Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

Dr. Klara DALVA

Ankara niversitesi Tp Fakltesi, Hematoloji Bilim Dal, Ankara

1. Giri Akm Sitometrisinin (ASM) gncel hematolojik uygulamalardaki kullanm giderek artmaktadr. Bu artn nedenleri arasnda, ksa srede sonu alnabilmesi, kullanmnn kolay renilebilmesi, anormal hcrelerin tannmasna olan katklar saylabilir. ASM hematolojide en ok tan, lsemi/ lenfoma/miyelom gibi hastalklarn snflanmas ve tedavinin takibi amalaryla kullanlmaktadr. Akm Sitometresi ile bir sspansiyon halindeki hcre ya da partikller lazer ile aydnlatlmakta olan bir blmeden geirilir; hcrelerin n nnden geerken verdikleri sinyaller toplanarak analiz edilir. Oluan sinyallerin kayna, hcrenin byklk, granlarite gibi fiziksel zellikleri olabildii gibi; hcreye balanan eitli florokromlar da olabilir. Bylece hcre ya da partikln immunfenotipi, DNA ierii, enzim aktiviteleri, hcre membran potanasiyeli, canll gibi eitli zellikleri hakknda bilgi toplanabilir. 2. Kullanm Alanlar Akm Sitometrisinin Hematolojide en ok kullanld alanlar arasnda: Lsemik hcrelerin immunfenotiplemesi Hcrenin DNA ieriinin ve hcre dngsnn analizi, Hematopoetik kk hcrelerin saylmas ve alt gruplarnn belirlenmesi, Hcre canllnn tespit edilmesi, apoptoz ile ilgili aratrmalar oklu ila direncinin(MDR) tespit edilmesi Hcresel immun yantn belirlenmesi Trombosit almalar

Trombosit rnlerine bulam lkositlerin saylmas, Hedef olarak seilen hcrelerin floresanla iaretlenerek saflatrlmas ve dier uygulama alanlar saylabilir. ASM almalar iin perifer kan rnei, kemik ilii aspirasyon materyali ve biyopsileri, ince ine aspirasyon materyalleri, tm vcut svlarndaki hcreler [Bronkoalveolar lavaj(BAL), Lomber ponksiyon(LP) ile alnan rnekler] kullanlabilir. 2.1 mmun Fenotipleme mmunfenotipleme, hematolojik malinitelerin tannmasna ve morfolojiye ek bilgiler kazandrarak tiplendirilmesine yardmc olmaktadr. Hcre yzey antijenlerinin tanmlanmasnda Cluster of Differantiation, CD terminolojisi kullanlr. Antijenlerin ou bir hcre serisine elik etseler de o seriye zgn deildirler. Farkllamann deiik evrelerinde sergilenen antijenler, hcrenin olgunlamasnn takibinde kullanlabilir . Belli tmr hcrelerine zgn antijenlerin says ise ok kstldr (r PML de PML-RARa, KML de Bcr-abl gen rnleri). Baz tmr hcrelerinde antijenlerin aberan bulunmalar sz konusudur (r: miyeloid bir hcrede lenfoid bir antijenin bulunmas) Hcreyi tanyp geliiminin hangi evresinde olduunu belirleyebilmek iin eitli antikor panellerinin kullanlmas gerekir. ASM almalarn deerlendirebilmek ve karlatrlabilir sonular iin alma protokolleri ve toplanan veriler standardize edilmelidir. Veri analizinde hedeflenen: 1)anormal, neoplazi potansiyeli olan hcrelerin normallerden ayrlmas, 2)anormal hcrelerdeki antijen profilinin ortaya koyulmasdr. Bu amala birok parametrenin birlikte deerlendirilmesi gerekir(dar

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

73

DALVA K.

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

ayla krlan k FSC 90 ayla krlan k SSC ve antijenlerin iaretlendii florokromlardan kaynaklanan sinyaller) Ayn hcrede birden ok (en sk 3-4) antijenin belirlenmesi tavsiye edilmektedir. Anormal bir hcre topluluu grldnde bunun immunfenotipinin tanmlanmas gerekir. Bunu ifade etmenin en kolay yolu antijen tayan hcrelerin oranlarn (%) bildirmektir. Antijen younluunu gstermek iin de llen floresan sinyallerin iddeti belirlenir(Mean Fluorescent Intencity,MFI), ancak bu parametre hcre zerindeki antijen says yan sra kullanlan florokrom ile de yakndan ilgilidir; gerekirse standartlar kullanlarak antijen/hcre saysn belirlemek mmkndr. Deerlendirmeler iin sadece anormal hcreleri iine alan bir grubun seilmesi (gating) nerilse de incelenen rnekteki normal antijen dalmn bilmeden anormal bir topluluu tanmak mmkn olmaz, rnekteki normal hcreler zaman zaman bir internal kontrol olarak da fonksiyon grrler. ASM ile immunfenotipleme yapmann Avantajlar: Byklk (FSC) ve Granler (SSC) yaplarna gre hcreler snflandrlabilir. l hcreler alma d tutulabilir. Zayf eksprese edilen yzey antijenleri tesbit edilebilir. ok renkli(2,3,4,) analizler ile hcrenin fenotipi, geliiminin hangi evresinde bulunduu belirlenebilir. E zamanl bulunan birden ok hematolojik malinitenin, bifenotipik hcrelerin belirlenmesi mmkndr. Dezavantajlar: Sklerotik kemik iliinden, hiposelller kemik iliklerinden ASM iin yeterli sayda hcre toplanamaz. Hcrelerin evreleriyle olan ilikileri gzlenemez T hcreden zengin lenfomalarda ufak bir monoklonal B hcre klonunun tannmas mmkn olmayabilir. T hcreli lenfomalarn aberan bir antijen(rnein bir panT hcre belirleyicinin kayb/ azalmas) bulundurmadklar srece tannmas mmkn olmaz. Aberan bir T hcre immunfenotipi, herzaman bir malinite gstergesi olmayp;

enfeksiyoz mononukleoz, reaktif dermatoz, enflamatuvar hastalklarda da grlebilir. Lenfomalarda doku tutulumunun homojen olmad durumlarda yalanc negatif sonular alnabilir. Hodgkin hastalnda neoplastik hcre saysnn az olmas nedeniyle de tanda ASM kullanmnn bir yarar olmaz. Dezavantajlar nedeni ile ASM sonularnn daima k mikroskobu verileri ile birlikte deerlendirilmesi gerekir. Klinik veriler, molekler/sitogenetik almalar da verilerin deerlendirilmesinde yardmc olan unsurlardr. ASM, morfolojik olarak phelenilen eitli hastalklar dorulamakta, hastalk alt tiplerinin belirlenmesinde, ayrc tanda seenekleri azaltmada, kullanlabilir. Baz durumlarda morfoloji bilinmese de tansal deerlendirmelerin yaplabilecei savunulmaktadr (tablo 1) 2.1.1 Akut Lsemiler Akut lsemierin %95 i temel antikorlarn kullanld bir panel ile tanmlanabilir (tablo 2, koyu yazlanlar). Bu panel ile hcre serisinin tanmlanamad durumlarda, morfolojik veriler AML M6 M7 den phe ettirdiinde, minimal rezidel hastaln takibinde kullanlacak bir parametre arandnda, prognostik verilere ulalmak istendiinde literatr nda kullanlan dier antikorlar yardmc olabilir. Analiz edilecek hcrelerin doru seimi nemlidir. zellikle kemik ilii rneklerinde sadece FSC ve SSC den yararlanarak hcrelerin kesin snrlarla ayrlmas mmkn olmaz. Hcreleri bulundurduklar CD45 miktarna ve 90 krlan k (SSC) zelliklerine gre ayrmak yol gsterici olabilir (ekil 1) ancak bu antikorun her tbe eklenmesi maliyeti arttrc bir faktrdr. Tablo 1. ASM nin tanya katkda bulunduu hematolojik hastalklar ASM ile tan koyulabilir ASM tan ve ayrc tanda yardmcdr Pre-B ALL Follikler NHL T-ALL Mantle Cell Lenfoma B-CLL, SLL, Dier low gradelenfomalar Hairy Cell Lsemi Byk B hcreli NHL Akut Miyeloid Lsemi Burkitts lenfoma Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinri Large granuler lenfosit hastalklar Plazma hcre hastalklar MDS
ALL: Akut Lenfoblastik Lsemi, CLL: Kronik Lenfositik Lsemi , SLL:Kk Lenfositik Lenfoma, NHL: NonHodgkin Lenfoma Mitchell S. Ward, pathology (1999) 31 den modifiye

