UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.

LABORATORIO DE BIOQUMICA ESTRUCTURAL.

INFORME EXPERIMENTAL DE LA CINETICA ENZIMATICA DE LA UREASA.

CARMONA BARAJAS ANGEL. PEREZ ALCALA ESTHER. LOPEZ ARTEAGA FERNANDO. GRUPO: 1603 07 DE NOVIEMBRE DEL 2007.

EQUIPO 1.

Cintica enzimtica de la ureasa. Introduccin. Las enzimas son los catalizadores que determinan el patrn de las transformaciones qumicas en los sistemas biolgicos. Casi todas las enzimas son protenas que median la transformacin de diferentes formas de energa; por ser protenas, son susceptibles a los mismos factores que desnaturalizan a las protenas, como el calor, cidos fuertes, bases fuertes, metales pesados y detergentes. Pueden tener componentes no proteicos, como carbohidratos, fosfatos, lpidos, iones metlicos o pequeas molculas orgnicas. Un sustrato es el compuesto especfico sobre el que acta una enzima afectando la velocidad de la reaccin. La cintica enzimtica se encarga de la velocidad de la reaccin y del modo es que sta cambia en respuesta a cambios en los parmetros experimentales. Un inhibidor es una sustancia que, cuando interacciona con una enzima, provoca una disminucin en la actividad cataltica. La inhibicin enzimtica puede ser: Reversible, si se produce una formacin de un complejo enzimtico inhibidor no covalente. Irreversible, si se forma un complejo covalente enzima-inhibidor. Se combinan con o se destruyen un grupo del enzima que es esencial para su actividad, o aquellos que forman una asociacin no covalente muy estable. Son tiles para estudiar los mecanismos de reaccin. Los aminocidos con funciones catalticas clave en el sitio activo, pueden ser identificados, determinado qu aminocido se ha unido covalentemente a un inhibidor despus de la inactividad del enzima. Los inhibidores suicidas son relativamente poco reactivos hasta que se unen al sitio activo de un enzima especfico. Pasa a travs de los primeros pasos de una reaccin enzimtica normal, a continuacin se convierte en un compuesto muy reactivo que se combina irreversiblemente con el enzima en lugar de ser transformado en el producto normal. La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea en amoniaco y bicarbonato, donde el primero se difunde a travs de la capa semipermeabe de acetato butirato de celulosa interpuesta entre el reactivo y las capas de indicador para minimizar la difusin de los iones hidroxilo del colorante. La funcin de la enzima es degradar la urea en amonaco y dixido de carbono. La ureasa se produce a partir de Lactobacillus fermentum. Dicha enzima pertenece al grupo se las ureasas denominadas ureasas cidas. Se activa a pH bajo. L. fermentum se cultiva en medio sinttico. Despus de la fermentacin se filtra el cultivo, se lava con agua y las clulas se matan en alcohol de 50 % vol. La suspensin se seca por liofilizacin o por pulverizacin. La preparacin consiste en un polvo formado por clulas muertas enteras que contienen la enzima. La ureasa no debe contener ni substancias ni microorganismos ni actividades enzimticas colaterales que puedan: - ser perjudiciales para la salud, - ser perjudiciales para la calidad de los productos tratados, - llevar a la formacin de productos indeseables, - ocasionar o facilitar un fraude. La ureasa se presenta bajo forma de polvo cristalino, blanco, inodoro, de un sabor ms bien dulce. Las enzimas tiene un pH ptimo en el que su actividad es mxima; a valores superiores o inferiores de pH la actividad disminuye. Algunas cadenas laterales de aminocidos pueden actuar como cidos o bases dbiles que desarrollan funciones crticas en el sitio activo de la enzima que dependen del

