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BIOTECNOLOGIA EN PRODUCCION ANIMAL

A. Clement-Sengewald, G. Palma & G. Brem Introduccin La mayor intervencin del hombre en el pool gentico de los actuales animales domsticos fue a travs de la domesticacin. Ninguna otra medida productiva puede o podr afectar el componente gentico poblacional en una forma tan completa. En los comienzos de la domesticacin el hombre no produjo cambios en la reproduccin de los animales. De esta forma se mantuvo la seleccin natural. Posteriormente se observ que la reproduccin programada de los animales conduca a un aceleramiento de la seleccin. A travs del aprovechamiento de la variabilidad gentica podan criarse animales, que respondan mejor al fenotipo establecido, o sea aquellos que posean las caractersticas externas deseadas. Con el tiempo se establecieron programas de mejoramiento que no respondan solamente al deseo de una persona sino de varias y ms tarde al objetivo de agrupaciones de criadores. El empleo de la gentica poblacional como tambin de los mtodos gentico-estadsticos permiti, junto con la aplicacin de la inseminacin artificial, el desarrollo de exigentes programas de seleccin y evaluacin de la descendencia. Con el desarrollo de la biotecnologa se alcanz un nivel, en el cual es posible la manipulacin dirigida del genoma o determinados genes con mayor rapidez. Es posible adems alcanzar la manifestacin de algunas particularidades productivas, las cuales con la seleccin natural o programas de mejoramiento seran difciles de alcanzar. Las tcnicas reproductivas, mediante las cuales es posible afectar el genoma de los animales (cuadro 2), se diferencian de las tcnicas gnicas, las cuales se ocupan de los genes en forma individual (cuadro 3). Tcnicas reproductivas Las tcnicas reproductivas abarcan la inseminacin, la congelacin de semen, la micromanipulacin, la produccin in vitro, el clonado y la congelacin de los embriones. Los tratamientos hormonales de induccin y sincronizacin del celo de las hembras receptoras de semen y embriones como as tambin de las donantes de embriones, garantizan en muchos casos que las mencionadas tcnicas se cumplan con xito. La tcnica reproductiva de mayor aplicacin es la inseminacin artificial (IA) y con ella la congelacin de semen. A pesar de la resistencia presentada originalmente por razones ticas se reconoci rpidamente una de las ventajas de la IA con la disminucin de las enfermedades infecciosas transmitidas a travs de la cpula. Con la misma celeridad se observ que era posible obtener una mayor descendencia de un solo macho dividiendo el semen de un eyaculado en porciones e inseminando con las mismas varias hembras simultneamente. De esta forma es posible aprovechar el potencial de los machos en forma intensiva y mejorar as la estimacin del valor gentico de los reproductores, dado que las particularidades heredables son mejor evaluadas con un gran nmero de hijos. La conservacin de semen congelado en nitrgeno lquido posibilit su almacenamiento durante dcadas, sin que ello afecte la fertilidad del mismo. La IA juega, junto con la congelacin de semen, un rol de importancia en la produccin bovina. La inseminacin artificial en las especies ovina, porcina y equina no alcanz un significado equivalente al existente en la especie bovina. En las dos ltimas es necesario modificar an los mtodos empleados para mejorar los resultados. La tcnica de inseminacin artificial por medio de laparoscopa en la especie ovina permite actualmente obtener resultados satisfactorios, lo que abri las posibilidades del comercio internacional de semen. La transferencia de embriones es una tcnica reproductiva en constante desarrollo. Su evolucin es observable particularmente en la especie bovina. La TE asociada a la superovulacin de las donantes (captulos, II al VIII) puede aumentar considerablemente el nmero de la descendencia por donante y de esta forma multiplicar el componente gentico materno (captulo XVII). En la tabla 1 se resume el significado que tiene la transferencia de embriones actualmente en Europa. Lamentablemente se
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dispone de poca informacin de la TE en pases sudamericanos aunque las actividades y comercializacin con embriones frescos y congelados son actualmente relevantes en Argentina (cuadro 1), Brasil y Paraguay. Tabla 1: Transferencias de embriones en Europa durante el ao 1991 (8th Scientific Meeting, A.E.T.E., Lyon, 11-12 sept. 1992) Embriones por donante tiles Transferidos (n) frescos % 5 62 5 54 4 59 6 32 3 43 4 71 6 49 5 50 3 50 6 63