74

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

DALVA K.

ekil 1. Tablo 3. AML de immunfenotipik zellikler FAB tipi mmunfenotip Notlar M0 FSC, SSC dk (lenfoblast gibi) 7+ ve 34+ prognozda 34+, DR+, 13+, 33+, MPO+/, olumsuz 7, CD4 M1 SSC(granlarite), M0 dan fazla 13+,33+,DR+,34 daha az, MPO+, 15c, 4 Maturasyon artm, daha az blast, 45 SSC dalmnda blastlar 34 daha az, 15+, 13+, 33+, DR+ SSC artm,45 zayf, DR13 zayf, 2, 11a-,18zayf,9+, 8-, 34-/+, 117+, Kuvvetli 13 retinoik sendrom lehine 56+ s form(bcr3 lehine) 2+ M4Eo lehine, spesifik olmayan Ig balanmas (FcR nedeniyle), CD14 spesifik ama sensitif deil Beklenenden az tannyor Erken eritroid iaretlerin kayb, Tan iin immunfenotipleme ve elektron mikroskobi(trombosit peroksidaz iin) gerekir, morfoloji tansal olmayabilir

2.1.1.1 Akut Miyeloid Lsemi (AML) ASM, AMLnin French-American-British (FAB) snflamasna gre gruplanmasnda sitokimyasal yntemlerin nne gemitir. zellikle M0 ve M7 olgularnda tan iin immunolojik yntemler gereklidir. AML hcreleri CD13, CD33, MPO ya zgn antikorlarla iaretlenir, dier miyeloid antijenler snflamada yardmc olsalar da prognostik deerleri snrldr (tablo 3). CD11b nin kt prognostik deeri dnda CD34 bata olmak zere baz antijenlerin nemine dair almalar olsa da gr birlii yoktur. AML hcrelerinde lenfoid antijenlerin bulunmas her zaman mix-lineage veya bifenotipiyi gstermez. Mevcut ise aberan AML hcrelerinin

19+,34+,(56+), t(8;21) lehine

M2

M3

Tablo 2. Akut Lsemi Tansnda kullanlabilecek temel antikorlar Hcre Serisi B T M Hcre serisini belirleyici cCD79a cCD3 cMPO cCD22 CD3 CD13 CD19 CD7 CD33 Matrasyonu belirleyici CD34 TdT CD10 CD20 CD22 c IgM CD34 TdT CD1 CD2 CD3 CD5 CD4 CD8 CD34, CD117 CD15 CD11a, CD11b HLA DR CD14 CD68 CD41, CD61 cCD235a(Gly-A)

M4, M5 Benzer zellikleri var M4 de blast daha ok, FSC-SSC M0/M1 dan fazla, monositik komponent+, 33+ >13+, DR+, 14+, 15+, 34+ M5: 33+, 13-, 34-, zayf 7+, monositlerde 4+ M6 Nadir, DR+, 34+, 13, 33, 45-/zayf, 235a++ 61+, 41+,33, Trombosit adezyonuna bal yalanc+ dikkat!!

M7

Dier karakteristikler

Saylar CD no ifade etmektedir (r:33=CD33),DR=HLA-DR, +:pozitif, -: negatif, :deiken, MPO: miyeloperoksidaz

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

75

DALVA K.

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

tannmasn kolaylatrrlar (%5-28). CD2 varlnn zellikle ocuklarda kt prognostik olup; biyolojik olarak farkl olan bir hastaln iareti olduu kabul edilir. CD 19 varl kt prognostik [t(9;22)] veya iyi prognostik [t(8,21), t(15;17), inv(16)] sitogenetik belirleyicilere elik edebilir. Sitogenetik veriler prognozun belirlenmesinde en gvenilir iaretlerdir ve her genetik iarete zgn olan bir immunfenotip bulunmadndan ASM bunun nne geememitir. NK hcreli akut lsemi, morfolojisi ve immunfenotipi ile AML M3v ile benzerlik gsterse de RARa mutasyonu yoktur. CD56+, CD16- olan bu hcreler ATRAya yant vermezler ve CD56+, PML/RARa+ olan AMLM3 olgularndan ayrlmalar gerekir. ntegrinlerin kayb (CD11a, CD11b, CD18) M3 iin tipik bir bulgudur. AML M7 olgularnda CD41ve CD61 ile pozitif reaksiyon veren hcrelerin, lsemik blastlara yapm olan aktif trombositlerden kaynaklanmadndan emin olunmaldr. Bu amala CC34, CD41 yansra matur trombosit iareti olan CD42b nin kullanlmas, megakaryoblastlar ile trombositlerin ayrlmasna olanak salar. 2.1.1.2 B Hcreli Akut Lenfoblastik Lsemi (ALL) Hcrelerin farkllamasna gre 4 snfta toplanabilen (ekil 2) bu lsemilerin immunfenotipik Tablo 4. B hcreli ALL de tipik immunfenotipik zellikler ALL tipi mmunfenotip Notlar null cell ALL c19+, c22+, c79a+, mmatr B hcrele, kt TdT+, 34+, 10prognoz B-prekursr ALL (Erken preB) (Pre-preB) (Common ALL) Blastlar kk (FSC,SSC dk), TdT4, DR+, 19+, parlak 22+, 34+,sIg-, 79a+ CD10+ (iyi prognoz), CD10-(kt prognoz) 19+, 24+, DR+, c22+,10+, Tdt, 20, 34-, cIgM Hcreler daha byk, 19+, 20+, 22+, 24+, parlak klonal sIg, TdT-, 10 zayf ocukluk ALL nin %70 i, erikin ALL nin %50 si CD10-, miyeloid ag+(15+) 11q23 anomalisi dndrr ve kt prognostik ocukluk a lsemilerin %25i, t(1;19) a bal kt prognoz, 19+,10+,9+,20,34FAB L3 ile rtr c-myc(8q24) ilgili translokasyonlar [r: t(8;14), t(2;8), t8;22)]

karakteristikleri tablo 4te zetlenmitir. TdT ve CD34, lenfomalarla ayrc tanda yardmcdr. Tan koyulabilmesi iin erken B hcre iaretlerinden (CD19, cCD22, cCD79a) en az ikisinin pozitif olmas gerekir. Hematogonlar: Hematogonlar kemik iliinde, eser miktarda da periferde bulunan CD10+, CD19+ hcreler olup; KI deki istirahat halindeki nc B hcreleri (timustaki T nclerine karlk olacak ekilde) tanmlamak iin kullanlr. Kemoterapi sonrasnda, kk hcre naklinden sonra saylar ok arttndan, bu dnemlerde incelenen KI rneklerinde hematogonlarn malin hcreler ile kartrlmamasna zen gsterilmelidir. 2.1.1.3 T Hcreli Akut Lenfoblastik Lsemi T-ALL erikin ALL lerin %25 ocukluk ann ise %15 inden sorumludur. Blastlarn CD45SSC dalmna gre lenfoblast/ miyeloblast/ monositik blgede yer alabilmeleri nedeniyle gate almak zor olabilir. FSC deerleri de yksek olabilir(byk hcreler). T- ALL tans iin sitoplazmik ya da yzeyel CD3 varl koul olup; CD2 veya CD7 varl tan iin yeterli deildir. Snflama timik farkllama evrelerine gre (CD1,4, 5,8) yaplr (tablo 5). CD10, iyi prognostik bir iarettir. T-ALL de spesifik T hcre antijenlerinin bulunmamas (Ag kayb), aberan eksprestyonlar ok tipiktir. ALL olgularn DNA ieriklerine (ploidi) gre snflamak da mmkndr. Hiperdiploidi daha iyi; hipodiploidi daha kt prognoz iaretidir.

