edilen sonular deerlendirildi. Standart bir Finnigan elektrosprey aleti pozitif ve negatif iyon modunda altrld. Ktle lmleri iin alma koullar; kapiler scakl, 200 C; kapiler voltaj, () 20,0 V; iyon sprey voltaj, () 4,5 kV; zc buharlatrc gaz ak hz 20 birim olarak seildi. Kromatografik almalarda bir Agilent 1100 HPLC (Agilent Technologies, Inc., California, USA) sistemi kullanld. Bu sistem drtl bir pompa sistemi, otomatik numune verici, termostatl kolon kompartman ve diyot array dedektrne (DAD) sahiptir. Elde edilen verileri ilemek iin Hawlet-Packard tarafndan yazlan HP Chem Station yazlm kullanld. Karmlarn ayrlmas ise Waters Symmetry C18 kolonu (5 m 4,6 x 150 mm) kullanlarak gerekletirildi. Ak hz 0,8 mL/min ve enjeksiyon hacmi 20 L olarak kullanld. Hareketli faz gnlk olarak hazrland ve 0,45 m membran filtreden geirilerek szld.

7.2. Ticari Tablet Formlasyonu Metot gelitirme iin 875 mg AMX, 125 mg KLV ieren bir ticari tablet formlasyonu (I. E. ULAGAY, TURKEY tarafndan retilmi Croxilex-BID 1000 mg kapl tabletler Batch no.401006 ) kullanld. Btn nerilen metotlar bu tablet

42

zerinde uyguland. AMX, KLV, ASP ve CLN Trk Farmakoloji firmalar tarafndan saland.

7.3. Standart zeltiler 35 mg/100 mL AMX, 25 mg/100 mL KLV, 30 mg/100 mL ASP ve 30 mg/100 mL CLN ieren stok zeltiler su ile hazrland. Oluacak bozunmalardan dolay meydana gelecek hatalar nlemek amacyla deneyin her seti iin taze zeltiler hazrland. AMX iin 21-49 g/mL ve KLV iin 3-7 g/mL ieren zeltilerin standart bir serisi stok zeltiler kullanlarak hazrland. metot iin ayn konsantrasyon aralndaki zeltiler kullanld. ESI-MS almalar iin 30 g/mL internal standart (IS) her bir zeltiye eklendi. Btn kalibrasyon denklemleri farkl lm kullanlarak elde edildi ve final sonular bunlarn ortalamas alnarak elde edildi.

7.4. Tablet Analizi Tablet zeltisi hazrlanmasnda, 10 tablet tartld ve bir havanda toz haline getirildi. Bu 10 tabletin ortalamalarndan bir tablet miktar kadar tartlarak 100 ml kalibreli bir volumetrik iede 100 ml su ierisinde zld. Hazrlanan zeltiler 0,45 m tek kullanmlk membran filtrelerden szld. Final zeltisi deneysel almalar iin allacak konsantrasyon aralna seyreltildi.

BLM 8. SONULAR VE TARTIMA

ekil 8.1 AMX ve KLVn her ikisinin suda alnm absorpsiyon spektrumlardr. Bileiklerin absorpsiyon spektrumlar iki etken maddenin dramatik konsantrasyon farklarn gsterir ve her iki bileik iin akan spektrumlarnn spektrofotometrik zmlenmesi iin baz kstlamalar getirir. Bu karm tabletlerin her iki etken maddesinin kantitatif tayini iin metotlarn avantajn gsteren mkemmel bir modeldir. Birinci trev metodu bir karm iindeki etken maddelerin zmlenmesini salayan sfr kesim noktas [7-12] kullanr. Sfr kesim noktas metodu karmlarn akan spektrumlar iin dezavantajlara sahiptir. allan dalga boylarnda baz kk kaymalar olmas ve trev spektrum piklerinin genellikle allan dalga boylarna uygun dmemesi riskleri vardr ki bu durumun spektrumun eimi ok yksek olduu zaman kesinlik ve dorulukta kayp ve dk hassasla neden olmas gibi tehlikeleri vardr [19].

