Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı

Dr. Klara DALVA
Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hematoloji Bilim Dalı, Ankara

1. Giriş Akım Sitometrisinin (ASM) güncel hematolojik uygulamalardaki kullanımı giderek artmaktadır. Bu artışın nedenleri arasında, kısa sürede sonuç alınabilmesi, kullanımının kolay öğrenilebilmesi, anormal hücrelerin tanınmasına olan katkıları sayılabilir. ASM hematolojide en çok tanı, lösemi/ lenfoma/miyelom gibi hastalıkların sınıflanması ve tedavinin takibi amaçlarıyla kullanılmaktadır. Akım Sitometresi ile bir süspansiyon halindeki hücre ya da partiküller lazer ışığı ile aydınlatılmakta olan bir bölmeden geçirilir; hücrelerin ışığın önünden geçerken verdikleri sinyaller toplanarak analiz edilir. Oluşan sinyallerin kaynağı, hücrenin büyüklük, granülarite gibi fiziksel özellikleri olabildiği gibi; hücreye bağlanan çeşitli florokromlar da olabilir. Böylece hücre ya da partikülün immunfenotipi, DNA içeriği, enzim aktiviteleri, hücre membran potanasiyeli, canlılığı gibi çeşitli özellikleri hakkında bilgi toplanabilir. 2. Kullanım Alanları Akım Sitometrisinin Hematolojide en çok kullanıldığı alanlar arasında: • Lösemik hücrelerin immunfenotiplemesi • Hücrenin DNA içeriğinin ve hücre döngüsünün analizi, • Hematopoetik kök hücrelerin sayılması ve alt gruplarının belirlenmesi, • Hücre canlılığının tespit edilmesi, apoptoz ile ilgili araştırmalar • Çoklu ilaç direncinin(MDR) tespit edilmesi • Hücresel immun yanıtın belirlenmesi • Trombosit çalışmaları

• Trombosit ürünlerine bulaşmış lökositlerin sayılması, • Hedef olarak seçilen hücrelerin floresanla işaretlenerek saflaştırılması ve diğer uygulama alanları sayılabilir. ASM çalışmaları için perifer kan örneği, kemik iliği aspirasyon materyali ve biyopsileri, ince iğne aspirasyon materyalleri, tüm vücut sıvılarındaki hücreler [Bronkoalveolar lavaj(BAL), Lomber ponksiyon(LP) ile alınan örnekler…] kullanılabilir. 2.1 İmmun Fenotipleme İmmunfenotipleme, hematolojik malinitelerin tanınmasına ve morfolojiye ek bilgiler kazandırarak tiplendirilmesine yardımcı olmaktadır. Hücre yüzey antijenlerinin tanımlanmasında “Cluster of Differantiation, CD” terminolojisi kullanılır. Antijenlerin çoğu bir hücre serisine eşlik etseler de o seriye özgün değildirler. Farklılaşmanın değişik evrelerinde sergilenen antijenler, hücrenin olgunlaşmasının takibinde kullanılabilir . Belli tümör hücrelerine özgün antijenlerin sayısı ise çok kısıtlıdır (ör PML de PML-RARa, KML de Bcr-abl gen ürünleri). Bazı tümör hücrelerinde antijenlerin “aberan” bulunmaları söz konusudur (Ör: miyeloid bir hücrede lenfoid bir antijenin bulunması) Hücreyi tanıyıp gelişiminin hangi evresinde olduğunu belirleyebilmek için çeşitli antikor panellerinin kullanılması gerekir. ASM çalışmalarını değerlendirebilmek ve karşılaştırılabilir sonuçlar için çalışma protokolleri ve toplanan veriler standardize edilmelidir. Veri analizinde hedeflenen: 1)anormal, neoplazi potansiyeli olan hücrelerin normallerden ayrılması, 2)anormal hücrelerdeki antijen profilinin ortaya koyulmasıdır. Bu amaçla birçok parametrenin birlikte değerlendirilmesi gerekir(dar

Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi
TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU

73

Bu panel ile hücre serisinin tanımlanamadığı durumlarda. Bazı durumlarda morfoloji bilinmese de tanısal değerlendirmelerin yapılabileceği savunulmaktadır (tablo 1) 2. minimal rezidüel hastalığın takibinde kullanılacak bir parametre arandığında. Değerlendirmeler için sadece anormal hücreleri içine alan bir grubun seçilmesi (gating) önerilse de incelenen örnekteki normal antijen dağılımını bilmeden anormal bir topluluğu tanımak mümkün olmaz. Anormal bir hücre topluluğu görüldüğünde bunun immunfenotipinin tanımlanması gerekir. Özellikle kemik iliği örneklerinde sadece FSC ve SSC den yararlanarak hücrelerin kesin sınırlarla ayrılması mümkün olmaz. Tablo 1. • Zayıf eksprese edilen yüzey antijenleri tesbit edilebilir. Hücreleri bulundurdukları CD45 miktarına ve 90° kırılan ışık (SSC) özelliklerine göre ayırmak yol gösterici olabilir (şekil 1) ancak bu antikorun her tübe eklenmesi maliyeti arttırıcı bir faktördür. SLL. hiposellüler kemik iliklerinden ASM için yeterli sayıda hücre toplanamaz. • Çok renkli(2. bifenotipik hücrelerin belirlenmesi mümkündür.1 Akut Lösemiler Akut lösemierin %95 i temel antikorların kullanıldığı bir panel ile tanımlanabilir (tablo 2. ayırıcı tanıda seçenekleri azaltmada. • Eş zamanlı bulunan birden çok hematolojik malinitenin. ASM nin tanıya katkıda bulunduğu hematolojik hastalıklar ASM ile tanı koyulabilir ASM tanı ve ayırıcı tanıda yardımcıdır Pre-B ALL Folliküler NHL T-ALL “Mantle Cell” Lenfoma B-CLL.…) analizler ile hücrenin fenotipi. Diğer “low grade”lenfomalar “Hairy Cell” Lösemi Büyük B hücreli NHL Akut Miyeloid Lösemi Burkitt’s lenfoma “Paroxysmal Nocturnal” Hemoglobinüri “Large” granuler lenfosit hastalıkları Plazma hücre hastalıkları MDS ALL: Akut Lenfoblastik Lösemi. enfeksiyoz mononukleoz. reaktif dermatoz. örnekteki normal hücreler zaman zaman bir internal kontrol olarak da fonksiyon görürler. • Aberan bir T hücre immunfenotipi.4. kullanılabilir. Bunu ifade etmenin en kolay yolu antijen taşıyan hücrelerin oranlarını (%) bildirmektir. • Hodgkin hastalığında neoplastik hücre sayısının az olması nedeniyle de tanıda ASM kullanımının bir yararı olmaz. moleküler/sitogenetik çalışmalar da verilerin değerlendirilmesinde yardımcı olan unsurlardır. enflamatuvar hastalıklarda da görülebilir. ancak bu parametre hücre üzerindeki antijen sayısı yanı sıra kullanılan florokrom ile de yakından ilgilidir. Dezavantajları nedeni ile ASM sonuçlarının daima ışık mikroskobu verileri ile birlikte değerlendirilmesi gerekir. koyu yazılanlar). ASM ile immunfenotipleme yapmanın Avantajları: • Büyüklük (FSC) ve Granüler (SSC) yapılarına göre hücreler sınıflandırılabilir. Klinik veriler.3. ASM. Dezavantajları: • Sklerotik kemik iliğinden. gerekirse standartlar kullanılarak antijen/hücre sayısını belirlemek mümkündür. Antijen yoğunluğunu göstermek için de ölçülen floresan sinyallerin şiddeti belirlenir(Mean Fluorescent Intencity. • T hücreli lenfomaların aberan bir antijen(örneğin bir panT hücre belirleyicinin kaybı/ azalması) bulundurmadıkları sürece tanınması mümkün olmaz. prognostik verilere ulaşılmak istendiğinde literatür ışığında kullanılan diğer antikorlar yardımcı olabilir. • Hücrelerin çevreleriyle olan ilişkileri gözlenemez • T hücreden zengin lenfomalarda ufak bir monoklonal B hücre klonunun tanınması mümkün olmayabilir. Analiz edilecek hücrelerin doğru seçimi önemlidir. morfolojik veriler AML M6 M7 den şüphe ettirdiğinde.MFI). Ward. • Ölü hücreler çalışma dışı tutulabilir. hastalık alt tiplerinin belirlenmesinde. morfolojik olarak şüphelenilen çeşitli hastalıkları doğrulamakta. SLL:Küçük Lenfositik Lenfoma. gelişiminin hangi evresinde bulunduğu belirlenebilir. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı açıyla kırılan ışık FSC 90° açıyla kırılan ışık SSC ve antijenlerin işaretlendiği florokromlardan kaynaklanan sinyaller) Aynı hücrede birden çok (en sık 3-4) antijenin belirlenmesi tavsiye edilmektedir. • Lenfomalarda doku tutulumunun homojen olmadığı durumlarda yalancı negatif sonuçlar alınabilir.1.DALVA K. herzaman bir malinite göstergesi olmayıp. CLL: Kronik Lenfositik Lösemi . NHL: NonHodgkin Lenfoma Mitchell S. pathology (1999) 31 den modifiye 74 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU .

FSC-SSC M0/M1 dan fazla. ±:değişken. 11a-. Trombosit adezyonuna bağlı yalancı+ dikkat!! M7 Diğer karakteristikler Sayılar CD no ifade etmektedir (ör:33=CD33). 34-/+. DR13 zayıf. DR+. CD14 spesifik ama sensitif değil Beklenenden az tanınıyor Erken eritroid işaretlerin kaybı. -: negatif. t(8.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. Tablo 3. 235a++ 61+. zayıf 7+. MPO ya özgün antikorlarla işaretlenir. MPO+.DR+.18zayıf. CD4± M1 SSC(granülarite). 34-. Özellikle M0 ve M7 olgularında tanı için immunolojik yöntemler gereklidir. 33+. 34+. M0 dan fazla 13+. 33+ >13+. 2±. 45 SSC dağılımında blastlar 34 daha az.33+. CD61 cCD235a(Gly-A) M4. Tanı için immunfenotipleme ve elektron mikroskobi(trombosit peroksidaz için) gerekir. AML’nin French-American-British (FAB) sınıflamasına göre gruplanmasında sitokimyasal yöntemlerin önüne geçmiştir.33±. 13+. AML hücreleri CD13.21) lehine M2 M3 Tablo 2.1 Akut Miyeloid Lösemi (AML) ASM. 34+ M5: 33+.34+. 13±. Şekil 1. monositik komponent+. 14+. DR+. DR+. 41+. MPO+/. 15c. SSC düşük (lenfoblast gibi) 7+ ve 34+ prognozda 34+. Akut Lösemi Tanısında kullanılabilecek temel antikorlar Hücre Serisi B T M Hücre serisini belirleyici cCD79a cCD3 cMPO cCD22 CD3 CD13 CD19 CD7 CD33 Matürasyonu belirleyici CD34 TdT CD10 CD20 CD22 c IgM κ λ CD34 TdT CD1 CD2 CD3 CD5 CD4 CD8 CD34. 33+. AML de immunfenotipik özellikler FAB tipi İmmunfenotip Notlar M0 FSC. 13+. monositlerde 4+ M6 Nadir. Mevcut ise aberan AML hücrelerinin 19+. 33±. CD11b HLA DR CD14 CD68 CD41. AML hücrelerinde lenfoid antijenlerin bulunması her zaman “mix-lineage” veya bifenotipiyi göstermez. 117+. daha az blast. DR+ SSC artmış. 15+. 45-/zayıf. 8-. Kuvvetli 13 retinoik sendrom lehine 56+ s form(bcr3 lehine) 2+ M4Eo lehine.9+. CD117 CD15 CD11a. MPO: miyeloperoksidaz Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 75 .34 daha az.45 zayıf. 4± Maturasyon artmış.1. spesifik olmayan Ig bağlanması (↑FcR nedeniyle). +:pozitif. 13-.DR=HLA-DR. diğer miyeloid antijenler sınıflamada yardımcı olsalar da prognostik değerleri sınırlıdır (tablo 3). CD33. morfoloji tanısal olmayabilir 2.1. 15+. CD11b nin kötü prognostik değeri dışında CD34 başta olmak üzere bazı antijenlerin önemine dair çalışmalar olsa da görüş birliği yoktur. olumsuz 7±.(56+). M5 Benzer özellikleri var M4 de blast daha çok.

iyi prognostik bir işarettir. miyeloid ag+(15+) 11q23 anomalisi düşündürür ve kötü prognostik Çocukluk çağı lösemilerin %25i. CD 19 varlığı kötü prognostik [t(9. minimal s3+. kötü TdT+. t(15. ALL olgularını DNA içeriklerine (ploidi) göre sınıflamak da mümkündür. eser miktarda da periferde bulunan CD10+. T-ALL de spesifik T hücre antijenlerinin bulunmaması (Ag kaybı). Kemoterapi sonrasında. cIgM Hücreler daha büyük. TdTc. 5+. CD10. AML M7 olgularında CD41ve CD61 ile pozitif reaksiyon veren hücrelerin. koyu yazılanlar tipik bulgulardır Sayılar CD no ifade etmektedir (ör: 3=CD3). lenfomalarla ayırıcı tanıda yardımcıdır. PML/RARa+ olan AMLM3 olgularından ayrılmaları gerekir. 19+. 5+. 7+.9+.8). 24+. 19+.34FAB L3 ile örtüşür c-myc(8q24) ilgili translokasyonlar [Ör: t(8. CD2 veya CD7 varlığı tanı için yeterli değildir. DR=HLA-DR. c79a+. 3± Seyrek Medullar Sayılar CD no ifade etmektedir (ör: 19=CD19). FSC değerleri de yüksek olabilir(büyük hücreler). 2. Bu amaçla CC34. 10± zayıf Çocukluk ALL nin %70 i. 34+.B ALL B-ALL 1a+.10+. 34-. 19+. CD2 varlığının özellikle çocuklarda kötü prognostik olup. İntegrinlerin kaybı (CD11a.17). aberan eksprestyonlar çok tipiktir. TdT ve CD34. inv(16)] sitogenetik belirleyicilere eşlik edebilir. 79a+ CD10+ (iyi prognoz). c22+. Hiperdiploidi daha iyi. CD10-(kötü prognoz) 19+.8) yapılır (tablo 5). 76 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . DR+. -: negatif.SSC düşük). cCD22.14). Sınıflama timik farklılaşma evrelerine göre (CD1. CD11b. 20±. Ig: İmmunglobulin. KI deki istirahat halindeki öncü B hücreleri (timustaki T öncülerine karşılık olacak şekilde) tanımlamak için kullanılır.2 B Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerin farklılaşmasına göre 4 sınıfta toplanabilen (şekil 2) bu lösemilerin immunfenotipik Tablo 4. NK hücreli akut lösemi. 7+. Tablo 5. 7+.sIg-. t8. c22+. 24+.21). morfolojisi ve immunfenotipi ile AML M3v ile benzerlik gösterse de RARa mutasyonu yoktur. lösemik blastlara yapışmış olan aktif trombositlerden kaynaklanmadığından emin olunmalıdır. s: yüzeyel. ±: değişken c: Sitoplazmik. cCD79a) en az ikisinin pozitif olması gerekir. 4+ veya 8+. CD16.ALL tanısı için sitoplazmik ya da yüzeyel CD3 varlığı koşul olup. TdT+ 2+.3 T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi T-ALL erişkin ALL lerin %25 çocukluk çağının ise %15 inden sorumludur. Hematogonlar: Hematogonlar kemik iliğinde.20±. T hücreli ALL de tipik immunfenotipik özellikler ALL tipi İmmunfenotip Notlar Pre(pro)T-ALL Erken kortikal timik Geç Kortikal timik c3+. kök hücre naklinden sonra sayıları çok arttığından. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı tanınmasını kolaylaştırırlar (%5-28).olan bu hücreler ATRA’ya yanıt vermezler ve CD56+. hipodiploidi daha kötü prognoz işaretidir.1. 22+. B hücreli ALL de tipik immunfenotipik özellikler ALL tipi İmmunfenotip Notlar “null cell” ALL c19+. -: negatif. CD56+. biyolojik olarak farklı olan bir hastalığığın işareti olduğu kabul edilir. Tdt±. 34+. Tanı koyulabilmesi için erken B hücre işaretlerinden (CD19. 2.19) a bağlı kötü prognoz. T. İmmatür B hücrele.1.22)] karakteristikleri tablo 4’te özetlenmiştir. 7+. TdT-.1. dual 4+/8+. +: pozitif.10+. CD41 yanısıra matur trombosit işareti olan CD42b nin kullanılması. TdT4.DALVA K. parlak 22+. parlak klonal sIg. bu dönemlerde incelenen KI örneklerinde hematogonların malin hücreler ile karıştırılmamasına özen gösterilmelidir. 5. t(2. 2+. megakaryoblastlar ile trombositlerin ayrılmasına olanak sağlar. DR+. 10prognoz B-prekursör ALL (Erken preB) (Pre-preB) (“Common” ALL) Blastlar küçük (FSC. CD18) M3 için tipik bir bulgudur. diğer T antijenleri2+. t(1. TdT parlak+ Kötü prognoz pre. 20+. CD19+ hücreler olup. +: pozitif. 5+.4. erişkin ALL nin %50 si CD10-.1.22)] veya iyi prognostik [t(8. Sitogenetik veriler prognozun belirlenmesinde en güvenilir işaretlerdir ve her genetik işarete özgün olan bir immunfenotip bulunmadığından ASM bunun önüne geçememiştir. Blastların CD45SSC dağılımına göre lenfoblast/ miyeloblast/ monositik bölgede yer alabilmeleri nedeniyle “gate” almak zor olabilir. ±: değişken c: Sitoplazmik.

