Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı

Dr. Klara DALVA
Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hematoloji Bilim Dalı, Ankara

1. Giriş Akım Sitometrisinin (ASM) güncel hematolojik uygulamalardaki kullanımı giderek artmaktadır. Bu artışın nedenleri arasında, kısa sürede sonuç alınabilmesi, kullanımının kolay öğrenilebilmesi, anormal hücrelerin tanınmasına olan katkıları sayılabilir. ASM hematolojide en çok tanı, lösemi/ lenfoma/miyelom gibi hastalıkların sınıflanması ve tedavinin takibi amaçlarıyla kullanılmaktadır. Akım Sitometresi ile bir süspansiyon halindeki hücre ya da partiküller lazer ışığı ile aydınlatılmakta olan bir bölmeden geçirilir; hücrelerin ışığın önünden geçerken verdikleri sinyaller toplanarak analiz edilir. Oluşan sinyallerin kaynağı, hücrenin büyüklük, granülarite gibi fiziksel özellikleri olabildiği gibi; hücreye bağlanan çeşitli florokromlar da olabilir. Böylece hücre ya da partikülün immunfenotipi, DNA içeriği, enzim aktiviteleri, hücre membran potanasiyeli, canlılığı gibi çeşitli özellikleri hakkında bilgi toplanabilir. 2. Kullanım Alanları Akım Sitometrisinin Hematolojide en çok kullanıldığı alanlar arasında: • Lösemik hücrelerin immunfenotiplemesi • Hücrenin DNA içeriğinin ve hücre döngüsünün analizi, • Hematopoetik kök hücrelerin sayılması ve alt gruplarının belirlenmesi, • Hücre canlılığının tespit edilmesi, apoptoz ile ilgili araştırmalar • Çoklu ilaç direncinin(MDR) tespit edilmesi • Hücresel immun yanıtın belirlenmesi • Trombosit çalışmaları

• Trombosit ürünlerine bulaşmış lökositlerin sayılması, • Hedef olarak seçilen hücrelerin floresanla işaretlenerek saflaştırılması ve diğer uygulama alanları sayılabilir. ASM çalışmaları için perifer kan örneği, kemik iliği aspirasyon materyali ve biyopsileri, ince iğne aspirasyon materyalleri, tüm vücut sıvılarındaki hücreler [Bronkoalveolar lavaj(BAL), Lomber ponksiyon(LP) ile alınan örnekler…] kullanılabilir. 2.1 İmmun Fenotipleme İmmunfenotipleme, hematolojik malinitelerin tanınmasına ve morfolojiye ek bilgiler kazandırarak tiplendirilmesine yardımcı olmaktadır. Hücre yüzey antijenlerinin tanımlanmasında “Cluster of Differantiation, CD” terminolojisi kullanılır. Antijenlerin çoğu bir hücre serisine eşlik etseler de o seriye özgün değildirler. Farklılaşmanın değişik evrelerinde sergilenen antijenler, hücrenin olgunlaşmasının takibinde kullanılabilir . Belli tümör hücrelerine özgün antijenlerin sayısı ise çok kısıtlıdır (ör PML de PML-RARa, KML de Bcr-abl gen ürünleri). Bazı tümör hücrelerinde antijenlerin “aberan” bulunmaları söz konusudur (Ör: miyeloid bir hücrede lenfoid bir antijenin bulunması) Hücreyi tanıyıp gelişiminin hangi evresinde olduğunu belirleyebilmek için çeşitli antikor panellerinin kullanılması gerekir. ASM çalışmalarını değerlendirebilmek ve karşılaştırılabilir sonuçlar için çalışma protokolleri ve toplanan veriler standardize edilmelidir. Veri analizinde hedeflenen: 1)anormal, neoplazi potansiyeli olan hücrelerin normallerden ayrılması, 2)anormal hücrelerdeki antijen profilinin ortaya koyulmasıdır. Bu amaçla birçok parametrenin birlikte değerlendirilmesi gerekir(dar

Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi
TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU

73

morfolojik veriler AML M6 M7 den şüphe ettirdiğinde. ASM ile immunfenotipleme yapmanın Avantajları: • Büyüklük (FSC) ve Granüler (SSC) yapılarına göre hücreler sınıflandırılabilir.1. • Ölü hücreler çalışma dışı tutulabilir. SLL. minimal rezidüel hastalığın takibinde kullanılacak bir parametre arandığında. SLL:Küçük Lenfositik Lenfoma. pathology (1999) 31 den modifiye 74 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . • Hodgkin hastalığında neoplastik hücre sayısının az olması nedeniyle de tanıda ASM kullanımının bir yararı olmaz. hastalık alt tiplerinin belirlenmesinde. herzaman bir malinite göstergesi olmayıp. prognostik verilere ulaşılmak istendiğinde literatür ışığında kullanılan diğer antikorlar yardımcı olabilir. • Zayıf eksprese edilen yüzey antijenleri tesbit edilebilir. Hücreleri bulundurdukları CD45 miktarına ve 90° kırılan ışık (SSC) özelliklerine göre ayırmak yol gösterici olabilir (şekil 1) ancak bu antikorun her tübe eklenmesi maliyeti arttırıcı bir faktördür.1 Akut Lösemiler Akut lösemierin %95 i temel antikorların kullanıldığı bir panel ile tanımlanabilir (tablo 2. Bu panel ile hücre serisinin tanımlanamadığı durumlarda. CLL: Kronik Lenfositik Lösemi . gerekirse standartlar kullanılarak antijen/hücre sayısını belirlemek mümkündür. Bazı durumlarda morfoloji bilinmese de tanısal değerlendirmelerin yapılabileceği savunulmaktadır (tablo 1) 2. enfeksiyoz mononukleoz. Dezavantajları: • Sklerotik kemik iliğinden. ayırıcı tanıda seçenekleri azaltmada. • Hücrelerin çevreleriyle olan ilişkileri gözlenemez • T hücreden zengin lenfomalarda ufak bir monoklonal B hücre klonunun tanınması mümkün olmayabilir. Diğer “low grade”lenfomalar “Hairy Cell” Lösemi Büyük B hücreli NHL Akut Miyeloid Lösemi Burkitt’s lenfoma “Paroxysmal Nocturnal” Hemoglobinüri “Large” granuler lenfosit hastalıkları Plazma hücre hastalıkları MDS ALL: Akut Lenfoblastik Lösemi. ancak bu parametre hücre üzerindeki antijen sayısı yanı sıra kullanılan florokrom ile de yakından ilgilidir. enflamatuvar hastalıklarda da görülebilir.…) analizler ile hücrenin fenotipi. koyu yazılanlar). NHL: NonHodgkin Lenfoma Mitchell S. hiposellüler kemik iliklerinden ASM için yeterli sayıda hücre toplanamaz. morfolojik olarak şüphelenilen çeşitli hastalıkları doğrulamakta. Antijen yoğunluğunu göstermek için de ölçülen floresan sinyallerin şiddeti belirlenir(Mean Fluorescent Intencity. Tablo 1. • Aberan bir T hücre immunfenotipi. Değerlendirmeler için sadece anormal hücreleri içine alan bir grubun seçilmesi (gating) önerilse de incelenen örnekteki normal antijen dağılımını bilmeden anormal bir topluluğu tanımak mümkün olmaz. bifenotipik hücrelerin belirlenmesi mümkündür. Klinik veriler. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı açıyla kırılan ışık FSC 90° açıyla kırılan ışık SSC ve antijenlerin işaretlendiği florokromlardan kaynaklanan sinyaller) Aynı hücrede birden çok (en sık 3-4) antijenin belirlenmesi tavsiye edilmektedir. • Çok renkli(2. • Lenfomalarda doku tutulumunun homojen olmadığı durumlarda yalancı negatif sonuçlar alınabilir. reaktif dermatoz.4. Ward. örnekteki normal hücreler zaman zaman bir internal kontrol olarak da fonksiyon görürler. moleküler/sitogenetik çalışmalar da verilerin değerlendirilmesinde yardımcı olan unsurlardır. Analiz edilecek hücrelerin doğru seçimi önemlidir. ASM. • T hücreli lenfomaların aberan bir antijen(örneğin bir panT hücre belirleyicinin kaybı/ azalması) bulundurmadıkları sürece tanınması mümkün olmaz.MFI). • Eş zamanlı bulunan birden çok hematolojik malinitenin. Dezavantajları nedeni ile ASM sonuçlarının daima ışık mikroskobu verileri ile birlikte değerlendirilmesi gerekir. Bunu ifade etmenin en kolay yolu antijen taşıyan hücrelerin oranlarını (%) bildirmektir. Özellikle kemik iliği örneklerinde sadece FSC ve SSC den yararlanarak hücrelerin kesin sınırlarla ayrılması mümkün olmaz.DALVA K. kullanılabilir. Anormal bir hücre topluluğu görüldüğünde bunun immunfenotipinin tanımlanması gerekir.3. gelişiminin hangi evresinde bulunduğu belirlenebilir. ASM nin tanıya katkıda bulunduğu hematolojik hastalıklar ASM ile tanı koyulabilir ASM tanı ve ayırıcı tanıda yardımcıdır Pre-B ALL Folliküler NHL T-ALL “Mantle Cell” Lenfoma B-CLL.