44

2.0 a5 a1 1.0 b5 0.5 b1

AMX KLV

1.5 Absorbans

0 200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

Dalga boyu (nm)

ekil 8.1. Suda AMX (---) ve KLV (__ )absorpsiyon spektrumlar a1 - a5 ; 21 g/mL den 49 g/mL ye AMX konsantrasyonlarn gsterir b1 - b5 ; 3 g/mL den 7 g/mL ye KLV konsantrasyonlarn gsterir

ekil 8.2 AMX ve KLV iin kalibrasyon aamasnda birinci trev spektrumlarn gsterir. AMX uygun kalibrasyon iin yeterli sinyal younluunu salarken, KLV daha iyi bir kalibrasyon iin yeterli akl gstermez. Birinci trev ayrca spektrumun grlt seviyesini de arttrr ve bu durum belirli sfr kesim noktalarnda sinyal younluunun okunmasn daha da zorlar. Trev spektrumlarnda sinyalin grltye orann ve pik eklini etkileyen ana parametrelerden biri deeridir. Bu parametre iyi zmlenmi geni bir pik vermesi iin iyiletirilmi olmaldr rnein; tayinde yksek hassaslk ve iyi seicilik vermesi gibi. Daha yksek deerlerinde sinyal-grlt oran daha iyileir bylece trev spektrumundaki ini klar azalr. Ayrca, eer deeri ar yksek olursa ikinci

45

trevin spektral younluu ktye gider. nn eitli deerleri test edildi ve uygun sinyal-grlt orann vermesi amacyla =5 nm seildi.

0.02 0 Birinci trev -0.02 -0.04 -0.06 -0.08 -0.1 b1 b5 a5 a1

AMX KLV

210

220

230

240

250 260 Dalga boyu

270

280

290

300

ekil 8.2. Suda AMX (---) ve KLV (__ ) birinci trev spektrumlar a1 - a5 ; 21 g/mL den 49 g/mL ye AMX konsantrasyonlarn gsterir b1 - b5 ; 3 g/mL den 7 g/mL ye KLV konsantrasyonlarn gsterir

Trev spektrofotometrisi bir spektral erinin matematiksel trevlerinden birinin izilmesi ve hesaplanmasn kapsar. Bylece, ok bileenli sistemlerin zmlenmesi, azaltlm rnek trbidimetresi ve spektral detaylarn azaltlmas gibi birok analitik probleme uygun zmler getirir. Baka yerlerde de trev spektrofotometrisinin teorik ksmn bulmak mmkndr [7-12]. Trev-UV spektrofotometrisinin zmlenmesinin arttrlmas ilalarn tayinleri iin avantaj olarak kullanlr. Bilindii gibi daha yksek dereceli trevler daha sivri pik genlikleri, ama verilen bir eri iin bant genilii daha dk trev absorbans birimleri verir [19]. Trev derecesinin en iyi seimi geni perdelemelerin daha ok azald zamandr. Bizim durumumuzda KLV iin verdii dk absorpsiyon deerlerinden dolay birinci trev seildi.

46

ekil 8.3 internal standart varlnda sz konusu bileiklerin negatif iyon ESI-MS spektrumlarn gsterir. Spektrumlar hibir n ayrma teknii olmakszn alnd.

(ASP-H)

10 9 9 8 8 7 7

178.9
(KLV-H)
-

197.9

Bal pik iddeti

6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 5 0 20 25 30
223. 255. 300.

(AMX-H)

363.9

(2AMX-H)

728.9
319. 337.

396.

426.

485.

538.

585.

650. 672. 726.

748.

35

40

45

50

55

60

65

70

75

m/z

ekil 8.3. Suda AMX 35 g/mL, KLV 5 g/mL ve IS 30 g/mL tablet formlasyonunun negatif iyon ESI-MS spektrumlar MS koullar: negatif ESI modu; stlm kapiler scakl, 200 C; kapiler voltaj, 4,5 kV; zc buharlatrc gaz ak hz, 20 birim

Spektrumlardaki btn pikler tespit edildi ve pik ykseklikleri kantitatif almalar iin kullanld. alma parametreleri bileiin karm zeltisi 5 L/min bir hacimle ktle spektrometrisine direkt enjekte edilmesiyle belirlendi. Deiik ktle spektrometrik koullar (ESI probe scakl, kapiler voltaj ve koni voltaj) aratrld. ESI probe scakl kabul edilebilir en dk scakla ayarland (200 C). Kapiler voltaj internal standart varlnda AMX ve KLV tayini iin -4,5 kVta sabit tutuldu. AMXda ktle spektrumu elektrosprey kaynandaki iyonizasyondan sonra m/z 363.9te deprotone

