Terim Kapakin

YY Vet Fak Derg, 2006, 17 (1-2):55-58

Scanning- Elektron Mikroskobu

Kbra Asena TERM KAPAKN* Atatrk niversitesi Veteriner Fakltesi Patoloji Anabilim Dal -ERZURUM
Geli ve kabul tarihi: 05.06.2006-04.08.2006, * Sorumlu aratrmac, 312 3170315/242, kbraterim@yahoo.com

ZET Elektron mikroskobu (EM) grnt oluturmak iin ktan daha ok elektronlar kullanan bir mikroskoptur. EM byk bir alan derinliine sahiptir, yksek bytme yapar. Grntnn kalitesi, netlii ve detay zenginlii rezolsyona baldr ki EMda rezolsyon gc 2-20 angsrtromdur. Scanning- Elektron Microskobu (SEM) biyoloji, tp, madde bilimleri ve yer yz bilimlerinden elde edilen rnekleri 100.000 kez byterek yzey yaplarn grntleyerek yzeyde meydana gelen farkllklar deerlendirir. boyutlu hayali bir grnt oluturur. Anahtar Kelimeler: Scaning elektron mikroskobu, fiksasyon, kaplama. Scanning-Electron Microscopy SUMMARY The electron microscope (EM) is a scientific instrument that utilizes a beam of electrons, rather than light, to image a specimen. Electron microscopes (EM) have a large depth of field and provide a high level of magnification. The quality, clarity and opulence of details of the image are dependent on resolution, and the resolution achieved by electron microscopes ranges between 220 angstroms. Scanning electron microscopy (SEM) magnifies specimens pertaining to biology, medicine, matter sciences and earth sciences, 100 000 times, and enables evaluation of differences in the surface by means of imaging surface structures. SEM reconstructs a visionary three-dimensional image. Keywords: Scanning electron microscopy, fixation, cower.

GR Elektron mikroskobu (EM) grnt oluturmak iin ktan daha ok elektronlar kullanan bir mikroskoptur. EM k mikroskobuyla (IM) karlatrldnda bir ok avantajnn olduu grlr. EMda IMnun aksine aydnlatma kayna olarak k yerine vakum iinde hzlandrlm elektron demeti kullanlr. IMda genelikle boyanm preparatlar n, rnein iinden gemesi yolu ile incelenerek, tp, bilim ve mhendislik gibi birok alanda kullanlr. Ancak atom gibi ok kk cisimcikleri grmemiz iin gerekli olan yksek bytmeleri veremezler. EM ise; yksek bytme yapar. Byk bir alan derinliine sahiptir, yani yksek rezolsyonlu grntler oluturur. Grntnn kalitesi, netlii ve detay zenginlii rezolsyona baldr ki IMnun rezolsyon gc 0,5-l mikron iken EMda bu oran 2-20 angsrtromdur (1,3,9,16). lk EMu Knoll ve Ruska tarafndan Almanyada gelitirilmitir (3,12,14). EMnun, Transmission Electron Microscopy (TEM) ve Scanning Electron Microscopy (SEM) olmak zere iki temel tipi vardr. Daha az kullanm alanna sahip Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM)da nc tipi olarak bilinmektedir (3,9,17). SEM: Biyolojik botanik, hcre biyolojisi, tp (Adli Tp, anatomi, mikrobiyoloji, biyokimya, fizyoloji, toksikoloji, patoloji), madde bilimleri ve yer yz bilimlerinden elde edilen rnekleri 100.000 kez byterek yzey yaplarn grntleyerek yzeyde meydana gelen farkllklar deerlendirilir (1,3,8,10,16). boyutlu hayali bir grnt oluturur. Her geen gn gelitirilen zellikleri ile SEM, IMundan 300 defa daha fokus 55