morfoloji tanısal olmayabilir 2. daha az blast. 33±. 13+.1 Akut Miyeloid Lösemi (AML) ASM.21) lehine M2 M3 Tablo 2. MPO: miyeloperoksidaz Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 75 .33±. CD61 cCD235a(Gly-A) M4. 45-/zayıf.DR=HLA-DR. DR+. AML’nin French-American-British (FAB) sınıflamasına göre gruplanmasında sitokimyasal yöntemlerin önüne geçmiştir. t(8. 34+. 33+ >13+. FSC-SSC M0/M1 dan fazla.1. 41+. 4± Maturasyon artmış. monositlerde 4+ M6 Nadir. ±:değişken. Akut Lösemi Tanısında kullanılabilecek temel antikorlar Hücre Serisi B T M Hücre serisini belirleyici cCD79a cCD3 cMPO cCD22 CD3 CD13 CD19 CD7 CD33 Matürasyonu belirleyici CD34 TdT CD10 CD20 CD22 c IgM κ λ CD34 TdT CD1 CD2 CD3 CD5 CD4 CD8 CD34.45 zayıf. DR+ SSC artmış. 34-. +:pozitif. 34+ M5: 33+. DR+. 15c. SSC düşük (lenfoblast gibi) 7+ ve 34+ prognozda 34+. 8-. DR13 zayıf. Kuvvetli 13 retinoik sendrom lehine 56+ s form(bcr3 lehine) 2+ M4Eo lehine. 15+. MPO+/. CD4± M1 SSC(granülarite). monositik komponent+.34+. M0 dan fazla 13+.18zayıf. AML hücreleri CD13. Trombosit adezyonuna bağlı yalancı+ dikkat!! M7 Diğer karakteristikler Sayılar CD no ifade etmektedir (ör:33=CD33). M5 Benzer özellikleri var M4 de blast daha çok. 33+. MPO ya özgün antikorlarla işaretlenir. Mevcut ise aberan AML hücrelerinin 19+.33+. 13-. 45 SSC dağılımında blastlar 34 daha az. CD117 CD15 CD11a.DR+. 15+. 117+. spesifik olmayan Ig bağlanması (↑FcR nedeniyle). 14+. 13+. zayıf 7+.9+. CD14 spesifik ama sensitif değil Beklenenden az tanınıyor Erken eritroid işaretlerin kaybı. 235a++ 61+. MPO+. Tanı için immunfenotipleme ve elektron mikroskobi(trombosit peroksidaz için) gerekir.(56+). 33+. 11a-.34 daha az. 34-/+. 13±.1. AML hücrelerinde lenfoid antijenlerin bulunması her zaman “mix-lineage” veya bifenotipiyi göstermez. Özellikle M0 ve M7 olgularında tanı için immunolojik yöntemler gereklidir. CD33. olumsuz 7±. 2±. Şekil 1. diğer miyeloid antijenler sınıflamada yardımcı olsalar da prognostik değerleri sınırlıdır (tablo 3). DR+. CD11b HLA DR CD14 CD68 CD41. -: negatif. Tablo 3. CD11b nin kötü prognostik değeri dışında CD34 başta olmak üzere bazı antijenlerin önemine dair çalışmalar olsa da görüş birliği yoktur.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. AML de immunfenotipik özellikler FAB tipi İmmunfenotip Notlar M0 FSC.

Tablo 5. 20+.8) yapılır (tablo 5). t(2. TdT parlak+ Kötü prognoz pre. TdTc. koyu yazılanlar tipik bulgulardır Sayılar CD no ifade etmektedir (ör: 3=CD3). t(15. parlak 22+.ALL tanısı için sitoplazmik ya da yüzeyel CD3 varlığı koşul olup. -: negatif. Hiperdiploidi daha iyi. 34+. Kemoterapi sonrasında. inv(16)] sitogenetik belirleyicilere eşlik edebilir. diğer T antijenleri2+.34FAB L3 ile örtüşür c-myc(8q24) ilgili translokasyonlar [Ör: t(8. CD56+. 76 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . 4+ veya 8+. Tanı koyulabilmesi için erken B hücre işaretlerinden (CD19. CD2 veya CD7 varlığı tanı için yeterli değildir. 3± Seyrek Medullar Sayılar CD no ifade etmektedir (ör: 19=CD19). kötü TdT+. -: negatif.20±. Bu amaçla CC34. 5+.8). CD10-(kötü prognoz) 19+. t8. 34-. parlak klonal sIg.olan bu hücreler ATRA’ya yanıt vermezler ve CD56+. 7+. 5+.1. CD11b. biyolojik olarak farklı olan bir hastalığığın işareti olduğu kabul edilir. megakaryoblastlar ile trombositlerin ayrılmasına olanak sağlar. DR+. CD16. 24+. 19+. dual 4+/8+. 19+. hipodiploidi daha kötü prognoz işaretidir. İntegrinlerin kaybı (CD11a. 10± zayıf Çocukluk ALL nin %70 i.SSC düşük). Ig: İmmunglobulin.1. Hematogonlar: Hematogonlar kemik iliğinde. bu dönemlerde incelenen KI örneklerinde hematogonların malin hücreler ile karıştırılmamasına özen gösterilmelidir.10+. ±: değişken c: Sitoplazmik. c22+. 24+. cCD79a) en az ikisinin pozitif olması gerekir. aberan eksprestyonlar çok tipiktir.sIg-. Tdt±. 5.9+. 2. DR=HLA-DR.19) a bağlı kötü prognoz. ALL olgularını DNA içeriklerine (ploidi) göre sınıflamak da mümkündür. Sitogenetik veriler prognozun belirlenmesinde en güvenilir işaretlerdir ve her genetik işarete özgün olan bir immunfenotip bulunmadığından ASM bunun önüne geçememiştir.1. morfolojisi ve immunfenotipi ile AML M3v ile benzerlik gösterse de RARa mutasyonu yoktur. t(1. eser miktarda da periferde bulunan CD10+. 19+. miyeloid ag+(15+) 11q23 anomalisi düşündürür ve kötü prognostik Çocukluk çağı lösemilerin %25i.10+. T. CD41 yanısıra matur trombosit işareti olan CD42b nin kullanılması.22)] veya iyi prognostik [t(8. 34+. Blastların CD45SSC dağılımına göre lenfoblast/ miyeloblast/ monositik bölgede yer alabilmeleri nedeniyle “gate” almak zor olabilir. ±: değişken c: Sitoplazmik. c79a+. T hücreli ALL de tipik immunfenotipik özellikler ALL tipi İmmunfenotip Notlar Pre(pro)T-ALL Erken kortikal timik Geç Kortikal timik c3+. 79a+ CD10+ (iyi prognoz).1. cCD22. s: yüzeyel. CD19+ hücreler olup.14).21). 2. c22+. CD10. kök hücre naklinden sonra sayıları çok arttığından. TdT ve CD34. CD2 varlığının özellikle çocuklarda kötü prognostik olup. 7+. 7+. 20±.3 T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi T-ALL erişkin ALL lerin %25 çocukluk çağının ise %15 inden sorumludur. KI deki istirahat halindeki öncü B hücreleri (timustaki T öncülerine karşılık olacak şekilde) tanımlamak için kullanılır. 10prognoz B-prekursör ALL (Erken preB) (Pre-preB) (“Common” ALL) Blastlar küçük (FSC. AML M7 olgularında CD41ve CD61 ile pozitif reaksiyon veren hücrelerin. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı tanınmasını kolaylaştırırlar (%5-28). CD18) M3 için tipik bir bulgudur. CD 19 varlığı kötü prognostik [t(9. TdT-. İmmatür B hücrele. minimal s3+. T-ALL de spesifik T hücre antijenlerinin bulunmaması (Ag kaybı). iyi prognostik bir işarettir. TdT4. 5+.17). +: pozitif. lösemik blastlara yapışmış olan aktif trombositlerden kaynaklanmadığından emin olunmalıdır. NK hücreli akut lösemi.2 B Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerin farklılaşmasına göre 4 sınıfta toplanabilen (şekil 2) bu lösemilerin immunfenotipik Tablo 4. lenfomalarla ayırıcı tanıda yardımcıdır. DR+. erişkin ALL nin %50 si CD10-. 2+. PML/RARa+ olan AMLM3 olgularından ayrılmaları gerekir. TdT+ 2+.22)] karakteristikleri tablo 4’te özetlenmiştir. 22+.B ALL B-ALL 1a+. Sınıflama timik farklılaşma evrelerine göre (CD1.DALVA K. cIgM Hücreler daha büyük. B hücreli ALL de tipik immunfenotipik özellikler ALL tipi İmmunfenotip Notlar “null cell” ALL c19+. FSC değerleri de yüksek olabilir(büyük hücreler). 7+. +: pozitif.4.

Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. farklılaşma göstermeyen (undifferantiated) Lösemiler Lösemilerin %1 kadarı sınıflandırılamamaktadır.2 Kronik Miyelositer Lösemi (CML.1. B: monositik. T hücre için CD3.1. antijen sayısına göre yapılacak bir değerlendirmenin doğru olmadığını düşünmektedir.5 Akut. Kemik iliğinde normal A: B hücre. Hücre serilerini en iyi tanımlayan antijenler B hücre için CD22. Hücrelerin en az %10 unda miyeloid Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 77 .1. D: eritroid hücre gelişimi ve immunfenotipik özellikleri 2. 2. 2. Bu durumun lenfoid antijen taşıyan AML ya da miyeloid antijen taşıyan lenfoid malinitelerden farklı olduğu vurgulanmalıdır.1. KML) ve NON-KML Miyeloproliferatif Hastalıklar (NCMPDS) ASM nin KML nin kronik fazında kullanımı sınırlıdır. Şekil 2. Bu ayrımı kolaylaştırmak için bir skorlama sistemi kullanılamakta olasa da bazı araştırmacılar. bir hücre serisine özgün olan başka bir antijen taşımadıkları görülür.4 Bifenotipik Akut Lösemiler Lösemik hücre üzerinde lenfoid ve miyeloid antijenlerin birarada bulunduğu bir erken öncü hücre(pluripotent) malinitesi olarak tanımlanır. HLA-DR+. CD7+ olup. Nadir olarak aynı anda iki farklı malin hücre serisinin bir arada bulunduğu durumlar söz konusu olabilir ki “mixed lineage” veya “bilineage” lösemi olarak adlandırılır.1. ve genellikle CD38+. C: granulositik. Bu olguların tipik olarak CD34+. miyeloid hücreler için MPO dur.

sIgparlak+. T-.olabilir. 15+. CLL: kronik lenfositik lösemi.14) sIg parlak+. 22+. Kan ve kemik Tablo 6. 19+. CD5. Klonal bir sitogenetik anomali bulunduran olgularda aberan antijen ekspresyonları (NCMPD deki gibi). CD14 CD15 de azalma. 11c+++. DR=HLA-DR.. Hastalığı B7/BB1 +++ RS hücreleri Aktivasyon: 25+. CD20+. CLL ve SLLnin aynı hücreden köken alan ancak doku dağılımı farklılık göstern hastalıklar olduğu düşünülmektedir. CD5. 2. CD56. 24-.3 Kronik Lenfoproliferatif Hastalıklar ASM. 79a+. Zap70 ekspresyonunun Ig ağır zincir mutasyonları ile ilişkili olduğu ve kötü prognoz. DR+. kalın yazılanlar karakteristik özellikleri vurgulamaktadır 78 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . Bu durum trizomi 12 ve kötü prognoz ile birliktedir. 24+.CD36. 105+. 45±. İmmunfenotip ile “high grade” tansformasyon(Richter) ve prolenfositik transformasyonların CLL den ayrılması mümkün olmaz. 45-. DR+. DR+. Non-KML miyeloproliferatif hastalıklarda CD2. CLL nin atipik morfoloji gösteren bir alt grubunda sIg parlak+. SMZL: splenik “marginal zone” lenfoma.3. 103-. sIg ılımlı+. Blastik transformasyonda ise farklılaşmanın lenfoblastik ya da miyeloblastik yönde mi olduğu tanınabilir. 22-.3.45+. CD11b-CD16 arasında) izlenebilir. DR+. “Non-Hodgkin” Lenfomalar. Bhücre kaynağının belirlenmesinde ve ayırıcı tanıdaki seçenekleri minimale indirmek konularında yardımcı veriler sağlar. SLL: küçük lenfositik lenfoma. 20+.10-. 2. 5-. diğer “low grade” lenfomaların ekarte edilmesi gerekir. <%20 1020+. 22+. CD19+ olması tipiktir.1 Kronik Lenfositik Lösemi.1. 23-. 23±. DR+. CD33.30-. TdT-.3. t(11. 23-. 34.2. 20+. SLVL: villöz lenfositli splenik lenfoma. Anormal veriler arasında: (1) polisitemia verada bcl-XL ekspresyonunda artma. 21-. +: pozitif. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı seri antijenlerinin dağılımında (özellikle CD33. MALT&monositoid 11c+. Bcr-abl onkogenine özgün antikorlar. B-NHL 19+. CD34) beklenen yaşam süresinin kısa olması lehinedir. HCLvariant: 11c z+.görülür LCL “Hodgkin” Genellikle: 30+. 22+. CD5+. FMC7+. sIgM parlak+. 20+. 25+. 20parlak+. hızlı seyir lehine bir veri olduğu bilinmektedir (tablo 7). 19 ko ekspresyonu sIgM/D z+. ±: değişken z+: zayıf pozitif. 5. Birden çok antijen dağılımının bozulması söz konusudur. 25z+ 21-. 71+ T antijenleri: %50 sinde 2. Miyelodisplaziler(MDS): Immunfenotiplemenin tanısal ve prognostik önemine dair çalışmalar olsa da standart tanımlamalar yoktur. iki miyeloid antijenin dağılımındaki senkronizasyonun bozulması (ör. CD56 ekspresyonu) belirlenebilir. hücrelerin ışık saçılım özelliklerindeki değişiklikler (özellikle hipogranülarite) dikkat çekmektedir. CD13. 23-. CD7. 43+. sIg+. 20+. p-selektin. HCL: “hairy cell”lösemi. Tanımlayıcı tek bir antijen olmasa da antijenlerin dağılma özellikleri. 19+. genelde doku biyopsilerindeki tipik immunfenotipik özellikleri ile tanınır. ASM ile kronik miyelomonositer lösemilerdeki monositlerin oranı ve bu monositlerdeki anormal antijen ekspresyonları(ör CD13. 22+. yoğunlukları yol göstericidir (tablo 6).DALVA K.103+. 5-. B hücre Lenforoprliferatif hastalıklarında fenotipik özellikler Hastalık İmmunfenotip Notlar CLL/SLL 5+. gpIb ve gpIIb/IIIa da azalma. 2.15-.1. LCL: Büyük hücreli lenfoma. 23-. PLL: prolenfositik lösemi. trombospondin. 23parlak+. 10-. -: negatif.CLL tanısı şüphe ile karşılanıp. 20++. 19+. sIgD±. 11c19+. 25-. CD13) artma ya da azalma yönünde değişiklikler. 22++ sIg. 22+. 19+. CD71 gibi miyeloid olmayan antijenlerin aberan ekspresyonu bulunabilir. (3) Miyeloproliferatif bazı hastalıklarda miyeloid hücrelerde CD66 ve CD14 ün aberan koekspresyonu bulunabilir. FMC7+. malin (klonal) lenfoid proliferasyonun benign proliferasyondan ayrılmasında. 10+. 70. gpIV ve c-Mpl de artma. 20+. 5-. 10-. CD23-.4 + Sayılar CD no ifade etmektedir (ör: 19=CD19).CD16. MCL: “Mantle cell” lenfoma. Anaplastik LCL: 30+. KML hücrelerinin belirlenmesinde kullanılabilir. 19+. DR+. CD10. CD7. 43-. CLL/SLL olgularında aberan antijen ekspresyonları (CD2. FCC: “Follicular center” hücreli lenfoma. RS: Reed Stenberg hücreleri. 20 z+. CLL Erişkin lösmiler arasında en sık görülen tip olan CLL de. 22++. klonal hafif zincir z+ PLL sIg parlak+. DR+.1. (2)esansiyel trombositozda trombosit yüzeyindeki gp1a/IIa. tipik FMC7-. NHL NHL. 70+. 5-. 19+. FMC7+ CD79b+ izlenir. CD13. 10%50 sinde 5+ MCL FCC MZL SMZL/SLVL HCL l > k. 25+. 5-. 71+ Büyük hücreli karsinomdan ayrır Nodüler lenfositten zengin HD farklı bir tip olup.

