DENEYN ADI : Lactobacillus Casei ve E.

Colinin Tuz ve pH Toleranslarnn Belirlenmesi GR Mikroorganizmalarn gelimelerinde nemli evre koullarndan biride mikroorganizmann bulunduu ortamn ozmatik basncdr. Yani mikroorganizmalarn gelitii ortamn tuz, eker vb maddelerin konsantrasyonu gelime iin byk nem tar. Halofilik ( tuz seven ) ve osmofilik ( eker seven ) bakterilerin ortamdaki younlua bal olarak gelimeleri etkilenir. Tuz konsantrasyonu (kloridler, slfatlar ve dierleri), tuzlu toprak ve sularda dk ya da yksek tuz konsantrasyonu ile mikroorganizmalarn canlln etkileyen ana ekolojik faktr oluturur. Mikroorganizmalarn remeleri iin, besiyerinin pH 'snn optimal snrlar iinde bulunmas gereklidir. Minimal ve maksimal pH limitlerine yanatka reme azalr ve durur. Bakterilerin optimal pH limitleri olduka deiiktir. Asit ortam seven mikroorganizmalar (maya, kf, laktobasil, asetobakter, vs) yan sra, alkali besiyerlerinde reyenler de (mikoplazma, toprak bakterileri, V. cholera, vs.) vardr. nsan ve hayvanlarda hastalk oluturanlar genellikle, konaknn sv ve dokularnn pH derecesinde (pH. 7.0-7.4) rerler. Patogenik mikroorganizmalarn besi yerlerinde reme pH limitleri, apatogenlerden daha dardr. Besi Yeri Hazrlk Aamalar Bir gda maddesinin mikrobiyolojik analizinde sonularn geerlilii; Analizlere uygun besi ortamnn seilmesine, Besi yerinin doru olarak hazrlanna, Doru kullanmna baldr. Ortam bileimine giren maddeler ve zeltiler usulne uygun olarak hazrlanmal ve saklanmaldr. Bilgi ile iyi bir ekilde hazrlanan besiyerlerinde mikroorganizmalar retmek ve izole etmek daha kolaydr. Besiyerleri ok farkl ekillerde hazrlanabilir ve kullanlabilir. Tartlan besi yeri bileenleri veya dehidre hazr besiyerlerinin hazrlanmasnda srasyla; Tartm Kaba aktarma zndrme Berraklatrma eklinde yol izlenmelidir. Besi yeri pHnn llmesi pH metre elektrotlar ile zeltideki H+ iyonu konsantrasyonunun saysal deeri llr. pH metre ile lm yaplrken; pH metrenin besi yeri scaklna gre scakl ayarlanr. Tampon zeltiler (genellikle pH=4 ve pH=7 veya pH=4 ve pH=11 olan tampon zeltiler kullanlr) ile pH metre ayarlanr (kalibre edilir). Daha sonra pH metre elektrotlar besi yerine batrlr. pH deeri skaladan okunur.

Besi yerinin pHs belirtilen pHdan yksek veya dk olduunda ayarlanmal, formlde istenen pHya getirilmelidir.

Besi yerinin pHs filtrasyonla sterilize edilmi 1 N veya 0.1 N HCl ile ya da 1 N veya 0.1 N NaOH kullanlarak ayarlanr. Besi yeri pHs stenenden yksekse 1 N veya 0.1 N HCl, stenenden dkse 1 N veya 0.1 N NaOH kullanlarak formlasyonunda belirtilen dereceye ayarlanr. Besi yeri pHnn ayarlanrken u noktalara dikkat edilmelidir; >Besi yerinin pHsn ayarlanrken besi yeri bir erlene aktarlr, manyetik kartrc ve stcya konur. Besi yerine duruma gre damla damla 1N veya 0.1 N NaOH ya da 1N veya 0.1 N HCl eklenerek pH ayarlanr. > pH ayarlamas srasnda asit veya baz damlalarnn elektrotlara dememesine dikkat edilmelidir. > Besi yerinde agar varsa agarn katlamamas iin besi yeri 45 48o Cye kadar soutularak pH ayarlanr. Bu durumda pH metre kalibrasyonu da 45 48o Cde yaplmaldr. > Besi yerinin pHnda sterilizasyon sonunda 0.2 0.4 kadar dme olabilir. Bunun iin ya besi yerinin pH istenenden 0.2 0.4 kadar yksek ayarlanr ya da besi yerine PO4 tuzlar gibi tampon maddeler ilave edilir. > Gda iletmelerinde her otoklavlama sonras mutlaka pH kontrol yaplmaldr. Tampon zelti Bir zeltiye belli miktarlara kadar asit veya baz eklendiinde, zeltinin pH deerinin deimesini engeller ynde tepkime verebilen zel zeltilere tampon zelti denir. Tampon zeltinin iinde ya zayf asit ve onun konjuge baz; ya da zayf baz ve onun konjuge asidi bulunur. rnein asetik asit ile sodyum asetat; amonyak ile amonyum klorr karm gibi. DENEYN YAPILII Metod Laboratuvarlarda kullanlan pek ok besiyeri, dehidre formdan hazrlanr. Bu amala, gereken miktar dehidre besiyeri tartlp, zerine damtk su eklenir ve gerekli ise baka kaplara (rnein tplere) datlp, sterilize edilir. Besiyeri hazrlamada kullanlacak cam malzemenin ok iyi bir ekilde ykanm ve durulanm, besiyeri hazrlamada kullanlan kalitede sudan geirilmi ve yeterince kurutulmu olmas gerekmektedir. Tartm iin zel tartm kaykklar ya da kk beherler kullanlmal, dorudan erlen ya da balona tartmdan olabildiince kanlmaldr. zellikle bileimden hazrlamalarda tartm srasnda her madde iin temiz spatl (kak) kullanlmas, besiyeri ve/veya besiyeri bileenlerinin kapaklar aldktan sonra hata yapmamaya zen gsterilerek tartmn elden geldiince abuk bitirilmesi ve besiyeri kapann skca kapatlmas gerekir. Tartm srasnda besiyeri ve/veya bileenlerinin ok az da olsa toz bulutu oluturmamasna zen gsterilmeli, eer toz bulutu olutu ise kesinlikle solunulmamaldr. Besiyerine ilave edilecek su ayr bir l silindirinde bulundurulmaldr. Prensip olarak suyun hacmi ile silindirin hacmi birbirine yakn olmaldr. Suyun yaklak 1/3' uygun bir kaba aktarlr, bunun zerine tartlm dehidre besiyeri ilave edilir. Bu uygulama ile cam kabn

