ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh : Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten : Saefullah Habibi : B1J0008010 : VI :3 : Zakiyyah

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011

I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincinganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan. Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agarosa. Hasil dari berbagai manipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui proses elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan meletakkannya pada suatu medan listrik. Separasi material elektroforesis didasarkan pada perbedaan dalam muatan molekul, ukuran molekul, atau kombinasi antara keduanya. Karena elektroforesis merupakan pergerakan dari molekul bermuatan listrik pada medan arus listrik maka molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda bermuatan positif (kutub positif) dan molekul bermuatan positif akan bermigrasi ke arah kutub negatif. Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya. Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu.

Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju elektroda positif. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan. B. Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk melihat cara kerja dan prinsip elektroforesis gel agarosa.

II. MATERI DAN METODE A. Materi

Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi Gelas ukur 1000 ml, Labu erlenmeyer 50 ml, Mikropipet beserta tip, Sarung tangan, Kertas parafilm, Seperangkat alat elektroforesis, UV transiluminator dan Kamera (Foto digital). Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi DNA produk PCR (DNA No. 9), DNA marka (DNA yang dipotong dengan Hind III), Agarosa, Larutan buffer TAE 1X (tris-base, asam asetat glacial dan EDTA), Akuades, Loading dye (Bromophenol blue, xylene cyalol) dan Larutan Etidium Bromid (EtBr). B. Metode 1. 10 ml larutan buffer TAE 0,2M + 500 mL akuades dihomogenkan (larutan 500 mL TAE 1x). 2. Gel agarosa 0,2 g + TAE hingga 20 ml (agarosa 1%), dididihkan hingga larut sempurna. 3. Disiapkan baki elektroforesis dan diletakkan selotip disetiap ujung baki elektroforesis. 4. Sisir elektroforesis dipasang di salah satu ujung baki dengan posisi hampir menyentuh dasar baki. 5. Dituang larutan agarosa 60C ke dalam baki elektroforesis dan dibiarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. 6. Sisir diambil dengan hati-hati kemudian selotip dilepaskan dari ujung-ujung baki. 7. Baki yang telah berisi gel agarosa dimasukan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisa dengan larutan buffer TAE 1x (dipastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 8. Disiapkan kertas parafilm, dimasukkan 10L sampel DNA dan 2L loading dye 6x ke dalam sumuran gel dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm. 9. Elektroforesis dinyalakan, diatur voltase dan waktunya (70 V, 35), dirunning. 10. Hasil running diangkat menggunakan sarung tangan, gel agarosa dimasukkan ke dalam EtBr selama 2 menit kemudian dipindahkan ke aquades selama 1. 11. Gel dikeluarkan kemudian divisualisasikan pada UV transiluminator.

12. Didokumentasikan dengan kamera.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil

Gambar 1. Visualisasi DNA Hasil Elektroforesis B. Pembahasan Berdasarkan hasil visualisasi DNA setelah dielektroforesis diperoleh bahwa pita DNA marka tidak muncul, sedangkan DNA sampel menghasilkan pita-pita DNA. Hal tersebut dapat terjadi karena DNA marka terdenaturasi sebelum dielektroforesis, penyimpanan DNA marka setelah selesai digunakan tidak disimpan kembali pada lemari pendingin. Menurut Standfield et al. (1996), kemungkinan terjadinya kegagalan tersebut karena DNA telah mengalami depolarisasi. Perlu diperhatikan bahwa pemberian arus listrik pada gel agarosa tidak boleh sembarangan karena jika terlalu besar dapat mengakibatkan panas yang akan merubah bentuk pita DNA. Beberapa kemungkinan yang menyebabkan pita-pita DNA tidak terbetuk seperti seharusnya, diantaranya adalah DNA dimasukan dalam sumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut, perendaman yang terlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di gel agarosa. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel. Waktu yang paling optimal dalam elektroforesis yang sebenarnya adalah 30 50 menit dengan menggunakan arus 50 mA. Pita-pita DNA yang terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita yaitu, open circular, linear, circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya (Sambrook & Russel 2001). Menurut Pratiwi (2001), elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Klug and