1.1. Hücre serilerini en iyi tanımlayan antijenler B hücre için CD22. Bu ayrımı kolaylaştırmak için bir skorlama sistemi kullanılamakta olasa da bazı araştırmacılar.2 Kronik Miyelositer Lösemi (CML. B: monositik. antijen sayısına göre yapılacak bir değerlendirmenin doğru olmadığını düşünmektedir. Bu olguların tipik olarak CD34+.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. ve genellikle CD38+. HLA-DR+. Hücrelerin en az %10 unda miyeloid Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 77 . C: granulositik.1. KML) ve NON-KML Miyeloproliferatif Hastalıklar (NCMPDS) ASM nin KML nin kronik fazında kullanımı sınırlıdır. Kemik iliğinde normal A: B hücre.1. miyeloid hücreler için MPO dur. T hücre için CD3. Bu durumun lenfoid antijen taşıyan AML ya da miyeloid antijen taşıyan lenfoid malinitelerden farklı olduğu vurgulanmalıdır. Şekil 2. 2. Nadir olarak aynı anda iki farklı malin hücre serisinin bir arada bulunduğu durumlar söz konusu olabilir ki “mixed lineage” veya “bilineage” lösemi olarak adlandırılır.1. CD7+ olup.4 Bifenotipik Akut Lösemiler Lösemik hücre üzerinde lenfoid ve miyeloid antijenlerin birarada bulunduğu bir erken öncü hücre(pluripotent) malinitesi olarak tanımlanır. farklılaşma göstermeyen (undifferantiated) Lösemiler Lösemilerin %1 kadarı sınıflandırılamamaktadır. D: eritroid hücre gelişimi ve immunfenotipik özellikleri 2. bir hücre serisine özgün olan başka bir antijen taşımadıkları görülür.5 Akut. 2.

SLVL: villöz lenfositli splenik lenfoma. Anormal veriler arasında: (1) polisitemia verada bcl-XL ekspresyonunda artma. p-selektin. B hücre Lenforoprliferatif hastalıklarında fenotipik özellikler Hastalık İmmunfenotip Notlar CLL/SLL 5+. sIgD±. 2. CD56 ekspresyonu) belirlenebilir. 105+. Hastalığı B7/BB1 +++ RS hücreleri Aktivasyon: 25+. 20+. 19 ko ekspresyonu sIgM/D z+. 10+.2. yoğunlukları yol göstericidir (tablo 6). DR+. T-. Zap70 ekspresyonunun Ig ağır zincir mutasyonları ile ilişkili olduğu ve kötü prognoz.3 Kronik Lenfoproliferatif Hastalıklar ASM. CD7. NHL NHL. RS: Reed Stenberg hücreleri. Anaplastik LCL: 30+. CD13. 20 z+. 23-.3. 11c19+. 23-. 43-. gpIb ve gpIIb/IIIa da azalma.103+. 22+. 5-. -: negatif. 20+. Klonal bir sitogenetik anomali bulunduran olgularda aberan antijen ekspresyonları (NCMPD deki gibi).10-. FMC7+.3. 10-.1 Kronik Lenfositik Lösemi.CD16. 71+ Büyük hücreli karsinomdan ayrır Nodüler lenfositten zengin HD farklı bir tip olup. 23-. PLL: prolenfositik lösemi. Blastik transformasyonda ise farklılaşmanın lenfoblastik ya da miyeloblastik yönde mi olduğu tanınabilir. genelde doku biyopsilerindeki tipik immunfenotipik özellikleri ile tanınır. 22+.olabilir. FMC7+. CD56.1. CD11b-CD16 arasında) izlenebilir. CD7. 20parlak+. CD71 gibi miyeloid olmayan antijenlerin aberan ekspresyonu bulunabilir.4 + Sayılar CD no ifade etmektedir (ör: 19=CD19). 22++. 21-. 79a+. MCL: “Mantle cell” lenfoma. CLL nin atipik morfoloji gösteren bir alt grubunda sIg parlak+. 10-. 5-. 19+. 25+. trombospondin.CLL tanısı şüphe ile karşılanıp. kalın yazılanlar karakteristik özellikleri vurgulamaktadır 78 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . DR=HLA-DR. 2. SMZL: splenik “marginal zone” lenfoma. Bcr-abl onkogenine özgün antikorlar. 70+. Bu durum trizomi 12 ve kötü prognoz ile birliktedir.30-. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı seri antijenlerinin dağılımında (özellikle CD33. CD5. CD10. sIg+. hızlı seyir lehine bir veri olduğu bilinmektedir (tablo 7). 20+.1. Kan ve kemik Tablo 6. 20+. 23parlak+. 23-. 22+.. (3) Miyeloproliferatif bazı hastalıklarda miyeloid hücrelerde CD66 ve CD14 ün aberan koekspresyonu bulunabilir. 103-. FCC: “Follicular center” hücreli lenfoma. “Non-Hodgkin” Lenfomalar. CD23-.DALVA K. CLL ve SLLnin aynı hücreden köken alan ancak doku dağılımı farklılık göstern hastalıklar olduğu düşünülmektedir. DR+. t(11. 5-. DR+. 70. SLL: küçük lenfositik lenfoma.45+. Bhücre kaynağının belirlenmesinde ve ayırıcı tanıdaki seçenekleri minimale indirmek konularında yardımcı veriler sağlar.CD36. CLL/SLL olgularında aberan antijen ekspresyonları (CD2. 19+. Non-KML miyeloproliferatif hastalıklarda CD2. KML hücrelerinin belirlenmesinde kullanılabilir. 71+ T antijenleri: %50 sinde 2. CD19+ olması tipiktir. malin (klonal) lenfoid proliferasyonun benign proliferasyondan ayrılmasında. 5. Miyelodisplaziler(MDS): Immunfenotiplemenin tanısal ve prognostik önemine dair çalışmalar olsa da standart tanımlamalar yoktur. HCLvariant: 11c z+. DR+. DR+. 10%50 sinde 5+ MCL FCC MZL SMZL/SLVL HCL l > k. 45-. gpIV ve c-Mpl de artma. <%20 1020+. 2. 19+. CD5+. 25-.14) sIg parlak+. CD5. 24+. 5-. FMC7+ CD79b+ izlenir.1. diğer “low grade” lenfomaların ekarte edilmesi gerekir. 19+. 15+. 25z+ 21-. Birden çok antijen dağılımının bozulması söz konusudur.3. CD14 CD15 de azalma. MALT&monositoid 11c+. 25+. ASM ile kronik miyelomonositer lösemilerdeki monositlerin oranı ve bu monositlerdeki anormal antijen ekspresyonları(ör CD13. Tanımlayıcı tek bir antijen olmasa da antijenlerin dağılma özellikleri. CLL: kronik lenfositik lösemi. iki miyeloid antijenin dağılımındaki senkronizasyonun bozulması (ör. 19+. HCL: “hairy cell”lösemi. DR+. 45±. 23±. 11c+++. 24-. sIg ılımlı+. CD13. klonal hafif zincir z+ PLL sIg parlak+. CD13) artma ya da azalma yönünde değişiklikler. İmmunfenotip ile “high grade” tansformasyon(Richter) ve prolenfositik transformasyonların CLL den ayrılması mümkün olmaz. 20++. 5-. 22-. ±: değişken z+: zayıf pozitif. tipik FMC7-. B-NHL 19+. 22++ sIg. 22+. sIgM parlak+. +: pozitif. TdT-. CD20+.görülür LCL “Hodgkin” Genellikle: 30+. hücrelerin ışık saçılım özelliklerindeki değişiklikler (özellikle hipogranülarite) dikkat çekmektedir. 22+. (2)esansiyel trombositozda trombosit yüzeyindeki gp1a/IIa. 34. 43+. 19+. sIgparlak+.15-. CD34) beklenen yaşam süresinin kısa olması lehinedir. DR+. 20+. CD33. CLL Erişkin lösmiler arasında en sık görülen tip olan CLL de. LCL: Büyük hücreli lenfoma.