56+: daha agresif NK-LGL MF/Sézary Büyük B hücreli Lenfoma Bcl-2 CD10+. 2. bazı çalışmalarda CD30+ B hücreler. bazılarında sadece poliklonal hücreler veya karışık hücre topluluklarından bahsedilmektedir. variant HCL ile ayırımı zor olabilir. klinik özellikleri birlikte değerlendirilmelidir. CD11c. Tanının morfoloji ve immunfenotipik bulgularla birlikte koyulması gerekir. CyclinD1’in moleküler analizini gerektiren durumlar olabilir(zayıf CD23 ekspresyonları) . CD5-. Ancak büyük hücreler daha duyarlı olduklarından. hazırlık işlemleri sırasında parçalanmaları ve tanınmamaları sık karşılaşılan bir durumdur. 252+. CLL ve HCL den ayırıcı tanısı gerekir.1. 56+. HLA-DR) taşımaları karmaşaya neden olabilir. 3-. Tablo 8. pansitopeni) bu antijenlerin aranması gerekir. CD25 gibi antijenlerin varlığı tipiktir. bu grupta yer alır. 8+. nadiren 8+ 3+. T hücre lenfoproliferatif hastalıklarında fenotipik özellikler Hastalık İmmunfenotip Notlar T-PLL 2+. 57+. 4+. ±:değişken. 4+. 16+. 25- CLL: Kronik lenfositik lösemi. uzun hastalıksız yaşam lehine önemlidir. CD23 ile de CLL ile ayırıcı tanı mümkün olur (tablo 6).3. “Hairy cell” lösemi: doğru tedavi ile tedavisi mümkün olan bir hastalık olduğundan tanınması Tablo 7. 8-. Tedaviye farklı yanıt veren variant tipinde CD25. 3+. CD33 karakterize CD34 CD38 ZAP-70 MUM1 Plazma hücre diskrazileri CD11c. 84+/8-: tedaviye daha iyi yanıt T-LGL lösemi 2+. 16+. CD103. Cd14. Genellikle sIg(-) olduğundan monoklonalite de gösterilemez. 7-. Erişkinlerde genellikle B hücreli olup. “Mantle Cell” lenfoma: İmmunfenotipleme. 5+. Tanı için immunfenotip.beklenir. OS: “Overall Survival” Sayılar CD no ifade etmektedir (ör:3=CD3). morfoloji. eksta nodal) ve monositik B hücreli (nodal) lenfomalar. 8-. -: negatif. immunfenotipi ile diğer büyük hücreli kanserlerden ayrılabilir. CD10 Miyelomonositik işaretler ve CD10. 11b+.CD7 Tümü kısa OS ve CD10 hızlı progres ile CD13. 56-. 4-. TdT+) ayrılmasında kullanılabilir. Reed Sternberg hücreleri bireyler arasında değişip. SLL: Küçük lenfositik lenfoma. TdT-) lenfoblastik lenfomadan (sIg-. NK: “Natural Killer Cell”. 3+. immun fenotipik özellikleri benzerdir. akım sitometrideki ışık saçılımından(FSC) büyük hücrelerin oranı saptanabilir. 3+. 7+. 5+. 8-. MCL.3 “Hodgkin” Hastalığı Hodgkin Hastalığında malin hücrelerin sayısı az olup ( <%1) çoğunluğu enflamatuvar hücreler oluşturduğundan CD4+ hücrelerin hakim olduğu karışık bir hücre topluluğu izlenir. 4+. CD13. iliği örneklerindeki karakteristik bulgular daha az tanımlanmıştır. blastik MCL nin (sIg+. Kİ aspirasyonunda zorluk. 4-. 7-. CD79b MCL ‘de pozitif iken CLL/SLLde genellikle bulunmaz. 5-. MUM1-(germinal merkez fenotipi) Erişkin T 2+. CD5+. 252+. 25Tanı zor TCR gen rearanjmanı gösterilmedikçe reaktif T hücre proliferasyonu ekarte edilemez L selektin ekspresyonu ↑ Aberran patern . LGL: “Large granular Lymphocyte”.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. 3+. CD71. 5+. ASM incelemesinde “debri”lerin bulunduğu kısı kalabalıktır. kısa OS ve agresif hastalıkla birliktedir Kısa OS. “Large Cell” lenfoma: Perifer kanında pek görülmeyen bu hücreler. MF: mycosis fungoides Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 79 . 5+. +:pozitif. Şüpheli durumlarda(splenomegali. 57-. hassas olup kolayca parçalanabilir. CD15. lösemi/lenfoma 25parlak+ T-CLL 2+. ileri evre lehine Uzamış OS. T hücreden zengin B hücre lenfomalarının HH ve T hücreli lenfomalardan ayrılması zordur. 3+. Dual 4+/8+. Kan ve kemik iliği örnekleri yerine lenf nodülünden yapılacak immunfenotipleme daha anlamlıdır. Lenfoid/Plazma hücre hastalıklarında İmmunfenotipik prognostik işaretler Hastalık İşaretler Prognostik önemi CLL/SLL CD2. “Follicular centre cell” lenfoma: Tüm lenfomaların yaklaşık %45i bu tipte olup. “Anaplastic large cell” lenfoma: CD30+ olan bu hücreler. 4-/8+ nadir 4+. 7+. “Marginal zone” lenfoma: Mukozalardaki lenfoid doku (MALT. 7-. Bcl-6+. aktivasyon işaretlerini de (CD25. 8±.

