BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos de centrifugación
CENTRIFUGACION: aplicación de una fuerza superior a la de la
gravedad (g = 981 cm/seg2).

CENTRIFUGACION ANALITICA: uso principal en el estudio de

propiedades fisico-químicas de macromoléculas y complejos
supramoleculares.

CENTRIFUGACION PREPARATIVA: uso en separación de

estructuras subcelulares, vescículas de membranas, precipitados
proteicos, etc.
 TIPOS DE CENTRIFUGA

Características comunes:
Un motor que hace girar un rotor donde se colocan los tubos
que contienen las muestras a centrifugar.

Diferencias:
Velocidad que puede alcanzar la centrífuga
Presencia o ausencia de refrigeración
Presencia o ausencia de vacío
Volumen máximo de muestra

Tipos más usados en el laboratorio:

Microfugas; utilizan tubos Eppendorf (hasta 10 000 x g)
Centrífugas refrigeradas; volúmenes mayores (hasta
100 000 g)
Ultracentrífugas preparativas (hasta 600 000 x g)
Tipos de rotores utilizados en
centrifugación:

d) Rotor de ángulo fijo

f) Rotor de tubo vertical (menos

usado).

c) Rotor “swinging bucket” (vasos

basculantes).
Como calcular la velocidad de sedimentación:

G = ω2 x r ω = 2π x (rev. x min-1)/60

G: campo centrífugo aplicado (aceleración; cm/seg2)

ω : velocidad angular (en radianes/seg)
r: distancia de la partícula al eje de rotación (cm)

G = 4 π2 (rev. x min –1)2 x r/ 3600

Fuerza centrífuga aplicada:

F = m x G = m x ω2 x r
(m = masa de la partícula)
 EL CAMPO CENTRIFUGO

Se expresa generalmente en en múltiplos del campo gravitacional

g (981 cm/seg2).

El campo centrífugo relativo (CCR) es la razón entre la aceleración

centrífuga a un radio y velocidad especificados, y la aceleración de
gravedad:

CCR = 4 π2 x (rpm)2 r/ 3600 x 981

Las unidades del CCR se expresan en “x G” y las “revoluciones por

minuto” se abrevian como rpm.

Habitualmente estos cálculos se hacen con un nomograma.

 VELOCIDAD DE SEDIMENTACION DE UNA ESFERA
La velocidad de sedimentación depende no sólo del campo centrífugo
aplicado sino también de la densidad y radio de la partícula y de la
viscosidad del medio. La relación entre estas variables está definida
por la ley de Stokes para una partícula esférica rígida:

donde: υ es la velocidad de sedimentación de la esfera

2/9 es una constante para la forma esférica
r el radio de la partícula
ρp la densidad de la partícula
ρm la densidad del medio
g el campo gravitacional
η la viscosidad del medio
Así, dos partículas esféricas pueden separarse en función de su densidad
y/o su tamaño
 EL COEFICIENTE DE SEDIMENTACION

La velocidad de sedimentación de una partícula puede también

expresarse como su “coeficiente de sedimentación” s:

Estos valores se expresan habitualmente como unidades Svedberg.

Una unidad Svedberg equivale a 10-13 segundos.

Coeficiente de sedimentación y peso molecular de una serie de proteínas

Protein S value (Svedberg units) Molecular weight

Pancreatic trypsin inhibitor 1 6,520

Cytochrome c 1.83 12,310

Ribonuclease A 1.78 13,690

Myoglobin 1.97 17,800

Trypsin 2.5 23,200

Carbonic anhydrase 3.23 28,800

Concanavlin A 3.8 51,260

Malate dehydrogenase 5.76 74,900

Lactate dehydrogenase 7.54 146,200

DATOS NECESARIOS PARA DEFINIR UNA CENTRIFUGACION

- Velocidad del rotor

- Distancia radial
- Duración de la centrifugación

La velocidad de sedimentación de una partícula depende, además

de la masa de la partícula, de la densidad y viscosidad del medio y el
grado de desviación de la partícula de una forma esférica.

Las partículas generan fricción, la que se opone a su movimiento, la

que depende del tamaño, forma e hidratación de la partícula y de la
viscosidad del medio.
 Al centrifugar una partícula, pronto se llega a un equilibrio entre la
fuerza centrífuga y la fuerza de fricción, con lo que la partícula avanza
a una velocidad constante.

Lo que define la separación de dos partículas diferentes es su

diferencia de tamaño y de densidad. Estos son la base de la separación
de macromoléculas biológicas o de organelos subcelulares. También
influye la forma de las partículas. Todo esto puede expresarse
matemáticamente.

La situación es aún más compleja, pues como la fuerza centrífuga

depende de la distancia de la partícula al centro de rotación, a medida
que avanza el proceso de centrifugación, la fuerza (y velocidad) se
van haciendo mayores.
 APLICACIONES DE LAS CENTRIFUGAS PREPARATIVAS
- Centrifugación diferencial. Utilizada en fraccionamiento celular y
subcelular. Se basa en la diferencia de velocidad de sedimentación de
partículas biológicas de diferente tamaño, forma y densidad. Se somete
un homogeneizado a centrifugaciones repetidas aumentando cada vez
la fuerza centrífuga. Se logra así obtener las siguientes fracciones:
Núcleos
Mitocondrias
Lisosomas
Microsomas
Fracción soluble

- Centrifugación en gradiente de densidad. Permite separar partículas

de similar tamaño pero distinta densidad. Puede usarse sedimentación de
velocidad o de equilibrio. En el primer caso se utiliza un gradiente de
sacarosa (separación de componentes en preparaciones de membrana).
En el segundo, cloruro de cesio (purificación de DNA).
Densidad y coeficiente de sedimentación de diversos componentes
celulares.
 CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

CENTRIFUGACION EN GRADIENTE DE DENSIDAD

 CENTRIFUGACION ISOPICNICA
Y DENSIDAD DE FLOTACION
DEL DNA

Utilizado para la purificación de DNA,

basado en la diferencia de densidad entre
DNA, RNA y proteínas. También es
útil para separar DNA de hebra simple
del de hebra doble.
Se genera un gradiente de CsCl y el DNA
se equilibra en el tubo según su densidad
de flotación.
 Esquema del fraccionamiento
de un homogeneizado de
músculo esquelético.

Primero se utiliza centrifugación

diferencial, seguido de
1000 g
centrifugación en gradiente
de densidad de sacarosa.