CD71.3. HLA-DR) taşımaları karmaşaya neden olabilir. 8-. 252+. 5+. ±:değişken. 5+. 7-. Reed Sternberg hücreleri bireyler arasında değişip. T hücreden zengin B hücre lenfomalarının HH ve T hücreli lenfomalardan ayrılması zordur. uzun hastalıksız yaşam lehine önemlidir. SLL: Küçük lenfositik lenfoma. 7-. iliği örneklerindeki karakteristik bulgular daha az tanımlanmıştır.3 “Hodgkin” Hastalığı Hodgkin Hastalığında malin hücrelerin sayısı az olup ( <%1) çoğunluğu enflamatuvar hücreler oluşturduğundan CD4+ hücrelerin hakim olduğu karışık bir hücre topluluğu izlenir. immunfenotipi ile diğer büyük hücreli kanserlerden ayrılabilir. LGL: “Large granular Lymphocyte”. 4-. 8-. pansitopeni) bu antijenlerin aranması gerekir.56+: daha agresif NK-LGL MF/Sézary Büyük B hücreli Lenfoma Bcl-2 CD10+. CD15. MF: mycosis fungoides Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 79 . 84+/8-: tedaviye daha iyi yanıt T-LGL lösemi 2+. CD5+. 3+. lösemi/lenfoma 25parlak+ T-CLL 2+. OS: “Overall Survival” Sayılar CD no ifade etmektedir (ör:3=CD3). +:pozitif. 8+. CD10 Miyelomonositik işaretler ve CD10. nadiren 8+ 3+. Bcl-6+. Ancak büyük hücreler daha duyarlı olduklarından. Şüpheli durumlarda(splenomegali. 16+. 7+. akım sitometrideki ışık saçılımından(FSC) büyük hücrelerin oranı saptanabilir. morfoloji. 16+. blastik MCL nin (sIg+. 4-. 8-. CD103. 25- CLL: Kronik lenfositik lösemi. 3-. hazırlık işlemleri sırasında parçalanmaları ve tanınmamaları sık karşılaşılan bir durumdur.CD7 Tümü kısa OS ve CD10 hızlı progres ile CD13. “Large Cell” lenfoma: Perifer kanında pek görülmeyen bu hücreler. 5-. Tanının morfoloji ve immunfenotipik bulgularla birlikte koyulması gerekir. 7+. CyclinD1’in moleküler analizini gerektiren durumlar olabilir(zayıf CD23 ekspresyonları) . “Hairy cell” lösemi: doğru tedavi ile tedavisi mümkün olan bir hastalık olduğundan tanınması Tablo 7. 4+. CD33 karakterize CD34 CD38 ZAP-70 MUM1 Plazma hücre diskrazileri CD11c. 3+. 8±. CD11c. 11b+. CD23 ile de CLL ile ayırıcı tanı mümkün olur (tablo 6). Genellikle sIg(-) olduğundan monoklonalite de gösterilemez. 5+. 5+. CD5-. 57-. 252+. 4+. 3+. “Mantle Cell” lenfoma: İmmunfenotipleme. aktivasyon işaretlerini de (CD25. “Marginal zone” lenfoma: Mukozalardaki lenfoid doku (MALT. Tanı için immunfenotip. 56+. NK: “Natural Killer Cell”. variant HCL ile ayırımı zor olabilir. 2. T hücre lenfoproliferatif hastalıklarında fenotipik özellikler Hastalık İmmunfenotip Notlar T-PLL 2+. 57+.1. TdT-) lenfoblastik lenfomadan (sIg-. 3+. CD25 gibi antijenlerin varlığı tipiktir. CD79b MCL ‘de pozitif iken CLL/SLLde genellikle bulunmaz. CD13. bazılarında sadece poliklonal hücreler veya karışık hücre topluluklarından bahsedilmektedir. 4-/8+ nadir 4+. Erişkinlerde genellikle B hücreli olup. Kİ aspirasyonunda zorluk. Kan ve kemik iliği örnekleri yerine lenf nodülünden yapılacak immunfenotipleme daha anlamlıdır. immun fenotipik özellikleri benzerdir. bu grupta yer alır. Cd14. Tablo 8. klinik özellikleri birlikte değerlendirilmelidir. ASM incelemesinde “debri”lerin bulunduğu kısı kalabalıktır. Tedaviye farklı yanıt veren variant tipinde CD25. kısa OS ve agresif hastalıkla birliktedir Kısa OS. “Follicular centre cell” lenfoma: Tüm lenfomaların yaklaşık %45i bu tipte olup. ileri evre lehine Uzamış OS. CLL ve HCL den ayırıcı tanısı gerekir. 56-. bazı çalışmalarda CD30+ B hücreler. eksta nodal) ve monositik B hücreli (nodal) lenfomalar. Lenfoid/Plazma hücre hastalıklarında İmmunfenotipik prognostik işaretler Hastalık İşaretler Prognostik önemi CLL/SLL CD2. -: negatif. 25Tanı zor TCR gen rearanjmanı gösterilmedikçe reaktif T hücre proliferasyonu ekarte edilemez L selektin ekspresyonu ↑ Aberran patern . MCL.beklenir. 4+. 3+. TdT+) ayrılmasında kullanılabilir. MUM1-(germinal merkez fenotipi) Erişkin T 2+.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. “Anaplastic large cell” lenfoma: CD30+ olan bu hücreler. Dual 4+/8+. hassas olup kolayca parçalanabilir. 7-.

