UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE PATOLOGA VETERINARIA CATEDRA DE MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA ASIGNATURA: MICROBIOLOGA

COPROCULTIVO: DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE INFECCIONES ENTRICAS DE ORIGEN BACTERIANO

I.- OBJETIVO GENERAL: Al finalizar la prctica, el estudiante estar en la capacidad de interpretar el resultado de un coprocultivo. II.- OBJETIVOS ESPECFICOS: 1.- Enumerar de acuerdo al orden de frecuencia, y las especies animales involucradas, los agentes productores de infecciones entricas en las principales especies de animales domsticos. 2.- Evaluar la importancia epidemiolgica, clnica y sanitaria que tiene la familia Enterobacteriaceae. 3.- Explicar esquemticamente los pasos a seguir en el procesamiento de una muestra para lograr un coprocultivo exitoso. 4.- Seleccionar el tipo de muestra a tomar en un paciente con infeccin entrica y describir el procedimiento (discriminando las principales especies de animales domsticos) para la correcta toma de una muestra de heces para realizar un coprocultivo. 5.- Identificar en los medios de asilamiento selectivos las colonias presuntivas de E. coli, Salmonella y otras bacterias productoras de infecciones entricas, no enterobacterias. 6.- Mencionar las pruebas a realizar en la identificacin microbiolgica (diagnstico presuntivo y definitivo) de las bacterias productoras de infecciones entricas 7.- Interpretar el resultado de la investigacin de leucocitos fecales. 8.- Explicar la importancia del coprocultivo en el diagnstico de toda infeccin entrica. III.- CONTENIDOS: DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE INFECCIONES ENTRICAS DE ORIGEN BACTERIANO 1.- Agentes etiolgicos de las infecciones entricas: Virus, bacterias y hongos. 2.- Bacterias ms frecuentes productoras de diarreas: E. coli, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, Vibrios, otros. 3.- Diagnstico Microbiolgico a.- Investigacin de leucocitos fecales Procedimiento

Interpretacin b.- Coprocultivo Toma de muestra, transporte, siembra en medios selectivos y de enriquecimiento Aislamiento e identificacin bioqumica de los principales agentes bacterianos productores de diarreas c.- Identificacin serolgica de Salmonella y Shigella IV.- ACTIVIDADES DEL DOCENTE: Exposicin demostrativa de aproximadamente 30-40 minutos que incluye: 1.- Procedimiento a seguir para realizar un coprocultivo: Toma de muestra, siembra en medios selectivos y de enriquecimiento. 2.- Observar y describir los diferentes tipos de colonias presentes en los medios selectivos: Agar SS, Agar MacConkey, Agar EMB de Levine y Agar XLD 3.- Efectuar la siembra de una colonia previamente seleccionada de los medios selectivos en un medio diferencial de Kliger 4.- Realizar la lectura de las reacciones bioqumicas observadas en un medio de Kliger, caldo urea, lisina descarboxilasa, fenilalanina desaminasa, rojo metilo, voges proskauer, indol y citrato. 5.- Describir la importancia de la identificacin serolgica a partir de una colonia identificada presuntivamente como: Shigella o Salmonella aislados de un coprocultivo V.- ACTIVIDADES DEL ALUMNO: 1.- Responder las preguntas formuladas en la hoja del ejercicio prctico al final de esta gua. 2.- Esquematizar el procedimiento para la identificacin del germen aislado a partir de una muestra de heces 3.- Inspeccionar un tubo con caldo tetrationato inoculado con una muestra de coprocultivo. 4.- Sembrar en Agar MacConkey, Agar SS, Agar EMB de Levine y Agar XLD a partir de un cultivo de enriquecimiento (Caldo tetrationato) inoculado con una muestra de coprocultivo. 5.- Incubar las placas con los medios selectivos sembrados en un ambiente de microaeroflia a 37C por 24 horas. 6.- Inspeccionar, observar y describir las colonias de Salmonella, Proteus, Klebsiella y E. coli desarrolladas en los medios selectivos sembrados el da anterior. 7.- Observar, a partir de una placa de aislamiento, el repique de una colonia al medio diferencial de Kliger y la siembra de las diferentes pruebas bioqumicas diferenciales: caldo urea, lisina descarboxilasa, fenilalanina desaminasa, rojo metilo, voges proskauer, indol y citrato