Tablo 5. T hcreli ALL de tipik immunfenotipik zellikler ALL tipi mmunfenotip Notlar Pre(pro)T-ALL Erken kortikal timik Ge Kortikal timik c3+, 7+, dier T antijenleri2+, 5+, 7+, TdT parlak+ Kt prognoz

pre- B ALL

B-ALL

1a+, 2+, 5+, 7+, dual 4+/8+, minimal s3+, TdT+ 2+, 5+, 7+, 4+ veya 8+, TdTc, 3

Seyrek

Medullar

Saylar CD no ifade etmektedir (r: 19=CD19), DR=HLA-DR, +: pozitif, -: negatif, : deiken c: Sitoplazmik, Ig: mmunglobulin, koyu yazlanlar tipik bulgulardr

Saylar CD no ifade etmektedir (r: 3=CD3), +: pozitif, -: negatif, : deiken c: Sitoplazmik, s: yzeyel,

76

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

DALVA K.

ekil 2. Kemik iliinde normal A: B hcre, B: monositik, C: granulositik, D: eritroid hcre geliimi ve immunfenotipik zellikleri 2.1.1.4 Bifenotipik Akut Lsemiler Lsemik hcre zerinde lenfoid ve miyeloid antijenlerin birarada bulunduu bir erken nc hcre(pluripotent) malinitesi olarak tanmlanr. Bu durumun lenfoid antijen tayan AML ya da miyeloid antijen tayan lenfoid malinitelerden farkl olduu vurgulanmaldr. Bu ayrm kolaylatrmak iin bir skorlama sistemi kullanlamakta olasa da baz aratrmaclar, antijen saysna gre yaplacak bir deerlendirmenin doru olmadn dnmektedir. Hcre serilerini en iyi tanmlayan antijenler B hcre iin CD22, T hcre iin CD3, miyeloid hcreler iin MPO dur. Nadir olarak ayn anda iki farkl malin hcre serisinin bir arada bulunduu durumlar sz konusu olabilir ki mixed lineage veya bilineage lsemi olarak adlandrlr. 2.1.1.5 Akut, farkllama gstermeyen (undifferantiated) Lsemiler Lsemilerin %1 kadar snflandrlamamaktadr. Bu olgularn tipik olarak CD34+, HLA-DR+, ve genellikle CD38+, CD7+ olup, bir hcre serisine zgn olan baka bir antijen tamadklar grlr. 2.1.2 Kronik Miyelositer Lsemi (CML, KML) ve NON-KML Miyeloproliferatif Hastalklar (NCMPDS) ASM nin KML nin kronik faznda kullanm snrldr. Hcrelerin en az %10 unda miyeloid

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

77

DALVA K.

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

seri antijenlerinin dalmnda (zellikle CD33, CD13) artma ya da azalma ynnde deiiklikler, iki miyeloid antijenin dalmndaki senkronizasyonun bozulmas (r. CD13- CD16, CD11b-CD16 arasnda) izlenebilir. Blastik transformasyonda ise farkllamann lenfoblastik ya da miyeloblastik ynde mi olduu tannabilir. Bcr-abl onkogenine zgn antikorlar, KML hcrelerinin belirlenmesinde kullanlabilir. Non-KML miyeloproliferatif hastalklarda CD2, CD5, CD7, CD56,CD36, CD71 gibi miyeloid olmayan antijenlerin aberan ekspresyonu bulunabilir. Birden ok antijen dalmnn bozulmas sz konusudur. Anormal veriler arasnda: (1) polisitemia verada bcl-XL ekspresyonunda artma, (2)esansiyel trombositozda trombosit yzeyindeki gp1a/IIa, gpIb ve gpIIb/IIIa da azalma, p-selektin, trombospondin, gpIV ve c-Mpl de artma, (3) Miyeloproliferatif baz hastalklarda miyeloid hcrelerde CD66 ve CD14 n aberan koekspresyonu bulunabilir. ASM ile kronik miyelomonositer lsemilerdeki monositlerin oran ve bu monositlerdeki anormal antijen ekspresyonlar(r CD13, CD14 CD15 de azalma, CD56 ekspresyonu) belirlenebilir. Miyelodisplaziler(MDS): Immunfenotiplemenin tansal ve prognostik nemine dair almalar olsa da standart tanmlamalar yoktur. Klonal bir sitogenetik anomali bulunduran olgularda aberan antijen ekspresyonlar (NCMPD deki gibi), hcrelerin k salm zelliklerindeki deiiklikler (zellikle hipogranlarite) dikkat ekmektedir. 2.1.3 Kronik Lenfoproliferatif Hastalklar ASM, malin (klonal) lenfoid proliferasyonun benign proliferasyondan ayrlmasnda, T-, Bhcre kaynann belirlenmesinde ve ayrc tandaki seenekleri minimale indirmek konularnda yardmc veriler salar. Tanmlayc tek bir antijen olmasa da antijenlerin dalma zellikleri, younluklar yol gstericidir (tablo 6). 2.1.3.1 Kronik Lenfositik Lsemi, CLL Erikin lsmiler arasnda en sk grlen tip olan CLL de, CD5+, CD19+ olmas tipiktir.. CLL ve SLLnin ayn hcreden kken alan ancak doku dalm farkllk gstern hastalklar olduu dnlmektedir. CLL nin atipik morfoloji gsteren bir alt grubunda sIg parlak+, CD20+, CD23-, FMC7+ CD79b+ izlenir. Bu durum trizomi 12 ve kt prognoz ile birliktedir. mmunfenotip ile high

grade tansformasyon(Richter) ve prolenfositik transformasyonlarn CLL den ayrlmas mmkn olmaz. CD5- CLL tans phe ile karlanp; dier low grade lenfomalarn ekarte edilmesi gerekir. CLL/SLL olgularnda aberan antijen ekspresyonlar (CD2, CD7, CD10, CD13, CD33, CD34) beklenen yaam sresinin ksa olmas lehinedir. Zap70 ekspresyonunun Ig ar zincir mutasyonlar ile ilikili olduu ve kt prognoz, hzl seyir lehine bir veri olduu bilinmektedir (tablo 7). 2.1.3.2. Non-Hodgkin Lenfomalar, NHL NHL, genelde doku biyopsilerindeki tipik immunfenotipik zellikleri ile tannr. Kan ve kemik Tablo 6. B hcre Lenforoprliferatif hastalklarnda fenotipik zellikler Hastalk mmunfenotip Notlar CLL/SLL 5+, 19+, 20 z+, DR+, 5, 19 ko ekspresyonu sIgM/D z+, 23parlak+, tipik FMC7-, 10-, 22-, klonal hafif zincir z+ PLL sIg parlak+, 5-, 22+, 19+, 20parlak+, DR+, FMC7+, 23-, 105+, sIgM parlak+, sIgD, 23-, 19+, 20+, DR+, 22+, 43+, 10%50 sinde 5+

MCL FCC MZL SMZL/SLVL HCL

l > k, t(11;14)

sIg parlak+, 5-, 10+, 23, 19+, <%20 1020+, DR+, 22+, 43-, 11c19+, 20+, DR+, 22+, sIg+, MALT&monositoid 11c+, 5-, 10-, 23-, 21-, 24-, 25-, B-NHL 19+, 20+, 22++, sIgparlak+, 24+, 5-, 103-, 19+, 20++, DR+, 79a+, HCLvariant: 11c z+, 25+,103+, sIg lml+, FMC7+, 25z+ 21-, 5-,10-, 23-, 11c+++, 22++ sIg- olabilir, 19+, 20+, 22+, 34, TdT-, 45, Anaplastik LCL: 30+, 25+, 71+ Byk hcreli karsinomdan ayrr Nodler lenfositten zengin HD farkl bir tip olup; 20+,45+,15-,30-, 70- grlr