derinliine ve 20 ile 100.000 arasnda net grme oranna sahiptir (3,8,10). TEM: Biyoloji, tp, madde bilimleri ve yer yz bilimlerinden elde edilen rnekleri 600.000 kez byterek i yaplarn grntler (1,3,15). STEM: Hem TEM hem de SEMin zelliklerine sahiptir. rnekte atomik elementlerin yaylm ve varln saptamada ve elektron demetlerinin ince rnekleri delerek taranmasnda kullanlr. Bu yzden balca kullanm alan analizlerdir (3,17). SEMin Kullanm Alanlar Medikal kullanm: Salkl, salksz kan ve doku rneklerini veya hastala sebep olan etkenleri belirlemede, ila verilen hastalarla verilmeyenler arasndaki farklar gzleyerek ilacn hasta zerindeki etkilerini belirlemede kullanlabilir. Adli Tp: Metal paralar, boya ve mrekkep gibi maddeleri karlatrmada ya da sa veya iplik gibi maddeleri inceleyerek polis laboratuarlarnda delilleri incelemede kullanlabilir. Metaller: Souk ve scak gibi farkl koullar altnda metallerin dayanklln belirlemede, gvenlik nedeniyle gl bir metal kullanm gerektiren uak, tren, gemi ve otomobil gibi aralarn yapmnda kullanlan metallerin dayanklln belirlemede kullanlr. Bilimsel Aratrmalar: Biyologlar bitki ve hayvan dokularna bakmak, kimyagerler mikroskobik kristalleri incelemek, metallerin, plastiklerin ve seramiklerin yapsn incelemek gibi bilimsel aratrmalarda SEMin kullanlabilecei pek ok farkl alan vardr (9).

YY Vet Fak Derg, 2006, 17 (1-2):55-58 EM. in rnek Alma lk adm kullanacamz rnekleri uygun bir ekilde almak ve onlar hazrlamaktr. Bunlar bitki, insan veya hayvanlardan alnan rnekler, olabilecei gibi bakteri, virus gibi hcre elemanlar ve ok eitli yzeyler olabilir. rnek boyutlar fiksasyon iin uygun (5x5 mm) boyda olmaldr (1,3,6,16). EMde Fiksatifler ve Fiksasyon Fiksasyon EM iin biyolojik rneklerin hazrlanmasndaki ilk basamaktr. Amac alnan rnei canl organizmayla karlatrldnda mmkn olduunca en az farkllk oluturacak ekilde hazrlamak ve rnekten bloklar oluturmaktr. Dehidrasyon, gmme ve elektron demetine maruz kalmada bile ultrastrktrel ilikilerin korunduu ekle getirip sabitlemeyi amalamaktadr (1,2,3,4,5,16), (Tablo 1). EM Fiksatiflerinin Gelitirilmesi: IM iin kullanlan fiksatiflerinin ou EM iin yetersizdir. lk EM almalarnda fiksasyon iin IMda kullanlan formaldehit denenmi fakat yeterli sonu alnamaynca 1950lerde osmik asit kullanlmaya balanlmtr. Osmium tetra oksit (OsO4) EMda fiksatiflerin temelini oluturur. OsO4le lipitler ve karbonhidratlar ok iyi bir ekilde tespit edilirken, proteinlerin ounluu tespit edilmez ya da paralanr. Bu yzden de enzim aratrmalarnda primer fiksasyon iin kullanlamaz. Kesiti alnan rneklerin boya maddelerine kar affinitesini artrr. Dokulara ok yava ilediinden rnekler ok kk olmaldr. OsO4 ve sonrasnda potasyum permanganat hem zarlar hem de bitkiler iin alternatif fiksatiflerdir (1,3,5,10,13). 1963de Sabatini, Benshch, Barnett (15) primer fiksatif olarak aldehit kullanmn zellikle de gluteraldehiti, sekonder fiksatif olarak da OsO4 kullanmn nermilerdir. Gnmzde en ok kullanlan ve en ok tercih edilen bir fiksatif gluteraldehit olup bunun balca sebebi ise gluteraldehitin karbonhitratlar, proteinler ve enzimlerin ounu fikse edebilmesinden kaynaklanmaktadr. Ayrca fiksasyondan sonra rnekler tamponlarda bzmeden uzun bir sre muhafaza edilebilir. Gluteraldehitin bunlarn yannda lipitleri iyi fikse edememesi ve bunlarla tespit edilmi rneklerin boyalar yeterince alamamas gibi dezavantajlara sahiptir. Bu yzden aldehitle fiksasyondan sonra OsO4le postfiksasyon zorunluluu vardr (1,3,5,13,16). Tersiyer fiksatif olarak uranil asetat kullanlabilir ki zellikle lipitler iin iyi bir fiksatiftir (5). Tampon zeltiler: EMda sklkla Fosfat, Cacodylate, Veronal acetate, Collidine tamponlar kullanlr (1,3,5,6,16). Fosfat tamponlar hari dierlerinin insanlar ve EM cihaz zerine yan etkileri vardr. Fosfat tamponlar EMda kullanlan en fizyolojik tampondur. Ekstraselller svlar taklit ederler ve hcre kltrlerine toksik deildir. Perfzyon fiksasyonu, OsO4 gibi yava penetre ve reaktive olan fiksatifler iin mkemmel tampondurlar. Tek dezavantajlar dier tamponlara nazaran fiksasyon srasnda presipitat oluturmalar ve yavata olsa mikroorganizmalarla kontamine olmasdr. Gnmzde en ok monobazik56