CD59 eksikliği gösterilemez. Kemik iliğindeki hücrelerde CD138 ve VLA5 eksprese edilirken. VLA5+ İmmatür plazma hücreleri: CD45+. CD57-. monositler için CD55. Miyeloma aslında kemik iliğinin bir hastalığı olsa da bazı miyelom hastalarında ve reaktif durumlarda(karaciğer hst. LGL nin CD3+. daha sessiz seyreder. hastalıklardaki klonal değişimler nedeniyle fenotipte değişiklikler ortaya çıkabilir. CD3+.1. Tipik fenotipler şöyle özetlenebilir: Primitif plazma hücreleri: CD45++. NK-LGL’de CD2+. PNH klonunun büyüklüğünü saptamak için eritrosit ve lenfositlerden ziyade granulosit ve monositklerdeki ekspresyonunun kullanılması önerilmektedir. 2. T. CD8-. Bu proteinlerden CD55. CD22. CD19Primitif hücrelerin varlığı kötü prognoz işaretidir. HLA-DR).5 Paroksismal Nokturnal hemoglobinüri (PNH) PNH. Önemli olan tümöre özgün olan antijen/sinyallerin kullanılmasıdır. daha agresif seyreder. Eritrositler yanısıra granulosit. genellikle nötropeni ve otoimmun hastalıklar eşlik eder. MAC’ın eritrositleri parçalamasına neden olur. CD59’un eksikliği “membran attack complex”. HIV) perifer kanında da plazma hücrelerine rastlanabilir. Aplastik Anemiye eşlik edebilir veya dönüşebilir. monositlerde de bu proteinlerin eksikliği görülür. PNH eritrositleri fenotiplerine göre 3 gruba ayrılabilir. Hemoliz ve hemoglobinüri. CD19+. CD59 ekspresyonu hiç yoktur.1. CD16+. CD48 in en iyi belirleyiciler olduğu CD16 nın eozinofillerde bulunmaması nedeniyle eksikliğinin dikkatle değerlendirilmesi gerektiği bilinmektedir.1. CD 38. ASM ile ışık saçılım özelliklerinden de yararlanarak uygulanan multiparametrik analizler ile MRD belirlenebilir.3. PNH.6 Minimal Residüel Hastalık (MRD) Hematolojik malinitelerin tedavisini takiben MRD’nin tesbiti giderek daha fazla önem kazanmaktadır. Hücre memranına Glikozilfosfatidilinozitol (GPI) ile bağlı bulunan proteinlerin eksikliği söz konusudur.1. CD10+. 80 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . TCR+ olup. gibi diğer antijenlerle birlikte kullanılırsa daha iyi bir ayırım sağlanabilir. Tip II hücreler ise komplemana orta derecede hassasiyet gösterirler ve bu proteinler için kısmi bir eksiklik söz konusudur. CD38++ Matür plazma hücreleri: CD45-. PNH I komplemana duyarlığın normal olduğu tip olup.4 Multipl Miyelom Plazma hücreleri farklılaştıkça B hücre antijenlerini (CD19. CD45. Posfatidil İnozitol Glikan sınıf A (PIG-A) genindeki mutasyonlara bağlı ortaya çıkar ancak. CD56+ olan bir varyantı hepatosplenik g d hücre lenfoması olarak da bilinmekte ve kötü prognoz göstermektedir. PCA-1. CD14. CD56+. CD55. trombositopeni ve hepatosplenomegali daha belirgin olup. çok az sayıdaki tümör hücrelerinin bile belirlenmesini sağlar. Anemi. fenotipine göre T ve NK olarak ikiye ayrılır T-LGL’de CD24. Genetik işaretler için kullanılan moleküler yöntemler. CD38++. 2. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı 2. 2. CD16+. CD3 yanısıra CD4 veya CD8 pozitiftir. CD45i kaybeder ve CD38(çok parlak). Kemik iliğindeki miyelom hücrelerinin normal plazma hücrelerinden farklı olarak CD56 ekspresyonlarının yüksek olduğu görülür. Bunlar tanı anındakiler ile aynı olabilir veya. Miyelodisplastik Sendrom. klonal bir hastalık olup.3. CD138 gibi yeni antijenler taşır. CD3-.4 T Hücre Hastalıkları Bu hastalıklarda perifer tipi T hücre fenotipi izlenir.izlenir.1. CD8zayıf+. Duyarlılık 10-3-10-4 düzeylerindedir. CD56-. periferik kanda sitopeni. CD57+. CD5-. venöz tromboza yatkınlık en karakteristik klinik bulgulardır.5 “Large granular” Lenfositik (LGL) Lösemi LGL Lösemi morfolojisi tipik olup. TCR. CD38++. Garnulositler için CD55. Her iki durumda da immatür plazma hücreleri bulunabilir ve özgün olmayan bir uyarılma işaretidir. 2. nadir görülen edinsel. NK hücrelerde monositlerde de bulunduğunda tek başına değil de CD56. CD4. Matür hücreler ise sadece aktif hastalığı olan miyelom hastalarında bulunup monoklonal özelliktedirler. CD59. Normal T hücre antijenlerinin kaybı ya da yoğunluklarının değişmesi tipiktir (tablo 8).DALVA K. Nadir görülen aberan bir ekspresyon. sIg. CD59 CD66b. CD56+. PNH III ise hassasiyetin 15-25 kat fazla olduğu tipi temsil eder ve CD55. klonal gelişme için bu mutasyonun varlığı yeterli değildir. periferdeki hücrelerde bu antijenler yoktur ya da çok zayıf eksprese edilirler.

hücrenin DNA içeriğini yansıtmaktadır. hücre zarı geçirgen hale getirildikten ve RNAse ile işlem gördükten sonra boyanması önerilmektedir. Bu şekilde hücrelerin çoğalma hızları hakkında bilgi toplanır. +17.%10 olması beklenir. Bu durumda test edilen hücredeki DNA’nın normal hücrelerdeki DNA miktarlarına oranlanması ile elde edilen değer DNA indeksi olup. DAPI. Hematolojik malinitelerde anaploidi nedeni olabilen kromozomal değişiklikler Hastalık Akut Miyeloid Lösemi Kronik Lenfositik Lösemi Akut lenfoblastik Lösemi “Non-Hodgkin” lenfoma Kromozomal değişiklikler +8 (%13). Anaploidinin bulunması malinite lehine bir bulgu olsa da bu her zaman doğru değildir. Normalde 1 +/. DNA indeksinin >1 olması hiperploidi. Bu durumun sonuçları etkilememesi için DNA’nın. Bu tür florokromların bir kısmı sadece DNA ya bağlanırken çoğu DNA ve RNA ya bağlanabilme özelliğindedir. Boyama sitokiyometriktir. Kemik iliğindeki hematogonlar. benzer şekilde anaploidi daima kötü prognozun bir işareti olarak algılanmamalıdır. 2. MRD için uygun bir takip parametresidir. Hoechst dür. +14. <1 olması hipoploidi olarak tanımlanır.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. +6. +18. B hücreli CLL de CD19. pre B hücreleri ile aynı antijenleri taşırlar. Bu hücreler ancak antijen ekspresyonunun şiddeti veya eşlik eden aberan bir antijenden yararlanarak malin hücrelerden ayrılabilir. -7(%10) +12 (%30) +4. +20 +12 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 81 . Hücre döngüsünün ASM ile izlenmesi Şekil 4. Akım Sitometresi ile hücrelerin hangi bölünme fazında ne miktarda hücre bulunduğunu tespit etmek de mümkündür. Hematolojik malinitelerde en sık karşılaşılan anaploidi sebepleri tablo 9’da özetlenmiştir. Diploid hücreler. Tek bir ölçümde MRD nin pozitif olması relapsın habercisi olabilirse de ardışık ölçümlerde MRD varlığı relaps için çok daha iyi bir göstergedir. MRD tesbiti için 7. Lösemik lenfoblastlarda 11q23 anomalisi bulunduğunda. yani boyanın miktarı hücrede bulunan DNA miktarıyla doğru orantılıdır. Diploid bir hücredeki DNA miktarı 2n olarak tanımlanır (şekil 3). Hücre döngüsüne eşlik eden proteinler söz edilir. CD5 birlikteliği %5 duyarlıkla MRD yi saptarken bu ikiliye k/l monoklanalitesinin eşlik etmesi halinde duyarlık %1’e yükselir. bundan farklı değerler bulunduğunda anaploididen Şekil 3. G0 /G1 fazında yer alırkan S (sentez) fazındaki hücrelerin DNA içeriği diploid ile tetraploid hücreler arasında olacaktır (şekil 3).2 Hücre DNA İçeriğinin Belirlenmesi (PLOİDY) DNA. G2 ve Mitozdaki hücreler ise 4n miktarında DNA taşıdıklarından tetraploid olarak izlenecektir. çift sarmalla şelat yapabilen floresan boyalarla işaretlenebilir. Tablo 9. Bu konu ilgili konuşmacılar tarafından ayrıca işlenecektir. +10. Bu amaçla en sık kullanılan boyalar Propidyum İyodür (PI).1 antijenine yönelik antikorlar kullanılabilir.