LCL

Hodgkin Genellikle: 30+, 70+, 15+, 45-, Hastal B7/BB1 +++ RS hcreleri Aktivasyon: 25+, DR+, 71+ T antijenleri: %50 sinde 2,3,4 +

Saylar CD no ifade etmektedir (r: 19=CD19), DR=HLA-DR, +: pozitif, -: negatif, : deiken z+: zayf pozitif, CLL: kronik lenfositik lsemi, SLL: kk lenfositik lenfoma, PLL: prolenfositik lsemi, MCL: Mantle cell lenfoma, FCC: Follicular center hcreli lenfoma, SMZL: splenik marginal zone lenfoma, SLVL: villz lenfositli splenik lenfoma, HCL: hairy celllsemi, LCL: Byk hcreli lenfoma, RS: Reed Stenberg hcreleri, kaln yazlanlar karakteristik zellikleri vurgulamaktadr

78

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

DALVA K.

ilii rneklerindeki karakteristik bulgular daha az tanmlanmtr. Tannn morfoloji ve immunfenotipik bulgularla birlikte koyulmas gerekir. Mantle Cell lenfoma: mmunfenotipleme; blastik MCL nin (sIg+, CD5+, TdT-) lenfoblastik lenfomadan (sIg-, CD5-, TdT+) ayrlmasnda kullanlabilir, CD23 ile de CLL ile ayrc tan mmkn olur (tablo 6). CyclinD1in molekler analizini gerektiren durumlar olabilir(zayf CD23 ekspresyonlar) . CD79b MCL de pozitif iken CLL/SLLde genellikle bulunmaz. Follicular centre cell lenfoma: Tm lenfomalarn yaklak %45i bu tipte olup; akm sitometrideki k salmndan(FSC) byk hcrelerin oran saptanabilir. Ancak byk hcreler daha duyarl olduklarndan, hazrlk ilemleri srasnda paralanmalar ve tannmamalar sk karlalan bir durumdur. Marginal zone lenfoma: Mukozalardaki lenfoid doku (MALT, eksta nodal) ve monositik B hcreli (nodal) lenfomalar, bu grupta yer alr, immun fenotipik zellikleri benzerdir. Kan ve kemik ilii rnekleri yerine lenf nodlnden yaplacak immunfenotipleme daha anlamldr. MCL, CLL ve HCL den ayrc tans gerekir, variant HCL ile ayrm zor olabilir. Hairy cell lsemi: doru tedavi ile tedavisi mmkn olan bir hastalk olduundan tannmas Tablo 7. Lenfoid/Plazma hcre hastalklarnda mmunfenotipik prognostik iaretler Hastalk aretler Prognostik nemi CLL/SLL CD2,CD7 Tm ksa OS ve CD10 hzl progres ile CD13, CD33 karakterize CD34 CD38 ZAP-70 MUM1 Plazma hcre diskrazileri CD11c, CD13, Cd14, CD15, CD10 Miyelomonositik iaretler ve CD10, ksa OS ve agresif hastalkla birliktedir Ksa OS, ileri evre lehine Uzam OS, uzun hastalksz yaam lehine

nemlidir. CD11c, CD103, CD25 gibi antijenlerin varl tipiktir. pheli durumlarda(splenomegali, K aspirasyonunda zorluk, pansitopeni) bu antijenlerin aranmas gerekir. Tedaviye farkl yant veren variant tipinde CD25- beklenir. Large Cell lenfoma: Perifer kannda pek grlmeyen bu hcreler, hassas olup kolayca paralanabilir. ASM incelemesinde debrilerin bulunduu ks kalabalktr. Erikinlerde genellikle B hcreli olup, immunfenotipi ile dier byk hcreli kanserlerden ayrlabilir. T hcreden zengin B hcre lenfomalarnn HH ve T hcreli lenfomalardan ayrlmas zordur. Genellikle sIg(-) olduundan monoklonalite de gsterilemez. Anaplastic large cell lenfoma: CD30+ olan bu hcreler, aktivasyon iaretlerini de (CD25, CD71, HLA-DR) tamalar karmaaya neden olabilir. Tan iin immunfenotip, morfoloji, klinik zellikleri birlikte deerlendirilmelidir. 2.1.3.3 Hodgkin Hastal Hodgkin Hastalnda malin hcrelerin says az olup ( <%1) ounluu enflamatuvar hcreler oluturduundan CD4+ hcrelerin hakim olduu kark bir hcre topluluu izlenir. Reed Sternberg hcreleri bireyler arasnda deiip; baz almalarda CD30+ B hcreler, bazlarnda sadece poliklonal hcreler veya kark hcre topluluklarndan bahsedilmektedir. Tablo 8. T hcre lenfoproliferatif hastalklarnda fenotipik zellikler Hastalk mmunfenotip Notlar T-PLL 2+, 3+, 5+, 7+, Dual 4+/8+, 4-/8+ nadir 4+, 84+/8-: tedaviye daha iyi yant T-LGL lsemi 2+, 3+, 5-, 7-, 4-, 8+, 16+, 11b+, 56-, 57+, 252+, 3-, 16+, 56+, 4-, 8, 57-, 252+, 3+, 5+, 7-, 4+, 8-, 25Tan zor TCR gen rearanjman gsterilmedike reaktif T hcre proliferasyonu ekarte edilemez L selektin ekspresyonu Aberran patern , nadiren 8+ 3+,56+: daha agresif

NK-LGL MF/Szary

Byk B hcreli Lenfoma Bcl-2 CD10+, Bcl-6+, MUM1-(germinal merkez fenotipi)

Erikin T 2+, 3+, 5+, 7-, 4+, 8-, lsemi/lenfoma 25parlak+ T-CLL 2+, 3+, 5+, 7+, 4+, 8-, 25-

CLL: Kronik lenfositik lsemi, SLL: Kk lenfositik lenfoma, OS: Overall Survival

Saylar CD no ifade etmektedir (r:3=CD3), +:pozitif, -: negatif, :deiken, LGL: Large granular Lymphocyte, NK: Natural Killer Cell, MF: mycosis fungoides

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

79

DALVA K.

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

2.1.3.4 T Hcre Hastalklar Bu hastalklarda perifer tipi T hcre fenotipi izlenir. CD3 yansra CD4 veya CD8 pozitiftir. Normal T hcre antijenlerinin kayb ya da younluklarnn deimesi tipiktir (tablo 8). 2.1.3.5 Large granular Lenfositik (LGL) Lsemi LGL Lsemi morfolojisi tipik olup; fenotipine gre T ve NK olarak ikiye ayrlr T-LGLde CD24, CD3+, CD8zayf+, CD16+, CD57+, CD56-, CD5-, TCR+ olup; genellikle ntropeni ve otoimmun hastalklar elik eder, daha sessiz seyreder. NK-LGLde CD2+, CD16+, CD56+, CD3-, CD4, CD8-, CD57-, TCR- izlenir. Anemi, trombositopeni ve hepatosplenomegali daha belirgin olup; daha agresif seyreder. LGL nin CD3+, CD56+ olan bir varyant hepatosplenik g d hcre lenfomas olarak da bilinmekte ve kt prognoz gstermektedir. 2.1.4 Multipl Miyelom Plazma hcreleri farkllatka B hcre antijenlerini (CD19, CD22, sIg, HLA-DR), CD45i kaybeder ve CD38(ok parlak), PCA-1, CD138 gibi yeni antijenler tar. CD 38, T, NK hcrelerde monositlerde de bulunduunda tek bana deil de CD56, CD45, gibi dier antijenlerle birlikte kullanlrsa daha iyi bir ayrm salanabilir. Tipik fenotipler yle zetlenebilir: Primitif plazma hcreleri: CD45++, CD38++, CD19+, CD10+, CD56+, VLA5+ mmatr plazma hcreleri: CD45+, CD38++ Matr plazma hcreleri: CD45-, CD38++, CD19Primitif hcrelerin varl kt prognoz iaretidir. Miyeloma aslnda kemik iliinin bir hastal olsa da baz miyelom hastalarnda ve reaktif durumlarda(karacier hst, HIV) perifer kannda da plazma hcrelerine rastlanabilir. Her iki durumda da immatr plazma hcreleri bulunabilir ve zgn olmayan bir uyarlma iaretidir. Matr hcreler ise sadece aktif hastal olan miyelom hastalarnda bulunup monoklonal zelliktedirler. Kemik iliindeki hcrelerde CD138 ve VLA5 eksprese edilirken; periferdeki hcrelerde bu antijenler yoktur