47

olmu trler, [AMX-H]-, verdi. KLVn negatif iyon ESI spektrumu m/z 197.9de deprotone bir pik verdi, [KLV-H]-. Kantitatif almalar iin m/z 178.9de internal standardn deprotone bir molekler iyonu, [M-H]-, kaydedildi. Bu almada bu iki bileiin negatif iyon ESI-MS spektrumlar tablet ieriinden hibir perdeleme olmadn kantlamak iin alnd. 728.9 amuda gsterilen pik zeltideki AMX [2AMX-H]- nun dimer oluturduunu gsterir ve bu pikin younluu konsantrasyon arttka artar. Bu durum ayn zamanda zeltideki AMXun miktarn kantitatif olarak belirlemek iin baka bir frsat verir. Ayn zamanda pozitif iyon modunda allarak baka bir ESI-MS metodu gelitirildi. Temel olarak, KLV pozitif iyon modunda kendi bana birok potasyum ve sodyum kompleksleri oluturur. AMX gibi dier potasyum kapan bileikler KLVn ESI-MS spektrum profilini deitirdi ve grlmesini imkansz hale getirdi. Pozitif iyon modunda, KLVn miktarn tayin etmek iin AMXun potasyum kompleksini kullandk. nk AMXa btn potasyum KLV tarafndan salanm olacak ve [AMX+ K]+nin pik younluu kantitatif almalar iin kullanlabilir olacaktr. ekil 4 tablet ieriinin pozitif iyon modunda spektrumlarn gsterir ve set ii spektrumlar KLVn sudaki pozitif iyon ESI-MS spektrumlarn gsterir. Pozitif iyon modunda CLN yi internal standart olarak kullandk. Bu antibiyotii sememizin nedeni hibir sodyum veya potasyum kompleksi oluturmamasyd bu durumda kantitatif almalarn pozitif iyon modunda yaplmas mmkn oldu. CLN ok iyi pozitif iyon spektrumu vermesine ramen, hi negatif iyon spektrumu vermez dolaysyla negatif iyon almalar iin ASP kullandk. Spektrumlar kantitatif ESI-MS almalarnda neden negatif iyon modunun esas metot olarak seildii hakknda bilgi verdi. Bunun sebebi pozitif iyon modundaki spektrumlarda KLV pikinin yokluu ve temel olarak kantitatif almalar iin basit MS spektrumlar vermesidir.

48
(AMX+H) + 365.9
(2KLV+3K+2H) +

100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Bal pik iddeti

(IS+H) + 425.1

100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

512.8 (2KLV+2K+Na -2H) + 496.8 (3KLV+3K+Na -3H) + 733.8 (KLV+2K -H)+ 275.9

Relative Abundance

(2KLV+4K+3H) + 749.7

(3KLV+2K+2Na -3H) + 717.8 (KLV+Na +K-H) + 259.9 (2KLV+K+2Na -2H)+ 480.8 514.8 594.7 610.7 194.1 169.9 244.0 287.0 341.9 373.7 578.7 375.7 432.1 565.0 655.3 701.9 692.7 766.9

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

m/z

(2AMX+H) + + 730.9 (2AMX+K) 768.6

(AMX+K) + 403.9 438.7 (AMX -OH) + 348.9

165.8 244.9 274.9 311.8

388.9

(2AMX+Na) + 752.9

460.7

507.9

567.4

614.0

626.1

707.9

790.7

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

ekil 8.4. Suda AMX 35 g/mL, KLV 5 g/mL ve IS 30 g/mL tablet formlasyonunun pozitif iyon ESIMS spektrumlar resim suda KLV pozitif iyon spektrumlarn gsterir MS koullar: pozitif ESI modu; stlm kapiler scakl, 200 C; kapiler voltaj, 4,5 kV; zc buharlatrc gaz ak hz, 20 birim

m/z

ekil 8.5de her iki bileiin kromatogram gsterildi. Elde edilen kromatogram birbirini perdeleyen hibir pik olmadn gsterdi. AMX ve KLVn alkonma zamanlar srasyla 2,2 ve 4,5 dakikayd. Rutin rnek analizinde 6 dakikalk kromatografik yrtme sresi yeterliydi. Bu kromatografik almada internal standart kullanlmad. Her bir kromatografik yrtmenin normalizasyonu iin toplam pik alanlar kullanld. 8.1. Birinci Trev Metodu Spektrumlarn trevleri =5 nm aralklarla hesapland ve sonuta elde edilen spektrum ekil 8.2de gsterildi. En iyi kalibrasyon denklemi iin farkl deerleri denendi ama hesaplamalar iin en uygun olarak =5 nm deeri bulundu. Bileiklerin absorpsiyon spektrumlarnn trevi alndktan sonra iki farkl kalibrasyon denklemi kurabilmek iin sfr kesim noktalar belirlendi. Her bir bileik iin sentetik karmlarda ve tabletlerde