Terim Kapakin dibazik sodyum fosfat karm olan Srensen tamponu kullanlmaktadr (3,5,8,16). Tamponlarn pHs: EM fiksatifleri tamponlarla ntral pHda tutulmaya allr (3,5). ou fiksatifler pH 6,5-8 arasndadr. Albumin iin pH 7 veya daha az, nkleer materyal ve akromatik demetler iin ise pH 6 civarlarnda olmaldr (2,3,5,8,16). Osmolarite: Hipertonik ortam veya fiksatifler hipotoniklerden daha az zararldr. Fiksatifin osmolaritesi tampon konsantrasyonu deitirilerek ayarlanabilirken, glukozskroz ve Na-kolloid de eklenebilir. Glukoz ve skroz albminin iyi fiksasyonuna izin vermeyecei iin primer OsO4 fiksatifleriyle kullanlmamaldr. Sekonder OsO4 ve gluteraldehit fiksatiflerle uyumludurlar. Sodyum klorid tampona pH tam oluturmadan eklenmelidir. Aksi taktirde pH deiiklie urar. Gluteraldehit ve formaldehit osmolarite de inaktiftirler (3,5,8,16). Primer Fiksasyon: Fiksasyon zamana, sya, rnein boyutuna ve fiksatifin yapsna baldr. Veronal acetate ve collidine tamponlar primer fiksasyonda daha stndrler. zole hcreler birka dakikada, tm dokular saatler ierisinde fikse olurlar. zelliklede s ok dkse OsO4le primer fiksasyon iin 0 oCde 2 saat uygundur. Aldehitler iinde buna yakn bir sre gereklidir. Aldehitlerle fiksasyonda lipitlerin ykmna yol aacandan bu sre uzatlmamaldr (1,3,5,16). AldehitOsO4le fiksasyonda ise s deiiklii 0-25 oCde ok az yapsal deiiklik oluur. Ancak mikrotbller dk sda korunamazlar. Yksek sda mitokondriler de bzme ve sitoplazmada granlarite oluur. Isnn 0-4 oC snrlandrlmas aktiviteyi de snrlar. OsO4, gluteraldehit ve potasyum permanganatla ok ksa balang fiksasyonundan sonra oda ssnda ana fiksasyon nerilir (1,2,3,5,6,13,16). Ykama: Birden fazla fiksatif kullanlacaksa ilk maddenin fiksasyona katlmayan ksm ykanr. Ykama zellikle aldehit sonras OsO4 kullanlacaksa nem tamaktadr. nk her iki madde de birbirleriyle etkilemektedir. Bunlarn yansra ok sayda rnek iin ykamadan kanlmaldr. rnein: sinaptik vezikller, skrozlu cacodylat tamponda 30 dakika bekletilirse dzlemeye balarlar (1,4,3,5). Ykama nedeniyle oluan artefaktlar gluteraldehit-OsO4 kombine olarak kullanldnda nlenebilir. Genellikle 4 oCde, pH 7,4de 2 saat ierisinde 3 kez ykama solsyonu deiimi uygulanr (1,3,5,6,8,13,15). Gluteraldehit ile fikse edilen rnekler, fiksasyon sonras gece boyunca ykama solsyonunda braklabilirken formaldehitle fikse edilen rnekler braklamaz nk formaldehit dokularda reversible reaksiyona girer. Ykama fiksasyonla ayn sda yaplmaldr. Ykama solsyonunun osmolaritesi fiksatifinkinden farkl olmaldr. nk fiksasyonda zarn osmotik yaps genellikle deiir (3,5). Sekonder Fiksasyon: Sre ve s primer fiksasyondan daha az nemlidir. En ok %1lik OsO4le fikse edilirler ve primer fiksasyonda kullanlanla ayn tampon zelti 4 oCde veya oda ssnda bir saat sreyle uygulanr (1,3,5,13,16).