ya da ok zayf eksprese edilirler. Kemik iliindeki miyelom hcrelerinin normal plazma hcrelerinden farkl olarak CD56 ekspresyonlarnn yksek olduu grlr. 2.1.5 Paroksismal Nokturnal hemoglobinri (PNH) PNH, nadir grlen edinsel, klonal bir hastalk olup; Posfatidil nozitol Glikan snf A (PIG-A) genindeki mutasyonlara bal ortaya kar ancak; klonal gelime iin bu mutasyonun varl yeterli deildir. Hemoliz ve hemoglobinri, periferik kanda sitopeni, venz tromboza yatknlk en karakteristik klinik bulgulardr. PNH, Miyelodisplastik Sendrom, Aplastik Anemiye elik edebilir veya dnebilir. Hcre memranna Glikozilfosfatidilinozitol (GPI) ile bal bulunan proteinlerin eksiklii sz konusudur. Bu proteinlerden CD55, CD59un eksiklii membran attack complex, MACn eritrositleri paralamasna neden olur. Eritrositler yansra granulosit, monositlerde de bu proteinlerin eksiklii grlr. Garnulositler iin CD55, CD59 CD66b, monositler iin CD55, CD59, CD14, CD48 in en iyi belirleyiciler olduu CD16 nn eozinofillerde bulunmamas nedeniyle eksikliinin dikkatle deerlendirilmesi gerektii bilinmektedir. PNH eritrositleri fenotiplerine gre 3 gruba ayrlabilir. PNH I komplemana duyarln normal olduu tip olup; CD55,CD59 eksiklii gsterilemez. PNH III ise hassasiyetin 15-25 kat fazla olduu tipi temsil eder ve CD55, CD59 ekspresyonu hi yoktur. Tip II hcreler ise komplemana orta derecede hassasiyet gsterirler ve bu proteinler iin ksmi bir eksiklik sz konusudur. PNH klonunun bykln saptamak iin eritrosit ve lenfositlerden ziyade granulosit ve monositklerdeki ekspresyonunun kullanlmas nerilmektedir. 2.1.6 Minimal Residel Hastalk (MRD) Hematolojik malinitelerin tedavisini takiben MRDnin tesbiti giderek daha fazla nem kazanmaktadr. Genetik iaretler iin kullanlan molekler yntemler, ok az saydaki tmr hcrelerinin bile belirlenmesini salar. ASM ile k salm zelliklerinden de yararlanarak uygulanan multiparametrik analizler ile MRD belirlenebilir. nemli olan tmre zgn olan antijen/sinyallerin kullanlmasdr. Bunlar tan anndakiler ile ayn olabilir veya, hastalklardaki klonal deiimler nedeniyle fenotipte deiiklikler ortaya kabilir. Duyarllk 10-3-10-4 dzeylerindedir. Nadir grlen aberan bir ekspresyon,

80

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

DALVA K.

MRD iin uygun bir takip parametresidir. Kemik iliindeki hematogonlar, pre B hcreleri ile ayn antijenleri tarlar. Bu hcreler ancak antijen ekspresyonunun iddeti veya elik eden aberan bir antijenden yararlanarak malin hcrelerden ayrlabilir. Lsemik lenfoblastlarda 11q23 anomalisi bulunduunda, MRD tesbiti iin 7.1 antijenine ynelik antikorlar kullanlabilir. B hcreli CLL de CD19, CD5 birliktelii %5 duyarlkla MRD yi saptarken bu ikiliye k/l monoklanalitesinin elik etmesi halinde duyarlk %1e ykselir. Tek bir lmde MRD nin pozitif olmas relapsn habercisi olabilirse de ardk lmlerde MRD varl relaps iin ok daha iyi bir gstergedir. Bu konu ilgili konumaclar tarafndan ayrca ilenecektir. 2.2 Hcre DNA eriinin Belirlenmesi (PLODY) DNA, ift sarmalla elat yapabilen floresan boyalarla iaretlenebilir. Boyama sitokiyometriktir; yani boyann miktar hcrede bulunan DNA miktaryla doru orantldr. Bu amala en sk kullanlan boyalar Propidyum yodr (PI), DAPI, Hoechst dr. Bu tr florokromlarn bir ksm sadece DNA ya balanrken ou DNA ve RNA ya balanabilme zelliindedir. Bu durumun sonular etkilememesi iin DNAnn, hcre zar geirgen hale getirildikten ve RNAse ile ilem grdkten sonra boyanmas nerilmektedir. Diploid bir hcredeki DNA miktar 2n olarak tanmlanr (ekil 3). Bu durumda test edilen hcredeki DNAnn normal hcrelerdeki DNA miktarlarna oranlanmas ile elde edilen deer DNA indeksi olup; hcrenin DNA ieriini yanstmaktadr. Normalde 1 +/- %10 olmas beklenir; bundan farkl deerler bulunduunda anaploididen ekil 3. Hcre dngsnn ASM ile izlenmesi

ekil 4. Hcre dngsne elik eden proteinler

sz edilir. DNA indeksinin >1 olmas hiperploidi, <1 olmas hipoploidi olarak tanmlanr. Anaploidinin bulunmas malinite lehine bir bulgu olsa da bu her zaman doru deildir; benzer ekilde anaploidi daima kt prognozun bir iareti olarak alglanmamaldr. Hematolojik malinitelerde en sk karlalan anaploidi sebepleri tablo 9da zetlenmitir. Akm Sitometresi ile hcrelerin hangi blnme faznda ne miktarda hcre bulunduunu tespit etmek de mmkndr. Bu ekilde hcrelerin oalma hzlar hakknda bilgi toplanr. Diploid hcreler, G0 /G1 faznda yer alrkan S (sentez) fazndaki hcrelerin DNA ierii diploid ile tetraploid hcreler arasnda olacaktr (ekil 3). G2 ve Mitozdaki hcreler ise 4n miktarnda DNA tadklarndan tetraploid olarak izlenecektir.

Tablo 9. Hematolojik malinitelerde anaploidi nedeni olabilen kromozomal deiiklikler Hastalk Akut Miyeloid Lsemi Kronik Lenfositik Lsemi Akut lenfoblastik Lsemi Non-Hodgkin lenfoma Kromozomal deiiklikler +8 (%13), -7(%10) +12 (%30) +4, +6, +10, +14, +17, +18, +20 +12

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

81

DALVA K.