49

konsantrasyon hesaplamalarnda kullanlabilen dz izgiyi veren dier bileiin absorpsiyon deerlerine karlk gelen konsantrasyonlarn grafii izildi. Ayn metot dier bileik iin de uyguland. kili bir karmdaki AMX ve KLV miktarlar sinyallere orantl olacak ekilde bulundu ve kalibrasyon denklemlerinin istatistiksel parametreleri Tablo 8.1de zetlendi. 8.2. ESI-MS Metot ki ilacn negatif ve pozitif iyon ESI-MS spektrumlar ve internal standartlar srasyla ekil 8.3 ve ekil 8.4te gsterildi. Negatif iyon spektrumunda ASP internal standart olarak kullanld. AMX

KLV
iddet

Alkonma zaman (min)

ekil 8.5. Suda AMX ve KLV HPLC kromatogram; kromatogramlar en yksek konsantrasyonlarda alnd (Her iki ila iin KLV iin 7 g/mL ve AMX iin 49 g/mL )

50

Spektrumlarda bileiklerin hepsini ve ek pikleri grmek mmkndr. AMX zeltide protone olmu dimer verir, bu yzden biz de en iyi kalibrasyon denklemlerini elde etmek iin ayn bileik iin ilgili btn pikleri younluklarn birbirine ekleyerek dahil ettik. Pozitif iyon ESI-MS internal standart olarak CLNyi kulland dolaysyla ek pikler oluturdu ve biz hesaplamalar iin ayn prosedr uyguladk. Elektrosprey temel olarak; stlan kapiler scakl, kapiler voltaj, skimer voltaj ve ESI kaynandaki dier birok parametreye bal olarak deiik pikler retti. Bu almada ESI kayna en iyi iyonlama salamak, byk molekl topluluklar oluumunu nlemek, kolay iyonlaabilen madde engellemelerini gidermek ve iyonlarn paralanmalarn nlemek iin optimize edildi. Kalibrasyon prosedr iin AMX, KLV ve ISin kalibrasyon standartlar analiz edildi. AMX ve KLVn pik ykseklikleri IS pik yksekliine blnerek normalize edildi. Bu normalize edilmi deerlerle konsantrasyonlar arasnda dorusal bir iliki olduu gzlemlendi ve ilgili doru denklemleri Tablo 8.1de gsterildi. Btn durumlarda kalibrasyon erilerinde geri hesaplanan konsantrasyonlar nominal deerlerin 5 %i iindeydi ve konsantrasyon ve elde edilen dedektr sinyalleri arasndaki iliki dorusal model kabul edilebilir bulundu. 8.3. HPLC Metodu ekil 8.4te verilen kromatogram 21-49 g/mL AMX ve 3-7 g/mL KLV konsantrasyonlarna karlk gelir. Dedektr karl pik alan olarak lld. Kromatografik ayrma Waters Symmetry C18 Column 5 m 4,6 x 150 mm kolonunda, oda scaklnda ve 0.1 M fosfat tampon (pH=8) ve asetonitril (v/v, 60:40) den oluan mobil fazda gerekletirildi. Ak hz 20 L enjeksiyon hacmi ile 0,8 mL/min olarak ayarland. almalar srasnda internal standart kullanlmad. Kalibrasyonlar iin btn pikler her bir kromatogramdaki her bir ilacn pik alanna karlk toplam alan kullanlarak normalize edildi. Btn enstrmental ve deneysel parametreler sz konusu metotlar iin en iyi sinyal-grlt orann elde etmek iin iyiletirildi. Trev hesaplamalar iin trev ileminden sonra azalan younluklara bal olarak bileiklerin sinyal younluklar nemlidir. ESI-MS durumu iin ktle

51

spektrometrisinin dk tayin limitine bal olarak sinyal younluu problem olmaz. Bu metotta salam bir metot elde etmek iin nemli parametreler zeltilerin hazrlanmas ve ESI kaynak parametreleridir. 8.4. Metot Validasyonu Her iki ila iin de; AMX iin 2149 g/mL, KLV iin 37 g/mL konsantrasyon aralklar zerinden be noktal kalibrasyon erileri oluturuldu. Bu konsantrasyon aral spektrofotometrik metot gelitirme iin kullanlan ve absorpsiyon almalar iin beklenen ila konsantrasyonu baz alnarak seildi. ESI-MS ve HPLC almalar ilalarn iyiletirilmi pik alanlarna karlk konsantrasyonlarn grafii izildi ve konsantrasyon aralklar iinde dorusallk bulundu. Saf ilalarn ve karmlarn regresyon denklemleri arasnda benzerlik gzlemlendi ki bu da bir ilacn varlnda dierinin tahmininde herhangi bir perdeleme olmayacan gstermektedir. Kalibrasyon grafiklerinden regresyon denklemleri eimin (Sb) ve kesimin (Sa) standart sapmalar hesapland. Kalibrasyon grafiklerinin dorusallklar ve absorpsiyon lmlerinin Beer kanunlarna uyumu regresyon denklemlerinin korelasyon katsaylarnn (r) yksek deerleri sayesinde kantland. Tablo 1de elde edilen kalibrasyon denklemleri ve hata deerleri gsterilmitir. Saf formdaki AMX ve KLV iin ve her iki ilacn sentetik karmlar iin ve tabletlerin ierikleri iin geri kazanm yoluyla uygulanan metotlarn kesinlii ve seicilii kantland. Sentetik karmlar hazrlamak iin kalibrasyon iin kullanlan stok zeltileri seyreltildi. Metotlarn yzde geri kazanmlar 100 5% civarnda bulundu (Tablo 8.2).