Terim Kapakin Organ ve Dokularn Fiksasyonu: 1) mmersiyon fiksasyonu: Deri gibi kan akmnn kesilmesine dayana bilecek dokular in vitro olarak immersiyon yntemiyle fikse edilebilirler. Alnacak dokunun bykl fiksatife ve doku younluuna gre deiir. Primer fiksasyon iin en fazla 0,5 mmlik kplere kesilir. Aldehit fiksasyonunda ise rnekler biraz daha byk olabilir. 2) n vivo fiksasyon: Denek anestezi altndayken doku ortaya kartlr. Fiksatif dokunun iine ya da stne damlatlr. Damlatma teknii, yeterince penetrasyon olmadndan yalnzca yzeysel tabakalar incelendiinde etkilidir. Fiksatif 10-20 dakika sreyle srekli olarak damlatlr ve fazlas emdirilir. Burada temel olarak veronal asetat tamponlu OsO4 % 1-2 konsantrasyonda kullanlr. Sonrasnda primer fiksasyon immersiyon yntemindeki gibi devam ettirilir. Oda ssnda ya da souk ortamda 1-4 saat srdrlr. Bu tekniin dezavantaj anestezik maddenin doku hasar oluturma olasldr (3,5,6,16). 3) Perfzyon fiksasyonu: a) Anestezi tipi: Rat, fare, hamster gibi kk deneklerde eter veya halotan kullanlr. Daha byklerde Tablo 1: SEM de yaygn olarak kullanlan fiksatifler*
rnekler Prokaryotlar

YY Vet Fak Derg, 2006, 17 (1-2):55-58 ise nembutal, kloral hidrat, urethan intraperitoneal ya da intra venz kullanlr. b) Perfzyon svs vermek: Bu yntem denek bykl, doku ve uygulaycnn yeteneine baldr. r: kk hayvanlarda en uygun yntem aortadan perfzyon svsnn verilmesidir (3,5). Perfzyon svs ve fiksatifler: Perfzyon svsnn optimum scakl hakknda genel bir fikir birlii yoktur. Ayrca fiksatif uygulamadan nce tuz ile ykanp ykanmamas konusunda da bir fikir birlii yoktur (3). Balang deneyleri iin oda scaklnda fiksatif yararldr. Toksisite azl veya yokluu, kolloid ozmotik basnta nemlidir. Tuz kullanlacaksa fiksatif uygulama yolundaki hazne tamamen tuz ile doldurulmaldr. Byk deney hayvanlarnda ayr hazne olmal ve bunlar 3 yollu vanayla balantl olmaldr. Bu haznelerinde fiksatif dierinde ise tuz olmaldr (3,5,6). Fiksatifin ss arttka fiksasyon daha hzl ve etkilidir. Enzim histokimyas iin fiksatif oda ssnda olmal, labil enzimler iin 0 oCda bir s gereklidir. Vcut ssnn altndaki deerlerde perfzyon svlar vazokontrksiyona yol ap perfzyon etkinliini bozabilir (3,5,16).