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

S+G2+M fazndaki hcreler S Faz Fraksiyonu (SPF) olarak tanmlanp; SPF nin yksek olmas, proliferasyon hznn yksek olduunun bir gstergesidir. Hcre dngs analizlerinde: analiz edilecek hcrelerin seimi ve kullanlacak yazlm programlarnda seilen modeller, karlatrlabilir sonular elde edilmesinde byk nem tar. Hcre dngs analizlerinde karlalan bir problem malin olan ve olmayan hcrelerin bir arada bulunabilmesidir. Bu durumda DNA y ilaretlemeden nce malin hcreleri ayrabilecek bir antijeni(r: epitelyal kkenli hcrelerde sitokeratin, B lenfoid tmrlerde CD19..... ) iaretlemek yardmc olabilir. Hcre dngs analizlerini hcre dngsne elik eden proteinlerin lm ile ile e zamanl deerlendirmek de mmkndr (ekil 4). 1.3 Hematopoetik Kk Hcrelerin Saylmas Kemik ilii rneklerindeki lkosit says graft kalitesi hakknda bir n bilgi verse de perifer kan rneinde hematopoetik kk hcreleri(HPKH) saymadan hzl bir deerlendirme yapmak mmkn deildir. Multiparametrik lmler kullanlan ASM almalar ile: (1)Perifer kanndan toplanan CD34+ HPKH ve progenitrler saylarak, toplanan rnn kalitesi deerlendirilebilir.(2) nceden yaplan saymlar, hcre toplanmas iin optimal zamann belirlenmesini salar. zellikle MM gibi mobilizasyonun ilerleyen gnlerinde malin hcre kontaminasyonu riski artan durumlarda en erken dnemde rn toplanmasnn nemi vurgulanmaldr. (3)eitli sitokinlerin ve /veya kemoterapi rejimlerinin CD34+ hcre saylarn ve alt gruplarn nasl etkiledii incelenebilir. (4) Aferez rnne yaplan mdahalelerin etkisi deerlendirilebilir (viyabilite, CD3 eksiltilmi rnlerde kalan T lenfosit, HPKH saylar) (5) Kriyoprezervasyonun hcre canll zerine etkisi deerlendirilebilir. (6) CD34+ hcrelerin alt gruplar deerlendirilebilir .CD34+, CD38-, lin-, CD90+ hcrelerin uzun sreli kalc engrafmanda; CD34+, CD41+ /CD61+ /CD62L+ hcrelerin erken dnem engrafmanda nem tadn gsteren almalar vardr. stirahat halindeki HPKH lerin CD34- olduklar ve uyarc bir sinyal aldklarnda CD34 ekspresyonunun balad bilinmektedir; CD34, aktif HPKH

belirleyicisidir. Kord kan rneklerinde lin-, CD38, CD7-, CD133 + hcrelerin de hematopoetik aktivite gsterdiine dair veriler olsa da multilineage hematopoez kapasitesi tayanlarn CD34+ hcreler olduu kabul edilmektedir. ASM ile CD34 saym iin: (1)Beyaz kredeki (BK) CD34+ hcre oranlar bulunup hemogramda elde edilen mutlak BK deerleri kullanlarak hesaplanr(Dual platform). (2)Birim hacimde bulunan CD34+ hcre says dorudan llr(Single platform) Bu lm iin ya volumetrik cihazlar kullanlr ya da mutlak says bilinen parlak floresan veren boncuklar eklenerek birim hacimdeki hcre says hesaplanr. Bu yntemle kan d rnlerde (kord kan, kemik ilii gibi) grlebilen ekirdekli krmz kre ya da kme trombositlerden kaynaklanan hatal BK saymlarna bal hatalar dlanm olur. Laboratuvarlar aras deikenlik azalr. Saymlar iin seilecek antikorlar, Class III veya II epitoplara zgn olmal ve tercihan Phycoerytrin (PE) iaretli olmaldr, ClassII FITC konjuge antikorlar kullanlmamaldr . En sk kullanlan Singleplatform ISHAGE metodu ile yaplan lmlerdir. Ynteme yaplan baz eklemeler ile CD34+ hcre alt gruplarnn veya hcre canllnn da deerlendirilmesi mmkn olmaktadr. Son yllarda kullanlmaya balanan bir teknikte yksek miktarlarda aldehit dehidrogenaz(ALDH) aktivitesi bulunan hcreler tesbit edilerek kk hcreler tannmaktadr. rne dntklerinde floresan verme zellii olan ALDH substaratlar kullanarak akm sitometresi araclyla fazla floresan veren kk hcreler tannp, miktarlar belirlenebilir.

1.4 Hcre Canlln Tesbiti, Apoptoz ile lgili almalar

ASM ile mmunfenotipleme uygulamalarnda zgn olmayan antikor balanmalarndan kanabilmek iin canl hcrelerle allmas gerekir. Bu amala 7AAD, Propidyum Iyodr(PI)gibi floresan veren boyalar kullanlarak hi bir n ilem yaplmad halde membran geirgen hale gelmi olan hcrelerin DNAsnn boyanmas salanarak canl/l hcre ayrm yaplabilir. Canl hcreler floresan vermezken l hcrelerin kullanlan florokromun zelliklerine gre farkl sinyal verdikleri gzlenir.

82

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

DALVA K.

Akm Sitometresinin nekrorobiyolojide kullanmnn 2 temel amac vardr: 1. Hcre lmne elik eden molekler ve fonksiyonel mekanizmalarn aydnlatlmas 2. l hcrelerin miktarnn tayini, apoptoz ve nekroz ile oluan lmlerin ayrt edilebilmesi Hcre lmne elik eden molekller arasnda en ok allanlar: bcl-2 ailesinin elemanler, kaspazlar, protoonkojenler (r:c-myc, ras...), tmr suprese edici genler (r: p53, pRB....)dir. ASMde fonksiyonel analizler de yaplabildii iin mitokondrial membran potansiyelindeki deiimlerin llmesi, oksidatif stresin belirlenmesi, hcre ii pH ve iyonize Ca dzeylerinin llebilmesi ile apoptoz hakknda yardmc bilgiler toplanabilir. ASMnin en byk avantaj ise bu lmlerin birkann ayn anda ayn hcre zerinde yaplabilmesidir. Apoptozun belirlenmesi iin kullanlan ok sayda yntem vardr. (1)Akm sitometresinde n dar(FSC) ve dik a ile krlma(SSC) zelliklerinden yararlanlarak srasyla hcrenin boyutlar ve granler yapsndaki deiiklikler kaydedilir. Apotozun erken dnemlerinde hcredeki bzmeye bal olarak FSC de bir azalma meydana gelir, SSCde balangta genellikle bir farkllk gzlenmese de baz hcrelerde SSCnin kromatindeki ve sitoplazmadaki younlamay yanstacak ekilde artt gzlenir.Olay ilerleyip hcre bznce ise SSC nin de azald gzlenir. Nekroz olaynda ise hcrede bzme deil ime olduundan FSC balangta bir art gsterir; plazma membrannn yrtlp sitozoln boalmasn takiben FSC ve SSC de belirgin bir azalma gze arpar. (2)Plazma membranndaki fosfolipidlerin dalm incelenebilir Plazma membranndaki fosfolipidler i ve d yapraklar arasnda asimetrik bir dalm gsterirler, apoptoz srasnda bu asimetri bozularak fosfatidilserin, hcre membrannn d yaprana geer. Antikoagulan bir protein olan Annexin Vin yksek affinite ile fosfatidilserine balanmasndan yararlanarak florokromla iaretli anti-Annexin aracl ile apoptotik hcreler saptanabilir. (3) plazma membranndaki aktif transportun kayb deerlendirilebilir, ya da mitokondrial membran potansiyelindeki deimeler llebilir.(4) Baz yntemler ise apoptoz srasnda meydana gelen DNA fragmanlarn saptamada yardmc olur Ortama dardan eklenen terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) aracl ile gerekleen bu deney, TUNEL deneyi (Tdt Mediated deoxyUridine Triphosphate-biotin Nick-End- Labeling) olarak