8.- Interpretar los resultados de las diversas pruebas bioqumicas sembradas (Kliger, caldo urea, lisina descarboxilasa, fenilalanina desaminasa, rojo metilo, voges proskauer, indol y citrato) 9.- Preparacin de un extendido coloreado con Gram a partir de un cultivo de 24 horas sospechoso de Salmonella en medio BHI. 10.- Realizar la prueba de catalasa y oxidasa a una colonia aislada a partir de uno de los medios selectivos o a partir del cultivo puro Salmonella en caldo BHI. VI.- EVALUACION: 1.- Discusin grupal en una sesin prctica VII.- CONSIDERACIONES TERICAS 1.- INTRODUCCIN La porcin inferior del intestino delgado tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia. Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios (bacteroides, bacilos gran positivos y estreptocos, microorganismos entricos Gram negativos y Streptococcus faecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patgenas de las heces implica la separacin de las especies patgenas, usualmente a travs del uso de medios selectivos, diferenciales y de cultivos de pre-enriquecimiento. El diagnstico bacteriolgico de las infecciones entricas se realiza de acuerdo a su patogenia. En las infecciones diarreicas se utiliza el coprocultivo, pero una vez que las bacterias invaden el torrente sanguneo, el diagnstico debe hacerse adems, por el hemocultivo y el estudio serolgico (serodiangstico de Widal) Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud animal y salud pblica. Sin embargo, muchas de estas enfermedades no son notificadas, ya sea porque en su mayora son autolimitadas y no ameritan la consulta al veterinario, o porque no son reportadas oportunamente por el personal de salud (subregistro). Su etiologa infecciosa es diversa, pudiendo ser producida por bacterias, virus, parsitos y hongos. 2.- AGENTES ETIOLGICOS Las principales causas de los trastornos gastrointestinales agudos incluyen: Virus, las toxinas de diferentes agentes bacterianos gram positivos, bacilos gram negativos invasores, fermentadores lentos de la lactosa y espirales. En las diferentes especies de animales domsticos se han encontrado en muestras procedentes del tracto gastrointestinal, los siguientes patgenos (ver Tablas 1, 2 y 3):

Tabla N 1.- INFECCIONES BACTERIANAS DEL TRACTO GASTROINTESTINAL EN LAS PRINCIPALES ESPECIES DE ANIMALES DOMESTICOS ESPECIE ANIMAL ENFERMEDAD AGENTE ETIOLOGICO BOVINOS Pseudomona sp., Proteus sp. Diarrea inducida por antibiticos Clostridium perfringens tipos B y C Enterotoxemia clostridial Escherichia coli Colibacilosis y colisepticemia Mycobacterium paratuberculosis Paratuberculosis (enf. De Johne) Salmonella spp. Salmonelosis CANINOS Escherichia coli (Endotoxemia) Gastroenteritis hemorrgica canina Clostridium (Enterotoxemia Clostridial) Salmonella sp., Campylobacter jejuni Colitis bacteriana Campylobacter jejuni Campylobacterosis entrica Salmonella sp Enteritis por Salmonella Enteritis en neonatos (Escherichia coli) Escherichia coli Neorickettsia helminthoeca Envenenamiento por salmn FELINOS EQUINOS Enteritis / colitis bacteriana Salmonelosis Enterotoxemia Clostridial Clostridiosis intestinal Septicemia Neonatal Diarrea idioptica Enfermedad del sueo AVES Enteritis necrtica Erisipela del pavo Salmonelosis Infeccin Arizona en pavos (Inf. Paracolon) Erispela del pavo Pseudotuberculosis en pavo Caida de "dropped wing" en palomas Enteritis ulcerativa (enf. de la codorniz) Enterotoxemia Clostridial (AD) Colibacilosis (Enf. del edema) (AD) Salmonellosis (PD) Ileitis (PD) Disenteria (PD) Adenomatosis intestinal (PD) Espiroquetosis intestinal OVINOS Colibacilosis y colisepticemia Enfermedad de Johne Disenteria del ternero Salmonelosis "Watery mouth" Bacterias Gram negativas Salmonella typhimurium, Salmonella agona, Salmonella cubana, Salmonella cerro serog. B Clostridium perfringens tipo B y C Clostridium perfringens tipo A Actinobacillus equuli, Streptococcus grupo C, Escherichia coli, Salmonella spp., Klebsiella spp Rhodococcus equi, Salmonella spp Actinobacillus equuli Clostridium Perfringens tipos A o C Erysipelothrix rhusiopathiae Salmonella gallinarum Salmonella pullorum, Salmonella spp. Salmonella arizonae Erysipelothrix rhusiopathiae Yersinia Pseudotuberculosis Salmonella typhimurium Clostridium colinum Clostridum perfringens tipo C Escherichia coli Salmonella cholerasuis Lawsonia intracellularis Treponema hyodysenteriae Campylobacter mucosalis, Campylobacter hyointestinalis, Campylobacer hyolei Serpulina pilosicoli Escherichia coli Mycobacterium paratuberculosis Clostridium perfringer tipo B Salmonella spp. Asociado con Escherichia coli.

PORCINOS

Tabla N 2.- INFECCIONES VIRALES DEL TRACTO GASTROINTESTINAL EN LAS PRINCIPALES ESPECIES DE ANIMALES DOMESTICOS ESPECIE ENFERMEDAD AGENTE ETIOLOGICO ANIMAL Pestivirus (Flaviviridae) Diarrea Viral Bovina (BVD) y enfermedad mucosal Herpesvirus ovino tipo 2 (OHV 2) Fiebre Catarral Maligna Morbillivirus (Paramyxoviridae) Rinderpest (peste bovina) BOVINOS Rotavirus (Reoviridae) Infecciones por Rotavirus Coronavirus (Coronaviridae) Infecciones por Coronavirus Coronavirus (Coronaviridae) Disentera de invierno Coronavirus (Coronaviridae) Infeccin por Coronavirus canino Herpesvirus canino tipo 1 Inf. Por Herpesvirus canino en cachorros Parvovirus (Parvoviridae) Parvovirosis canina CANINOS Morbilivirus (Paramyxoviridae) Enteritis por Distemper Adenovirus tipo 1 (Adenoviridae) Enteritis por Hepatitis infecciosa canina Parvovirus (Parvoviridae) Enteritis por Parvovirus Coronavirus (Coronaviridae) Enteritis por Coronavirus Lentivirus (Retroviridae) Inmunodeficiencia viral felina Coronavirus (Coronaviridae) Peritonitis infecciosa felina FELINOS Retroviridae Leucemia felina Parvovirus felino Panleucopenia felina EQUINOS Rotavirus Diarrea Rotavirus Aviar (Reoviridae) Infeccin por Rotavirus AVES Coronavirus (Coronaviridae) Enteritis transmisible del pavo (Cresta azul) Aviadenovirus (Adenoviridae) Enteritis Hemorrgica del pavo Coronavirus Enteritis transmisible (AD) PORCINOS Rotavirus Diarrea (AD) Morbillivirus (Paramyxoviridae) Peste de los pequeos rumiantes OVINOS Morbillivirus (Paramyxoviridae) Peste de los bovinos Rotavirus (Reoviridae) Rotavirosis

Tabla N 3.- INFECCIONES FUNGICAS DEL TRACTO GASTROINTESTINAL EN LAS PRINCIPALES ESPECIES DE ANIMALES DOMESTICOS ESPECIE ANIMAL ENFERMEDAD AGENTE ETIOLOGICO BOVINOS Cryptosporidium parvum Cryptoporidiosis CANINOS Histoplasma capsulatum Histoplasmosis canina FELINOS Histoplasma capsulatum Histoplasmosis felina Aspergillus flavus Enfermedad X del pavo (Aflatoxicosis) AVES Thrush of the crop Candida albicans OVINOS Cryptosporidum sp. Cryptosporidiosis

La importancia epidemiolgica y el peso especfico de cada una de estos microorganismos (bacterias, virus y hongos) como agentes causales de diarrea, varan dependiendo de la especie animal, edad del paciente, condiciones ambientales como el clima, variaciones estacionales, reservorios, factores epidemiolgicos como presencia de brotes epidmicos, saneamiento bsico y hbitos y creencias de los productores o dueos de mascotas. Existen dudas en cuanto al conocimiento de la epidemiologa de algunos agentes,

en particular sobre sus modos de transmisin y supervivencia en el medio. Se sabe ms sobre Salmonella en la cual el mecanismo de transmisin implica la va fecal y oral, favorecido por la excrecin de altas dosis de bacilos que pueden sobrevivir en el ambiente. El hacinamiento que caracteriza a la mayora de las poblaciones animales en los centros de cra y produccin, permite la diseminacin y persistencia de cepas patgenas. A pesar de los avances importantes en las investigaciones biomdicas en las ltimas dcadas, las diarreas continan siendo la mayor causa de prdidas econmicas en las explotaciones pecuarias y morbilidad y mortalidad entre las mascotas tanto en los pases desarrollados como en vas de desarrollo A.- VIRUS Los virus (Pestivirus, Herpesvirus, Morbillivirus, Rotavirus, Coronavirus, Parvovirus, Adenovirus, Lentivirus, Retrovirus, entre otros) son la causa ms frecuente de gastroenteritis y diarreas. Estas enfermedades son de presentacin clnica y duracin muy variada, constituyendo la segunda causa de enfermedad en la comunidad, despus de las infecciones respiratorias virales. Son autolimitadas, no ameritan, ni justifican tratamiento con antibiticos y su manejo es slo con medidas de soporte, tipo hidratacin. Su diagnstico se realiza bsicamente mediante. 1.- La epidemiologa: Generalmente aparecen por brotes. 2.- La ausencia de polimorfos nucleares en las heces 3.- Estudios serolgicos y aislamiento del virus. Estos hacen o permiten el diagnsticoi de certeza, pero resultan costosos. En nuestro campo de trabajo, los agentes virales relacionados con cuadros gastrointestinales ms importantes varan dependiendo de la especie animal estudiada (ver tabla N 2). Los inmunoensayos han pasado a dominar el diagnstico virolgico de la gastroenteritis aguda en el laboratorio clnico. Actualmente, hay disponible en el mercado una gran variedad de kits (mtodos rpidos para diagnstico) para los diferentes agentes etiolgicos virales, los cuales estn basados en pruebas de aglutinacin, inmunodifusin, ensayos inmunoenzimticos o con partculas de ltex. La sensibilidad entre los diferentes kits puede variar entre 70-95%, y si bien son de alta especificidad, puede haber algun resultado falsopositivo, especialmente cuando se utilizan los kits con partculas de ltex. Es por ello, que el clnico debe evaluar con cautela cada examen positivo dentro del contexto clnicoepidemiolgico Durante el componente terico del curso de Microbiologa se describirn estos virus, desde el punto de vista prctico nos limitaremos al estudio de las diarreas bacterianas. B.- BACTERIAS Los agentes bacterianos productores de diarrea se pueden clasificar en 4 grandes grupos, de acuerdo a sus mecanismos de patogenicidad. 1.- Bacterias Enterotxignicas: Producen diarrea acuosa por la elaboracin de una exotoxina. Ejemplo: Vibrio cholerae. Alguna cepas de E. coli (ECET), Aeromonas, son capaces de producir enterotoxinas. 2.- Bacterias productoras de Citotoxinas:

Las citotoxinas pueden llevar a la destruccin de la mucosa. Se describieron por primera vez en S. dysenteriae tipo I. Actualmente se le han descubierto en Clostridium difficile y en ciertos serotipos de E. coli (E. coli enterohemorrgica). Estas citotoxinas juegan un papel importante en la produccin de diarrea tipo disentrico por estas bacterias. 3.- Bacterias Enteroagregativas La capacidad de adherencia se ha estudiado bien en las E. coli enteroagregativas (ECEAg), conocidas anteriormente como Enteroadherentes, y E. coli EnteroToxignicas (ECET) en las cuales se ha demostrado la presencia de pili y fimbrias que median esta capacidad y a los que se han denominado factores de colonizacin (CFA). Causan diarrea aguda y crnica (> 14 das de duracin). La patognesis esta an en estudio; sin embargo, en las bacterias implicadas: ECEAg, se ha demostrado su adherencia a la mucosa intestinal y la elbaoracin de una enterotoxina y citotoxinas, lo que conduce a dao en la mucosa, secrecin de grandes cantidades de moco y diarrea secretora. 4.- Bacterias Enteroinvasivas Provocan diarrea inflamatoria por invasin de la mucosa intestinal: Shigella, Salmonella, Yersinia enterocoltica, algunas cepas de E. coli enteroinvasivas (ECEI) y Campylobacter jejuni Debe considerarse, adems de estos cuatro (4) grupos los agentes bacterianos productores de intoxicaciones alimentarias como: Staphylococcus aureus, Clostridium perfringer tipo A, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, en los cuales el mecanismo patgeno est determinado por la capacidad de estos organismos de producir toxinas en los alimentos que contaminan, de manera que la enfermedad es el resultado de la accin de sus toxinas preformadas y no de las bacterias mismas. Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son los componentes principales de la flora intestinal normal, ellos son capaces de causar enteritis (60 70% de casos), infecciones del tracto urinario (ms del 70% de los casos) y sepsis (poco comn). A esta familia pertenecen 25 gneros y ms de 110 especies, de las cuales ms de 40 especies o grupos son reconocidos como patgenos definidos. Aunque muchas especies pertenecientes a esta familia han sido implicadas como causa de diarrea, slo los miembros de los gneros Escherichia, Salmonella, Shigella y Yersinia estn claramente reconocidos como patgenos entricos. 3.- DIAGNSTICO Es de suma importancia para el clnico y de beneficio para el paciente establecer el diagnstico certero, mediante el estudio bacteriolgico, ello le ayudar a determinar la necesidad o no de un estudio bacteriolgico a otros miembros de la unidad de produccin o del ncleo familiar de los dueos del paciente; ejemplo: la salmonelosis puede dejar portadores sanos por muchos aos, an de por vida, por lo que pueden convertirse en transmisores de la enfermedad. La mayora de las infecciones entricas bacterianas no ameritan tratamientos especfico, sino medidas de sostn. Para determinar rpidamente la naturaleza de una enfermedad diarreica se est utilizando actualmente y con alto grado de confiabilidad de prueba de investigacin de leucocitos fecales que consiste en determinar el tipo de clulas inflamatorias presentes en las

heces; esto orienta sobre la naturaleza del proceso infeccioso. Por ejemplo; en la Shigelosis, Salmonelosis y diarreas provocadas por E. coli invasoras, se observa abundantes neutrfilos polimorfonucleares. En la fiebre tifoidea y amibiasis, en cambio predominan clulas inflamatorias mononucleares. En las diarreas producidas por virus, bacterias enterotoxignicas o debidas a intoxicaciones alimentarias, no se observan clulas inflamatorias de ningn tipo, las que tampoco se observan en heces de personas normales.
TABLA N 4: ENFERMEDADES GASTROINTESTINALES Y LEUCOCITOS FECALES ENFERMEDAD Shigelosis Salmonelosis E. coli invasiva Fiebre Tifoidea Amibiasis Colitis Ulcerosa Diarrea Alrgica Diarreas virales, toxignicas y personas sanas TIPO DE CELULA PREDOMINANTE Polimorfo nucleares Polimorfo nucleares Polimorfo nucleares Mono nucleares Generalmente Mono nucleares Polimorfo nucleares eosinofilos Mono nucleares Generalmente sin clulas inflamatorias

PROCEDIMIENTO PARA LA INVESTIGACIN DE LEUCOCITOS FECALES 1.- Colocar una pequea cantidad de moco o de heces en una lamina y mezclar con 2-3 gotas de azul de metileno al 1%. 2.- Cubrir con una laminilla y esperar 2-3 minutos con el objeto de obtener una buena coloracin nuclear. 3.- Observar al microscopio con los objetivos secos (10X y 40X) Aunque este mtodo es til como diagnstico presuntivo, el diagnstico bacteriolgico de las infecciones entricas se hace en base al coprocultivo. COPROCULTIVO: Es el estudio bacteriolgico de una muestra adecuada de las heces en medios apropiados para el diagnstico de bacterias patgenas entricas productoras de diarreas (Ver esquemas N 1 y 2) TOMA DE LA MUESTRA Y SU TRANSPORTE Una muestra adecuada es aquella que ha sido recolectada durante el periodo agudo de la enfermedad, cuando es ms fcil comprobar la presencia de pus, moco o sangre y antes de la administracin de drogas antimicrobianas. Muestras de heces frescas: Las heces frescas son preferidas a los hisopados rectales, debido al pequeo volumen que se toma en estos, y a la gran cantidad de flora normal presente en las heces, la cual puede desarrollar y producir una sobrepoblacin de bacterias que solapan a los verdaderos patgenos.

Una cantidad aproximada de 0,5 a 2 gr de material fecal debe ser tomada, y colocada en recipientes estriles En caso de pasar ms de dos horas entre el momento de la toma de la muestra y la siembra, es necesario mantenerla en un medio de conservacin y transporte, En este caso puede emplearse una solucin tamponada de fosfatos 0,033 molar, mezclada con glicerol a partes iguales, en una proporcin de 1 g de heces por 10 ml de solucin. El pH de esta solucin debe ser aproximadamente de 7,0 0,1. Debe recordarse que algunos enteropatgenos son muy sensibles a los cambios de pH, ya que ste puede descender durante el almacenamiento. Debe notarse la presencia de sangre, moco helmintos en la inspeccin somera inicial de la muestra. Pueden utilizarse tcnicas especiales para buscar protozoarios, parsitos y sus huevos. Los frotis teidos podrn revelar la prevalencia de leucocitos y de Candida albicans, pero no pueden diferenciar bacterias entricas patgenas de la flora normal. Hisopados rectales: En las aves y pequeos animales, puede ser de utilidad el hisopado rectal para la toma de material para el coprocultivo. Si la muestra se toma con un hisopo estril, debe tenerse cuidado de introducirlo hasta sobrepasar el esfnter anal, hasta una profundidad de 2-3 cm, y se le imprimen movimientos de rotacin, se trata de recoger lo ms posible de material mucosanguinolento que se encuentra en las paredes de la cloaca (aves) o de la ampolla rectal (mamferos). Si no se efecta la siembra inmediatamente, se introduce el hisopo cargado de material en un vial o tubo con tapa de rosca y con una solucin preservadora, como: Stuart, Cary-Blair o de Amies (medios de transporte), en los cuales las enterobacterias patgenas conservan su vitalidad durante varios das. Estos medios se distribuyen en tubos o en pequeos viales. Para el envo de las muestras, se impregna el hisopo con material tomado por hisopado rectal o con las heces, se introduce hasta el fondo del tubo y se quiebra la parte del aplicador que sobresale del borde del tubo. En estos medios las muestras pueden ser enviadas a temperatura ambiente. EXAMEN DIRECTO: El frotis directo, realizado en microscopio de campo oscuro, podra ayudar a diferenciar el gnero Campylobacter, pero no ayudara en la diferenciacin de la familia de las Enterobacterias por su morfologa similar. La tincin de Gram, debe ser siempre realizada para corroborar la pureza de un aislado, antes de las pruebas bioqumicas o test serolgicos. MEDIOS DE CULTIVO En las muestras de heces, las bacterias entricas patgenas se encuentran siempre asociadas a gran variedad de bacterias comensales, es por ello que para facilitar el aislamiento y la posterior identificacin de estas cepas patgenas, se emplean los medios de enriquecimiento, medios selectivos y medios diferenciales que se describen a continuacin, los cuales, en su mayora, se basan en la fermentacin de la Lactosa o Sucrosa: Medios de enriquecimiento: Un enriquecimiento en caldo debe ser usado, as como la siembra directa en placas tanto en medios ordinarios como selectivos y diferenciales. Los caldos comnmente ms usados para este propsito y especficamente para aislamiento de Salmonella son: Caldo Selenito de Leifson y Caldo de Mueller Kauffman o Caldo tetrationato. Este ltimo es el ms usado, esta compuesto por peptonas, sales biliares, carbonato de calcio y

tiosulfato de sodio. Antes de sembrar la muestra (1gr. De heces para cada 10 cc de medio) se le aaden 0,2 ml de solucin Yodo-yodurada; esta sustancia acta sobre el tiosulfato transformndolo en tetrationato de sodio, el cual inhibe el crecimiento de las bacterias Grampositivas y limita el crecimiento de casi la totalidad de las enterobacterias, incluyendo Shigella y E. coli siendo muy efectivo para el enriquecimiento de Salmonella. Luego de sembrado, se incuba a 37C por 6 a 24 horas, y posteriormente se toma una asada de estos caldos enriquecidos, y se siembran en medios selectivos diferenciales, tales como Bismuto Sulfito Agar (BSA), SalmonellaShigella Agar (SSA) y Agar MacConkey incubndolos a 37C durante 24 12 horas. El pre-enriquecimiento de las cepas de Yersinia requiere, previo a la siembra de los medios selectivos, de un almacenamiento por 2 semanas en caldo para Yersinia a 4 C. Los caldos comnmente ms usados para enriquecimiento selectivo y especficamente para aislamiento de Campylobacter son: Caldo Bolton, Caldo Preston, Caldo Exeter, Caldo Park y Sanders y CCDB (caldo con deoxicolato, cefoperazona y carbn) Medios Selectivos: Poco selectivos: Agar Desoxicolato, Agar Desoxicolato Lactosa, Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB de Levine), Agar Eosina Azul de Metileno modificado, Agar Endo, Agar MacConkey, Agar tergitol 7. Agar Desoxicolato: Es un medio altamente selectivo para aislamiento de entricos patgenos como Salmonella y Shigella. El desoxicolato sdico inhibe o suprime considerablemente el crecimiento de coliformes y gram positivos. Sin embargo en ocasiones crecen coliformes, y cuando se encuentran en grandes cantidades producen cido a partir de la lactosa, se precipitan la sal biliar, y dan un medio rojo que se hace difcil la deteccin de patgenos. Si la lactosa presente se fermenta por los coliformes, provoca una acidificacin del medio alrededor de las colonias. Este cambio de pH hace que el indicador rojo neutro cambie a rojo y, que la bilis precipite. La reduccin del citrato frrico-amnico a sulfuro de hierro, por microorganismos que producen H2S, est dada por el ennegrecimiento de la parte central de la colonia. Agar Desoxicolato Lactosa: - Medio agar DCLS (dexicolato-citrato-lactosa-sacarosa): Los compuestos principales son el tiosulfato sdico, el desoxicolato sdico y el citrato. Sirve para aislar Salmonella, Shigella (transparente rosceas) y Vibrio (colonias rojas) Agar Endo: Sus compuestos principales son la lactosa y la fucsina bsica. Sirve para el aislamienteo de coliformes (colonias incoloras de bacterias gram- lactosa-) y de enterobacterias (rosas o rosadas lactosa +) Agar Eosina Azul de Metileno o Agar de Levine: (Selectivo y diferencial). Es poco selectivo; se utiliza en el aislamiento de E. coli enteropatgenas, Salmonella y Shigella. Entre sus componentes se encuentran eosina y azul de metileno. En l la E. coli forma colonias con centro negruzco y reflejo metlico verdoso; la Salmonella forma colonias pequeas e incoloras. Las especies de los gneros Klebsiella y Enterobacter forman colonias mucosas, de color morado claro, con o sin reflejo metlico. Agar MacConkey: Medio selectivo y diferencial, que contiene sales biliares adems de lactosa. Los grmenes del grupo coliforme dan colonias de color rojo debido a la fermentacin de la lactosa, mientras que Salmonella y Shigella forman colonias incoloras.

Moderadamente selectivos: Agar Hektoen Entrico (HE), Agar Salmonella-Shigella (SSA), Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) Agar Hektoen Entrico (HE): Agar Salmonella-Shigella SS: Es un medio de aislamiento, selectivo para Salmonella y Shigella, por contener sales biliares que favorecen el desarrollo de estos grmenes Gramnegativos patgenos e inhiben el crecimiento de los grmenes Grampositivos. Es adems un medio diferencial porque contiene lactosa permitiendo la diferenciacin de grmenes fermentadores o no del carbohidrato; lo cual se determina por el viraje del indicador de pH, rojo neutro (amarillo, alcalino y rojo, cido). Las colonias de Salmonella y Shigella, grmenes no fermentadores de lactosa, son incoloras y translcidas; en cambio, aquellos grmenes fermentadores de lactosa (E.coli, Enterobacter) forman colonias de color rosado a rojo. Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD): Los compuestos principales son la L-lisina, el rojo fenol, el tiosulfato sdico, el citrato de hierro y azcares (lactosa, glucosa y xilosa). Sirve para aislar enterobacterias patgenas. Para hacer la lectura hay que seguir los siguientes criterios: La descarboxilacin de la lisina: colonias rojas caracterstico de Shigella, la Fermentacin de azcares: Colonias amarillas tipos de Escherichia, Citrobacter, Serratia, Proteus, Enterobacter y Klebsiella. La Produccin de SH2 (debido a tiosulfato sdico y citrato frrico): colonias negras tpico en Salmonella SH2 +, Arizona, Proteus y Edwardsiella. Altamente selectivos: Agar Sulfito de Bismuto (BSA), Agar Bilis Verde Brillante (BVBA), Agar Yersinia de Schiemann (Agar CIN - Cefsulodin-Irgasan-novobiocin). Agar Wilson Blair o Agar Sulfito de Bismuto: Es un medio muy selectivo para el aislamiento de Salmonella typhi y de algunas otras especies de este gnero. El Verde brillante y el bismuto inhiben considerablemente a los grmenes de acompaamiento. Las colonias de Salmonella H2S-positivas presentan ennegrecimiento debido al sulfuro de hierro. La reduccin de los iones bismuto a bismuto metlico produce brillo metlico alrededor de las correspondientes colonias. En este medio las colonias de Salmonella typhi se observan de color negro o gris oscuro con brillo metlico; otras especies del gnero Salmonella y Arizona pueden producir colonias negras o verde oscuro. Agar Bilis Verde Brillante (BVBA): Compuesta de bilis de buey, peptona, lactosa y verde brillante, sirve para el aislamiento e identificacin de coliformes en la leche y otros alimentos (la bilis y el verde inhiben el crecimiento de las gram + y alguna y la lactosa positiva produce gas). Agar Yersinia de Schiemann (Agar CIN - Cefsulodin-Irgasan-novobiocin): En el caso de sospechar de especies bacterianas del gnero Yersinia se pueden aislar en Agar Yersinia (Agar CIN), o en SSA, incubados a 25 C, previo el almacenamiento por 2 semanas en caldo para Yersinia a 4 C. Agar Skyrrow: Si se sospecha de Campylobacter, se aslan en el medio Campybap, o en el de Skyrrow, incubados a 40-42C en CO2 al 10% con reduccin en la tensin de O2. Agar tiosulfato-citrato-sacarosa con sales biliares (TCBS): Si se sospecha de Vibrio, estos se aslan en Agar tiosulfato-citrato-sacarosa con sales biliares (TCBS) previo enriquecimiento en agua de peptona alcalina (pH 8,5) con adicin de 1% de NaCl, pudiendo ser utilizada igualmente como medio de transporte. La muestra se inocular

en un volumen no inferior a 20 ml de agua de peptona alcalina con 1% de NaCl. Si la muestra requiere ser transportada o si el tiempo transcurrido entre su recogida y procesamiento es superior al establecido, se puede utilizar el medio de Cary-Blair porque la solucin de glicerol tamponado no es adecuada, debido a que el glicerol es txico para las especies del gnero Vibrio. AISLAMIENTO Comprende la siembra directa y la siembra previo enriquecimiento. La tcnica para la siembra directa es la siguiente: Se coloca una pequea gota de heces lquidas o en el caso de heces slidas, una suspensin de heces en suero fisiolgico, sobre la superficie de una placa de Agar SS, Agar MacConkey, Agar EMB de Levine; con asa de platino se extiende el material por agotamiento sobre toda la superficie del medio. Si la muestra de heces o de material tomado por hisopado rectal llega al laboratorio en medio de Cary-Blair o de Amies, se extrae el hisopo con una pinza y se pasa a un tubo con 1 cc de suero fisiolgico estril en el cual, por agitacin, se suspende el material. Con esta suspensin se realizan las siembras directas en los medios selectivos. La siembra del medio de enriquecimiento se efecta emulsionando 1 gr de heces (unos 2 ml de suspensin o el hisopo del tubo con medio de transporte), en el tubo de Caldo Tetrationato; y se lleva a la incubadora por 18-24 horas. Luego se siembra en placas con medios selectivos, incubndose por 18-24 horas a 35-37 C. IDENTIFICACION DE LAS CEPAS AISLADAS Las colonias sospechosas se identifican mediante el estudio de propiedades bioqumicas (identificacin bioqumica) (ver tablas N 6 y 7) y de constitucin antignica (identificacin serolgica) (Ver tabla N 8). Identificacin Bioqumica: Cada tipo de colonia sospechosa de ser un germen Gramnegativo patgeno se siembra en medios de diferenciacin como: 1.- Medio Kliger Permite apreciar las siguientes propiedades: a.- La fermentacin de la glucosa se reconoce por acidificacin del taco, que vira al amarillo (el indicador de pH es el rojo de Fenol que vira: amarillo en ambiente cido y rojo en ambiente alcalino) b.- La fermentacin de la lactosa se reconoce por acidificacin y viraje al amarillo del bisel. c.- La produccin de gas en la fermentacin de los carbohidratos; se observa por la formacin de burbujas de gas que rompen el medio, o si la produccin de gas es muy abundante, levantan el taco del fondo del tubo. d.- La produccin de hidrgeno sulfurado (H 2S) que se reconoce por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin del sulfuro de hierro, especialmente en el punto de unin del bisel con el taco. Cuando la cepa sembrada produce gran cantidad de H2S, se ennegrece todo el taco y parte del bisel, enmascarando un eventual viraje provocado por la fermentacin de la glucosa. El medio de Kliger se siembra por puncin en el taco y estras en el bisel y la lectura se efecta a las 18-24 horas de incubacin.

2.- Medio de Urea Indol 3.- Medio de manitol-motilidad 4.- Caldo MRVP 5.- Medio de citrato Existen mtodos rpidos para el diagnstico bacteriolgico, que realizan la identificacin bioqumica, tales como: API, ATB-PLUS, MICRO-ID y VITEK. Identificacin serolgica: Una vez aislada la cepa sospechosa de Salmonella, Shigella o E. coli e identificada mediante las pruebas bioqumicas preliminares, se procede a su identificacin serolgica para confirmar el diagnstico. En la identificacin serolgica, por lo general se utiliza la aglutinacin rpida sobre lmina. Para ellos, se toma una pequea porcin de la cepa sospechosa con el asa de platino, se coloca en una lmina porta-objeto y se diluye con una gota del antisuero conocida. En caso de ser la prueba positiva se produce una aglutinacin debido a que los anticuerpos especficos presentes en el antisuero se fijan a los antgenos de la superficie bacteriana y se produce la reaccin. Si la concentracin de bacterias es suficiente, se produce aglutinacin, formando agregados visibles.
Tabla N 5. Caractersticas de las colonias en medios selectivos y diferenciales de los microorganismos entricos pertenecientes a la Familia Enterobacteriaceae Microorganismo EMB Levine SSA MacConkey XLD Colonias grandes Poco crecimiento Colonias rojas Azul oscuro con Colonias grandes E. coli Colonias rojas o Rodeadas por brillo verde metlico, amarillas y grasas rosadas precipitado de bilis brillantes Colonias grandes, Enterobacter Ligero crecimiento, Colonias mucoides, Colonias mucoides, mucoides, azul Klebsiella colonias rosadas rosadas amarillas oscuras Colonias rojas y Colonias grandes, Colonias incoloras Proteus Colonias incoloras amarillas con centro incoloras con centro oscuro oscuro Colonias rojas y Colonias grandes, Colonias incoloras Salmonella Colonias incoloras amarillas con centro incoloras con centro oscuro oscuro Colonias grandes, Shigella Colonias incoloras Colonias incoloras Colonias Rojas incoloras

Tabla N 6. Caractersticas bioqumicas de los principales gneros de la Familia Enterobacteriaceae Escherichia Klebsiella Citrobacter Salmonella Proteus Yersinia Prueba Shigella Enterobacter H2S + Indol + VP + Citrato + + + ONPG + + Fenil Alanina + Ureasa + Lisina + -

Esquema N 1: Aislamiento de bacterias patgenas de la Familia Enterobacteriaceae a partir de una muestra de heces Suspensin fecal o hisopado rectal Agar MacConkey o Agar EMB de Levine Incubar 37C 24 horas Agar SS Incubar 37C 24 horas Caldo Tetrationato Incubar 37C 12-16 horas Agar Sultifo de Bismuto Subcultivar Tomar colonias para aislar: E. coli, Shigella y Salmonella Tomar colonias Shigella y Salmonella Tomar colonias Salmonella typhi u otras Salmonella Agar sulfito de Bismuto Incubar 37C 48 horas Tomar colonias para Salmonella Agar SS Incubar 37C 24 horas Tomar colonias para Salmonella Caldo Selenito o caldo Tetrationato

Tomar colonias para aislar: Yersinia enterocoltica

Tomado de: Manual for Laboratory Investigation of Acute Enteric Infections. CDC.

Tabla N 7: Pruebas Bioqumicas claves para el reconocimiento de Salmonella. GRUPO BACTERIANO PRUEBAS BIOQUIMICAS CLAVES ENTEROBACTERIAS Utilizan glucosa Reducen nitratos a nitritos Oxidasa negativos GNERO Salmonella Mviles Producen H2S Lactosa negativos Ureasa negativos Indol negativos

Tabla N 8: Estructuras y antgenos relacionados con el reconocimiento de tipos especficos de Salmonella. Antgeno Estructura asociada Clasificacin Tipos especficos Somtico (O) LPS En serogrupos A, B, C, D, E, etc Varios, determina Flagelar (H) Flagelo En serotipos nombre especifico Cpsula (slo en Capsular Vi Asociado a serotipo Typhi o Dublin algunas Salmonellas)

ACTIVIDADES PRCTICAS 1.- Mencione la importancia del coprocultivo en el diagnstico de las diarreas

2.- Asista a la demostracin de la tcnica a seguir en la toma de una muestra para coprocultivo 3.- Enumere los pasos a seguir en el procesamiento de un coprocultivo

4.- Observe y dibuje los diferentes tipos de colonias en los medios de aislamiento: Salmonella-Shigella agar, Agar MacConkey, Agar EMB de Levine y Agar XLD.

5.- Pruebas de Identificacin 5.1.- Dibuje e interprete los resultados obtenidos en una prueba de Kliger

BIBLIOGRAFA Brooks GF, Butel JN, Ornston NL, Jawetz E. Melnick J. Adelberg E. 1992. Microbiologa Mdica. Ed. El Manual Moderno. S.A. de C.V. Mxico D.F. Murray, P, Kobayashi, G. Pfaller, M. and Rosenthal, K. 1997. Microbiologa Mdica. Segunda edicin. Harcourt Brace de Espaa, S.A. Madrid, Espaa. Prescott LM, Harley JP, Klein DA. 1996. Microbiology. 3 edition, WCB Publishers. Tortora GJ, Funke RB, Case CL. 1993. Introduccin a la Microbiologa 3era Ed. Acribia, S.A. Espaa.