CD3 eksiltilmiş ürünlerde kalan T lenfosit.oldukları ve uyarıcı bir sinyal aldıklarında CD34 ekspresyonunun başladığı bilinmektedir.(2) önceden yapılan sayımlar. “Class” III veya II epitoplara özgün olmalı ve tercihan Phycoerytrin (PE) işaretli olmalıdır. Bu durumda DNA yı işlaretlemeden önce malin hücreleri ayırabilecek bir antijeni(ör: epitelyal kökenli hücrelerde sitokeratin. hücre toplanması için optimal zamanın belirlenmesini sağlar. Sayımlar için seçilecek antikorlar.. ) işaretlemek yardımcı olabilir. 1. B lenfoid tümörlerde CD19. Canlı hücreler floresan vermezken ölü hücrelerin kullanılan florokromun özelliklerine göre farklı sinyal verdikleri gözlenir.CD34+. CD133 + hücrelerin de hematopoetik aktivite gösterdiğine dair veriler olsa da “multilineage” hematopoez kapasitesi taşıyanların CD34+ hücreler olduğu kabul edilmektedir.. Özellikle MM gibi mobilizasyonun ilerleyen günlerinde malin hücre kontaminasyonu riski artan durumlarda en erken dönemde ürün toplanmasının önemi vurgulanmalıdır. kemik iliği gibi) görülebilen çekirdekli kırmızı küre ya da küme trombositlerden kaynaklanan hatalı BK sayımlarına bağlı hatalar dışlanmış olur. Yönteme yapılan bazı eklemeler ile CD34+ hücre alt gruplarının veya hücre canlılığının da değerlendirilmesi mümkün olmaktadır. aktif HPKH belirleyicisidir. Apoptoz ile İlgili Çalışmalar ASM ile İmmunfenotipleme uygulamalarında özgün olmayan antikor bağlanmalarından kaçınabilmek için canlı hücrelerle çalışılması gerekir. İstirahat halindeki HPKH lerin CD34. HPKH sayıları) (5) Kriyoprezervasyonun hücre canlılığı üzerine etkisi değerlendirilebilir. CD38-.4 Hücre Canlılığını Tesbiti. 82 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . CD34. lin-. (4) Aferez ürününe yapılan müdahalelerin etkisi değerlendirilebilir (viyabilite. Hücre döngüsü analizlerini hücre döngüsüne eşlik eden proteinlerin ölçümü ile ile eş zamanlı değerlendirmek de mümkündür (şekil 4). SPF nin yüksek olması. Ürüne dönüştüklerinde floresan verme özelliği olan ALDH substaratları kullanarak akım sitometresi aracılığıyla fazla floresan veren kök hücreler tanınıp. miktarları belirlenebilir. CD38. Hücre döngüsü analizlerinde: analiz edilecek hücrelerin seçimi ve kullanılacak yazılım programlarında seçilen modeller. proliferasyon hızının yüksek olduğunun bir göstergesidir. CD34+. Kord kanı örneklerinde lin-.DALVA K. (2)Birim hacimde bulunan CD34+ hücre sayısı doğrudan ölçülür(Single platform) Bu ölçüm için ya volumetrik cihazlar kullanılır ya da mutlak sayısı bilinen parlak floresan veren boncuklar eklenerek birim hacimdeki hücre sayısı hesaplanır. Multiparametrik ölçümler kullanılan ASM çalışmaları ile: (1)Perifer kanından toplanan CD34+ HPKH ve progenitörler sayılarak. (3)Çeşitli sitokinlerin ve /veya kemoterapi rejimlerinin CD34+ hücre sayılarını ve alt gruplarını nasıl etkilediği incelenebilir. toplanan ürünün kalitesi değerlendirilebilir. 1. ASM ile CD34 sayımı için: (1)Beyaz küredeki (BK) CD34+ hücre oranları bulunup hemogramda elde edilen mutlak BK değerleri kullanılarak hesaplanır(Dual platform). “Class”II FITC konjuge antikorlar kullanılmamalıdır . Son yıllarda kullanılmaya başlanan bir teknikte yüksek miktarlarda aldehit dehidrogenaz(ALDH) aktivitesi bulunan hücreler tesbit edilerek kök hücreler tanınmaktadır. CD41+ /CD61+ /CD62L+ hücrelerin erken dönem engrafmanda önem taşıdığını gösteren çalışmalar vardır. Hücre döngüsü analizlerinde karşılaşılan bir problem malin olan ve olmayan hücrelerin bir arada bulunabilmesidir. Propidyum Iyodür(PI)gibi floresan veren boyalar kullanılarak hiç bir ön işlem yapılmadığı halde membranı geçirgen hale gelmiş olan hücrelerin DNAsının boyanması sağlanarak canlı/ölü hücre ayırımı yapılabilir.. CD7-. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı S+G2+M fazındaki hücreler S Fazı Fraksiyonu (SPF) olarak tanımlanıp. CD90+ hücrelerin uzun süreli kalıcı engrafmanda.3 Hematopoetik Kök Hücrelerin Sayılması Kemik iliği örneklerindeki lökosit sayısı graft kalitesi hakkında bir ön bilgi verse de perifer kan örneğinde hematopoetik kök hücreleri(HPKH) saymadan hızlı bir değerlendirme yapmak mümkün değildir. Laboratuvarlar arası değişkenlik azalır. Bu amaçla 7AAD. Bu yöntemle kan dışı ürünlerde (kord kanı.. En sık kullanılan “Single”platform ISHAGE metodu ile yapılan ölçümlerdir. (6) CD34+ hücrelerin alt grupları değerlendirilebilir . karşılaştırılabilir sonuçlar elde edilmesinde büyük önem taşır.

ASM. peptid bağlayan tetramer ya da pentamer yapısında HLA kompleksleri kullanılarak bcr-abl peptidlerine reaktif T hücrelerin kantitatif tayini mümkün olmaktadır.Labeling) olarak adlandırılır. kaspazlar ve “serine” proteazların aktivasyonu hölçülebilmektedir. kaspazlar.. proteinaz3 kaynaklı peptidlere karşı immun yanıtın artmış olduğunu. hücre membranının dış yaprağına geçer. MM ile ilgili benzer çalışmalar mevcuttur.). ASM’de fonksiyonel analizler de yapılabildiği için mitokondrial membran potansiyelindeki değişimlerin ölçülmesi. oluşan bu yanıtların takibi için iyi bir araçtır. plazma membranının yırtılıp sitozolün boşalmasını takiben FSC ve SSC de belirgin bir azalma göze çarpar. MDR nin p-glikoprotein(p-gp) olarak bilinen ATP– bağımlı bir ilaç pompasının etkisiyle ortaya çıktığı bilinmektedir.5 Çoklu İlaç Direncinin (MDR) Tesbit Edilmesi MDR.. Ancak bu proteinlerin normal hücrelerde de bulunabilmesi değerlendirmeyi zorlaştıran bir faktördür . Ölü hücrelerin miktarının tayini. Nekroz olayında ise hücrede büzüşme değil şişme olduğundan FSC başlangıçta bir artış gösterir. ASM’nin en büyük avantajı ise bu ölçümlerin birkaçının aynı anda aynı hücre üzerinde yapılabilmesidir. Bu yöntemle ardışık 5-6 bölünme takip edilebilir.. oksidatif stresin belirlenmesi.)dir. ras.Olay ilerleyip hücre büzüşünce ise SSC nin de azaldığı gözlenir. Antikoagulan bir protein olan Annexin V’in yüksek affinite ile fosfatidilserine bağlanmasından yararlanarak florokromla işaretli anti-Annexin aracılığı ile apoptotik hücreler saptanabilir. hücre içi pH ve iyonize Ca düzeylerinin ölçülebilmesi ile apoptoz hakkında yardımcı bilgiler toplanabilir.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. Kök hücre naklinden sonra görülen relaps olgularında minor doku antijenlerine özgün Sitotosik T lenfositlerin verilmesi ile bu antijenler aracılığıyla antilösemik etki sağlanabilmektedir. Bu şekilde tümör aşıları gibi çeşitli tedavi uygulamalarının sonuçlarını değerlendirmek de mümkündür. Apotozun erken dönemlerinde hücredeki büzüşmeye bağlı olarak FSC de bir azalma meydana gelir. Bu konu ilgili konuşmacılar tarafından ayrıca işlenecektir. Antijenik bir uyarana karşı gelişen hücre proliferasyonun CFDA gibi bir florokrom aracılığı ile takibi de mümkündür. AML blastlarında WT1. apoptoz ve nekroz ile oluşan ölümlerin ayırt edilebilmesi Hücre ölümüne eşlik eden moleküller arasında en çok çalışılanlar: bcl-2 ailesinin elemanlerı. P-gp’ye ve ilaç direnci ile ilgili diğer proteinlere yönelik çeşitli antikorlar (MDR1 çeşitli klonları. 1. tümör suprese edici genler (ör: p53. Apoptozun belirlenmesi için kullanılan çok sayıda yöntem vardır. apoptoz sırasında bu asimetri bozularak fosfatidilserin. pRB. MRP) kullanarak MDR varlığı hakkında bilgi alınabilir. Miyelomda ise viral antijenlere karşı yetersiz immun yanıt oluştuğunu destekleyan veriler vardır.. Üzerinde en çok çalışılan malinitelerden biri KML olup. protoonkojenler (ör:c-myc. Bölünen bir hücrede her bölünme floresan miktarında azalmaya sebep olacaktır. (1)Akım sitometresinde ışığın dar(FSC) ve dik açı ile kırılma(SSC) özelliklerinden yararlanılarak sırasıyla hücrenin boyutları ve granüler yapısındaki değişiklikler kaydedilir. SSC’de başlangıçta genellikle bir farklılık gözlenmese de bazı hücrelerde SSC’nin kromatindeki ve sitoplazmadaki yoğunlaşmayı yansıtacak şekilde arttığı gözlenir. Hoescht gibi floresan veren substratların hücre içine alınıp/dışına atılmalarına bağlı görülen floresan sinyal değişklikleri ile takip edilmesi fonksiyonel bir ölçüm olduğundan MDR tesbiti için daha duyarlı ve özgün olduğu kabul edilir. AML. (3) plazma membranındaki aktif transportun kaybı değerlendirilebilir. 1. Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 83 . (2)Plazma membranındaki fosfolipidlerin dağılımı incelenebilir Plazma membranındaki fosfolipidler iç ve dış yapraklar arasında asimetrik bir dağılım gösterirler. Hücre ölümüne eşlik eden moleküler ve fonksiyonel mekanizmaların aydınlatılması 2. hematolojik malinitelerde kemoterapiye yanıt alınmamasının önemli sebeplerinden biridir. LRB1. ASM ile apoptoza eşlik eden proteazlar. Bir diğer uygulama alanı da minör doku antijenlerine (mHags) özgün sitotoksik hücre kullanımıdır. TUNEL deneyi (Tdt Mediated deoxyUridine Triphosphate-biotin Nick-End.(4) Bazı yöntemler ise apoptoz sırasında meydana gelen DNA fragmanlarını saptamada yardımcı olur Ortama dışarıdan eklenen “terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT)” aracılığı ile gerçekleşen bu deney.. ya da mitokondrial membran potansiyelindeki değişmeler ölçülebilir.6 Hücresel İmmun Yanıtın Belirlenmesi Çeşitli hematolojik malinitelerde tümör antijenlerine karşı mevcut olan ya da geliştirilen hücresel yanıtın ölçülmesi önem taşır. Pgp fonksiyonun Rhodamine 123. Akım Sitometresinin nekrorobiyolojide kullanımının 2 temel amacı vardır: 1.