sIg.3. hastalıklardaki klonal değişimler nedeniyle fenotipte değişiklikler ortaya çıkabilir. Tipik fenotipler şöyle özetlenebilir: Primitif plazma hücreleri: CD45++. HLA-DR).5 Paroksismal Nokturnal hemoglobinüri (PNH) PNH. CD38++ Matür plazma hücreleri: CD45-. TCR. Garnulositler için CD55. çok az sayıdaki tümör hücrelerinin bile belirlenmesini sağlar. CD8-.5 “Large granular” Lenfositik (LGL) Lösemi LGL Lösemi morfolojisi tipik olup. Posfatidil İnozitol Glikan sınıf A (PIG-A) genindeki mutasyonlara bağlı ortaya çıkar ancak. Nadir görülen aberan bir ekspresyon. CD59’un eksikliği “membran attack complex”. CD45i kaybeder ve CD38(çok parlak). Genetik işaretler için kullanılan moleküler yöntemler.izlenir.4 T Hücre Hastalıkları Bu hastalıklarda perifer tipi T hücre fenotipi izlenir. Normal T hücre antijenlerinin kaybı ya da yoğunluklarının değişmesi tipiktir (tablo 8). CD3 yanısıra CD4 veya CD8 pozitiftir. CD59 ekspresyonu hiç yoktur. CD3+. Bu proteinlerden CD55. CD14. monositlerde de bu proteinlerin eksikliği görülür. CD56+. CD4. daha agresif seyreder. Miyelodisplastik Sendrom.1. NK-LGL’de CD2+. CD59. PNH I komplemana duyarlığın normal olduğu tip olup. gibi diğer antijenlerle birlikte kullanılırsa daha iyi bir ayırım sağlanabilir. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı 2. PNH klonunun büyüklüğünü saptamak için eritrosit ve lenfositlerden ziyade granulosit ve monositklerdeki ekspresyonunun kullanılması önerilmektedir.4 Multipl Miyelom Plazma hücreleri farklılaştıkça B hücre antijenlerini (CD19. CD48 in en iyi belirleyiciler olduğu CD16 nın eozinofillerde bulunmaması nedeniyle eksikliğinin dikkatle değerlendirilmesi gerektiği bilinmektedir. PNH III ise hassasiyetin 15-25 kat fazla olduğu tipi temsil eder ve CD55. 2. CD55. PNH. Matür hücreler ise sadece aktif hastalığı olan miyelom hastalarında bulunup monoklonal özelliktedirler.1. CD138 gibi yeni antijenler taşır. Kemik iliğindeki miyelom hücrelerinin normal plazma hücrelerinden farklı olarak CD56 ekspresyonlarının yüksek olduğu görülür. monositler için CD55. Bunlar tanı anındakiler ile aynı olabilir veya. CD16+.3. periferik kanda sitopeni. 2. Miyeloma aslında kemik iliğinin bir hastalığı olsa da bazı miyelom hastalarında ve reaktif durumlarda(karaciğer hst. 80 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . CD5-. MAC’ın eritrositleri parçalamasına neden olur. ASM ile ışık saçılım özelliklerinden de yararlanarak uygulanan multiparametrik analizler ile MRD belirlenebilir. CD16+. 2. CD57-. LGL nin CD3+. NK hücrelerde monositlerde de bulunduğunda tek başına değil de CD56. PCA-1. CD19+. CD 38. CD19Primitif hücrelerin varlığı kötü prognoz işaretidir. fenotipine göre T ve NK olarak ikiye ayrılır T-LGL’de CD24. CD8zayıf+. periferdeki hücrelerde bu antijenler yoktur ya da çok zayıf eksprese edilirler. klonal gelişme için bu mutasyonun varlığı yeterli değildir. genellikle nötropeni ve otoimmun hastalıklar eşlik eder. Önemli olan tümöre özgün olan antijen/sinyallerin kullanılmasıdır. TCR+ olup. Anemi. HIV) perifer kanında da plazma hücrelerine rastlanabilir.CD59 eksikliği gösterilemez. klonal bir hastalık olup. CD45. Hücre memranına Glikozilfosfatidilinozitol (GPI) ile bağlı bulunan proteinlerin eksikliği söz konusudur. CD10+. nadir görülen edinsel. CD57+. CD56+ olan bir varyantı hepatosplenik g d hücre lenfoması olarak da bilinmekte ve kötü prognoz göstermektedir. trombositopeni ve hepatosplenomegali daha belirgin olup. Duyarlılık 10-3-10-4 düzeylerindedir. T.1. CD3-. venöz tromboza yatkınlık en karakteristik klinik bulgulardır. CD59 CD66b. Eritrositler yanısıra granulosit.DALVA K.1. Hemoliz ve hemoglobinüri. CD22. CD56-. Aplastik Anemiye eşlik edebilir veya dönüşebilir. VLA5+ İmmatür plazma hücreleri: CD45+. CD38++. daha sessiz seyreder. PNH eritrositleri fenotiplerine göre 3 gruba ayrılabilir. CD38++. Her iki durumda da immatür plazma hücreleri bulunabilir ve özgün olmayan bir uyarılma işaretidir. Tip II hücreler ise komplemana orta derecede hassasiyet gösterirler ve bu proteinler için kısmi bir eksiklik söz konusudur. 2.6 Minimal Residüel Hastalık (MRD) Hematolojik malinitelerin tedavisini takiben MRD’nin tesbiti giderek daha fazla önem kazanmaktadır. CD56+.1. Kemik iliğindeki hücrelerde CD138 ve VLA5 eksprese edilirken.

yani boyanın miktarı hücrede bulunan DNA miktarıyla doğru orantılıdır. +18.%10 olması beklenir. MRD tesbiti için 7. Anaploidinin bulunması malinite lehine bir bulgu olsa da bu her zaman doğru değildir. Hücre döngüsüne eşlik eden proteinler söz edilir.2 Hücre DNA İçeriğinin Belirlenmesi (PLOİDY) DNA. Tek bir ölçümde MRD nin pozitif olması relapsın habercisi olabilirse de ardışık ölçümlerde MRD varlığı relaps için çok daha iyi bir göstergedir. Bu konu ilgili konuşmacılar tarafından ayrıca işlenecektir. Bu şekilde hücrelerin çoğalma hızları hakkında bilgi toplanır. Akım Sitometresi ile hücrelerin hangi bölünme fazında ne miktarda hücre bulunduğunu tespit etmek de mümkündür. DAPI. Kemik iliğindeki hematogonlar. Hoechst dür. G0 /G1 fazında yer alırkan S (sentez) fazındaki hücrelerin DNA içeriği diploid ile tetraploid hücreler arasında olacaktır (şekil 3). Bu durumda test edilen hücredeki DNA’nın normal hücrelerdeki DNA miktarlarına oranlanması ile elde edilen değer DNA indeksi olup. DNA indeksinin >1 olması hiperploidi. benzer şekilde anaploidi daima kötü prognozun bir işareti olarak algılanmamalıdır. hücre zarı geçirgen hale getirildikten ve RNAse ile işlem gördükten sonra boyanması önerilmektedir.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. G2 ve Mitozdaki hücreler ise 4n miktarında DNA taşıdıklarından tetraploid olarak izlenecektir. <1 olması hipoploidi olarak tanımlanır. CD5 birlikteliği %5 duyarlıkla MRD yi saptarken bu ikiliye k/l monoklanalitesinin eşlik etmesi halinde duyarlık %1’e yükselir. bundan farklı değerler bulunduğunda anaploididen Şekil 3. hücrenin DNA içeriğini yansıtmaktadır. +10. +14. +17.1 antijenine yönelik antikorlar kullanılabilir. Hücre döngüsünün ASM ile izlenmesi Şekil 4. +6. -7(%10) +12 (%30) +4. Bu tür florokromların bir kısmı sadece DNA ya bağlanırken çoğu DNA ve RNA ya bağlanabilme özelliğindedir. Tablo 9. Bu durumun sonuçları etkilememesi için DNA’nın. Lösemik lenfoblastlarda 11q23 anomalisi bulunduğunda. Bu amaçla en sık kullanılan boyalar Propidyum İyodür (PI). Hematolojik malinitelerde en sık karşılaşılan anaploidi sebepleri tablo 9’da özetlenmiştir. +20 +12 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 81 . pre B hücreleri ile aynı antijenleri taşırlar. Diploid hücreler. Diploid bir hücredeki DNA miktarı 2n olarak tanımlanır (şekil 3). MRD için uygun bir takip parametresidir. Boyama sitokiyometriktir. çift sarmalla şelat yapabilen floresan boyalarla işaretlenebilir. Hematolojik malinitelerde anaploidi nedeni olabilen kromozomal değişiklikler Hastalık Akut Miyeloid Lösemi Kronik Lenfositik Lösemi Akut lenfoblastik Lösemi “Non-Hodgkin” lenfoma Kromozomal değişiklikler +8 (%13). Normalde 1 +/. B hücreli CLL de CD19. Bu hücreler ancak antijen ekspresyonunun şiddeti veya eşlik eden aberan bir antijenden yararlanarak malin hücrelerden ayrılabilir. 2.