Pais Alemania Blgica Francia Holanda* Inglaterra* Checoslovaquia Union Sovitica* Irlanda Espaa Italia

Lavajes de donantes (n) 4170 2169 7896 2521 2141 1507 4800 979 306 1060

9 8 8 s.i. s.i. 7 10 7 7 9

Congelados % 38 46 41 68 57 29 51 50 50 37

s.i.: Sin informacin; *: registros de la misma fuente del ao 1990 Produccin de terneros por medio de transferencia de embriones durante un ao (7.917.92) en la Repblica Argentina (Memorias de la Sociedad Rural Argentina, 1992) Raza Aberdeen Angus Holando Argentino Hereford Limousin Fleckvieh Otras Total Descendencia (n) 804 704 556 129 83 121 2897

Cuadro 1:

A travs de la TE es posible aumentar el progreso gentico, porque a travs del aumento del nmero de embriones y terneros el potencial gentico de la hembra puede reproducirse y emplearse con ms eficacia. Razas y animales exticos pueden, segn las necesidades, reproducirse rpidamente. La eficiencia de los programas de seleccin y cruzamiento aumentan considerablemente con la aplicacin de la transferencia de embriones. Junto con la TE es preciso tambin mencionar la congelacin de embriones por medio del mtodo estndar y vitrificacin (captulo IX). El almacenamiento de los embriones congelados se lleva a cabo en nitrgeno lquido (-196oC). De la misma forma que el semen los embriones pueden almacenarse durante dcadas. Las ventajas que ofrece esta tcnica es una mayor eficacia y ahorro en el uso de las receptoras en un programa de TE, facilidad en el transporte de los embriones y en consecuencia la posibilidad del comercio de material gentico. De esta forma los animales nacen en el lugar de destino y se adaptan al macro- y microclima
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de la regin. La congelacin de los embriones permite la formacin de reservas genmicas en forma de bancos de embriones. Ello tiene particular importancia en la conservacin de razas en peligro de extincin, cuya produccin y mantenimiento en establecimientos ganaderos son sumamente costosos. Cuadro 2: Objetivos de las tcnicas reproductivas en el bovino

- IA y Congelacin de semen Combate y disminuye enfermedades sexuales Empleo intensivo del potencial gentico del macho y mejoramiento de la estimacin del valor gentico (prueba de la descendencia) - Sincronizacin del celo induccin de la ovulacin y el parto Facilidad en el manejo reproductivo y productivo Disminucin de la mortalidad neonatal - Superovulacin, TE, congelacin de embriones Optimizacin del potencial de la hembra Rpida reproduccin de individuos exticos o razas en peligro de extincin Formacin de bancos de reservas genmicas Facilidad en la importacin y exportacin del material gentico - Manipulacin y microciruga de embriones para la produccin de mellizos monocigotas y quimeras Aumento del nmero de animales nacidos por embrin recolectado Optimizacin de la estimacin del valor gentico Creacin de modelos de investigacin - Determinacin del sexo Seleccin del sexo de acuerdo a los objetivos establecidos - Produccin in vitro de embriones Ahorro de donantes Produccin de embriones de vacas donantes que no responden a los tratamientos superovulatorios - Clonado de embriones por medio de transferencia nuclear Variabilidad libre de recombinaciones de genotipos individuales Aumento del nmero de terneros por embrin La TE posibilit la microciruga de los embriones, con la produccin de mellizos monocigotas (captulo X) y quimeras a travs de la combinacin de mitades de embriones diferentes. Por medio de la divisin de los embriones es posible aumentar el nmero de embriones producidos en un programa convencional de TE de 0,6-0,7 a 0,9-1,2 terneros por embrin dividido. Los mellizos producidos de esta forma constituyen modelos adecuados en produccin animal e investigacin. Las pruebas llevadas a cabo con mellizos idnticos permite una mayor exactitud de la estimacin del valor gentico de los padres, dado que la varianza de los mellizos es menor que las de los hermanos enteros y medio hermanos (captulo XX). Posibilita tambin la evaluacin de la influencia ambiental sobre los reproductores; si los animales idnticos se cran en medios diferentes su condicin gentica idntica facilitar la determinacin de cada diferencia ambiental (foto 1).