granül salınımının takibi mümkündür. CD40L antijenlerine yönelik olanlardır. ASM ile trombositlerin (1)Düşük değerlerde bile doğru sayımı. Trombositlere özgün yüzey antijenlerini taşıyan ve trombositlerden çok daha fazla trombojenik olan trombosit mikropartiküllerinin tanınması da mümkündür. (4) tam kandaki agregasyonları. (2) PAC-1. (5) Aktivasyonlarının takibi belirlenebilir Aktivasyona bağlı glikoprorein (gp)IIb/IIIa reseptördeki şekilsel değişim.Diğer bir yöntemde ise ortama eklenen floresan boncuklar aracılığı ile birim hacimdeki trombosit sayıları hesaplanır. Bu amaçla kantitatif ölçüm yaparak birim hacimdeki lökosit 84 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU .7 Trombosit Çalışmaları ASM kullanarak trombositlerin klinik önem taşıyan hemen hemen tüm fonksiyonlarının ölçülmesi mümkündür. (3)dolaşımdan uzaklaşmalarının takibi.8 Trombosit Ürünlerindeki Lökositlerin Sayımı Çok sayıda trombosit transfüzyonu yapılan hastalarda anti HLA antikorların gelişmesinden korunmak için ürün içindeki lökosit sayısının minimal düzeylerde olması istenir. örneğin doğru hazırlanması önem taşır. Sağlıklı sonuçlar elde edilmesi için örnekleme ile analiz arasında geçen süre. kontrol için seçilen hücreler ve yöntemler alınacak sonuçlar üzerinde doğrudan etkili olduğundan iyi planlanarak kullanılması gerekir. depolama defektlerinin saptanması. Antikorla(ör:CD41) işaretlenen trombositlerle birlikte kandaki diğer hücreler de sayılıp. Trombositlerdeki “dense” granüllere giren mepakrin gibi floresan boyaları kullanarak. Hızın yavaş tutulması ve kanın yeterince seyreltilmesi gerekir. Immunplatelet sayımı: Hücreye özgün antijenler kullanarak trombositler sayılabilir ve trombosit sayımı için referans bir ölçüm yöntemi olarak kabul edilmektedir. 1. trombopoetin uyarımı ile artar.000/ mcl ye kadar inebilmektedir. granül salınımı ile açığa çıkan öğeler. Daha sonra kan sayım cihazında elde edilen KK sayım değerleri kullanılarak trombosit sayıları belirlenir. 1. CD63) yüzeye çıktığı.DALVA K. salınan garanzim B/perforinin floresan işaretli antikorlar kullanarak ölçülmesi de mümkündür. diğer hücreler ile etkileşimleri ölçülebilir. Bernard Soluier sendromu(CD42a/CD42b eksikliği) gibi bazı genetik trombosit hastalıklarının tanınması mümkündür. Böyle duyarlı yöntemler kullanıldığında transfüzyon gereklilik sınırları 10. Retiküle Trombositler: Genç trombositleri temsil eden bu hücreler. Retiküle trombositlerin dolaşımdaki sayısı. Uyarılan hücrelerin fenotipinde meydana gelen değişikliklerden yararlanarak 4-18 saatlik bir antijenik uyaranı takiben yanıtın değerlendirilmesi mümkündür. CD25. Trombositlerin immunfenotiplemesi: ASM ile hücre yüzeyinde anormal glikoprotein ekspresyonundan yararlanarak Glanzmann’s trombastenisi ( CD41/CD61 eksikliği). hücre yüzeyinde beliren CD107a/b. İmmunfenotipleme ile bu değişikliklerin saptanması mümkündür. trombosit/eritrosit oranı belirlenir. Trrombositlere bağlı antikorlar(PaIg): ELISA yöntemlerine göre daha az işlem gerektiren ASM ölçümleri. Sitotoksitenin. kemik iliği baskılandığında ise azalır. LIBS gibi antijenlerde aktivasyondan sonra meydana gelen şekil seğişiklikleri nedeniyle yeni epitoplar açığa çıktığı görülür. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı Antijenik bir uyaranı takiben T hücrelerdeki hücre içi sitokinlerin ASM ile tayini oluşan immun yanıtın tipi hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir. trombositlere bağlı antikorların belirlenmesinde kullanılabilir. Bu amaçla en sık kullanılan antikorlar CD69. yüksek RNA içerikleri nedeniyle Thiazol Orange(TO) gibi nükleik asitlere özgün boyalar ile işaretlenip ASM de sayılabilirler. Bu çalışmaların aktivasyonu takip eden hangi zaman diliminde yapıldığı. Trombosit Aktivasyonu: Aktive olan trombositlerde (1) Normalde granüllerde bulunan antijenlerin (CD62P. kemik iliği yetmezliklerinden ayrılabilir. Böylece immun ya da yıkıma bağlı trombositopeniler. kullanılan yöntemler. Ancak adı geçen boyaların plastiğe kolayca bağlanma özellikleri nedeni ile her ölçümden sonra cihaz dikkatle temizlenerek takip eden immunfenotipleme çalışmalarını etkileyecek yalancı sinyaller yaratılmasından kaçınılmalıdır. Aktifleşen trombositler hızla dolaşımdan uzaklaştıkları için mümkün olduğunca aktivasyon yerine yakın noktalardan örnekleme yapılmalıdır. (2)yapım hızlarının değerlendirilmesi. Retiküle trombositlerle birlikte kullanıldığında immun trombositopeni ayırıcı tanısında yol göstericidir. Benzer yöntem retikulositlerin sayımı için de kullanılmaktadır.