1. CD38. B lenfoid tümörlerde CD19.oldukları ve uyarıcı bir sinyal aldıklarında CD34 ekspresyonunun başladığı bilinmektedir. Özellikle MM gibi mobilizasyonun ilerleyen günlerinde malin hücre kontaminasyonu riski artan durumlarda en erken dönemde ürün toplanmasının önemi vurgulanmalıdır. (6) CD34+ hücrelerin alt grupları değerlendirilebilir . Bu durumda DNA yı işlaretlemeden önce malin hücreleri ayırabilecek bir antijeni(ör: epitelyal kökenli hücrelerde sitokeratin.. Multiparametrik ölçümler kullanılan ASM çalışmaları ile: (1)Perifer kanından toplanan CD34+ HPKH ve progenitörler sayılarak. CD3 eksiltilmiş ürünlerde kalan T lenfosit. miktarları belirlenebilir. En sık kullanılan “Single”platform ISHAGE metodu ile yapılan ölçümlerdir. 82 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU .(2) önceden yapılan sayımlar. (4) Aferez ürününe yapılan müdahalelerin etkisi değerlendirilebilir (viyabilite. CD7-. toplanan ürünün kalitesi değerlendirilebilir. hücre toplanması için optimal zamanın belirlenmesini sağlar. CD133 + hücrelerin de hematopoetik aktivite gösterdiğine dair veriler olsa da “multilineage” hematopoez kapasitesi taşıyanların CD34+ hücreler olduğu kabul edilmektedir. SPF nin yüksek olması. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı S+G2+M fazındaki hücreler S Fazı Fraksiyonu (SPF) olarak tanımlanıp. (3)Çeşitli sitokinlerin ve /veya kemoterapi rejimlerinin CD34+ hücre sayılarını ve alt gruplarını nasıl etkilediği incelenebilir. CD41+ /CD61+ /CD62L+ hücrelerin erken dönem engrafmanda önem taşıdığını gösteren çalışmalar vardır.4 Hücre Canlılığını Tesbiti. Apoptoz ile İlgili Çalışmalar ASM ile İmmunfenotipleme uygulamalarında özgün olmayan antikor bağlanmalarından kaçınabilmek için canlı hücrelerle çalışılması gerekir. aktif HPKH belirleyicisidir.. ASM ile CD34 sayımı için: (1)Beyaz küredeki (BK) CD34+ hücre oranları bulunup hemogramda elde edilen mutlak BK değerleri kullanılarak hesaplanır(Dual platform). Kord kanı örneklerinde lin-.. HPKH sayıları) (5) Kriyoprezervasyonun hücre canlılığı üzerine etkisi değerlendirilebilir. Hücre döngüsü analizlerinde karşılaşılan bir problem malin olan ve olmayan hücrelerin bir arada bulunabilmesidir. “Class”II FITC konjuge antikorlar kullanılmamalıdır . 1.CD34+.DALVA K.. CD90+ hücrelerin uzun süreli kalıcı engrafmanda. CD34. “Class” III veya II epitoplara özgün olmalı ve tercihan Phycoerytrin (PE) işaretli olmalıdır. Laboratuvarlar arası değişkenlik azalır.3 Hematopoetik Kök Hücrelerin Sayılması Kemik iliği örneklerindeki lökosit sayısı graft kalitesi hakkında bir ön bilgi verse de perifer kan örneğinde hematopoetik kök hücreleri(HPKH) saymadan hızlı bir değerlendirme yapmak mümkün değildir. Sayımlar için seçilecek antikorlar. (2)Birim hacimde bulunan CD34+ hücre sayısı doğrudan ölçülür(Single platform) Bu ölçüm için ya volumetrik cihazlar kullanılır ya da mutlak sayısı bilinen parlak floresan veren boncuklar eklenerek birim hacimdeki hücre sayısı hesaplanır. Propidyum Iyodür(PI)gibi floresan veren boyalar kullanılarak hiç bir ön işlem yapılmadığı halde membranı geçirgen hale gelmiş olan hücrelerin DNAsının boyanması sağlanarak canlı/ölü hücre ayırımı yapılabilir. Hücre döngüsü analizlerini hücre döngüsüne eşlik eden proteinlerin ölçümü ile ile eş zamanlı değerlendirmek de mümkündür (şekil 4). Hücre döngüsü analizlerinde: analiz edilecek hücrelerin seçimi ve kullanılacak yazılım programlarında seçilen modeller. CD38-. Yönteme yapılan bazı eklemeler ile CD34+ hücre alt gruplarının veya hücre canlılığının da değerlendirilmesi mümkün olmaktadır. proliferasyon hızının yüksek olduğunun bir göstergesidir. Son yıllarda kullanılmaya başlanan bir teknikte yüksek miktarlarda aldehit dehidrogenaz(ALDH) aktivitesi bulunan hücreler tesbit edilerek kök hücreler tanınmaktadır. Canlı hücreler floresan vermezken ölü hücrelerin kullanılan florokromun özelliklerine göre farklı sinyal verdikleri gözlenir. CD34+. karşılaştırılabilir sonuçlar elde edilmesinde büyük önem taşır. Ürüne dönüştüklerinde floresan verme özelliği olan ALDH substaratları kullanarak akım sitometresi aracılığıyla fazla floresan veren kök hücreler tanınıp. Bu yöntemle kan dışı ürünlerde (kord kanı. Bu amaçla 7AAD. lin-. ) işaretlemek yardımcı olabilir. İstirahat halindeki HPKH lerin CD34. kemik iliği gibi) görülebilen çekirdekli kırmızı küre ya da küme trombositlerden kaynaklanan hatalı BK sayımlarına bağlı hatalar dışlanmış olur.

Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 83 . (1)Akım sitometresinde ışığın dar(FSC) ve dik açı ile kırılma(SSC) özelliklerinden yararlanılarak sırasıyla hücrenin boyutları ve granüler yapısındaki değişiklikler kaydedilir. AML blastlarında WT1. ya da mitokondrial membran potansiyelindeki değişmeler ölçülebilir. 1. ASM’de fonksiyonel analizler de yapılabildiği için mitokondrial membran potansiyelindeki değişimlerin ölçülmesi. oluşan bu yanıtların takibi için iyi bir araçtır. kaspazlar. (2)Plazma membranındaki fosfolipidlerin dağılımı incelenebilir Plazma membranındaki fosfolipidler iç ve dış yapraklar arasında asimetrik bir dağılım gösterirler. Apotozun erken dönemlerinde hücredeki büzüşmeye bağlı olarak FSC de bir azalma meydana gelir.. ASM’nin en büyük avantajı ise bu ölçümlerin birkaçının aynı anda aynı hücre üzerinde yapılabilmesidir. Hücre ölümüne eşlik eden moleküler ve fonksiyonel mekanizmaların aydınlatılması 2.. Hoescht gibi floresan veren substratların hücre içine alınıp/dışına atılmalarına bağlı görülen floresan sinyal değişklikleri ile takip edilmesi fonksiyonel bir ölçüm olduğundan MDR tesbiti için daha duyarlı ve özgün olduğu kabul edilir. Ancak bu proteinlerin normal hücrelerde de bulunabilmesi değerlendirmeyi zorlaştıran bir faktördür .Olay ilerleyip hücre büzüşünce ise SSC nin de azaldığı gözlenir. Pgp fonksiyonun Rhodamine 123.6 Hücresel İmmun Yanıtın Belirlenmesi Çeşitli hematolojik malinitelerde tümör antijenlerine karşı mevcut olan ya da geliştirilen hücresel yanıtın ölçülmesi önem taşır.5 Çoklu İlaç Direncinin (MDR) Tesbit Edilmesi MDR. Antikoagulan bir protein olan Annexin V’in yüksek affinite ile fosfatidilserine bağlanmasından yararlanarak florokromla işaretli anti-Annexin aracılığı ile apoptotik hücreler saptanabilir. hücre membranının dış yaprağına geçer. Bu konu ilgili konuşmacılar tarafından ayrıca işlenecektir..)dir. ras. Bu yöntemle ardışık 5-6 bölünme takip edilebilir. MDR nin p-glikoprotein(p-gp) olarak bilinen ATP– bağımlı bir ilaç pompasının etkisiyle ortaya çıktığı bilinmektedir. peptid bağlayan tetramer ya da pentamer yapısında HLA kompleksleri kullanılarak bcr-abl peptidlerine reaktif T hücrelerin kantitatif tayini mümkün olmaktadır. Nekroz olayında ise hücrede büzüşme değil şişme olduğundan FSC başlangıçta bir artış gösterir. Kök hücre naklinden sonra görülen relaps olgularında minor doku antijenlerine özgün Sitotosik T lenfositlerin verilmesi ile bu antijenler aracılığıyla antilösemik etki sağlanabilmektedir. Akım Sitometresinin nekrorobiyolojide kullanımının 2 temel amacı vardır: 1.. Antijenik bir uyarana karşı gelişen hücre proliferasyonun CFDA gibi bir florokrom aracılığı ile takibi de mümkündür.(4) Bazı yöntemler ise apoptoz sırasında meydana gelen DNA fragmanlarını saptamada yardımcı olur Ortama dışarıdan eklenen “terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT)” aracılığı ile gerçekleşen bu deney. (3) plazma membranındaki aktif transportun kaybı değerlendirilebilir. AML. Üzerinde en çok çalışılan malinitelerden biri KML olup. hücre içi pH ve iyonize Ca düzeylerinin ölçülebilmesi ile apoptoz hakkında yardımcı bilgiler toplanabilir.).Labeling) olarak adlandırılır. P-gp’ye ve ilaç direnci ile ilgili diğer proteinlere yönelik çeşitli antikorlar (MDR1 çeşitli klonları. oksidatif stresin belirlenmesi.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. SSC’de başlangıçta genellikle bir farklılık gözlenmese de bazı hücrelerde SSC’nin kromatindeki ve sitoplazmadaki yoğunlaşmayı yansıtacak şekilde arttığı gözlenir. kaspazlar ve “serine” proteazların aktivasyonu hölçülebilmektedir. ASM. Apoptozun belirlenmesi için kullanılan çok sayıda yöntem vardır. Ölü hücrelerin miktarının tayini. MM ile ilgili benzer çalışmalar mevcuttur. pRB. apoptoz sırasında bu asimetri bozularak fosfatidilserin.. protoonkojenler (ör:c-myc. ASM ile apoptoza eşlik eden proteazlar. hematolojik malinitelerde kemoterapiye yanıt alınmamasının önemli sebeplerinden biridir. MRP) kullanarak MDR varlığı hakkında bilgi alınabilir. proteinaz3 kaynaklı peptidlere karşı immun yanıtın artmış olduğunu. tümör suprese edici genler (ör: p53. 1. Bu şekilde tümör aşıları gibi çeşitli tedavi uygulamalarının sonuçlarını değerlendirmek de mümkündür. TUNEL deneyi (Tdt Mediated deoxyUridine Triphosphate-biotin Nick-End. plazma membranının yırtılıp sitozolün boşalmasını takiben FSC ve SSC de belirgin bir azalma göze çarpar. LRB1. Bir diğer uygulama alanı da minör doku antijenlerine (mHags) özgün sitotoksik hücre kullanımıdır. Miyelomda ise viral antijenlere karşı yetersiz immun yanıt oluştuğunu destekleyan veriler vardır. Bölünen bir hücrede her bölünme floresan miktarında azalmaya sebep olacaktır. apoptoz ve nekroz ile oluşan ölümlerin ayırt edilebilmesi Hücre ölümüne eşlik eden moleküller arasında en çok çalışılanlar: bcl-2 ailesinin elemanlerı.