tabanna dehidre besiyerinin yaparak erimemesine bal sterilizasyon yetersizliinin nne geilir. Daha sonra suyun geri kalan ksm cam kap boaznda ve i eperlerde kalm olabilen besiyeri paracklarn ykayarak kaba ilave edilir. Besiyeri pH'snn sterilizasyon ncesi ayarlanmas yanl olur. nk sterilizasyon sonrasnda pH az da olsa deiir. Dolays ile besiyeri pH'snn sterilizasyon ncesinde ayarlanmas, sterilizasyon sonrasnda yanl pH elde edilmesine yol aar. Otoklav ile sterilizasyon sonras agarl besiyerleri ounlukla Petri kutularna dklerek kullanlr. Besiyeri dklmeden nce, homojenliinden emin olmak iin alkalanmaldr. Bu ilemlerden sonra kltr besiyerine ekilir ve inkbasyona braklr.(24 saat) oalma grldkten sonra spektrofotometredeki deerler kaydedilerek deiik tuz konsantrasyonu ve deiik pHlarda oalma erisini izilir. Materyal Deney tp Kat MRS Agar Schoot ie pHmetre Spektrofotometre Asetik Asit Sodyum Hidroksit NaCL Distile Su Pipet Yapl Besiyerimizi hazrlayacaz. Bunun iin nce kat MRS Agardan ka gr. kullanacamz hesapladk. Mrs agar kab zerindeki deerleri kullanarak

1000 ml 60 ml. x= 3,132 gr.

52,2 gr MRS x gr

Hassas terazide bu deeri tarttk ve schoot ie iine koyduk. Otomatik kartrc ile zdk.

Resim. Hazrladmz besiyeri

Agardan 30 ml. alarak behere koyduk ve pHmetre ile pHn ltk. Bizim grup pH=5 ve pH=7 deerlerini hazrlad. Beherdeki ilk pH= 6,1 di. pH 5e indirmek iin pipet ile asetik asit damlattk ve pHmz 5e ayarladk.

Resim. pHmetre ile pH ayarlanmas Ayn ilemi pH=7 iin tekrarladk. Beherdeki besiyerini pipet yardmyla 8er ml. deney tplerine aktardk. Bundan sonra 0,1M ve 0,2M tuz konsantrasyonlarn hazrlamak iin besiyeri iine koyacamz tuz miktarn hesapladk.( NaCL=57 gr )

M=

formlnden 0,1M tuz konsantrasyonu iin;

0,1= n= 0,0008 =

n= 0,0008 mol

m= 0,046 gr NaCL gereklidir.

0,2 M tuz konsantrasyonu iin;

0,2= n= 0,0016 =

n= 0,0016 mol

m= 0,0912 gr NaCL gereklidir.

Gerekli tuz miktarlarn terazide ltkten sonra pH=5 ve pH=7 olan deney tplerine aktardk ve tuzun zlmesi iin deney tplerini elimizde kartrdk. Tplerin stlerini herhangi bir

karma olmamas iin sterilizasyon ncesi yazdk ve sterilizasyon iin tplerin azn pamuk ile kapattk ve otoklava koyduk.

Resim. Deiik tuz konsantrasyonunda ve pHlardaki besiyerlerimiz Otoklavdan steril besiyerimize aldk. Isttmz ze ile petri kabnda daha nce izole ettiimiz rnekten srtnme yoluyla aldk. Deiik tuz konsantrasyonunda ve pHdaki deney tplerine ekim yaptk. Tplerin azn pamuk ile kapatp inkbasyona braktk.