adlandrlr. ASM ile apoptoza elik eden proteazlar, kaspazlar ve serine proteazlarn aktivasyonu hllebilmektedir. 1.5 oklu la Direncinin (MDR) Tesbit Edilmesi MDR, hematolojik malinitelerde kemoterapiye yant alnmamasnn nemli sebeplerinden biridir. MDR nin p-glikoprotein(p-gp) olarak bilinen ATP baml bir ila pompasnn etkisiyle ortaya kt bilinmektedir. P-gpye ve ila direnci ile ilgili dier proteinlere ynelik eitli antikorlar (MDR1 eitli klonlar, LRB1, MRP) kullanarak MDR varl hakknda bilgi alnabilir. Ancak bu proteinlerin normal hcrelerde de bulunabilmesi deerlendirmeyi zorlatran bir faktrdr . Pgp fonksiyonun Rhodamine 123, Hoescht gibi floresan veren substratlarn hcre iine alnp/dna atlmalarna bal grlen floresan sinyal deiklikleri ile takip edilmesi fonksiyonel bir lm olduundan MDR tesbiti iin daha duyarl ve zgn olduu kabul edilir. Bu konu ilgili konumaclar tarafndan ayrca ilenecektir. 1.6 Hcresel mmun Yantn Belirlenmesi eitli hematolojik malinitelerde tmr antijenlerine kar mevcut olan ya da gelitirilen hcresel yantn llmesi nem tar. Bu ekilde tmr alar gibi eitli tedavi uygulamalarnn sonularn deerlendirmek de mmkndr. zerinde en ok allan malinitelerden biri KML olup; peptid balayan tetramer ya da pentamer yapsnda HLA kompleksleri kullanlarak bcr-abl peptidlerine reaktif T hcrelerin kantitatif tayini mmkn olmaktadr. AML, MM ile ilgili benzer almalar mevcuttur. AML blastlarnda WT1, proteinaz3 kaynakl peptidlere kar immun yantn artm olduunu; Miyelomda ise viral antijenlere kar yetersiz immun yant olutuunu destekleyan veriler vardr. Bir dier uygulama alan da minr doku antijenlerine (mHags) zgn sitotoksik hcre kullanmdr. Kk hcre naklinden sonra grlen relaps olgularnda minor doku antijenlerine zgn Sitotosik T lenfositlerin verilmesi ile bu antijenler araclyla antilsemik etki salanabilmektedir. ASM, oluan bu yantlarn takibi iin iyi bir aratr. Antijenik bir uyarana kar gelien hcre proliferasyonun CFDA gibi bir florokrom aracl ile takibi de mmkndr. Blnen bir hcrede her blnme floresan miktarnda azalmaya sebep olacaktr. Bu yntemle ardk 5-6 blnme takip edilebilir.

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

83

DALVA K.

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

Antijenik bir uyaran takiben T hcrelerdeki hcre ii sitokinlerin ASM ile tayini oluan immun yantn tipi hakknda yararl bilgiler salayabilir. Bu almalarn aktivasyonu takip eden hangi zaman diliminde yapld, kullanlan yntemler, kontrol iin seilen hcreler ve yntemler alnacak sonular zerinde dorudan etkili olduundan iyi planlanarak kullanlmas gerekir. Uyarlan hcrelerin fenotipinde meydana gelen deiikliklerden yararlanarak 4-18 saatlik bir antijenik uyaran takiben yantn deerlendirilmesi mmkndr. Bu amala en sk kullanlan antikorlar CD69, CD25, CD40L antijenlerine ynelik olanlardr. Sitotoksitenin, hcre yzeyinde beliren CD107a/b, salnan garanzim B/perforinin floresan iaretli antikorlar kullanarak llmesi de mmkndr. 1.7 Trombosit almalar ASM kullanarak trombositlerin klinik nem tayan hemen hemen tm fonksiyonlarnn llmesi mmkndr. ASM ile trombositlerin (1)Dk deerlerde bile doru saym, (2)yapm hzlarnn deerlendirilmesi, (3)dolamdan uzaklamalarnn takibi, (4) tam kandaki agregasyonlar, (5) Aktivasyonlarnn takibi belirlenebilir Aktivasyona bal glikoprorein (gp)IIb/IIIa reseptrdeki ekilsel deiim, granl salnm ile aa kan eler, dier hcreler ile etkileimleri llebilir. Immunplatelet saym: Hcreye zgn antijenler kullanarak trombositler saylabilir ve trombosit saym iin referans bir lm yntemi olarak kabul edilmektedir. Byle duyarl yntemler kullanldnda transfzyon gereklilik snrlar 10.000/ mcl ye kadar inebilmektedir. Antikorla(r:CD41) iaretlenen trombositlerle birlikte kandaki dier hcreler de saylp; trombosit/eritrosit oran belirlenir. Daha sonra kan saym cihaznda elde edilen KK saym deerleri kullanlarak trombosit saylar belirlenir.Dier bir yntemde ise ortama eklenen floresan boncuklar aracl ile birim hacimdeki trombosit saylar hesaplanr. Hzn yava tutulmas ve kann yeterince seyreltilmesi gerekir. Retikle Trombositler: Gen trombositleri temsil eden bu hcreler, yksek RNA ierikleri nedeniyle Thiazol Orange(TO) gibi nkleik asitlere zgn boyalar ile iaretlenip ASM de saylabilirler. Benzer yntem retikulositlerin saym iin de kullanlmaktadr. Retikle trombositlerin dolamdaki

says, trombopoetin uyarm ile artar, kemik ilii basklandnda ise azalr. Bylece immun ya da ykma bal trombositopeniler, kemik ilii yetmezliklerinden ayrlabilir. Ancak ad geen boyalarn plastie kolayca balanma zellikleri nedeni ile her lmden sonra cihaz dikkatle temizlenerek takip eden immunfenotipleme almalarn etkileyecek yalanc sinyaller yaratlmasndan kanlmaldr. Trombositlerin immunfenotiplemesi: ASM ile hcre yzeyinde anormal glikoprotein ekspresyonundan yararlanarak Glanzmanns trombastenisi ( CD41/CD61 eksiklii), Bernard Soluier sendromu(CD42a/CD42b eksiklii) gibi baz genetik trombosit hastalklarnn tannmas mmkndr. Trombositlerdeki dense granllere giren mepakrin gibi floresan boyalar kullanarak; depolama defektlerinin saptanmas, granl salnmnn takibi mmkndr. Trrombositlere bal antikorlar(PaIg): ELISA yntemlerine gre daha az ilem gerektiren ASM lmleri, trombositlere bal antikorlarn belirlenmesinde kullanlabilir. Retikle trombositlerle birlikte kullanldnda immun trombositopeni ayrc tansnda yol gstericidir. Trombosit Aktivasyonu: Aktive olan trombositlerde (1) Normalde granllerde bulunan antijenlerin (CD62P, CD63) yzeye kt; (2) PAC-1, LIBS gibi antijenlerde aktivasyondan sonra meydana gelen ekil seiiklikleri nedeniyle yeni epitoplar aa kt grlr. mmunfenotipleme ile bu deiikliklerin saptanmas mmkndr. Salkl sonular elde edilmesi iin rnekleme ile analiz arasnda geen sre, rnein doru hazrlanmas nem tar. Aktifleen trombositler hzla dolamdan uzaklatklar iin mmkn olduunca aktivasyon yerine yakn noktalardan rnekleme yaplmaldr. Trombositlere zgn yzey antijenlerini tayan ve trombositlerden ok daha fazla trombojenik olan trombosit mikropartikllerinin tannmas da mmkndr. 1.8 Trombosit rnlerindeki Lkositlerin Saym ok sayda trombosit transfzyonu yaplan hastalarda anti HLA antikorlarn gelimesinden korunmak iin rn iindeki lkosit saysnn minimal dzeylerde olmas istenir. Bu amala kantitatif lm yaparak birim hacimdeki lkosit

84

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

DALVA K.