hücre yüzeyinde beliren CD107a/b. Trombositlerin immunfenotiplemesi: ASM ile hücre yüzeyinde anormal glikoprotein ekspresyonundan yararlanarak Glanzmann’s trombastenisi ( CD41/CD61 eksikliği). (2)yapım hızlarının değerlendirilmesi. (3)dolaşımdan uzaklaşmalarının takibi. granül salınımı ile açığa çıkan öğeler. diğer hücreler ile etkileşimleri ölçülebilir. CD63) yüzeye çıktığı.7 Trombosit Çalışmaları ASM kullanarak trombositlerin klinik önem taşıyan hemen hemen tüm fonksiyonlarının ölçülmesi mümkündür.000/ mcl ye kadar inebilmektedir. (2) PAC-1. 1. Bu çalışmaların aktivasyonu takip eden hangi zaman diliminde yapıldığı. Benzer yöntem retikulositlerin sayımı için de kullanılmaktadır. kemik iliği baskılandığında ise azalır. kontrol için seçilen hücreler ve yöntemler alınacak sonuçlar üzerinde doğrudan etkili olduğundan iyi planlanarak kullanılması gerekir. CD40L antijenlerine yönelik olanlardır. Trombosit Aktivasyonu: Aktive olan trombositlerde (1) Normalde granüllerde bulunan antijenlerin (CD62P. yüksek RNA içerikleri nedeniyle Thiazol Orange(TO) gibi nükleik asitlere özgün boyalar ile işaretlenip ASM de sayılabilirler. Retiküle Trombositler: Genç trombositleri temsil eden bu hücreler. örneğin doğru hazırlanması önem taşır. Daha sonra kan sayım cihazında elde edilen KK sayım değerleri kullanılarak trombosit sayıları belirlenir. İmmunfenotipleme ile bu değişikliklerin saptanması mümkündür. ASM ile trombositlerin (1)Düşük değerlerde bile doğru sayımı. trombopoetin uyarımı ile artar. kemik iliği yetmezliklerinden ayrılabilir. 1. Trombositlere özgün yüzey antijenlerini taşıyan ve trombositlerden çok daha fazla trombojenik olan trombosit mikropartiküllerinin tanınması da mümkündür. granül salınımının takibi mümkündür. CD25. kullanılan yöntemler. Bernard Soluier sendromu(CD42a/CD42b eksikliği) gibi bazı genetik trombosit hastalıklarının tanınması mümkündür. depolama defektlerinin saptanması. Trombositlerdeki “dense” granüllere giren mepakrin gibi floresan boyaları kullanarak. Retiküle trombositlerle birlikte kullanıldığında immun trombositopeni ayırıcı tanısında yol göstericidir.DALVA K. trombositlere bağlı antikorların belirlenmesinde kullanılabilir. Sitotoksitenin. Sağlıklı sonuçlar elde edilmesi için örnekleme ile analiz arasında geçen süre.Diğer bir yöntemde ise ortama eklenen floresan boncuklar aracılığı ile birim hacimdeki trombosit sayıları hesaplanır. Ancak adı geçen boyaların plastiğe kolayca bağlanma özellikleri nedeni ile her ölçümden sonra cihaz dikkatle temizlenerek takip eden immunfenotipleme çalışmalarını etkileyecek yalancı sinyaller yaratılmasından kaçınılmalıdır. Retiküle trombositlerin dolaşımdaki sayısı. trombosit/eritrosit oranı belirlenir.8 Trombosit Ürünlerindeki Lökositlerin Sayımı Çok sayıda trombosit transfüzyonu yapılan hastalarda anti HLA antikorların gelişmesinden korunmak için ürün içindeki lökosit sayısının minimal düzeylerde olması istenir. Hızın yavaş tutulması ve kanın yeterince seyreltilmesi gerekir. Trrombositlere bağlı antikorlar(PaIg): ELISA yöntemlerine göre daha az işlem gerektiren ASM ölçümleri. Böyle duyarlı yöntemler kullanıldığında transfüzyon gereklilik sınırları 10. Bu amaçla en sık kullanılan antikorlar CD69. Uyarılan hücrelerin fenotipinde meydana gelen değişikliklerden yararlanarak 4-18 saatlik bir antijenik uyaranı takiben yanıtın değerlendirilmesi mümkündür. Antikorla(ör:CD41) işaretlenen trombositlerle birlikte kandaki diğer hücreler de sayılıp. Aktifleşen trombositler hızla dolaşımdan uzaklaştıkları için mümkün olduğunca aktivasyon yerine yakın noktalardan örnekleme yapılmalıdır. (5) Aktivasyonlarının takibi belirlenebilir Aktivasyona bağlı glikoprorein (gp)IIb/IIIa reseptördeki şekilsel değişim. LIBS gibi antijenlerde aktivasyondan sonra meydana gelen şekil seğişiklikleri nedeniyle yeni epitoplar açığa çıktığı görülür. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı Antijenik bir uyaranı takiben T hücrelerdeki hücre içi sitokinlerin ASM ile tayini oluşan immun yanıtın tipi hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir. salınan garanzim B/perforinin floresan işaretli antikorlar kullanarak ölçülmesi de mümkündür. Bu amaçla kantitatif ölçüm yaparak birim hacimdeki lökosit 84 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . Immunplatelet sayımı: Hücreye özgün antijenler kullanarak trombositler sayılabilir ve trombosit sayımı için referans bir ölçüm yöntemi olarak kabul edilmektedir. Böylece immun ya da yıkıma bağlı trombositopeniler. (4) tam kandaki agregasyonları.