Cummings (1994) menambahkan bahwa elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Prinsip dasar tekhnik elektroforesis ini adalah DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai tekhnik preparatif (Standfield 1996). Menurut Rachmaniar (1998), agarosa merupakan polimer dari 3,6-AnhidroL-galaktosa dengan b-d-galaktosa, yang memiliki komponen netral atau tidak bermuatan. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut, rumput laut yang digunakan yaitu Evchema spinosum atau bisa juga dari jenis golongan Phaephycophyta. Agarosa akan membentuk gel padat jika dilarutkan dengan pemanasan pada konsentrasi antara 0,5% dan 2%. Agarosa yang digunakan untuk elektroforesis lebih murni bila dibandingkan denga agar yang digunakan untuk kultur bakteri. Agarosa akan membentuk pori yang besar sesuai dengan konsentrasi agarosa. Sambrook and Russel (2001), menambahkan bahwa gel ini mengandung larutan buffer Tris Asetat EDTA (TAE) yang dapat memberikan resolusi terbaik untuk DNA. Gel agarosa mempunyai laju pemisahan lebih cepat, dapat memisahkan fragmen DNA antara 100 bp50 kb tergantung dari konsentrasi gel agarosa yang digunakan, medan gerak biasanya horizontal. Fungsi dari masing-masing alat dan bahan yang digunakan pada praktikum elektroforesis adalah: 1. Sarung tangan, digunakan untuk mencegah keringat dari tangan pada medium karena keringat mengandung DNAase dan melindungi toksik dari EtBr. Selama

pengerjaan harus mengenakan sarung tangan dan berbicara sesedikit mungkin (Faatih, 2009). 2. Mikropipet, digunakan untuk mengambil sampel DNA. 3. Transiluminator, digunakan untuk mengvisualisasi DNA yang sudah dirunning. 4. Kertas parafilm, digunakan untuk mencampur atau menghomogenkan sampel DNA dengan loading dye. 5. Sisir elektroda, digunakan untuk membuat sumur untuk melekatkan DNA. 6. EtBr, digunakan sebagai pewarna yang menyisip pada pasang basa yang akan menunjukan posisi fragmen-fragmen dengan ukuran berbeda. 7. Loading dye, digunakan sebagai pemberat (Bromophenol blue sebagai penanda jalannya elektroforesis, xylene cyalol sebagai penanda awal jalannya elektroforesis. 8. Larutan buffer TAE 1X (tris-base sebagai penyeimbang pH, asam asetat glasial sebagai elektrolit dan EDTA, digunakan untuk menginaktifkan enzim perusak DNA yaitu DNAase). 9. Agarosa, digunakan untuk memadatkan dan mengvisualisasi DNA. 10. Seperangkat elektroforesis, sebagai alat untuk elektroforesis DNA dengan 70 V selama 35 menit. Fachiyah (2006) pun mengemukakan beberapa faktor yang mempengaruhi Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarosa, sebagai berikut: 1. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa. 2. Konsentrasi gel agarosa Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. Rumusnya adalah: log=log-KrT dimana adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan mobility DNA. Tabel 1. konsentrasi gel agarosa dan ukuran molekul DNA
T

adalah gel konsentrasi serta adalah electrophoretic

No

Konsentrasi Gel Agarosa (%) 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

Effisiensi range Pemisahan pada DNA linier (kb) 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1

1 2 3 4 5 6 7 3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena: Konsentrasi gel agarosa Kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan Densitas kembaran superheliks pada bentuk I Pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III Tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I Konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg. Semakin padat gel agarosanya maka akan semakin lambat laju migrasinya dan semakin basar berat molekul DNA maka laju migrasinya pun semakin lambat. Berdasarkan ukuran, semakin berat molekul DNA maka semakin lambat laju migrasinya, begitu juga sebaliknya. Menurut Pramono (2011), berdasarkan struktur molekulnya, DNA yang paling cepat lajunya adalah DNA bentuk covalently closed
circular (CCC) disusul oleh bentuk linier, dan yang paling lambat adalah bentuk open circular (OC).

4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA 2kb pada gel agarosa bergerak 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.

5. Komposisi basa DNA atau temperature Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada suhu kamar 6. Keberadaan pewarna DNA Iintercalating agent Ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau doublestranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum.

III. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-molekul bermuatan listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan listriknya. 2. DNA bermuatan negatif sehingga DNA akan bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). 3. Semakin padat gel agarosa dan berat molekul DNA maka akan semakin lambat laju migrasinya.

B. Saran Pelaksanaan praktikum lebih bekerja secara aseptis dan teliti. Penggunaan sampel DNA yang digunakan lebih diperhatikan agar tidak terjadi denaturasi. Selanjutnya dalam pelaksanaan praktikum tidak hanya demo dalam penggunaan alat agar semua praktikan dapat mengetahui secara detail penggunaan alat.

DAFTAR REFERENSI Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, 10(1):61 67. Fatchiyah. 2006. Electroforesis Migration Rate. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler & Seluler Universitas Brawijaya Malang, Malang. Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood cliffs. Pramono, H. 2011. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed, Purwokerto. Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta. Rachmaniar. 1998. Pemisahan Agarosa dari Polisakarida Agar. Buku Produk Alam Laut I. Puslit Oseanografi LIPI, Jakarta.

Sambrook, J., Russel D. W. 2001. Ed. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Stanfield, W. D., Jaime S. C., Raul J. C. 1996. Molecular and Cell Biology. Mc Graw-Hill, New York.