mantenimiento de un cierto estado de ionizacin, mientras que en otras zonas de la protena algunas cadenas laterales ionizadas pueden jugar un papel esencial en las interacciones que mantienen la estructura de la protena. El intervalo de pH n el que cambia la actividad puede proporcionar alguna pista sobre qu aminocido est implicado. En el ambiente compacto de una protena, el pKa de las cadenas laterales de los aminocidos puede cambiar significativamente. Los efectos de la temperatura en las enzimas con muy complejos. Las enzimas funcionan lentamente a grados de congelacin, y sus actividades incrementan al aumentar la temperatura, puede llegar a elevarse lo suficiente como para destruir la actividad enzimtica. La mayora de las enzimas muestran actividad ptima entre 30 y 40 C. Una enzima es ms estable a la temperatura si se encuentra en un tejido intacto o si est en presencia de carbohidratos, pectinas u otros protenas. Los cambios a la temperatura afectan a: a) Estabilidad de las enzimas. b) Cambios en la ionizacin de grupos del sistema. c) pH del medio d) Afinidad de la enzima por el sustrato e) Rapidez de ruptura del complejo E-S f) Grado de asociacin de las enzimas que tienen ms de una subunidad. Las enzimas pueden ser inactivadas por el calor, algunas pueden existir en forma desnaturalizada reversible. Cuando esto pasa, adopta un estado conformacional activo, y se vuelve a observar la actividad enzimtica. Dada la mayor energa (temperatura) de las molculas, se sobrepone a la desnaturalizacin de la enzima debido a su origen proteico. El resultado global de estas dos interacciones da como resultado un perfil con un mximo de velocidad a una temperatura dada, denominada temperatura ptima. La actividad de una enzima se puede estudiar in vitro, bajo condiciones controladas aadindole una enzima a un substrato. S se trabaja con la condicin de que la concentracin del substrato sea saturante, variando entonces la concentracin de enzima, se observa que aumenta el producto de la reaccin, a pH y temperatura constantes. Si se mantiene la concentracin de la enzima constante y variando la concentracin de substrato se obtiene una curva hiperblica. Al principio un aumento de la concentracin de substrato produce un aumento rpido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue aumentando la concentracin de substrato, la velocidad de reaccin comienza a disminuir y a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reaccin, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reaccin que se obtiene a esa alta concentracin de substrato se define como la velocidad mxima (V) de la reaccin enzimtica bajo las condiciones especificadas. La concentracin de substrato (S), a la semivelocidad mxima de reaccin (V/2) representa la constante de Michaelis o Km, la cual es una caracterstica para cada enzima. La inversa de Km, o 1/Km, mide aproximadamente la afinidad de la enzima por el substrato. Mientras ms pequeo sea el valor de Km, mayor ser la afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, ste ser transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad. La ecuacin de Michaelis describe la relacin cuantitativa entre la velocidad de reaccin y la concentracin de substrato [S], si se conoce Vmax o Km: v= En donde:

v= es la velocidad de reaccin observada a una concentracin de substrato determinada [S] Km= constante de Michaelis en moles/ltro Vmax= velocidad mxima a concentracin saturante de substrato. Si v= Vmax/2; entonces = Km+[S] = 2[S] Km =[S] De tal forma que podemos concluir que Km es igual a la concentracin de substrato a la semivelocidad mxima de reaccin. Objetivos. A partir de la extraccin de la ureasa del frijol de soya, estudiaremos los factores que alteran a la velocidad de reaccin enzimtica, bajo condiciones ptimas de la ureasa. Resultados. Concentracin. Tubo Blanco Problema 1 0 0.1 2 0.1 0.5 3 0.05 0.8 4 0.1 1 5 0.1 1.6

Concentracin
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 2 3 4 5 6 Concentracin. Blanco Concentracin. Problema

pH Tubos 1 2

Blanco

Problema 0 0 0.6 2

3 4 5

0.6 2 1.2

2 1.1 0.1

pH
2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 1 2 pH Blanco 3 4 pH Problema 5 6

Temperatura C Blanco Problema 0 0.2 0.3 20 0.5 1.3 50 1 2 70 0.4 1.6 90 0.2 0.8

Temperatura
2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 20 40 60 80 100 Temperatura Blanco Temperatura Problema

Tiempo Segundos

Blanco

Problema

10 20 30 40

0.1 0.1 0.1 0.1

0.3 0.2 0.1 0.1

Tiempo
0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 10 20 Tiempo Blanco 30 Tiempo Problema 40 50

Anlisis de resultados. Conclusin. Bibliografa. VARGAS RODRIGUEZ YOLANDA MARINA, OBAYA VALDIVIA ADOLFO EDUARDO, Clculos de parmetros de rapidez en cintica qupimica y enzimtica, UNAM, Cuautitln, Mxico, 2005. WISEMAN ALAN, Manual de biotecnologa de las enzimas, Acribia, Espaa, 1991. NELSON L. DAVID, COX M. MICHAEL, Lehninger, Principios de bioqumica, 4 edicin, Ediciones Omega, Espaa, 2005.