Laboratuvarında multipl miyelomla ilişkili FISH uygulamalarından önce kemik iliği örneğindeki plazma hücrelerini saflaştırarak kullanıyoruz. and Molecular Genetic Findings Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 62B:25–38 (2004) 7. Özellikle moleküler yöntemlerle kombine edilebilecek yeni uygulama alanları ile ilgili çalışmalar giderek artmaktadır. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 34:82–86 (1998) 8. Artemis Chakerian.9 Hücre Saflaştırma (SORT) Kullanılan ilk akım sitometreleri. H. kalibrasyonu şarttır. Kromozomların “sort” edilmesi ile DNA veri bankaları için veri toplamak mümkün olabilmektedir. and Apoptosis Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 59B:46–53 (2004) 10. X. Michael Barnett. DVM. Kelly Garner. karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için akım sitometriden yararlanırken standardize edilmiş yöntemlerin kullanılması. Critical Rewies in Oncology/Hematology 50(2004)223261 12. A. Rogelio Paredes-Aguilera. Paietta. periyodik kontrolü. David Combs. Wind. Neuberg. Immunophenotypes in Patients With Acute Myeloid Leukemia Between Diagnosis and Relapse: Comparison With Cytomorphologic. van der Velden. D. van Dongen: Immunophenotypic Differentiation Patterns of Normal Hematopoiesis in Human Bone Marrow: Reference Patterns for Age-Related Changesand Disease-Induced Shifts Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 60B:1–13 (2004) 4. Renato Bassan.C. M. Kaynaklar 1. Cherie H.K. Jun-ichi Nishimura. Carlo Tondini Roel Willemze: Adult Acute Lymphoblastic Leukemia 11. September 2004 2. MT(ASCP).Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K.J. Norma Lopez-Santiago et al: Flow Cytometric Analysis of Cell-Surface and Intracellular Antigens in the Diagnosis of Acute Leukemia American Journal of Hematology 68:69–74 (2001) 5. Akım Sitometresi ile “sort” edilen hücreler. Yoshiko Murakami. M. Barbier. D. van Lochem. FISH gibi moleküler teknikler için kullanılması.A.G. hücreye özgün olan DNA sekanslarının PCR ile çoğaltılmasında. Bennett et al: A Surrogate Marker Profile for PML/RAR_ Expressing Acute Promyelocytic Leukemia and the Association of Immunophenotypic Markers with Morphologic andMolecular Subtypes. MD Post-PCR Multiplex Fluorescent Ligation Detection Assay and Flow Cytometry for Rapid Detection of Gene-Specific Translocations in Leukemia Am J Clin Pathol 122(5):783-793. Vincent R. 8-10 renkli analizlerle fonksiyon-fenotip ilşkilerinin kurulabileceği çeşitli çalışmalar. and Taroh Kinoshita: Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria: An Acquired Genetic Disease American Journal of Hematology 62:175–182 (1999) Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 85 . D. PhD.M. N.T. Goloubeva.Genellikle RNAnın parçalanmasını takiben DNA’ya bağlanan florokromlar ile çekirdekli hücrelerin işaretlenmesi prensibine dayalı bir yöntem kullanılır. te Marvelde. Biz de A:Ü. MD Applications of Flow Cytometry and Immunohistochemistry to Diagnostic Hematopathology Arch Pathol Lab Med—Vol 128. Floresan in-situ hibridizasyon (FISH) gibi tekniklerin uygulanmasında. Gray. Thomas MacKerrell. Gemma Gatta. David S. Susanne Schnittger Stability of Leukemia-Associated Aberrant 6. hücreleri verdikleri ışık sinyalleri esas alınarak karışık bir hücre topluluğu içinden ayırmak üzere (sort) düzenlenmişse de bugün rutin laboratuvarlarda kullanılan akım sitometrelerinin çok azında “sort” etme kapasitesi bulunmaktadır. Akım sitometresinden çok daha hızlı ve kolay olan saflaştırma tekniklerinin (ör: monoklonal antikorlar ile kaplı magnetik boncuklar) gelişmesi de bunda etkili olmuştur. 382–392 3. birer örnektir. Claudia Schoch. Sonuç Akım Sitometrisi hematolojide yukarıda özetlenmeye çalışılanlar yanı sıra pek çok klinik uygulama ve araştırma alanında daha kullanılabilir. Ancak özellikle hücre üzerindeki bir belirleyici zayıf olduğunda ya da çok parametre kullanılarak daha saf hücre toplulukları elde edilmek istendiğinde en iyi seçenek akım sitometresi olmaktadır. 1. B. Samir A. and J. Proliferation. cihazın optimum koşullarda kullanılması. sayılarını veren kitler geliştirilmiştir. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 59B:1–9 (2004) 9. Dunphy. MI T C H E L L S. Ming Chen. J. pp. transfekte hücrelerin klonlanmasında kullanılabilmektedir. V. Viswanatha. Nadir bulunan malin hücrelerin saflaştırılarak PCR yöntemleri. Kheiri. Westerdaal. 3. Renato Bassan et al: Adult Acute Myeloid Leukemia Critical Rewies in Oncology/Hematology 49(2004)197-222 13.1 O. J.F Hematoloji B. fonksyonel analizlerde.H. Muirhead. Cytogenetic. 14. K. Pathology (1999) 31.J. WA R D The Use Of Flow Cytometry In The Dıagnosıs And Monıtorıng Of Malıgnant Hematologıcal Dısorders. Matthew Smith. Lina Romero-Guzman. 2004. Daniela Voskova.G. Elde edilen verilerin multidisipliner değerlendirilmesi elde edilecek yararı büyük ölçüde arttıracaktır. hibrid teknolojilerinin akım sitometride değerlendirilecek şekilde uygulanması. Ancak her yöntemde olduğu gibi tekrarlanabilir. Ronot et al: A Flow Cytometric Assay for Simultaneous Assessmentnof Drug Efflux. E. E. Bonagura et al: Flow Cytometry With or Without Cytochemistry of Acute Leukemias?.

G. Barnard. Anna Guarini. and G. J. Huynh Hans E. MT(ASCP). Gianluca Gaidano. Bernard Husson. Daniela Capello et al Chronic lymphocytic leukemia patients with highly stable and indolent disease show distinctive phenotypic and genotypic features BLOOD. Artemis Chakerian. 102( 3) 2003 18.G. Lori A.1 V. Stacchini.112:105–110 21. Chikako Satoh. Indra Ramasamy. Viswanatha. MD Post-PCR Multiplex Fluorescent Ligation Detection Assay and Flow Cytometry for Rapid Detection of Gene-Specific Translocations in Leukemia Am J Clin Pathol 122(5):783-793. A. Godio. Kelly Garner. PhD. Martini. Inherited Bleeding Disorders: Disorders of Platelet Adhesion and Aggregation Critical Rewies in Oncology/Hematology 49(2004)1-35 86 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . Hideya Hyodo et al: Association between phenotypic features of blasts and the blast percentage in bone marrow of patients with myelodysplastic syndromes Leukemia Research 28 (2004) 1171–1175 20.DALVA K. Marc Maynadie´. Ford*. Palestro Flow Cytometry in the Bone Marrow Staging of MatureB-Cell Neoplasms Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 54B:10–18 (2003) 22. Ming Chen. NUMBER 7 23. Wood. David Combs. Johnsen: Molecular and Clinical Follow-Up after Treatment of Multiple Myeloma Acta Haematol 2004. Kussick. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı 15. Franc¸oise Picard. Kiyoyuki Ogata. Alan D. L. Owen et al: A simplified approach to determining P-glycoprotein expression in peripheral blood mononuclear cell subsets Journal of Immunological Methods 274 (2003) 129– 137 19. A. Yvan Cornet et al Immunophenotypic clustering of myelodysplastic syndromes BLOOD. Andreas Thiel and Alexander Scheffold Antigen-specific cytometry: The Monitoring of Immune Responses and Immunopathology ISAC 2004 Tutorial IV 26. Krueger et al: Evaluation of Platelet Function by Flow Cytometry METHODS 21. DVM. PhD Four-Color Flow Cytometry Identifies Virtually All Cytogenetically Abnormal Bone Marrow Samples in the Workup of Non-CML Myeloproliferative Disorders Am J Clin Pathol 120(6):854-865. Michelson. A. MD. Francesca Romana Mauro. David S. Marc R. P. Hoggard. Antinoro. Christian Wuchter et al: Correlation of Protein Expression and Gene Expression in Acute Leukemia Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 55B:29–36 (2003) 17. 16. Steven J. 2004. 259Ð270 (2000) 25. Brent L. PhD. Demurtas. Wolfgang Kern. Bernard Chatelain. Thomas Rasmussen Lene M. Alexander Kohlmann. 1 OCTOBER 2002 _ VOLUME 100. Knudsen Tuan K. MD. 2003 24.