52

Tablo 8.1. farkl metottan elde edilen kalibrasyon grafiklerinin istatistiksel sonular
Metot D ESI-MS NEGATF ESI-MS POZTF HPLC la AMX KLV AMX KLV AMX KLV AMX KLV 284.4 230.4 220 220 Regresyon denklemi A= -2.91E-04CAMX-1.20E-05 A= 8.88E-04CKLV - 1.76E-02 A= 3.56E-02CAMX - 2.95E-01 A= 7.67E-02CKLV - 2.72E-01 A= 6.67E-02CAMX - 2.03E-01 A= 1.95E-01CKLV - 8.81E-01 A= 2.46E-02CAMX - 1.93E-01 A= 2.06E-02CKLV - 6.40E-03 r 0.9997 0.9991 0.9957 0.9919 0.9965 0.9981 0.9991 0.9973 SE(m) 6.15E-06 2.12E-06 1.40E-03 4.00E-03 2.30E-03 4.90E-03 5.91E-04 8.75E-04 SE(n) 2.24E-04 2.21E-04 4.91E-02 4.15E-02 8.29E-02 5.11E-02 2.15E-02 9.10E-03 SE(r) 1.36E-04 1.34E-04 2.99E-02 2.52E-02 5.04E-02 3.11E-02 1.31E-02 5.50E-03

D C A r SE(r) SE(m) SE(n)

= = = = = = =

Birinci trev Konsantrasyon (g/mL) AMX ve KLV iin seilen dalga boylarnda genlikler Regresyon katsays Dorusal regresyonun standart hatas Eimin standart hatas Kesimin standart hatas

Farmakolojik tabletteki ieriin perdelemeleri metotla detayl ekilde alld. Bu yzden bu iki bileii ieren standart ekleme teknii ticari tabletlere uyguland. Standart ekleme metodunun uygulanmasnda uygulanan metotlarn standart hatalar, standart sapmalar ve nispi standart sapmalar alt sonu iin hesapland ve Tablo 8.3 te gsterildi. Elde edilen sonulara gre, bu metotlar iin iyi bir kesinlik ve doruluk olduu gzlendi. Sonu olarak iki bileiin analizinde tablet ierii engellemeye neden olmaz. Bu sonular ayn zamanda tablet ieriinin ok fazla perdeleme etkisi olmadn kantlar.

Tablo 8.2. Uygulanan kalibrasyon teknikleri ile farkl sentetik karmlarda AMX ve KLV tayini iin elde edilen geri kazanmlar

Eklenen HPLC AMX 48.49 41.61 34.67 28.00 20.99 34.80 35.16 34.85 34.68 34.41 47.95 41.81 28.21 21.09 5.96 6.87
ORTALAMA

D D AMX 97.3 100.5 99.9 100.6 99.2 99.0 100.5 99.3 99.7 101.0 98.5 103.5 KLV 95.2 94.8 103.4 100.0 96.7 95.5 98.7 96.9 105.6 98.1 104.4 104.6 AMX 101.7 101.5 102.1 98.5 99.3 102.1 102.2 101.6 100.6 100.6 101.3 102.2 KLV 97.9 101.8 101.0 100.6 102.9 99.0 100.1 100.0 103.0 103.5 99.9 101.8 KLV 4.76 4.74 5.17 5.00 4.84 6.69 5.92 4.85 4.23 2.95 4.18 5.23 6.17 6.83 27.58 20.99 6.11 7.00 27.81 21.09 5.89 7.15 AMX 49.84 42.63 35.72 27.59 20.86 35.75 35.77 35.56 35.22 35.22 49.65 42.91 KLV 4.90 5.09 5.05 5.03 5.15 6.93 6.01 5.00 4.12 3.11 4.00 5.09 AMX 49.21 42.22 35.43 27.60 21.23 35.57 35.85 35.36 35.43 35.29 49.28 42.49 KLV 5.17 5.06 5.05 5.01 4.98 7.16 5.89 5.13 4.09 3.09 4.15 5.04 KLV 4.85 4.85 4.79 4.81 4.88 6.74 5.90 4.79 4.00 3.03 3.92 4.80