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Foto 1: Mellizos monocigotas de la raza Fleckvieh producidos por medio de Micromanipulacin (BREM, captulo X) La produccin microquirrgica de quimeras puede llevarse a cabo de dos formas. En primer lugar a travs de la inyeccin de clulas en el blastocele de embriones, en este caso se espera que las clulas inyectadas tomen parte en el desarrollo del embrin. Otro mtodo es la produccin de quimeras a travs del agregado de embriones o hemi-embriones diferentes en una misma zona pelcida (figura 1). Las dos o ms mitades o embriones enteros a agregar son liberados de la membrana pelcida y posteriormente las combinaciones deseadas nuevamente transportadas a una zona pelcida comn. El nuevo embrin, producto del agregado, se organiza rpidamente y se transfiere de acuerdo con el programa convencional. Embrin I Embrin II Embrin I Embrin II

Fig. 1: Modelo de produccin de quimeras a partir de varios embriones

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Si se emplea como marcador el color de piel, la presencia de la quimera se determinar por los diferentes colores del pelaje (foto 2).

Foto 2: Quimera producida con las razas Fleckvieh y Murnau Werdenfelser (BREM, 1986) Las quimeras se emplean en la investigacin gentica bsica de mutaciones y fallas genticas dado que es posible establecer como se comportan dos lneas diferentes en un individuo y su efecto sobre el desarrollo corporal. Intensos trabajos de investigacin en los ltimos 10 aos hicieron posible la produccin in vitro (PIV) de embriones (captulo XI) y de la misma forma su cultivo hasta estadios transferibles en condiciones convencionales. Las ventajas de la PIV de embriones son numerosas: disminucin del costo de los embriones, disponibilidad de embriones en estadios tempranos de desarrollo a bajos costos, dado que con la produccin in vivo la recoleccin de los embriones del oviducto se lleva a cabo por medio de ciruga. El nmero de donantes pude reducirse. La PIV de embriones puede ser utilizada adems en aquellos casos en los cuales una vaca no puede ser sometida a los lavajes convencionales o debe ser sacrificada. Esto es particularmente importante cuando se trata de animales de alto valor gentico como as tambin razas en peligro de extincin (foto 3).

Foto 3:

Ejemplar de la raza Murnau Werdenfelser en peligro de extincin, obtenido por medio de la produccin in vitro de embriones (BERG, captulo XI)
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Hace pocos aos se emplea la tcnica de transferencia nuclear en la produccin de clones, esto es, la posibilidad de producir varios embriones genticamente idnticos (captulo XII). Con ayuda del clonado es posible transferir algunos embriones para probar los animales nacidos mientras otros tantos permanecen congelados. Si el resultado de las pruebas es positivo los embriones pueden descongelarse emplearse como donantes de blastmeros en un reclonaje. En teora se dispone de un nmero ilimitado de ncleos para nuevos reclonados. Las aplicaciones de esta tcnica son interesantes como numerosas: las pruebas de evaluacin con estos animales es ms exacta por la menor variabilidad gentica de los clones, posibilitando una evaluacin ms precisa de las influencias ambientales. Ahorra animales de experimentacin y de prueba (por ejemplo, descendencia) frente a aquellos con un menor vnculo familiar. Con la multiplicacin de animales de alto valor gentico puede acelerarse el progreso gentico. Adems es posible destinar un embrin para diagnosticar el sexo del clon, lo que permite seleccionar los animales producidos tambin por su sexo.

Tcnicas gnicas Las tcnicas gnicas conocidas tambin como de ingeniera gentica incluyen el clonado de genes, el anlisis de los mismos para el diagnstico de determinadas variantes gnicas, que llevan consigo particularidades positivas o negativas y la transferencia gnica (Cuadro 3). Cuadro 3: Objetivos de las tcnicas gnicas en produccin animal