saylarn veren kitler gelitirilmitir.Genellikle RNAnn paralanmasn takiben DNAya balanan florokromlar ile ekirdekli hcrelerin iaretlenmesi prensibine dayal bir yntem kullanlr. 1.9 Hcre Saflatrma (SORT) Kullanlan ilk akm sitometreleri, hcreleri verdikleri k sinyalleri esas alnarak kark bir hcre topluluu iinden ayrmak zere (sort) dzenlenmise de bugn rutin laboratuvarlarda kullanlan akm sitometrelerinin ok aznda sort etme kapasitesi bulunmaktadr. Akm sitometresinden ok daha hzl ve kolay olan saflatrma tekniklerinin (r: monoklonal antikorlar ile kapl magnetik boncuklar) gelimesi de bunda etkili olmutur. Ancak zellikle hcre zerindeki bir belirleyici zayf olduunda ya da ok parametre kullanlarak daha saf hcre topluluklar elde edilmek istendiinde en iyi seenek akm sitometresi olmaktadr. Akm Sitometresi ile sort edilen hcreler, fonksyonel analizlerde, hcreye zgn olan DNA sekanslarnn PCR ile oaltlmasnda, Floresan in-situ hibridizasyon (FISH) gibi tekniklerin uygulanmasnda, transfekte hcrelerin klonlanmasnda kullanlabilmektedir. Kromozomlarn sort edilmesi ile DNA veri bankalar iin veri toplamak mmkn olabilmektedir. Biz de A:.T.F Hematoloji B. D. Laboratuvarnda multipl miyelomla ilikili FISH uygulamalarndan nce kemik ilii rneindeki plazma hcrelerini saflatrarak kullanyoruz. 3. Sonu Akm Sitometrisi hematolojide yukarda zetlenmeye allanlar yan sra pek ok klinik uygulama ve aratrma alannda daha kullanlabilir. zellikle molekler yntemlerle kombine edilebilecek yeni uygulama alanlar ile ilgili almalar giderek artmaktadr. Nadir bulunan malin hcrelerin saflatrlarak PCR yntemleri, FISH gibi molekler teknikler iin kullanlmas, hibrid teknolojilerinin akm sitometride deerlendirilecek ekilde uygulanmas, 8-10 renkli analizlerle fonksiyon-fenotip ilkilerinin kurulabilecei eitli almalar, birer rnektir. Ancak her yntemde olduu gibi tekrarlanabilir, karlatrlabilir sonular elde etmek iin akm sitometriden yararlanrken standardize edilmi yntemlerin kullanlmas, cihazn optimum koullarda kullanlmas, periyodik kontrol, kalibrasyonu arttr. Elde edilen verilerin multidisipliner deerlendirilmesi elde edilecek yarar byk lde arttracaktr.

Kaynaklar
1. Cherie H. Dunphy, MD Applications of Flow Cytometry and Immunohistochemistry to Diagnostic Hematopathology Arch Pathol Lab MedVol 128, September 2004 2. MI T C H E L L S. WA R D The Use Of Flow Cytometry In The Dagnoss And Montorng Of Malgnant Hematologcal Dsorders, Pathology (1999) 31, pp. 382392 3. E.G. van Lochem, V.H.J. van der Velden, H.K. Wind, J.G. te Marvelde, N.A.C. Westerdaal, and J.J.M. van Dongen: Immunophenotypic Differentiation Patterns of Normal Hematopoiesis in Human Bone Marrow: Reference Patterns for Age-Related Changesand Disease-Induced Shifts Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 60B:113 (2004) 4. Rogelio Paredes-Aguilera, Lina Romero-Guzman, Norma Lopez-Santiago et al: Flow Cytometric Analysis of Cell-Surface and Intracellular Antigens in the Diagnosis of Acute Leukemia American Journal of Hematology 68:6974 (2001) 5. Daniela Voskova, Claudia Schoch, Susanne Schnittger Stability of Leukemia-Associated Aberrant 6. Immunophenotypes in Patients With Acute Myeloid Leukemia Between Diagnosis and Relapse: Comparison With Cytomorphologic, Cytogenetic, and Molecular Genetic Findings Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 62B:2538 (2004) 7. Samir A. Kheiri, Thomas MacKerrell, Vincent R. Bonagura et al: Flow Cytometry With or Without Cytochemistry of Acute Leukemias?, Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 34:8286 (1998) 8. E. Paietta,1 O. Goloubeva, D. Neuberg, J. M. Bennett et al: A Surrogate Marker Profile for PML/RAR_ Expressing Acute Promyelocytic Leukemia and the Association of Immunophenotypic Markers with Morphologic andMolecular Subtypes, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 59B:19 (2004) 9. M. Barbier, B. D. Gray, K. A. Muirhead, X. Ronot et al: A Flow Cytometric Assay for Simultaneous Assessmentnof Drug Efflux, Proliferation, and Apoptosis Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 59B:4653 (2004) 10. Renato Bassan, Gemma Gatta, Carlo Tondini Roel Willemze: Adult Acute Lymphoblastic Leukemia 11. Critical Rewies in Oncology/Hematology 50(2004)223261 12. Matthew Smith, Michael Barnett, Renato Bassan et al: Adult Acute Myeloid Leukemia Critical Rewies in Oncology/Hematology 49(2004)197-222 13. Ming Chen, DVM; Artemis Chakerian, PhD; David Combs; Kelly Garner, MT(ASCP); David S. Viswanatha, MD Post-PCR Multiplex Fluorescent Ligation Detection Assay and Flow Cytometry for Rapid Detection of Gene-Specific Translocations in Leukemia Am J Clin Pathol 122(5):783-793, 2004. 14. Jun-ichi Nishimura, Yoshiko Murakami, and Taroh Kinoshita: Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria: An Acquired Genetic Disease American Journal of Hematology 62:175182 (1999)

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU

85

DALVA K.

Hematolojide Akm Sitometri Kullanm

15. Ming Chen, DVM; Artemis Chakerian, PhD; David Combs; Kelly Garner, MT(ASCP); David S. Viswanatha, MD Post-PCR Multiplex Fluorescent Ligation Detection Assay and Flow Cytometry for Rapid Detection of Gene-Specific Translocations in Leukemia Am J Clin Pathol 122(5):783-793, 2004. 16. Wolfgang Kern, Alexander Kohlmann, Christian Wuchter et al: Correlation of Protein Expression and Gene Expression in Acute Leukemia Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 55B:2936 (2003) 17. Anna Guarini, Gianluca Gaidano, Francesca Romana Mauro, Daniela Capello et al Chronic lymphocytic leukemia patients with highly stable and indolent disease show distinctive phenotypic and genotypic features BLOOD, 102( 3) 2003 18. J. Ford*, P.G. Hoggard, A. Owen et al: A simplified approach to determining P-glycoprotein expression in peripheral blood mononuclear cell subsets Journal of Immunological Methods 274 (2003) 129 137 19. Kiyoyuki Ogata, Chikako Satoh, Hideya Hyodo et al: Association between phenotypic features of blasts and the blast percentage in bone marrow of patients with myelodysplastic syndromes Leukemia Research 28 (2004) 11711175

20. Thomas Rasmussen Lene M. Knudsen Tuan K. Huynh Hans E. Johnsen: Molecular and Clinical Follow-Up after Treatment of Multiple Myeloma Acta Haematol 2004;112:105110 21. A. Stacchini, A. Demurtas, L. Godio, G. Martini,1 V. Antinoro, and G. Palestro Flow Cytometry in the Bone Marrow Staging of MatureB-Cell Neoplasms Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 54B:1018 (2003) 22. Marc Maynadie, Francoise Picard, Bernard Husson, Bernard Chatelain, Yvan Cornet et al Immunophenotypic clustering of myelodysplastic syndromes BLOOD, 1 OCTOBER 2002 _ VOLUME 100, NUMBER 7 23. Steven J. Kussick, MD, PhD; Brent L. Wood, MD, PhD Four-Color Flow Cytometry Identifies Virtually All Cytogenetically Abnormal Bone Marrow Samples in the Workup of Non-CML Myeloproliferative Disorders Am J Clin Pathol 120(6):854-865, 2003 24. Alan D. Michelson, Marc R. Barnard, Lori A. Krueger et al: Evaluation of Platelet Function by Flow Cytometry METHODS 21, 259270 (2000) 25. Andreas Thiel and Alexander Scheffold Antigen-specific cytometry: The Monitoring of Immune Responses and Immunopathology ISAC 2004 Tutorial IV 26. Indra Ramasamy. Inherited Bleeding Disorders: Disorders of Platelet Adhesion and Aggregation Critical Rewies in Oncology/Hematology 49(2004)1-35

86

Molekler Hematoloji ve Sitogenetik Alt Komitesi

TEMEL MOLEKLER HEMATOLOJ KURSU