BULUNAN ESI-MS ESI-MS NEGATF POZTF

% Geri Kazanm ESI-MS ESI-MS NEGATF POZTF AMX 104.5 101.0 102.2 97.9 100.1 103.1 101.7 102.3 100.9 99.6 102.8 98.7 KLV 102.8 107.4 97.7 100.6 106.4 103.7 101.4 103.2 97.5 105.5 95.7 97.3

HPLC AMX 99.0 99.1 99.1 100.0 99.9 99.4 100.5 99.6 99.1 98.3 97.9 99.5 KLV 96.9 97.0 95.8 96.1 97.6 96.2 98.3 95.7 99.9 100.9 97.8 95.9

AMX 49 42 35 28 21 35 35 35 35 35 49 42

KLV 5 5 5 5 5 7 6 5 4 3 4 5

AMX 47.66 42.19 34.98 28.17 20.83 34.64 35.18 34.77 34.89 35.35 48.25 43.48

28 21

6 7

27.64 20.79

SD RSD

98.7 99.0 99.8 1.46 1.47

102.8 97.5 99.6 3.84 3.85

98.5 99.9 100.9 1.33 1.32

101.8 100.0 101.0 1.61 1.59

99.8 100.9 101.1 1.81 1.79

99.0 102.6 101.5 3.66 3.60

100.7 100.4 99.5 0.80 0.81

99.2 98.1 97.5 1.62 1.66

53

SD = Standart sapma RSD = Bal standart sapma

54

Tablo 8.3. nerilen kalibrasyon teknikleri tarafndan ticari tablete uygulanan standart ekleme metodunun sonular D
ESI-MS NEGATF ESI-MS POZTF HPLC

ORTALAMA SD RSD SE CL(0.05)

AMX 34.9 1.22 3.5 0.71 2.81

KLV 4.83 0.13 1.31 0.07 0.29

AMX 34.85 0.92 2.63 0.53 2.11

KLV 4.91 0.06 0.64 0.04 0.14

AMX 35.21 1.52 1.51 0.62 1.22

KLV 5.04 1.59 1.58 0.65 1.27

AMX 34.65 0.09 0.27 0.05 0.22

KLV 4.83 0.11 1.16 0.06 0.26

Tayin limitleri (LOD) ve kantitatif (nicelendirme) limitler (LOQ) kalibrasyon verilerinden hesapland ve Tablo 8.4te gsterildi. LOD ve LOQ metodun hassaslna karar verir. LOD analitin tespit edilen en kk konsantrasyonu iken LOQ minimum llebilen konsantrasyondur. AMX ve KLV iin bunlar srasyla 0,87 ve 0,47 g mL-1 dzeylerindedir. LOQ deerleri AMX ve KLV iin srasyla 2,01 ve 0,99 g mL-1 dir. Metodun seicilii farmakolojik preperasyonun test edilmesiyle tespit edilir. Bu sonular her iki tayin ve kantitatif limitlerinin kabul edilebilir aralkta olduunu gsterdi. Tablo 8.4 AMX ve KLVn drt metot iin LOD ve LOQ deerleri hakknda detayl bilgi gsterir. Ticari tablet denemelerinde uygulanan metotlar deerlendirildi. Alt edeer numune tayini yapld. Her iki ilacn geri kazanmlar iin uygun sonular elde edildi (Tablo 8.4) ve tablet ierikleri ile iyi uyuma iindeydi. Trev spektrofotometrik metodunun validasyonu iin sonular HPLC metodundan alnan sonularla karlatrld. Ticari tablet iin sonular Tablo 8.4 te verildi. Bir yol metot tarafndan elde edilen tablet sonularna ANOVA (varyansn analizi) uyguland. Test sonular Tablo 8.4 te tablolatrld. Hesaplanan F deerleri metotlar arasnda ok fazla farkllk olmadn kantlayacak ekilde tablolatrlm F deerlerinden daha dk bulundu. Bu almada sunulan btn prosedrler AMX ve KLVn karmlarnn laboratuar rnekleriyle iyi bir kesinlik ve dorulukla llmesini mmkn klar. Sonular ESI-MS metodunun uygulamalarnn kk absorpsiyon deeri olan ilalarn llmesi iin nemli bir avantaj saladn gsterir. Metodun avantaj temel olarak kolaylndan kaynaklanr. Ayrca bu hzl ve ekonomik bir metottur.