Fiksatifler Gluteraldehit OsO4 FAA (%10 formalin,% 85 ethanol, %5 glacial acetic acid) OsO4 takiben Gluteraldehit / OsO4 buhar OsO4 Sv Uranyl acetate takiben gluteraldehit gluteraldehit / formoldehit,OsO4 takiben gluteraldehit OsO4 takiben gluteraldehit FAA (%10 formalin,% 85 ethanol, %5 glacial acetic acid) Dondurularak kurutmay takiben formoldehit Buhar, Osmium Gluteraldehit ya da OsO4 takiben gluteraldehit / formoldehit

Tampon solsyonu cacodylate, phosphate veronal-acetate Kullanlmaz cacodylate,phosphate kullanlmaz cacodylate cacodylate, phosphate, deniz ya da gl suyu phosphate phosphate kullanlmaz kullanlmaz cacodylate ya da phosphate cacodylate ya da phosphate eitlidir kullanlmaz

Mantarlar

Suda yaayan organizmalar (protozoa, mantarlar gibi)

Bitkiler

Hayvanlar

OsO4 gluteraldehit / formoldehit FAA (%10 formalin,% 85 ethanol, %5 glacial acetic acid)

* Bozzola JJ, Russell LD den alnmtr. Dehidrasyon Dehidrasyonun asl etkisi rneklerden lipitlerin karlmasdr. Bu oran %95i bulur. Proteinlerin ise % 4 karlr. Bu oranlar fazla olursa dokularn hcre ve hcre ii yaplar bzr (3,5). Dehidrasyonda kullanlan ajanlar: Aseton, etanol, etilen glikol, polietilen glikol ve propilen oksidtir. 57 Bunlar ierisinde en fazla tercih edilen etanol ve asetondur. Aseton, beyin dokusunun dehidrasyonunda hcreyi daha iyi koruduu iin etanole gre daha ok tercih edilir. Gmme materyallerinden polyester resin etanolde znmedii iin aseton iinde dehidrate edilir. Epoksi resinler, etanol ve asetona gre propilen oksidde daha kolay znebildiinden dehidrasyonunda en ok

YY Vet Fak Derg, 2006, 17 (1-2):55-58 propilen oksid kullanlr (3,5,6,8,16). Dehidrasyon ncesi rnekler OsO4 ile fikse edilirse, kullanlmas gereken ajan yerine yanl ajan kullanlmas, dehidrasyon ilemi dk sda ve yksek hzda yaplrsa dokulardan lipidlerin uzaklatrlmas azalr (2,3,5,16). Standart Dehidrasyon lemi: Dehidrasyonda kullanlacak zeltinin miktar numune hacminin 10 kat olacak ekilde kullanlr. Dehidrasyon oda ssnda yaplmaldr. ayet dehidrasyon soukta balamsa s oda ssna ykseltilir (1,3,5,16). SEMde Dehidrasyon izelgesi: - % 25lik, -% 50lik, -% 75lik, 2x % 96lik, 2x-% 100lk aseton veya etanol iinde 15-20 dk. (1,3,5,6,8,10,16). SEMde Kurutma 1) Havada kurutma (Air drying): Havada kurutulmaya braklan canl rneklerin (yumuak dokularda) yzeyinde slaklktan kaynaklanan bir su tabakas mevcuttur. Bu su tabakas ile hava arasnda yksek gerilim kuvvetlerine sahip bir ara yz oluur. Havada kurutma nedeni ile su tabakasnda buharlama yolu ile uzaklatrlan molekller su- hava ara yzndeki yksek yzey gerilim kuvvetlerine kar koyamaz. Bu durum incelenen canl rneklerin yzeyindeki hassas yaplarn zarar grmesiyle sonulanan bzmelere neden olur. Bu nedenle havada kurutma sert dokularn kurutulmasnda (r: kemik,di) tercih edilir (3,16). 2) Kritik noktada kurutma (Critical point drying): Dokudaki aseton,etanol veya amil asetat ile sv CO2in yer deitirmesi esasna dayanr. Sv CO2 kritik noktada, belirli basn ve scaklkta gaz haline geerken rnek deforme olmadan kurumu olur (3,8,10,16). Kritik Noktada Kurutma Basamaklar rnekler saf aseton ieren bir havuzun ierisine bir sepet yardmyla yerletirilerek cihazn vanalar kapatlr ve ierisine sv CO2in dolmas salanr.10 dk.sonra hava vanas alr. Tekrar sv CO2 almaya balanr (bu ilem 3 defa tekrarlanr). 3-10 dk. sonunda scak su vanas alr. Scaklk 35 0C olduunda su vanas kapatlarak, tm vanalar alr ve basn drlerek rnek alnr (3,16) . SEMde Kaplama Yzeyin grntlenmesi iin elektronlar yanstacak bir madde ile kaplanmas gereklidir. Bu madde gold paladiumdur. Kaplamann kalnl rnee gre ayarlanr ki genellikle 100 Angstrmdur. Kaplamada kullanlan materyalin yzeyinde kme eklinde toplanmamasna dikkat edilmelidir (3,8,10,16). Altn Kaplama Basamaklar rnekler metal stab zerine iki tarafl yapkan bant ile yaptrlr. Gerekirse rnek evresine gm boyas srlrek kaplama cihazna yerletirilir. Yzeyin parlamasn nlemek iin argon gazyla havann yer deitirmesi salanr. Plazma fazna geen gold paladium sayesinde kaplama gerekleir. Kaplanan rnekler desikatrde saklanmaldr (3,10,16). KAYNAKLAR

