La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones qumicas y biolgicas.

La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin.

Todas las sustancias pueden absorber energa radiante. El vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible. El agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo.

Las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez, la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de luz blanca que incide sobre ellas y dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

El

Es una forma de Energa radiante que se propaga en forma de ondas.

Longitud de onda (l): es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en nanmetros (nm).

 Frecuencia

(n): es el nmero de ciclos por segundo. inversa a la longitud de onda. Su frmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o hertzios.

Es

Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de la longitud de onda.

 Espectro

Electromagntico: Se denomina espectro electromagntico o simplemente espectro a la radiacin electromagntica que emite (espectro de emisin) o absorbe (espectro de absorcin) una sustancia. Cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Regin Ultravioleta: l = 10-380 nm Regin Visible: l = 380-780 nm Regin Infrarroja: l = 780-30.000 nm

La absorcin de energa luminosa hace que la molcula pase desde un estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la molcula relaja su energa mediante distintos mecanismos (vibracin, rotacin, etc.) Cada molcula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de molculas.

No slo se aplica a la forma visible de radiacin electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectofotometra de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).

Se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una regin de energa muy alta. Provoca dao al ojo humano as como quemadura comn. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, grupos carbonilos y otros tienen su mxima absorbancia en la regin UV, por lo que sta es muy importante para la determinacin cualitativa y cuantitativa de compuestos orgnicos. Diversos factores -como pH, concentracin de sal y el disolvente- que alteran la carga de las molculas, provocan desplazamientos de los espectros UV.

el color visible de una solucin que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es complementario del color que transmite. Para realizar mediciones de absorcin es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solucin coloreada. La fuente de radiacin visible suele ser una lmpara de tungsteno y no proporciona suficiente energa por debajo de 320 nm.
Apreciamos

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico que absorbe luz, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (Ia) y dejar pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It

La absorcin y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentracin y de la distancia recorrida.

La cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentracin en la solucin. La absorbancia de una solucin es directamente proporcional ala concentracin y a la longitud del paso de la luz. La absorbancia de una solucin es directamente proporcional ala concentracin y a la longitud del paso de la luz. A = e . b. c Siendo: A: absorbancia. No tiene unidades. e: el coeficiente de extincin molar, tambin llamado coeficiente de absorcin. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm). b: es la longitud de paso de la luz, en cm. c: es la concentracin del absorbente. Se mide en mol/L.

Ley de Beer:

Sustancia absorvente

Intensidad trans.

Medio absorvente

Intensidad transm.

Dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz. Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisin de energa radiante. En este caso, lo que se mide es la energa emitida y, en este fenmeno se basa la fotometra de llama o la fluorescencia.

Es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

1. Fuente de luz: proporciona energa radiante en forma de luz visible o no visible. Tipos de lmparas:
Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro visible y el ultravioleta. Fuente de un espectro continuo de energa radiante entre 360-950 nm. Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duracin y emiten energa radiante de mayor intensidad. Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: producen un espectro continuo en la regin ultravioleta entre 220-360 nm. Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de lneas que se utilizan para calibracin de longitudes de onda, se emplean solo para espectrofotmetros y cromatografa HPLC.

2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda. 3. Monocromadores. Pueden ser: Prismas: son fragmentos con forma de cua de un material que permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano. Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas paralelas situadas a distancias iguales entre s y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metlica. Cada una de estas hendiduras se comporta como un pequeo prisma.

Rendija de salida: tiene como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de la muestra. 5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin. Pueden ser de distintos tipos y tamaos (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores resultados con cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posicin. 6. Detector. Puede ser de dos tipos: Fotoclulas o clulas fotovoltaicas:
4.

 7.

Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el detector y que puede ser lectura directa o puede ser amplificadores de seal. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y clculos automticos de concentraciones con relacin a las curvas de calibracin.

 ESPECTROFOTMETRO

DE HAZ SIMPLE: es igual que la descripcin dada para el espectrofotmetro en general. Consta de los mismos elementos (Ej. Bilirrubinmetro: para determinar bilirrubina directa en capilar).

 ESPECTROFOTMETRO

DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO: todos los componentes estn duplicados, menos la lmpara y el medidor. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo por los distintos componentes separados en el espacio. Esto compensa las variaciones de intensidad de luz y de absorbancia.

ESPECTROFOTMETRO DE HAZ DOBLE EN EL TIEMPO: Utilizan los mismos componentes que el espectrofotmetro de haz simple. Dos haces de luz pasan por los mismos componentes pero no al mismo tiempo. Emplean un Chopper consistente en un interruptor rotativo del haz luminoso colocado a continuacin de la rendija de salida. Un sistema de espejos dirige la porcin de luz reflejada por el chopper a travs de una cubeta de referencia y de ah al detector comn. El detector lee alternativamente el haz procedente de la muestra y el de la cubeta de referencia. Esto compensa la variacin de energa radiante.