55

Tablo 8.4. nerilen kalibrasyon metotlar tarafndan farmakolojik dozaj formlarnda elde edilen sonular

D AMX 35.05 ORTALAMA: 0.99 SD 2.82 RSD 0.57 SE 2.26 CL(0.05) 0.5344 ANOVA Fteorik 3.6823 0.8752 LOD 2.0056 LOQ KLV 4.81 0.07 0.73 0.04 0.16 0.9217 3.6823 0.6258 1.5095

ESI-MS NEGATF

ESI-MS POZTF

HPLC KLV 5.05 0.63 0.62 0.26 0.5 0.9217 3.6823 0.5674 1.2342 AMX 34.2 0.08 0.22 0.04 0.17 0.5344 3.6823 0.7821 2.0772 KLV 4.82 0.11 1.19 0.07 0.26 0.9217 3.6823 0.475 1.1389

AMX 34.7 0.77 2.21 0.44 1.76 0.5344 3.6823 0.7713 1.8939

KLV 4.96 0.13 1.28 0.07 0.29 0.9217 3.6823 0.3255 0.995

AMX 35.2 1.99 1.98 0.81 1.59 0.5344 3.6823 0.6534 1.9546

la ierii (mg) : Tablet bana 875 mg AMX,125 mg KLV Deerler 25 kez seyreltilmi konsantrasyon deerlerini gsterir Sonular her bir metot iin 6 kopyann ortalamasndan elde edildi SE: Standart hata CL: Gvenirlik limiti

Ayn zamanda kantitatif almalar iin uygun internal standart bulma, kompleks oluumlar ve iyon basklar gibi baz kstlamalara sahiptir. Gsterilen deneysel sonular doru, kesin ve hassas olarak dorulanan metotlarn kullanlabilirlii, tekrar edilebilirlii ve gvenilirlii iin tam kant salar. Sonulardan, HPLCnin dier ikisinden daha iyi sonular verdii aktr ama genellikle metot gelitirme iin masraf ve ekstra zaman tketimi getirir ve bazen bu bileikleri birbirinden ayrmak mmkn olmaz. Uygulanan iki metot ilem prosedrlerinin detayl bilgisini gerektirmez. Bundan dolay bu metot dier daha fazla zaman tketici kromatografik tekniklerle kyaslandnda hzl ve ekonomiktir.

56

8.5. Sonular Bu almann amac uygulanan spektrofotometrik metotlar ESI-MS metotlaryla karlatrmak, ESI-MS metodunun kalibrasyonlar iin daha fazla seicilik verecek ekilde farmakolojik alanda kullanlabilir olduunu gstermek ve HPLC deerleri ile sonularmz dorulamaktr. UV spektrumunda AMX ve KLV kombinasyonlar byk farkllklar gstermedii ve KLV fazla absorpsiyon yapmad halde kantitatif almalar iin birinci trev metodunun kullanlabilir olduu gsterildi. ESI-MS iki aktif bileik arasnda dramatik konsantrasyon farkllndan etkilenmeksizin daha iyi ve eitli pikler vermektedir. Bu iki bileiin hibir n ayrma ve piklere ierik etkisi olmadan hem birinci trev hem de ESI-MS metotlar kullanlarak kolayca llebildii gsterildi. Gelitirilen HPLC metodu ayn zamanda elde edilen sonularn, dalm almalar ve tablet analizi iin kabul edilebilir aralklar iinde olduunu kantlamaktadr.

KAYNAKLAR

[1] [2]

KRAMER, R. 1998. Chemometric Techniques for Quantitative Analysis. 51. Marcel Dekker Inc., New York. PATRICK, W. C., BEEBE, K. R., and KOWALSKI B. R. 1987. Multicomponent Analysis Using an Array of Piezoelectric Crystal Sensors. Analytical Chemistry 59. 1529 ADAMS, M.J., 1995. Chemometrics in Analytical Spectroscopy. 187. The Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, Science Park, Cambridge. MARTENs, H. and Naes, T. 1991. Multiseriate Calibration, Wiley, Chichester, UK. HAALAND, D. M., THOMAS, E. V. 1988. Anal. Chem. Partial leastsquares methods for spectral analyses. 2. Application to simulated and glass spectral data. 60: 1202-1208. COWE I.A., MCNICOL J.W., CUTHBERTSON D.C., 1998. Principal component analysis: a chemometric approach to the analysis of near infrared spectra Analyst, 510, 1233.Analytical Proceedings, 27: 61. STROJEK, J. W., YATES, D., and KUWANA, T., 1975. Derivative spectrophotometry. Application to trace sulfur dioxide analysis Anal. Chem. 47:1050. GREEN, G. L. and O'HAVER, T. C. 1974. Derivative luminescence spectrometry. Anal. Chem. 46:2191. BERZAS NEVADO, J. J., CABANILLAS C. G. and SALINAS, F. 1992. Spectrophotometric resolution of ternary mixtures of salicylaldehyde, 3hydroxybenzaldehyde and 4- hydroxybenzaldehyde by the derivative ratio spectrum-zero crossing method. Talanta.39: 547-553 OHAVER, T.C., GREEN, G.L.1976. Numerical error analysis of derivative spectrometry for the quantitative analysis of mixtures. Anal. Chem. 48:312. O'HAVER. T. C., FELL. A. F., SMITH, G., GANS, P., SNEDDON, J., BEZUR, L., MICHEL, R. G., OTTAWAY, J. M., MILLER, J. N.,