- Produccin gnica de productos a travs de la transformacin de clulas de levaduras, de bacterias o de animales mamferos con un ADN recombinante in vitro - Formacin de un banco de genes para la conservacin de material gentico - Modificacin gnica de los microorganismos del rumen con el objeto de alcanzar una digestin ms eficiente y la disposicin endgena de producir componentes metablicos esenciales - Mtodos analticos (Anlisis gnico) Ayuda en la orientacin de anlisis gnicos posteriores Estudio de la relacin entre marcadores ADN e importantes caractersticas productivas - Diagnstico Estudio gentico y diagnstico de fallas genticas Determinacin de variantes gnicas definidas para caractersticas deseadas Determinacin de la identidad de la ascendencia de animales reproductores ("impresin digital ADN") - Transferencia de genes Mejoramiento de la calidad de productos animales Produccin de animales resistentes a enfermedades Mejora de la eficiencia productiva Produccin de protenas (Gene Farming) En la tcnica de produccin gnica de sustancias por medio de la transformacin de clulas de levaduras, de bacterias o de mamferos se introduce un ADN recombinante en las clulas a fin de capacitarlas en la produccin de protenas. De esta forma pueden producirse hormonas, vacunas y otras sustancias en forma idntica a la natural, pura y a bajos costos.
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El empleo de microorganismos ruminales modificados gnicamente permiti reducir el nivel de hidrlisis de nitrgeno, la protelisis y la produccin de lactato regulando la relacin de acetato, propionato y butirato. A travs de los organismos ruminales modificados genticamente se espera una digestin ms eficiente y una mejora de la disponibilidad de aminocidos y vitaminas. Este mtodo de tcnica gnica se encuentra an en la fase de prueba y sometido a discusin sobre su libertad de aplicacin, dado que los microorganismos del rumen son liberados tambin en el ambiente. El anlisis genmico tiene el objetivo de describir una especie animal en forma progresiva y completa con ayuda de mtodos celulares y gnicos. El mismo pretende identificar los genes y analizar sus secuencias de nucletidos para aclarar finalmente el modo de efecto de genes o complejos de ellos (captulo XV). Contrariamente a la especie humana, sobre la cual se discute el conflicto tico de analizar la totalidad del genoma, ese aspecto no juega rol alguno en produccin animal. Un anlisis completo significa, sin embargo, costos y esfuerzos muy grandes, razn por la cual slo se llevan a cabo anlisis parciales. Los conocimientos obtenidos en la especie humana, ms avanzados que en otras especies, convierten a la primera en una modelo adecuado para el anlisis del genoma de los animales de inters zootcnico. Una vez identificado el gen deseado pueden buscarse las variantes naturales del mismo y emplear los animales portadores en programas de mejoramiento. El nmero de genes identificados en animales de inters productivo no supera en la actualidad los 100. En el hombre se identificaron hasta ahora ms de 3000 genes. El anlisis genmico comprende 3 reas: Mapa gnico Anlisis de acoplamiento Caracterizacin individual de genes

El mapeo gnico pretende determinar la localizacin de caractersticas heredables en los cromosomas y establecer una relacin lineal entre ellos. Entre los mtodos de mapeo se incluyen el empleo de hbridos celulares, la hibridacin in situ, la microdiseccin cromosmica y la subordinacin de una caracterstica al efecto conjunto de varios genes. Los mapas gnicos sirven de orientacin en el genoma. Cuanto ms exacto es el conocimiento de la estructura y localizacin individual de los genes, ms exacto es el reconocimiento de la totalidad del genoma. El anlisis de acoplamiento gentico pretende determinar la distancia entre dos localizaciones gnicas. En produccin animal se intenta establecer una relacin entre marcadores ADN y caractersticas de importancia productiva. De esta forma el marcador ADN se convierte en el punto de partida del segmento que contiene el gen de inters. Actualmente se dispone de dos mtodos de anlisis de acoplamiento gentico: polimorfismo del largo del fragmento de restriccin (restrictions-fragment-large-polimorphisms) PLFR y el VNTRs. El PLFR basa su actividad en la capacidad de las enzimas de restriccin de cortar una cadena de ADN slo en aquellas posiciones donde se encuentran las secuencias de bases que responden a la enzima de restriccin. Si se modifican slo los pares de bases, se originan fragmentos de restriccin de diverso largo, que pueden separase con ayuda de electroforesis en gel. Si la caracterstica en cuestin aparece en una familia, se aisla el ADN de cada uno de los miembros y con ayuda de enzimas de restriccin y una sonda de ADN se producen muestras fragmentadas. Cuando el marcador gentico se encuentra ubicado lo suficientemente cercano al segmento de ADN que codifica la caracterstica a estudiar, se heredar siempre junto con l. Esto es, estn acoplados. El segundo mtodo de acoplamiento es el conocido como "variable numberd tandem repeats" (VNTR). Estas son pares de bases muy cortas ordenadas en tandem con diferente nmero de copias y que pueden estar distribuidas en gran nmero sobre todo el genoma. La diferencia de largo se establece por medio de PLFR. La diferencia se basa en que dada la frecuencia de su presencia con este mtodo se aumenta la posibilidad de establecer un acoplamiento. El tercer campo de anlisis genmico es el de la caracterizacin individual. Genes individuales de
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importancia para la produccin animal son caracterizados en su estructura de secuencia ADN a fin de establecer un cuadro exacto de los fenmenos hereditarios a nivel molecular. Un ejemplo de ello es la aracnomegalia en la raza Braunvieh europea, gen letal con un ndice endmico de 5%. Etiolgicamente se supone un defecto en los genes responsables de la produccin del colgeno. Si ese gen fuera identificado a nivel molecular podra ser evaluada su presencia en cada reproductor de forma tal de eliminar a los portadores. Con el diagnstico gnico se pretende en produccin animal reconocer variantes gnicas, que influencian en forma positiva ciertas caractersticas de inters productivo. En la actualidad existen dos mtodos diagnsticos disponibles para determinar segura y rpidamente la presencia de esas variantes gnicas: hibridacin y sonda de ADN o PCR (Polymerase-Chain-Reaction). La hibridacin consiste en el corte de la hlice de ADN en fragmentos por medio de enzimas de restriccin, los fragmentos son separados electroforticamente. Genes individuales pueden ser identificados con ayuda de una sonda gnica, dado que sta se deposita en el fragmento de ADN. PCR permite obtener de un slo fragmento de ADN varios millones de copias en un lapso de pocas horas. Estas se hacen visibles con ayuda de una minielectroforesis, ahorrando el trabajoso mtodo de hibridacin. Con ambos mtodos de diagnstico gnico pueden identificarse variantes gnicas an cuando se presentan en estado heterocigota. Un ejemplo de ello es la determinacin del sexo de embriones, que se lleva a cabo con PCR antes de la transferencia (captulo XV). El principio del fenmeno conocido como impresin digital ADN se basa en que si el genoma total de los animales fuera cortado y evaluado con diferentes pruebas se observara que ningn animal es idntico a otro, respondiendo al mismo principio de la impresin digital. A ello se lo denomina polimorfismo del lugar de corte. El mismo est determinado por fenmenos de mutacin natural y tiene como consecuencia diferentes largos de fragmentos de restriccin, lo que establece un modelo individual para cada animal. En teora puede identificarse cada animal sin riesgo de confusin. Dado que el ADN se transmite a la descendencia y las mutaciones ocurren raras veces se emplea este mtodo para la determinacin de la ascendencia, ya que los hijos portan slo fragmentos de ADN que estn presentes en los padres. La transferencia de genes (captulo XIII) se estableci como tcnica a partir de la dcada de 1980 transfiriendo, en primeras experiencias, secuencias recombinadas a ratones. A partir de 1985 se inform sobre los primeros animales domsticos transgnicos. Para la transferencia gnica es importante que cada gen sea aislado, caracterizado y recombinado con elementos reguladores adecuados. Ello ocurre gracias a la ayuda de mtodos biolgico-moleculares. La transferencia gnica debe llevarse a cabo en lo posible en estadios embrionarios tempranos, a fin de que la estructura gnica se integre en todas las clulas corporales. Por esa razn el mejor momento del desarrollo del individuo es el estadio unicelular. Para llevar a cabo la transferencia de genes existen 3 tcnicas disponibles: la microinyeccin de ADN en el proncleo de los cigotos, la transferencia a travs de vectores retrovirales y a travs de clulas totipotentes transformadas genticamente. El espectro de aplicaciones de la transferencia gnica en produccin bovina es grande. En primer lugar pueden mejorarse la calidad o la composicin de sus productos. Ejemplos de ello son: la produccin de leche libre de lactosa para aquellas personas que sufren de insuficiencia de lactasa, la mejora en la composicin crnea de la res, la produccin de animales resistentes a enfermedades, la produccin de protenas importantes para el hombre en animales. En ese "gene farming" se acoplan promotores a interesantes estructuras gnicas (factores de la coagulacin, por ejemplo) y transfieren a animales que producirn la protena deseada. Adems se pretende modificar el equilibrio dinmico entre la biosntesis y degradacin de determinados productos a travs de enzimas claves para favorecer la produccin de ciertos productos de regulacin compleja. La investigacin y desarrollo de estas tcnicas significan un esfuerzo econmico de magnitud y una inversin de tiempo muy grande. Es de esperar, sin embargo, que los resultados brindarn importantes aportes a la produccin animal.
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