Terim Kapakin

1. Benjamin FT, Raymond T J (1978): Diagnostic Electron Mcroscopy, Volum l. John Wiley and Sons, nc. New York. 2. Bharatan S, Desroches KS (1997): Transmission Electron Microscopy Charasterization of Lattice Damage, Eriim:http://www.info.newcastle.edu.au Eriim Tarihi:12.05.2002. 3.. Bozzola JJ, Russell LD (1998): Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologist, 2 th Edition. Jones and Bartlett Publishing, nc. London.. 4.Ghadially FN (1982): Ultrastructural Pathology of the Cell and Matrix, 2 th. Edition. London.. 5. Glauert AM (1975): Fixation, Dehydraton and Embedding of Bologcal Specmens, Amercan Elsever Publshng Co., nc. New York. 6. Glauert AM (1998): Lewis PR Biological Specimen Preparation for Transmission Electron Microscopy. Eriim:editorial @ portlandpress.com Eriim Tarihi: 03.05.2002 7. Glauert AM (1956): Rogers G E: A new embeding medium for electron microscopy. Nature, October: 803 8. Hayat M A (1978): Principles and Techniques of Scanning Electron Microscopy, Volum 6. Litton Educational Publishing, nc. New York. 9. Iowa State Universtiy (1999): What is the EM?.Eriim:http://www.mse.iastate.edu/microscopy/uses. html, Eriim Tarihi:12.04.2002 10. Joel LTD (1999): Questions and Answers on Snanning Electron Microscope. Eriim: http:// www.jeol.com./external.html, Eriim Tarihi:26.03.2002. 11. Lewis PR, Knight DP (1992): Cytochemical staining methods for electron microscopy. 12. Marton L (1968): Early history of the electron microscope. San Francisco Press, nc. pp: 1:1-8. San Francisco. 13. Palada GE (1952): A study of fxaton for electron mcroscopy. J. Exptl. Med.95:285-298. 14. Peven DR, Gruhn JD (1985) : The Development of Electron Microscopy. Arch. Pathol Lab. Med, July: 683-691. 15. Sabatini DD, Bensch K, Barrnett RJ (1963): Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular structure and enzymic activity by aldehyde fixation. J Microsc. 92:69. Alnmtr. Glauert AM (1975): Fixation, Dehydraton and Embedding of Bologcal Specmens. Amercan Elsever Publshng Co., nc.. New York. 16. Wagner, R.J (2000): Techniques in Biological Electron Microscope,.Erisim: 28499 @ udel. Edu., Eriim Tarihi:22.04.2002 17. Wall JS: Scanning Transmission Electron Microscop, Eriim:Wall @ bnl.gov., Eriim Tarihi:26.03.2002.

58