A. J.1 O. Ronot et al: A Flow Cytometric Assay for Simultaneous Assessmentnof Drug Efflux. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 59B:1–9 (2004) 9. Yoshiko Murakami.K. Ancak her yöntemde olduğu gibi tekrarlanabilir. and Molecular Genetic Findings Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 62B:25–38 (2004) 7. Ancak özellikle hücre üzerindeki bir belirleyici zayıf olduğunda ya da çok parametre kullanılarak daha saf hücre toplulukları elde edilmek istendiğinde en iyi seçenek akım sitometresi olmaktadır. Pathology (1999) 31. birer örnektir. WA R D The Use Of Flow Cytometry In The Dıagnosıs And Monıtorıng Of Malıgnant Hematologıcal Dısorders. Elde edilen verilerin multidisipliner değerlendirilmesi elde edilecek yararı büyük ölçüde arttıracaktır. Carlo Tondini Roel Willemze: Adult Acute Lymphoblastic Leukemia 11. Thomas MacKerrell. hücreleri verdikleri ışık sinyalleri esas alınarak karışık bir hücre topluluğu içinden ayırmak üzere (sort) düzenlenmişse de bugün rutin laboratuvarlarda kullanılan akım sitometrelerinin çok azında “sort” etme kapasitesi bulunmaktadır. Özellikle moleküler yöntemlerle kombine edilebilecek yeni uygulama alanları ile ilgili çalışmalar giderek artmaktadır. Laboratuvarında multipl miyelomla ilişkili FISH uygulamalarından önce kemik iliği örneğindeki plazma hücrelerini saflaştırarak kullanıyoruz.Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı DALVA K. X. and Taroh Kinoshita: Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria: An Acquired Genetic Disease American Journal of Hematology 62:175–182 (1999) Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU 85 . David Combs.M. MT(ASCP). Proliferation. Westerdaal. Sonuç Akım Sitometrisi hematolojide yukarıda özetlenmeye çalışılanlar yanı sıra pek çok klinik uygulama ve araştırma alanında daha kullanılabilir.A. Paietta. Renato Bassan. Renato Bassan et al: Adult Acute Myeloid Leukemia Critical Rewies in Oncology/Hematology 49(2004)197-222 13. B. Kheiri. Wind. J. Akım Sitometresi ile “sort” edilen hücreler. sayılarını veren kitler geliştirilmiştir. and Apoptosis Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 59B:46–53 (2004) 10. Muirhead. FISH gibi moleküler teknikler için kullanılması. M. Gemma Gatta. hücreye özgün olan DNA sekanslarının PCR ile çoğaltılmasında.H. Goloubeva. Kromozomların “sort” edilmesi ile DNA veri bankaları için veri toplamak mümkün olabilmektedir. 2004.9 Hücre Saflaştırma (SORT) Kullanılan ilk akım sitometreleri. Viswanatha. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 34:82–86 (1998) 8. 8-10 renkli analizlerle fonksiyon-fenotip ilşkilerinin kurulabileceği çeşitli çalışmalar. Cytogenetic. D. N. Dunphy. Ming Chen. 14. transfekte hücrelerin klonlanmasında kullanılabilmektedir. 1. Michael Barnett. D. hibrid teknolojilerinin akım sitometride değerlendirilecek şekilde uygulanması. E. Claudia Schoch. Akım sitometresinden çok daha hızlı ve kolay olan saflaştırma tekniklerinin (ör: monoklonal antikorlar ile kaplı magnetik boncuklar) gelişmesi de bunda etkili olmuştur. E. pp. Lina Romero-Guzman. Rogelio Paredes-Aguilera. Susanne Schnittger Stability of Leukemia-Associated Aberrant 6. September 2004 2. and J. Barbier. Nadir bulunan malin hücrelerin saflaştırılarak PCR yöntemleri. H.G. cihazın optimum koşullarda kullanılması. Bonagura et al: Flow Cytometry With or Without Cytochemistry of Acute Leukemias?. Vincent R. Immunophenotypes in Patients With Acute Myeloid Leukemia Between Diagnosis and Relapse: Comparison With Cytomorphologic. PhD. Gray.G. MD Applications of Flow Cytometry and Immunohistochemistry to Diagnostic Hematopathology Arch Pathol Lab Med—Vol 128. Bennett et al: A Surrogate Marker Profile for PML/RAR_ Expressing Acute Promyelocytic Leukemia and the Association of Immunophenotypic Markers with Morphologic andMolecular Subtypes. V.J. Cherie H. van der Velden. K. Matthew Smith. D. van Dongen: Immunophenotypic Differentiation Patterns of Normal Hematopoiesis in Human Bone Marrow: Reference Patterns for Age-Related Changesand Disease-Induced Shifts Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 60B:1–13 (2004) 4. M. kalibrasyonu şarttır. MD Post-PCR Multiplex Fluorescent Ligation Detection Assay and Flow Cytometry for Rapid Detection of Gene-Specific Translocations in Leukemia Am J Clin Pathol 122(5):783-793.F Hematoloji B. David S. periyodik kontrolü. Biz de A:Ü. Artemis Chakerian.J. MI T C H E L L S. 382–392 3.Genellikle RNAnın parçalanmasını takiben DNA’ya bağlanan florokromlar ile çekirdekli hücrelerin işaretlenmesi prensibine dayalı bir yöntem kullanılır. Kaynaklar 1. fonksyonel analizlerde.T. te Marvelde. Kelly Garner. van Lochem. Daniela Voskova. Jun-ichi Nishimura. Critical Rewies in Oncology/Hematology 50(2004)223261 12. Neuberg.C. DVM. Samir A. Floresan in-situ hibridizasyon (FISH) gibi tekniklerin uygulanmasında. karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için akım sitometriden yararlanırken standardize edilmiş yöntemlerin kullanılması. Norma Lopez-Santiago et al: Flow Cytometric Analysis of Cell-Surface and Intracellular Antigens in the Diagnosis of Acute Leukemia American Journal of Hematology 68:69–74 (2001) 5. 3.

Chikako Satoh. Francesca Romana Mauro. Huynh Hans E. Daniela Capello et al Chronic lymphocytic leukemia patients with highly stable and indolent disease show distinctive phenotypic and genotypic features BLOOD. P. Hematoloji’de Akım Sitometri Kullanımı 15. Marc R. NUMBER 7 23. Knudsen Tuan K. 2004. A. Indra Ramasamy. Barnard. PhD. Ford*. Anna Guarini. J. 259Ð270 (2000) 25. Alan D. David S. 102( 3) 2003 18. Kussick. Brent L. Gianluca Gaidano. Lori A. Hideya Hyodo et al: Association between phenotypic features of blasts and the blast percentage in bone marrow of patients with myelodysplastic syndromes Leukemia Research 28 (2004) 1171–1175 20. Michelson. Inherited Bleeding Disorders: Disorders of Platelet Adhesion and Aggregation Critical Rewies in Oncology/Hematology 49(2004)1-35 86 Moleküler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi TEMEL MOLEKÜLER HEMATOLOJİ KURSU . 2003 24. Viswanatha. MD. PhD Four-Color Flow Cytometry Identifies Virtually All Cytogenetically Abnormal Bone Marrow Samples in the Workup of Non-CML Myeloproliferative Disorders Am J Clin Pathol 120(6):854-865. DVM. Alexander Kohlmann. Godio. Martini. and G. Kelly Garner. Wood. Yvan Cornet et al Immunophenotypic clustering of myelodysplastic syndromes BLOOD. David Combs. 1 OCTOBER 2002 _ VOLUME 100. Palestro Flow Cytometry in the Bone Marrow Staging of MatureB-Cell Neoplasms Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 54B:10–18 (2003) 22. Thomas Rasmussen Lene M. Ming Chen. Bernard Husson. Wolfgang Kern. MD. G. A. Bernard Chatelain. PhD. Kiyoyuki Ogata.DALVA K.G.112:105–110 21. Johnsen: Molecular and Clinical Follow-Up after Treatment of Multiple Myeloma Acta Haematol 2004. Stacchini. 16. Artemis Chakerian. MT(ASCP). Steven J. A.1 V. Demurtas. Antinoro. Krueger et al: Evaluation of Platelet Function by Flow Cytometry METHODS 21. Franc¸oise Picard. Christian Wuchter et al: Correlation of Protein Expression and Gene Expression in Acute Leukemia Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 55B:29–36 (2003) 17. Owen et al: A simplified approach to determining P-glycoprotein expression in peripheral blood mononuclear cell subsets Journal of Immunological Methods 274 (2003) 129– 137 19. Andreas Thiel and Alexander Scheffold Antigen-specific cytometry: The Monitoring of Immune Responses and Immunopathology ISAC 2004 Tutorial IV 26. MD Post-PCR Multiplex Fluorescent Ligation Detection Assay and Flow Cytometry for Rapid Detection of Gene-Specific Translocations in Leukemia Am J Clin Pathol 122(5):783-793. Marc Maynadie´. L. Hoggard.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful