DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE CAFENA EN LA COCA COLA UTILIZANDO HPLC

RESUMEN Se analiz la concentracin de cafena en la coca cola usando HPLC (Cromatografa de alta eficiencia), teniendo como referente diversas concentraciones de cafena: 5ppm, 10ppm, 20ppm y 30ppm. Despus se determin el rea y por ltimo se grafic los resultados y se determin la concentracin de cafena en el analito de inters; en nuestro caso, la coca cola.

INTRODUCCIN

HPLC es un tipo de cromatografa en columna utilizada en bioqumica y qumica analtica. Comnmente llamada cromatografa lquida de alta eficiencia, en este mtodo el compuesto que se est analizando (analito) pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de la columna. El analito es introducido en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan dependiendo de las interacciones con la fase estacionaria a medida que se adelanta por la columna.

PARTES DEL CROMATFORO HPLC

Analito: Es el compuesto, elemento o in de inters analtico en la muestra; es decir, las especies qumicas cuya presencia o concentracin se desea conocer. El analito

puede ser identificado y cuantificado, se puede determinar la cantidad y la concentracin del mismo. Fase estacionaria: En el mtodo HPLC normalmente la fase estacionaria hace referencia a un cilindro con pequeas partculas redondeadas slidas o un lquido fijado en un slido que presenta determinadas caractersticas qumicas en su superficie. Fase mvil: Consiste en un fluido(gas, lquido) que arrastra a la muestra a travs de la fase estacionaria. En HPLC, la fase mvil es un disolvente no polar como el hexano (fase normal). sta fase se mueve a travs de la columna de cromatografa (fase estacionaria) de foma que la muestra interacciona con la fase estacionaria y se separa. Tiempo de retencin: Es el tiempo caracterstico que tarda un analito particular en pasar a travs del sistema, desde la columna de entrada hasta el detector bajo condiciones fijadas. Curva de calibracin: Es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin con una seria de elementos de concentracin conocida. Se basa en la existencia de una relacin que en principio es lineal, entre un carcter medible como la absorbancia, y otro variable como la concentracin. Para ello, es necesario efectuar diluciones de soluciones conocidas y as poder hacer una relacin entre la conocida y la desconocida.

CROMATOGRAFA DE FASE NORMAL La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin. La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estricos de forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicas tienden a aumentar el tiempo de retencin.

CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de

naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente. El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicas. La cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contra iones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin cromatogrfica.

PARMETROS NECESARIOS EN LA CONFIGURACIN DEL EQUIPO DE HPLC Es necesario a menudo invertir la columna y enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del detector, para evitar que se obstruya la columna de HPLC o que queden partculas depositadas all. Configurar la presin para evitar que se d perdida de resolucin. Revisar la bomba antes de hacer el anlisis para evitar que queden gases atrapados all y hallan variaciones no deseadas en el tiempo de retencin. Es importante desgasificar adecuadamente las fases mviles para reducir la concentracin de oxgeno disuelto y de esta forma evitar picos falsos. Es necesario seleccionar adecuadamente el buffer que se va a utilizar, puesto que el pH juega un papel fundamental en el mtodo de HPLC ya que puede aumentar la hidrofobicidad de algunos compuestos. Tambin es fundamental, seleccionar la columna con la que se desea trabajar, dependiendo de los aminocidos y el tipo de polaridad de los mismos.

RESULTADOS

ANLISIS DE RESULTADOS

CUANTIFICACIN DE CAFENA EN LA COCA-COLA TABLA REA VS CONCENTRACIN DE CAFENA Cafena 5ppm 10ppm 20ppm 30ppm rea 208,30582 388,05811 709,20807 1102,74144

GRAFICA REA VS CONCENTRACIN DE CAFENA

Cuantificacin de afena en Coca-Cola

1200 1000 rea (mAU*S) 800 600 400 200 0 5ppm 10ppm 20ppm 30ppm rea Linear (rea) y = 250.77x R = 0.9428

Calculo de cafena en Coca-Cola Y=250,77X 662,55481ppm/ 250,77ppm = X 2,6420ppm=X

CONCLUSIONES

Como se evidencia, la tcnica de HPLC es una gran herramienta en el anlisis de diversos analitos tales como: hidrocarburos, molculas atmosfricas, componentes alimenticios, sustancias esteroideas; al igual que todo tipo de molcula biolgica. Se logr observar la importancia de la columna que se va a utilizar y del tipo de cromatografa que se debe utilizar, como se vio vara dependiendo del analito que se desea determinar; en ste caso, la coca cola. La concentracin de cafena en la coca cola fue de 2.6420 ppm (partes por milln), que equivale en porcentaje a 0.026420mg/litro x 100: 0.2642% de la muestra total.