[3]

[4] [5]

[6]

[7]

[8] [9]

[10]

[11]

58

AHMAD, T. A., BRIAN P., 1982. Derivative spectroscopy and its applications in analysis. Anal. Proc., 19:22. [12] MORELLI B., 1988. First and second derivative spectrophotometric assay of mixtures of cefuroxime and cephalexin. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 6:199. NEEDHAM, S. R., COLE, M. J., and FOUDA, H. G., 1998. Direct plasma injection for high-performance liquid chromatographicmass spectrometric quantitation of the anxiolytic agent., Journal of Chromatography: Biomedical Applications, 718:87-94. CHOWDHURY, S. K., LAUDICINA D., BLUMENKRANTZ N., WIRTH M. and ALTON K. B., 1999. An LC/MS/MS method for the quantitation of MTIC (5-(3-N-methyltriazen-1-yl)- imidazole-4-carboxamide), a bioconversion product of temozolomide, in rat and dog plasma, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 19: 659-668. KESKI-HYNNIL, H., RAANAa, K., FORSBERG, M., MNNIST, P., TASKINEN, J. and KOSTIAINEN, R., 2001. Quantitation of entacapone glucuronide in rat plasma by on-line coupled restricted access media column and liquid chromatographytandem mass spectrometry, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications,759:227-236. DING, L., LI, L., TAO, P., YANG, J., and ZHANG, Z., 2002. Quantitation of tamsulosin in human plasma by liquid chromatographyelectrospray ionization mass spectrometry Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 767:75-81. HAN, X., 2002. Characterization and Direct Quantitation of Ceramide Molecular Species from Lipid Extracts of Biological Samples by Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Biochemistry, 302:199-212. KOCH, D. E., ISAZA, R., CARPENTER, J. W. and HUNTER, R. P. 2004. Simultaneous extraction and quantitation of fentanyl and norfentanyl from primate plasma with LC/MS detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 34:577-584. ERGEN, N., GRSOY, A., ATE, ., lalarn Tannmas ve Kantitatif Tayini, 4. Bask, stanbul niversitesi Yaynlar, stanbul, 1989. C. CAZAUBON, J. GOUGAT, F. BOUSQUET, et al., J. Farmak ol. Exp. Ther. 265 (1993) 826 834. TALSKY, G, Derivative Spectophotometry, Germany, 1994. SKOOG, A.D., HOLLER, F.J. ve NIEMAN, T.A., Analitik Kimya Temelleri, 7. bask, Bilim yaynclk, Ankara, 1999.

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19] [20] [21] [22]

59

[23] [24]

GNDZ , T., nstrmental Analiz, Gazi Kitabevi Ankara 1999, (12251273) DANIEL C. HARIS, W., H., FREEMAN, Quantitative Chemical Analysis Seventh Edition(Michelson Laboratory, China Lake) (Avail. 6/2006) May 2006,928, (4-7) SKOOG, D., A., LEARY, J., J., Principles of Instrumental Analysis, Forty Edition Printed in the United States of America by Saunders College Publishing Orlando 1992, (726-733)

[25]

60

ZGEM

1983 ylnda Sakarya ili Adapazar ilesinde doan Ayenur KORKMAZ; ilk, orta ve lise renimini Adapazarnda tamamlad. 1999 ylnda Abant zzet Baysal niversitesi Fen-Edebiyat Fakltesi ngilizce Kimya blmn kazand ve 2003 ylnda bu blmden mezun oldu. 2004 Bahar yarylnda Sakarya niversitesi Fen Bilimleri Enstits Kimya Anabilim dalnda Yksek Lisans renimine balad. Halen Dzce ilinde ngilizce retmeni olarak grev yapmaktadr.